专利名称：一种鉴定鲢鱼幼苗性别的分子生物学方法
技术领域：
本发明涉及一种分子生物学，特别是一种鉴定鲢鱼幼苗性别的分子生 物学方法。
背景技术：
我国有着丰富的鱼类资源，其中许多鱼类在生长速率上存在着性别差 异，因此，开展这些鱼类性别决定相关基因及性别特异标记的研究对于鱼 类性别控制具有很高的理论指导意义。鲢鱼(i/;;; o/^/w/m/c/2^^ wo/浙/;c) 又叫白鲢、水鲢、跳鳐、鲢子，属于鲤形目，鲤科，是著名的四大家鱼之 一。著名的特产经济鱼类，养殖历史悠久，在我国池塘、湖泊、水库均有 养殖，且养殖产量一直居我国淡水养殖之首。鲢鱼雌性生长发育快，生长 迅速。目前人工雌核发育与激素性反转结合创造全雌性的养殖群体是鲢鱼 育种的主要方向。但是由于鲢第一次性成熟需3 4年，在幼苗时期根本 无法通过外观形态来判断其性别特征，所以怎样从幼苗群体中，简单快速 的识别出遗传性别成为制约鲢鱼成功选育的先决条件。
RAPD技术是近几年出现的，可以快速寻找分子标记的一种有效方法。 用它在某些动物的基因组中寻找性别标记已有成功报道。如在虹鳟鱼基因 组中找到了两个雄性特异的分子标记，可以作为识别雌雄的探针。Kovacs 等2000年用RAPD扫描非洲鲶鱼(C/an'os gw/印/m^)雌、雄基因池，找 到两个雄性性别相关的RAPD标记。
发明内容
本发明的目的是提供一对鲢鱼雄性特异性引物序列和一对对照管家基 因引物序列。
本发明的另外一个目的是提供一种能快速鉴别鲢鱼幼苗性别的方法。 本发明的技术方案是，鲢鱼DNA分子鉴定性别的特异性片段，其特 征在于该特别片断的序列命名为Hmmf。鲢鱼幼苗DNA分子鉴别的雄性 特异引物，其特征在于该引物是由Hmmf序列设计合成的，该引物序列命名为Hmmfl和Hmmf2，对照管家基因引物是通过在NCBI网络搜索到 的鲢鱼管家基因GAPDH设计合成的，其引物序列命名为Gapdhl和 G叩dh2。 一种鉴定鲢鱼幼苗性别的分子生物学方法，其特征在于利用设 计的特异引物Hmmf 1和Hmmf2 ，以及对照管家基因GAPDH的引物Gapdhl 和Gapdh2，以鲢鱼个'体基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为 25pl,反应组成为1U的TaqDNA聚合酶，2^1的dNTP， 100 200ng基因 组DNA，其中含雄性特异上下游引物及管家基因上下游引物各0.1拜ol/L， 在PCR仪上按下面的循环参数进行PCR扩增95t:预变性5min后，94 。C变性30sec， 6(TC退火30sec， 72'C延伸60sec共30个循环，最后72 。C延伸10min，扩增产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色，在 凝胶成像系统下观察并拍照记录，100bpDNA ladder作分子量标记，该方 法中对照管家基因GAPDH的扩增带在雌雄个体中均稳定存在，出现大小 为800bp目的条带的是雄性个体，没有条带的即为雌性个体。本发明与现 有技术比较具有能对鲢鱼幼苗进行性别鉴定且鉴别准确率高的显著优点。
图1为利用特异PCR法对性别特异片段的验证结果。在雌雄10个个 体中，对照管家基因条带在所有个体中清晰可见，证明PCR扩增程序没有 问题。1， 2， 3， 4， 5泳道都出现了大小为800bp的扩增带，均为雄性个 体；而6， 7， 8， 9， IO除管家基因外没有扩增出任何条带，均为雌性个体。 M为100bp梯度的DNA分子量标准。箭头1所指为大小为800bp的雄性 特异条带；箭头2所指为对照基因条带。
图2为利用雄性特异引物和管家基因引物的鲢鱼幼苗性别鉴定结果。 随机选取13个鲢鱼幼苗个体进行性别鉴定。其中l， 2， 3， 4， 5， 9， 10， 11八个个体的电泳带上有一个800bp大小的条带，为雄性个体；6， 7， 8， 11， 12五个个体在800bp位置上没有条带，为雌性个体。但管家基因条带 在雌雄个体中都出现。M为100bp梯度的DNA分子量标准。箭头1所指 为大小为800bp的雄性特异条带；箭头2所指为管家基因条带。
具体实施例方式
雄性特异引物的获得以及性别特异性的验证性腺解剖鉴定性别后，提取雌雄个体基因组DNA，利用220条随机引 物进行RAPD-PCR扩增，当使用到随机引物S2107时，在雄性个体中扩增 出一个稳定的谱带，该带纹在雌性个体中不存在，通过克隆和测序获得了 一段约800bp的雄性特异片段，命名为Hmmf (其DNA序列如表1)，该 片段属非编码序列，将该序列在Genebank上进行序列对比，未发现与之 同源的序列。该条带艮'卩为鲢鱼雄性特异条带，测序后设计一对雄性特异引 物Hmmfl和Hmmf2，通过NCBI搜索鲢鱼的GAPDH管家基因，设计一 对能作为PCR内部对照的引物Gapdhl和Gapdh2 (其DNA序列如表2)。 利用设计好的特异引物及对照基因引物在10个已知性别的个体中进行特 异PCR扩增，结果如图l所示，在雌雄10个个体中，对照管家基因条带 在所有个体中清晰可见，证明PCR扩增程序没有问题，1， 2， 3， 4, 5均 为雄性个体，泳道都出现了大小为800bp的扩增带；而6， 7， 8， 9， 10 均为雌性个体，除管家基因外没有扩增出任何条带，这表明本发明设计的 引物和方法能够用于鲢鱼性别的鉴定。
