专利名称:一种4-硝基酚-4-单加氧酶基因及制备方法和用途的利记博彩app
技术领域:
本发明涉及一种4-硝基酚-4-单加氧酶基因,同时还涉及该基因的制备方法,该基因编码的酶能够催化环境污染物4-硝基酚和4-硝基邻苯二酚的降解,能够分解代谢环境中的有毒污染物4-硝基酚和4-硝基邻苯二酚。本发明还涉及一种利用该基因表达有活性的4-硝基酚-4-单加氧酶的方法,以及4-硝基酚-4-单加氧酶在环境污染物微生物分解代谢中的应用。
背景技术:
硝基酚是最广泛使用的芳香烃化合物之一,也是研究芳香烃微生物代谢途径和机理的模式化合物。其中^硝基酚(/7wa-nitropheno1, 4-nitrophenolPNP)是一种重要的化工原料,常作为医药、染料、农药等合成的前体,同时在使用有机磷杀虫剂的环境中由于有机磷的水解也可导致硝基酚的积累。这类化合物常在生产和使用过程中被释放到环境中,它们难以降解,能在环境中长期残留。4-硝基酚能够影响人体的物质代谢,并且在食物链中有富集和放大效应,具有致畸、致突变、引发癌症等危险,严重威胁人类的健康和生存。因此已经被美国环保局列为优先环境污染物(PriorityPollutant List)(http:〃oaspub.epa.gov/wqsdatabase/)。
进入环境中的硝基酚及其它有机污染物,自然界中起初并不存在利用它们的微生物和酶系,但经过长期的进化,微生物有的自然突变成新的变种,有的通过产生诱导酶以适应新的环境条件,从而能够利用这些污染物
作为碳源、氮源或能源进行生长,同时使污染物得以降解或转化。4-硝基酚的代谢研究一直受到人们的关注,已经有多株能够完全代谢硝基酚的细菌纯培养物的报道。相对于其它硝基芳香烃化合物,4-硝基酚的代谢途径最为多样。4-硝基酚的氧化代谢途径是目前报道的最主要的代谢途径,根据中间产物的不同,可以分为对苯二酚途径和苯三酚途径。
4-硝基酚的对苯二酚代谢途径广泛存在于革兰氏阴性菌中,在该途径中,4-硝基酚首先被氧化为对苯二醌(p-benzoquinone),对苯二醌在还原酶作用下还原为对苯二酚(hydroquinone),然后进入开环途径。对苯二酚在双加氧酶的作用下开环生成y-羟基粘康酸半醛(Y-hydroxymuconicsemialdehyde , HMSA ),后者在脱氢酶作用下转化为马来酰乙酸(maleylacetate , MA ) 。 MA在MA还原酶作用下生成p-酮己二酸
((3-ketoadipate)并最终进入三羧酸循环(Tricarboxylic acid cycle, TCA),[Spain JC & Gibson DT (1991) Pathway for biodegradation of p-nitrophenol in aMoraxe〃fl sp. Appl. Environ. Microbiol. 57: 812-819.]。
另一条经典的4-硝基酚代谢途径是苯三酚途径,这种代谢途径在革兰氏阳性菌中广泛存在。在该途径中4-硝基酚在2-和3-位羟化形成苯三酚
(1,2,4-benzenetrio1, hydroxyquinol),代谢过程中可能有中间产物4-石肖基邻苯二酚(4-nitrocatechol)的产生。苯三酚在双加氧酶的作用下被开环生成马来酰乙酸,然后还原成p-酮己二酸[Jain RK, Dreisbach JH & Spain JC(1994) Biodegradation of p-nitrophenol via l,2,4-benzenetriol by an ^W/^o6a"er sp.Appl, Environ. Microbiol. 60: 3030-3032.]。
虽然4-硒基酚代谢菌株的分离及代谢途径的研究已经开展了半个世纪,但关于4-硝基酚代谢途径在分子生物学水平上的研究很少。目前,已经从两个菌株中报道了参与4-硝基酚代谢的基因及操纵子,这两株菌均为革兰氏阳性菌,都是经1,2,4-苯三酚途径降解4-硝基酚。分别来自i /zo(iococci^ opacws SAO101 [Kitagawa W, Kimura N & Kamagata Y (2004) Anovel ,nitrophenol degradation gene cluster from a Gram-positive bacterium,i 力ot/ococcM o/wcwa SAOlOl. J. Bacteriol. 186: 4894-4902.]禾口」W/zr6^""er sp.JS443菌株[Perry LL & Zylstra GJ (2007) Cloning of a gene cluster involved in thecatabolism of _p-nitrophenol by ^4rt/zn 6a"e/" sp. strain JS443 and characterization ofthe p-nitrophenol monooxygenase. J. Bacteriol. 189: 7563-7572.]。其代谢过程中的最关键的酶一一4-硝基酚单加氧酶也分别得到了克隆和鉴定。这两种4-硝基酚单加氧酶均属于双组分的黄素单加氧酶,包括一个依赖NAD(P)H的还原酶组分和一个依赖黄素的单加氧酶组分,而且其蛋白序列具有较高的一致性(72%)。参与4-硝基酚代谢的基因簇在在国际基因数据库
