专利名称：依托泊苷诱导建立的宫颈癌多药耐药细胞株的利记博彩app
技术领域：
本发明属肿瘤生物学领域，涉及一种人宫颈癌耐药细胞株。具体涉及以人宫
颈癌SiHa为亲代细胞，通过逐步增加化疗药物依托泊苷(VP16)作用浓度，建
立了宫颈癌多药耐药细胞株SiHa/VP16。
背景技术：
宫颈癌严重危害着女性健康，其发病率居女性恶性肿瘤第二位。全世界每年 的宫颈癌新发病例约50万，而我国每年新发病人数约占世界总发病人数的1/3。 化疗是治疗宫颈癌的重要手段，但化疗中常见且难以解决的问题是多药耐药性 的产生，即肿瘤同时对多种结构和作用机制不同的化疗药物产生交叉耐药的现 象，它是化疗失败的主要原因。因此研究肿瘤多药耐药机制以及防止或逆转肿 瘤多药耐药的发生对于提高化疗效果十分重要。近年来，肿瘤耐药细胞株已成 为重要的工具，大量研究利用它来揭示肿瘤细胞的耐药机制、研究肿瘤细胞的 耐药性逆转、开发及评价新的抗癌方法等。建立肿瘤耐药细胞株具有重要应用 价值。植物碱类化疗药物依托泊苷是肿瘤化疗的常用药物，作为二线药物也被 用于宫颈癌的化疗，建立宫颈癌对依托泊苷耐药细胞株能够为肿瘤耐药相关研 究提供必要的研究模型。SiHa宫颈鳞癌细胞株，由日本YIto建立，是肿瘤研究 的常用工具。目前国内尚无SiHa细胞对VP16的耐药株，国外有过相关研究， 但其耐药株的建立方式、耐药能力与我们的发明均有所不同。
肿瘤耐药细胞株的建立通常有两种方法， 一是逐步增加药物浓度、持续诱导 法，二是大剂量冲击间断给药法。国内外均有研究对这两种方法进行了比较， 认为不同诱导方式可能获得不同耐药机理的耐药细胞株，同时也可能影响肿瘤 细胞耐药程度，持续诱导比冲击诱导更易产生耐药性。持续诱导法以肿瘤细胞 最终能在特定浓度化疗药物中稳定生长作为诱导成功的判定标准，细胞耐药性 稳定、直观，因此本发明主要采用该法来诱导耐药细胞的产生。
肿瘤细胞耐药程度的判定常用耐药指数(resistant index, RI)来表示， RI是耐药细胞半数抑制浓度(50% inhibitory concentration, IC50)与亲代 细胞半数抑制浓度的比值。Snow等按耐药指数的高低将耐药性分为低度(〈5)、 中度(5-15)、高度(M5)。
发明内容
本发明的目的是建立宫颈癌耐药细胞株SiHa/VP16，为以下相关研究提供耐 药肿瘤细胞模型研究耐药肿瘤细胞形态学及生物学特点、研究肿瘤多药耐药
机制、分析化疗药物敏感性及筛选化疗药物、开发肿瘤耐药逆转药物、研发更 有效的肿瘤治疗方法等。
本发明的耐药细胞株建立步骤如下(1)人宫颈癌SiHa细胞株，复苏后用 DMEM培养液(含10%小牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100ug/ml)于37。C、 5%C02、 95%湿度条件下培养；(2)取对数生长期SiHa细胞，换新鲜培养液，加 入VP16，使其作用浓度为0. lug/ml，在37。C、 5%C02、 95%湿度条件下继续培 养，适时换液，维持0. lyg/ml药物浓度直至存活细胞能在此浓度稳定生长、 传代；(3)适当增加VP16的作用浓度，在37。C、 5%C02、 95%湿度条件下继续培 养，适时换液，维持药物浓度直至存活细胞能在此浓度稳定生长、传代；(4) 重复步骤(3)直到获得能在4n g/mlVP16中稳定生长、传代及复苏的SiHa/VP16 细胞株。