鲢鱼幼苗性别的鉴别
将实验鱼断尾取血少许(不超过0.5ml)，加至少两倍的抗凝剂ACD， 400(h"pm离心10min，去上清；加入5ml裂解液及20吗RNA酶，37。C温 育3h;加蛋白酶K至终浓度10(Hig/Vl， 5(TC过夜。经酚~ ^酚*氯仿*异 戊醇~~ 氯仿'异戊醇依次抽提，无水乙醇沉淀，70%乙醇洗涤。干燥后， 将鲢鱼基因组DNA溶于TE或无菌双蒸水中，分别编号。利用设计的雄性 特异引物和管家基因引物对13个未知性别鲢鱼幼苗个体进行PCR扩增， 反应体系为25pl， lUTaq酶，2pl dNTP， 100~200ng基因组DNA，雄性特 异上下游引物及管家基因上下游引物各0.1pmOl/L。循环参数为95'C预变 性5min后，94。C变性30sec， 60。C退火30sec， 72。C延伸60sec共30个 循环，最后72。C延伸10min。扩增产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，溴化 乙锭染色，在凝胶成像系统下观察并拍照记录。如图2发现对照基因 GAPDH的扩增带在雌雄个体中均稳定存在，8个出现大小为800bp目的带 的是雄性个体，其它5个没有条带的即为雌性个体。
以上均表明本发明设计的特异引物和方法能够用于鲢鱼幼苗雌雄性别
的鉴别。表1 .鲢鱼雄性特异片段Hmmf序列
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表2.鲢鱼雄性特异性引物序列和管家基因引物序列
引物 序列
Hmmf 1: 5' TGCAGGTCGACGATTTCCCAGC3'
雄性特异性引物序列
Hmmf2: 5'CCATTTTCTTTCACCTCGCACC 3'
Gapdhl: 5'GCCTCCTGCACCACCAACTG3'
对照基因引物序列 ~~~~--
Gapdh2; 5， CGGAAGGCCATGCCGGTCAG3，
权利要求
1、鲢鱼DNA分子鉴定性别的特异性片段，其特征在于该特异性片断的序列命名为Hmmf。
2、 鲢鱼幼亩DNA分子鉴别的雄性特异引物，其特征在于该引物是 由Hmmf序列设计合成的，该引物序列命名为Hmmfl和Hmmf2，对照管 家基因引物是通过在NCBI网络搜索到的鲢鱼管家基因GAPDH设计合成 的，其引物序列命名为Gapdhl和Gapdh2。
3、 一种鉴定鲢鱼幼苗性别的分子生物学方法，其特征在于利用设计 的特异引物Hmmfl和Hmmf2，以及对照管家基因GAPDH的引物Gapdhl 和Gapdh2,以鲢鱼个体基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为25)il， 反应组成为1U的TaqDNA聚合酶，2pl的dNTP， 100 200ng基因组DNA， 其中含雄性特异上下游引物及管家基因上下游引物各0.1pmol/L，在PCR 仪上按下面的循环参数进行PCR扩增95。C预变性5min后，94"C变性 30sec， 6CTC退火30sec， 72"延伸60sec共30个循环，最后72°。延伸 10min，扩增产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色，在凝胶成 像系统下观察并拍照记录，100bp DNA ladder作分子量标记，该方法中对 照管家基因GAPDH的扩增带在雌雄个体中均稳定存在，出现大小为800bp 目的条带的是雄性个体，没有条带的即为雌性个体。
全文摘要
本发明公开了一种鉴定鲢鱼幼苗性别的分子生物学方法，属于分子生物学领域，本发明的目的是提供鲢鱼幼苗DNA性别的特异性片段和其雄性特异引物及鉴定鲢鱼幼苗性别的方法。本发明的技术方案是，其特异性片段的序列为Hmmf1和Hmmf2。鉴定鲢鱼幼苗性别的分子生物学方法，利用设计的特异引物及对照管家基因GAPDH的引物以鲢鱼个体基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为25μl，在PCR仪上按30个循环参数进行PCR扩增，在凝胶成像系统下观察并拍照记录，100bp DNA ladder作分子量标记，出现大小为800bp目的条带的是雄性个体，没有条带的即为雌性个体。本发明用于鲢鱼幼苗性别鉴定。
文档编号C12Q1/68GK101613750SQ20091006428
公开日2009年12月30日 申请日期2009年2月27日 优先权日2009年2月27日
发明者夏晓华, 常重杰, 杜启艳, 王友利, 陈建军 申请人:河南师范大学