(GenBank)中的序列登录号分别为EF052871和AY131335。
4-硝基酚经对苯二酚途径代谢的分子生物学研究一直未见报道,在GenBank数据库中也没有相应的基因序列的报道。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种4-硝基-4-单加氧酶的基因序列,该序列来自环境中的4-硝基酚降解细菌,该基因与数据库中的其它基因没有明显的序列相似性,是一种全新的基因。本发明对于充分利用微生物代谢污染物能力的多样性、为解决硝基酚环境污染问题具有着重要的理论和应用价值。
4本发明的另一个目的是在于提供了一种4-硝基-4-单加氧酶的基因序列制备方法,该方法易行,操作简便,该方法采用PCR技术和染色体步移技术,能够快速的获得目的基因片段,尤其是长片段。
本发明的再一个目的是在于提供了一种4-硝基酚-4-单加氧酶基因在芳香烃环境污染物降解中的应用。4-硝基-4-单加氧酶能够分解代谢4-硝基酚等环境污染物,在硝基芳香烃污染物的环境处理中具有研究与应用价值。
本发明的技术要点之一是4-硝基酚降解微生物的分离和鉴定。在本发明的一个实施例中提供了一种分离鉴定4-硝基酚降解细菌的方法。该菌株是从有4-硝基酚污染历史的样品中分离获得的,筛选方法是"选择性培养富集法",即在基本培养基中只加入4-硝基酚作为唯一碳源、氮源和能源,只有能够利用4-硝基酚作为碳源、氮源和能源的细菌才能繁殖,以此达到富集和纯化的目的。最后通过单菌落分离鉴定,获得一株细菌纯培养物,经鉴定为恶臭假单胞菌,命名为NyZ402(/^^/owomw;w"^NyZ402)。该菌能够利用4-硝基酚作为碳源、氮源和能源进行生长,能够完全转化、降解污染物4-硝基酚和4-硝基邻苯二酚,实现有毒污染物的完全脱毒。
本发明所涉及的微生物菌株包括但不仅限于恶臭假单胞菌属,由于微生物间水平基因转移的广泛存在,所有环境中的细菌种群,包括可培养的和不可培养的微生物,都可以获得、遗传本发明所涉及的芳香烃代谢基因。
本发明的技术要点之二是克隆获得参与4-硝基酚代谢的基因簇序列,尤其是4-硝基酚-4-单加氧酶的基因(簇)序列。
如背景技术中所述,目前还没有关于4-硝基酚经对苯二酚途径代谢的公开文献报道,在国际核酸数据库(GenBank)中也没有相关序列的登录。而4-硝基酚经对苯二酚代谢途径与苯三酚代谢途径完全不同,其编码控制的基因序列,尤其是4-硝基酚单加氧酶的基因序列也不相同。因此,很难以同源序列为基础,通过PCR或者Southern杂交的方法来获取参与4-硝基酚经对苯二酚途径代谢的4-硝基酚-4-单加氧酶的基因(簇)序列。
在本发明的一个实施例中,提供了一种克隆获得4-硝基酚-4-单加氧酶的基因序列、以及参与4-硝基酚的对苯二酚代谢途径的基因簇序列方法,一种4-硝基-4-单加氧酶的基因序列制备方法,其步骤是
(1)对苯二酚双加氧酶基因的扩增。首先以恶臭假单胞菌NyZ402菌株(从土壤中分离,方法如实施例l)的基因组为模板,利用PCR的方法扩增获得一段对苯二酚双加氧酶基因(pwC)片段,该基因编码的对苯二酚双加氧酶可能催化对苯二酚的开环,参与4-硝基酚的下游代谢途径。
(2) 克隆获得参与4-硝基酚代谢的基因簇。通过染色体步移的方法(BD公司GenomeWalker试剂盒),就可以获得; w;7C基因附近的其它基
因簇序列。因为参与芳香烃代谢的基因簇往往是连锁的,是在基因组中紧密排列的。因此,户"pC基因的上下游基因序列中可能就包括催化4-硝基酚经对苯二酚代谢的最关键的酶一_4-硝基酚-4-单加氧酶的基因序列。
(3) 序列分析获取4-硝基酚-4-单加氧酶基因。对获得的基因簇序列进行比对分析,结果表明,在国际基因数据库(GenBank)中,与本发明所涉及的4-硝基酚-4-单加氧酶蛋白质序列最为相似的是来源于A^wg///^/扁/ga^^Af293的单加氧酶的序列(登录号为XP—754665),但相似性仅为38%,这就说明本发明所设计的基因是一个全新的基因,能够编码一种全新的参与4-硝基酚代谢的酶——4-硝基酚-4-单加氧酶。 一种分离的多肽,其序列为SEQIDNO:l所示的核苷酸序列。 一种分离的多肽,其序列为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
本发明所涉及的4-硝基酚-4-单加氧酶由1233个核苷酸组成,其中1231-1233位是终止密码子TAG。
4-硝基酚-4-单加氧酶核苷酸序列 (SEQ ID NO:l )ATGGGCGCATAG
该基因编码的蛋白质氨基酸序列如下。4-硝基酚-4-单加氧酶的氨基酸序列 (SEQ IDNO:2)
DPAQRARDNAMFDHAGKDLKVMREILLDFEKLNGRRVIAPR(3YAQALESMGA.
本发明涉及的纤4-硝基酚-4-单加氧酶由410个氨基酸构成,分子量为45.5 kD,等电点为6.5。
本发明所涉及4-硝基-4-单加氧酶基因序列的获取方法包括但不仅限于上述方法。本发明涉及的4-硝基-4-单加氧酶基因还可以通过以下方法获得(1)亚克隆以本发明所涉及的基因片段为模板,或者以含有本发明所涉及的基因片段的重组质粒为模板,或者以含有本发明所涉及的基因片段的基因工程菌株DNA为模板,通过常规分子生物学操作方法(如PCR),亚克隆得到相应基因片段,这些片段可以包括全部的或者部分的本发明所涉及基因序列,这些片段可在细菌、酵母、动植物细胞或其它真核、原核生物中表达,得到蛋白质或多肽片段,这些蛋白质或多肽片段与本发明所涉及的蛋白质有相同的生物学功能;(2)人工合成根据本发明所涉及的氨基酸或者核苷酸序列,可以通过化学合成的方法合成DNA片段,这些片段可以包括全部的或者部分的本发明所涉及基因序列,可以克隆到相应的载体中进行表达,表达的蛋白质或多肽与本发明所涉及的蛋白质有相同的生物学功能。
本发明所涉及的基因片段可以进行修饰,比如突变基因的某些核苷酸序列,但并不影响其编码的蛋白质氨基酸序列;可以增加、缺失本发明所涉及的氨基酸或者核苷酸序列,这些修饰不会影响蛋白质的生物化学特性、高级结构和蛋白质的生物学功能。比如可以在蛋白质或多肽N-端或C-端加上分泌信号肽,还可以加上适当的接头(如6个组氨酸)便于蛋白质提取、纯化。
本发明的技术要点之三是4-硝基酚-4-单加氧酶基因的功能验证。如背景技术中所述,本发明所涉及的4-硝基酚-4-单加氧酶基因尚未有公开的报道,验证本发明所涉及的基因的功能是进一步开发利用该基因的前提。
在本发明的一个实施例(实施例4)中提供了一种鉴定4-硝基酚-4-单
加氧酶基因及其编码蛋白功能的鉴定方法。该方法包括(1)4-硝基酚-4-
单加氧酶基因的PCR扩增。具体方法为,提取恶臭假单胞菌NyZ402菌株的基因组,以其为模板PCR扩增4-硝基酚-4-单加氧酶基因,所用引物为,Pl: 5'ATT GAA TTC ATA TGG GCC GTG ATA GGA GA3'(带下划线的碱基为EcoRI和Ndel的识别位点,引物包含了 SD序列)和P2:5'AGT TGA ATT CAC TCC TAC GAC GAAAGATCG3'(带下划线的碱基为EcoRI的识别位点)。PCR反应体系为模板(30ng/fi1) lpl;dNTP(每种10mM) 2^1;引物(各10pM) 2^1; IOX缓冲液5pl; ddH20 39.5pl;Pyrobest DNA Polymerase 0.5|il。其中IOX缓冲液和Pyrobest DNAPolymerase均来自Takaka公司。PCR反应条件94°C预变性5 min; 30个循环的94。C变性45 s, 57。C退火45 s, 72°C延伸1.5min;再72°C延伸7 min。 (2)目的基因片段的回收、克隆入载体。具体方法为,将PCR产物用1%(重量体积比)琼脂糖凝胶电泳,获得一条大小约为1300bp的片段,回收片段,用EcoRI酶切并克隆至pUC19 (Takaka公司)载体中,测序并进行序列分析,结果证明扩增得到的序列与预期的4-硝基酚_4-单加氧酶基因一致,在PCR过程中无突变产生。(3)在大肠杆菌(E.co//)中表达4-硝基酚-4-单加氧酶,具体方法为,利用限制性内切酶EcoRI和Ndel将PCR产物克隆至经过相应酶切的pET5a (Novagen公司)表达载体中,在含有氨苄青霉素(100pg/ml)的LB平板上筛选阳性克隆子。将阳性转化子置于含有氨苄青霉素(终浓度100pg/ml)的100mlLB中,在37°C、 200 rpm (转/分钟)条件下培养到OD6oo值约为0.6,力口入0.1 mMIPTG (Isopropyl-p-D-thiogalactopyranoside)至U培养液中继续诱导3-4h。将诱导表达好的菌体12,000g离心收集,在冰浴中超声波破碎10分钟,4°C、 200,000g离心1小时,所得上清即为粗酶液用于后继的研究。(4)通过紫外分光光度法测定该基因编码蛋白产物的4-硝基酚-4-单加氧酶的活性。反应以加入底物起始,底物4-硝基酚(420 nm摩尔消光系数为7,000 M"cm'1)的消耗通过400 nm的降低来确定。反应体系包括底物4-硝基酚0.05 mM, NADPH 0.2 mM, FAD 0.04 mM,蛋白粗酶液2pg。反应在20mM磷酸缓冲液中(pH7.0)室温(20-25°C以下相同)下进行,比活测定以340 nm处辅酶NADPH特征吸收峰(Xmax二340 nm,摩尔消光系数为6,220 M"cm—1)的减少来测定。酶活单位的定义为室温(20-25°C以下相同)下,每分钟1 pmol底物的减少或产物的增加所需的酶量,酶的比活为每克蛋白酶活单位的多少。(5)4-硝基酚-4-单加氧酶催化产物的鉴定。具体方法为,将含有4-硝基酚-4-单加氧酶基因的转化子置于含有氨苄青霉素(终浓度100pg/ml)的100ml LB中,在37°C、 200rpm (转/分钟)条件下培养到0D6(K)值约为0.6,加入0.1 mM IPTG到培养液中继续诱导3 — 4h。将诱导表达好的培养物12,000g离心收集,菌体用20mM磷酸缓冲液(pH7.0)清洗两次后,重悬于相同的缓冲液中,加入0.5 mM的4-硝基酚,30°C、 200 rpm温浴10分钟取样置于冰上直接进行HPLC (高效液相色谱)分析。检测条件为Gilson色谱仪Discover chromatograph (SupelcoTM HPLC Columns, USA) C-18(250 x 4.6 mm),每次进样量为2 pl,流动相为30%甲醇和70%水(体积比),流速1 m/min,在290 rnn处用119 UV/VIS检测仪检测产物,检测结果显示反应液中有对苯二酚生成(保留时间为4.0 min),说明4-硝基酚经过4-硝基酚-4-单加氧酶催化后可检测到产物对苯二酚。
本发明所涉及的基因-表达系统包括但不仅限于五.co"-pET5a系统,应用于本发明的克隆、表达载体包括但不仅限于下列载体pUC系列载体(Takaka公司)、pGEM-T (Progema公司)、pET系列载体(Novagen公司)。载体特征及克隆方法可参见冷泉港实验室编写的《分子克隆实验手
册》。应用于本发明的宿主一一载体系统包括但不仅限于下列系统细菌一一噬菌体系统,细菌一一质粒载体系统,酵母一一酵母载体系统,哺乳动物一一病毒系统(牛痘病毒、腺病毒等),昆虫细胞一一杆状病毒系统。本发明所涉及的基因与载体连接后可以克隆到相应的宿主中,以便于基因的保存、扩增和表达,还可以直接或间接的应用于4-硝基酚等环境污染物的生物降解处理。
本发明所涉及的4-硝基酚-4-单加氧酶基因的功能验证方法包括但不仅限于紫外分光光度法、气相色谱(GC)或高压液相色谱(HPLC)分析法,其它能够证明该蛋白活性的酶学研究的常规方法都可以应用与本发明。
本发明的技术要点之四是4-硝基酚-4-单加氧酶在4-硝基酚环境污染物生物降解中的应用。
在本发明的一个实施例中,提供了一个证明4-硝基酚-4-单加氧酶能够降解环境污染物4-硝基酚的方法_—基因工程菌株生物降解方法。该方法是利用表达4-硝基酚-4-单加氧酶的£丄0//菌株(Novagen公司),在实验室可控制环境中完全降解4-硝基酚。
本发明所涉及的4-硝基酚-4-单加氧酶在环境污染物生物降解中应用
9方法包括但不仅限于基因工程菌株生物降解法,应用本发明所涉及基因进行环境污染物处理的方法包括但不仅限于将本发明所涉及的基因直接或克隆至各种宿主一载体系统,然后释放到污染环境中;利用本发明所涉及的基因构建基因工程菌株,直接释放到污染环境中;利用含有本发明所涉及基因的基因工程菌株表达的有活性的蛋白,然后直接应用于环境污染物的处理。
本发明与现有技术相比,具有以下优点和效果(1)本发明所涉及的4-硝基酚-4-单加氧酶基因是一种全新的4-硝基酚降解基因,能够编码产生4-硝基酚-4-单加氧酶,该酶能够催化4-硝基酚和4-硝基邻苯二酚的降解,实现这类污染物的脱毒处理,处理过程无毒无害,不会产生"二次污染",遗留问题少,在环境污染物的生物降解中有着巨大的应用前景。(2)在污染物的降解过程中不需要添加任何辅助的物质,不破坏植物生长所需的土壤环境,最大限度的降低污染物处理过程对环境的影响。(3)操作简便,成本低,利于推广使用。(4)污染物降解速度快,对周围环境干扰少,在本发明的一个实施例中,提供了一种降解4-硝基酚的方法,经过14个小时就能完成污染物的完全去除。
图1. 4-硝基酚-4-单加氧酶降解转化4-硝基酚
将含有4-硝基酚-4-单加氧酶基因的菌株接种到4-硝基酚污染物中(起始浓度160pM),每小时取样,检测4-硝基酚的降解情况。横坐标为时间(单位小时),纵座标为4-硝基酚浓度(单位pM)。图2菌株NyZ402分解代谢污染物4-硝基酚
4-硝基酚初始浓度为0.5mM,接种菌体为LB清洗细胞。(■)培养物吸光值(0D6。。); ("4-NP浓度;(▲)亚硝酸根离子浓度。4-硝基酚代谢的同时伴随着亚硝酸根离子的释放。
具体实施例方式
所有实施例中的培养基及分子生物学操作方法为该领域技术人员所熟悉,可以参考Sambrook等"分子克隆"(实验室手册,冷泉港,1989)及"精编分子生物学实验指南"(美/F.奥斯伯等著,颜子颖等译,北京,科学出版社,1998)。下面结合附图及实施例子对本发明作进一步说明,但并不作为对本发明权利范围的限制。实施例1.恶臭假单胞菌NyZ402的分离和鉴定
从生产硝基酚等化合物的化工厂(任何化合物工厂)污水处理沉淀池中采集活性污泥样品。取lg样品加入100 ml富集培养基中(基本培养基UOg蛋白胨,10g酵母粉,10g氯化钠。12rC灭菌,20min)。加入4-硝基酚作为唯一碳、氮源),30。C富集培养3天,然后连续3次转接富集培养基,逐渐提高培养基中4-硝基酚浓度,直至培养基中4-硝基酚浓度提高到2mM。然后用固体富集培养基划线分离单菌落,选择生长好、传代稳定、降解能力好的一株单菌落进行研究。16S rDNA测序结果显示该菌株属于恶臭假单胞菌属,命名为NyZ402 ( i^ei^owonwNyZ術)。
实施例2. 4-硝基酚-4-单加氧酶基因的获得
1) 对苯二酚双加氧酶基因的扩增
将分离到的恶臭假单胞菌NyZ402菌株接种到LB液体培养基中,30。C摇床培养过夜。离心收集细菌细胞,提取基因组DNA。
根据GenBank中的苯三酚双加氧酶基因的保守序列设计两条引物,以NyZ402菌株的基因组DNA为模板PCR扩增该菌株的苯三酚双加氧酶基因。引物序列为上游,GTC GAC ATA TGA CCG ATC AAG ACAAAG CCA TC ,下游AAG CTT GGA TTC ATG ACT CAC TCT GCC TCCATGACGA。 50|al PCR反应体系含有模板(30ng/|al)dNTP (每种10mM) 2|il;引物(各lOpM) 2^1; IOX缓冲液5^1; ddH20 39.5^1; rTaq0.5pl。其中IOX缓冲液和rTaq均来自Takaka公司。PCR反应条件94°C预变性5 min; 30个循环的94°C变性45 s, 53°C退火45 s, 72°C延伸lmin;再72。C延伸7min。 PCR扩增获得一条大小为800 bp的条带,回收该片段并测序,结果表明该片段与GenBank中的苯三酚双加氧酶基因有较高的相似性(DNA序列一致性90%),表明该片段可能为NyZ402菌株中参与4-硝基酚代谢的对苯二酚开环酶(双加氧酶)基因(z^pC)片段。
2) 克隆获得参与4-硝基酚代谢的基因簇
以该片段为出发点,用染色体步移(genomic walking)的方法可以获得该片段上游和下游的基因序列,方法参见文献进行[Siebert PD, et al.,(1995) An improved PCR method for walking in uncloned genomic DNA. Nucl.Acids Res. 23: 1087-1088.]。通过3次连续的步移,共获得包括户"; C基因在内的15kb的片段。
3)序列分析获取4-硝基酚-4-单加氧酶基因
用DNAstar软件(DNAstar公司产品)对获得的序列进行分析,推测可能的开放阅读框(ORF),将其翻译为相应的氨基酸序列,并与GenBank数据库中的序列进行比对。结果表明该片段包括了可能参与4-硝基酚代谢途径的全部基因。其中催化4-硝基酚代谢的关键酶——4-硝基酚—4-单加氧酶基因(p";^4),与来源于爿^erg〃/w/ww/ga^w Af293的单加氧酶的序列(登录号为XP—754665)相似性为38%;与来源于Fra"h'asp. EANlpec的FAD依赖的单加氧酶序列(登录号为YP一001507373 )相似性为33%。这也表明该基因与GenBank中功能已知的基因无明显的序列相似性,为一个全新的基因,编码一种新的蛋白——4-硝基酚-4-单加氧酶。通过序列比对分析证明,已经克隆获得参与4-硝基酚代谢的基因簇序列,包括4-硝基酚-4-单加氧酶。
实施例3. 4-硝基酚-4-单加氧酶在大肠杆菌(五."//)中的表达
提取恶臭假单胞菌NyZ402菌株的基因组,以其为模板PCR扩增4-硝基酚-4-单加氧酶基因,所用引物为,Pl: 5'ATT GAA TTC ATA TGGGCC GTG ATA GGA GA3'(带下划线的碱基为EcoRI和Ndel的识别位点,引物包含了 SD序列)禾tl P2: 5'AGT TGA ATT CAC TCC TAC GACGAA AGA TCG3'(带下划线的碱基为EcoRI的识别位点)。PCR反应体系为模板OOng/pl) lpl;dNTP (每种10mM) 2pl;引物(各lO(iM)2nl; IOX缓冲液5pl; ddH20 39.5|al; Pyrobest DNA Polymerase 0,。其中10 X缓冲液和Pyrobest DNA Polymerase均来自Takaka公司。PCR反应条件94。C预变性5min; 30个循环的94°C变性45 s, 57°C退火45s, 72。C延伸1.5min;再72°C延伸7 min。将PCR产物用1% (重量体积比)琼脂糖凝胶电泳,获得一条大小约为1300 bp的片段,回收片段,用EcoRI酶切并克隆至pUC19 (Takaka公司)载体中,测序并进行序列分析,结果证明扩增得到的序列与预期的4-硝基酚-4-单加氧酶基因一致,在PCR过程中无突变产生。
利用限制性内切酶EcoRI和Ndel将PCR产物克隆至经过相应酶切的pET5a (Novagen公司)表达载体中,得到的重组质粒pZWWQ001转化至BL21(DE3) (Novagen公司)中,在含有氨节青霉素(100pg/ml)的LB平板上筛选阳性克隆子,用引物P1和P2验证筛选到的阳性克隆。将阳性转化子置于含有氨苄青霉素(终浓度100 pg/ml)的100mlLB中,在37。C、 200 rpm (转/分钟)条件下培养到OD綱值约为0.6,加入0.1mMIPTG (Isopropyl-卩-D-thiogalactopyranoside)到培养液中继续诱导3-4h。将诱导表达好的菌体12,000g离心收集,菌体用冰浴的20mM磷酸缓冲液(pH 7.0)清洗两次后,重悬于相同的缓冲液中。在冰浴中超声波破碎10分钟,4°C、 200,000g离心1小时,所得上清即为粗酶液用于后继的研究。
实施例4. 4-硝基酚-4-单加氧酶基因的功能鉴定
1) 4-硝基酚-4-单加氧酶酶活测定
以在大肠杆菌(五.co/0 (Novagen公司)中表达得到的4-硝基酚-4-单加氧酶粗酶液做酶催化反应实验。4-硝基酚-4-单加氧酶的活性测定通过紫外分光光度法检测。反应以加入底物起始,底物4-硝基酚(420 nm摩尔消光系数为7,000 M"cm")的消耗通过400 nm的降低来确定。反应体系包括底物4-硝基酚0.05 mM, NADPH (还原型辅酶II ) 0.2 mM,FAD (黄素腺嘌呤二核苷酸)0.04 mM,蛋白粗酶液2pg。反应在20mM磷酸缓冲液中(pH 7.0)室温下进行,比活测定以340 nm处辅酶NADPH特征吸收峰(Xmax二340 nm,摩尔消光系数为6,220 M"cm—1 )的减少来测定。酶活单位的定义为室温(20-25°C以下相同)下,每分钟1 pmol底物的减少或产物的增加所需的酶量,酶的比活为每克蛋白酶活单位的多少。测定结果为该4-硝基酚-4-单加氧酶比活性为49.6U/g。
2) 4-硝基酚-4-单加氧酶催化产物的鉴定
通过生物转化的方法鉴定4-硝基酚-4-单加氧酶催化4-硝基酚产物,具体做法如下将含有4-硝基酚-4-单加氧酶基因的转化子置于含有氨苄青霉素(终浓度100吗/ml)的100mlLB中,在37°C、 200rpm(转/分钟)条件下培养到OD6oo值约为0.6,加入O.lmMIPTG到培养液中继续诱导3 — 4h。将诱导表达好的培养物12,000g离心收集,菌体用20 mM磷酸缓冲液(pH 7.0)清洗两次后,重悬于相同的缓冲液中,加入0.5 mM的4-硝基酚,30°C、 200 rpm温浴10分钟取样置于冰上直接进行HPLC (高效液相色谱)分析。检测条件为Gilson色谱仪Discover chromatograph(SupelcoTM HPLC Columns, USA) C-18 (250 x 4.6 mm),每次进样量为2|ul,流动相为30%甲醇和70%水(体积比),流速1 ml/min,在290 nm处用119 UV/VIS检测仪检测产物,检测结果显示反应液中有对苯二酚生成(保留时间为4.0min),说明4-硝基酚经过4-硝基酚-4-单加氧酶催
化后可检测到产物对苯二酚。
3) 4-硝基酚-4-单加氧酶酶学特性研究
分别以4-硝基酚、2-硝基酚、3-硝基酚、4-硝基邻苯二酚为底物进行4-硝基酚-4-单加氧酶的酶活测定。结果显示,4-硝基酚-4-单加氧酶只对4-硝基酚和4-硝基邻苯二酚作用,具有较强的底物专一性,且4-硝基酚-4-单加氧酶对其天然底物4-硝基酚的催化速度明显大于4-硝基邻苯二酚,如下表所示。最终证明4-硝基酚-4-单加氧酶基因编码的酶能够分解代谢4-硝基酚和4-硝基邻苯二酚。
4-硝基酚-4-单加氧酶底物范围和相对酶活
底物酶比活()amol/min/g protein)相对活力(%)
4-硝基酚49.6100
4-硝基邻苯二酚13.327
实施例5. 4-硝基酚-4-单加氧酶在污染物降解中的应用
将含有4-硝基酚-4-单加氧酶基因的大肠杆菌(五.co/Z, Takara公司产品)基因工程菌株(如实施例3中构建)接种到含有氨节青霉素(终浓度100)ag/ml)的100mlLB中,在37°C、 200 rpm(转/分钟)条件下培养到OD6oo值约为0.6,加入O.l mM IPTG到培养液中继续诱导3 —4h。将诱导表达好的培养物12,000g离心收集,重悬于20 mM磷酸缓冲液(pH7.0)中,加入160 (^M的4-硝基酚,每小时取样,用HPLC检测底物降解情况,结果显示,含有4-硝基酚-4-单加氧酶基因的工程菌能够在14小时内完全降解转化4-硝基酚,降解率达到99%,如附图1所示。
实施例6.菌株NyZ402在4-硝基酚污染物降解中的应用
将在液体LB中生长过夜的恶臭假单胞菌NyZ402菌株用基本培养基(MM)清洗后以1% (重量体积比)的接种量接种进50ml的MM培养基中,加入0.5mM底物4-硝基酚作为唯一的碳、氮源供菌株生长,定时取样测定底物浓度和菌体浓度(OD6oq)的变化。结果附图2所示,菌株NyZ402能够以4-硝基酚作为唯一碳、氮源生长,4-硝基酚降低同时伴随着亚硝酸根离子的释放,这表明菌株NyZ402通过氧化途径代谢4-硝基酚。以单菌落接种菌体至MM培养基中,分别用浓度梯度为0.5mM, lmM, 1.5mM, 2mM禾B 2.5mM的4-石肖基酚作为菌株NyZ402生长的唯一碳、氮源进行生长,及过表明NyZ402对4-硝基酚的耐受浓度可以达到2mM,当4-硝基酚浓度高于2mM时,NyZ402不再生长。另外,NyZ402能够利用底物4-硝基酚、邻苯二酚和对苯二酚生长,但不能利用底物4-硝基邻苯二酚、2-硝基酚、3-硝基酚、偏苯三酚、2,6-二硝基酚、对硝基苯甲酸、硝基苯、间二硝基苯、2,4-二硝基甲苯、2,4,6-三硝基酚生长。
SEQUENCE LISTING
<110〉中国科学院武汉病毒研究所
<120> —种4-硝基酚-4-单加氧酶基因及制备方法和用途<130> —种4-硝基酚-4-单加氧酶基因及制备方法和用途<160〉 1
<170> Patentln version 3.3
<210〉 1
<211> 1233
<212> Type : DNA
<213> Pseudomonas putida
<400> 1
atgga雄aa ttgatggcgt agtggttgtc ggcggaggcc cggttgggtt gcttacagca 60ttgaaacttg gcaaggccgg tgtgcgggta gttgtcctgg agtccgaatc gggcgtttca 120ccctcaccgc gggcggttgc ctatatgcca cccactgctg cggcactgga ccgtttcggg 180ttgctcgacg acattcgcaa acgtgctgtg tggtgccctg atttcgctta ccgtcacggt 240aatggcgaac tgatcgcgaa aatggactgg gctgttctgg cacaggacac tgattacccc 300tatatgctgt tgctggcgca aaaccatgtg tccaatgtaa tcgtggagca tcttcgcaaa 360ctctccaatg tcgaaattcg ctggaatcac gcggtcgaag acattgagca ggacgacgac 420
tatgtgacca tggaaaccag cggccctgcc ggaaaagcac gtttgcgggc gaaatgggtt 480
gctgccaccg acggtgcacg cagtaccgta cgaggaaaaa tcgggctgtc ctttgatggt 540
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aaaaccggcc tgtggcgtgt gtgctatggc gaagatcctg agatctccga ggctgaagtc 720
cgccgccgct tgccggagcg tttcaagcgc ctgctgccgg gagcgccgac gcccgatcag 780
tatcgggtcg actacctcaa tccttaccgt gtccaccagc gttgcgccgc cgagttccgc 840
cgtggacggg tgatcctggc cggagatgct gcccatgcga ccaacccgat gggggggctg 900
ggactgtcgg ggggcgtact tgatgccgag catttggccg aggcgttgat tgcggtgatc 960
aaagaaggcg cttctaccaa ggtgctggat gagtactcta tcgatcggcg caaagtcttc 1020
ctcgagttca cgtccccgac cgcgactgcc aacttcacct ggatgaaaga aagtgaccct 1080
gcccagcgtg ctcgtgataa cgcaatgttt gatcatgcgg gcaaggactt gaaagtcatg 1140
cgtgaaattc ttctggactt cgagaagctc aacggccggc gcgtgatcgc tccacgacaa 1200
tatgcgcaag cgcttgaaag tatgggcgca tag 123权利要求
1、一种分离的多肽,其序列为SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
2、 一种分离的多肽,其序列为SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。
3、 一种实现权利要求1所述的4-硝基酚-4-单加氧酶基因的制备方 法,其步骤是(1) 对苯二酚双加氧酶基因的扩增,以恶臭假单胞菌NyZ402菌株的 基因组为模板,利用PCR的方法扩增获得一段对苯二酚双加氧酶基因片 段,该基因编码的对苯二酚双加氧酶可能催化对苯二酚的开环,参与4-硝 基酚的下游代谢途径;(2) 克隆获得参与4-硝基酚代谢的基因簇,通过染色体步移的方法, 就获得/7^C基因附近的基因簇序列,p^C基因的上下游基因序列中就包 括催化4-硝基酚经对苯二酚代谢的酶一一4-硝基-4-单加氧酶的基因序列;(3) 序列分析获取4-硝基酚-4-单加氧酶基因,对获得的基因簇序列 进行比对分析,结果表明,在国际基因数据库中,与所涉及的4-硝基酚-4-单加氧酶蛋白质序列最为相似的是来源于j^ergz7/^ Af293的 单加氧酶的序列,证明获得的基因编码的就是参与4-硝基酚代谢的酶一一 4-硝基酚-4-单加氧酶。
4、 权利要求1所述的一种4-硝基酚-4-单加氧酶基因在芳香烃环境污染物降解中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种4-硝基酚-4-单加氧酶基因及制备方法和用途,一种分离的多肽,序列为SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。其步骤是首先以恶臭假单胞菌NyZ402菌株的基因组为模板,利用PCR的方法扩增获得一段对苯二酚双加氧酶基因片段;其次是通过染色体步移的方法克隆获得参与4-硝基酚代谢的基因簇,获得pnpC基因附近的基因;第三是对获得的基因簇序列进行比对分析,获取4-硝基酚-4-单加氧酶基因,在国际基因数据库中,与所涉及的4-硝基酚-4-单加氧酶蛋白质序列无明显相似性。4-硝基酚-4-单加氧酶基因在芳香烃环境污染物降解中的应用。该方法易行,操作简便,能够快速的获得目的基因片段,尤其是长片段。为解决硝基酚环境污染问题具有着重要的理论和应用价值。
文档编号C12R1/40GK101597597SQ20091006288
公开日2009年12月9日 申请日期2009年6月26日 优先权日2009年6月26日
发明者虹 刘, 周宁一, 张俊杰, 王松鹤, 王淑君, 清 韦 申请人:中国科学院武汉病毒研究所