在诱导过程中，掌握适当的VP16增加浓度非常重要，理想状况是既通 过增加药物浓度筛选出少数耐药细胞又不致于使全部细胞死亡，从而不断获得 有更高耐药性的SiHa细胞。经过探索，在我们的发明中采用每阶段增加0.5 2u g/mlVP16的方法，初始诱导阶段细胞对药物较敏感，每次增加的药物量宜低，当细胞有一定 耐药能力后可适当加大增药浓度。历时9个月建立了SiHa/VP16耐药细胞株。用光学显货A 镜观察细胞形态、MTT法绘制细胞生长曲线、检测细胞耐药指数。我们发现， SiHa/VP16细胞立体感增强，有时呈现短且胖的梭形，但总地说来与SiHa细胞 差别不大；生长速度明显减慢；对VP16明显耐药，耐药指数(RI)为24.019， 除对VP16耐药外，对MTX中度耐药，对cDDP、 VCR、 5-Fu、 DOX呈低度耐药。
图1是倒置相差显微镜下SiHa活细胞观察图；图2是倒置相差显微镜下
SiHa/VP16活细胞观察图；图3是光学显微镜下SiHa细胞爬片HE染色观察图4是光学显微镜下SiHa/VP16细胞爬片HE染色观察图；图5是SiHa及
SiHa/VP16细胞生长曲线。
具体实施例方式
实施例1
SiHa/VP16多药耐药细胞株按以下步骤建立(1)人宫颈癌SiHa细胞株，复苏后用DMEM培养液(含10%小牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100ug/ml) 于37X:、 5%C02、 95%湿度条件下培养；(2)取对数生长期SiHa细胞，换新鲜培 养液，加入VP16，使其作用浓度为0. lug/ml，在37。C、 5%C02、 95%湿度条件 下继续培养，适时换液，维持O. lug/ml药物浓度直至存活细胞能在此浓度稳 定生长、传代；(3)适当增加VP16的作用浓度，在37t、 5%C02、 95%湿度条件 下继续培养，适时换液，维持药物浓度直至存活细胞能在此浓度稳定生长、传 代；(4)重复步骤(3)直到获得能在2iig/mlVP16中稳定生长、传代及复苏的 SiHa/VP16细胞株。每阶段增加VP16量为0. 5 2ug/ml。历时9个月建立 SiHa/VP16细胞株。
当细胞依次对0. 1 ti g/ml、 0.5tig/ml、 lpg/ml、 2ug/ml、 4ug/ml VP16 稳定耐药后，及时冻存该浓度耐药细胞于液氮中。冻存液由20%小牛血清、 5%DMS0、 75% DMEM培养液组成，冻存过程应逐步降温，采取4°C30分钟一-20 °C1小时一""7(TC过夜一液氮的顺序进行。冻存细胞的复苏按以下程序进行在 一个25cm2的细胞培养瓶中加入至少10ml含10%小牛血清的培养液；从液氮中取 出装有细胞的冻存管，立即放入37t:水浴轻轻摇动使冻存物在1分钟内解冻， 用酒精棉球擦拭冻存管外壁后拿入超净台；将解冻后的细胞悬液移入已加了培 养液的培养瓶中，稍加摇动混匀，拧松瓶盖，平放入二氧化碳培养箱中，在37°C、 5%C02、 95%湿度条件下培养，约24小时细胞贴壁后换新鲜培养液3 5ml继续培 养。
实施例2
对本方法建立的SiHa/VP16细胞株进行形态学观察及生物学特性鉴定 l.形态学观察
(1) 倒置相差显微镜观察活细胞形态
取对数生长期SiHa、 SiHa/VP16细胞各一瓶，换液后在倒置相差显微镜下 观察活细胞形态并照像。可见SiHa/VP16细胞立体感增强，有时呈现短且胖的 梭形，但总地说来与SiHa细胞差别不大。(如图l、 2所示)
(2) HE染色观察细胞形态
取对数生长期SiHa、 SiHa/VP16细胞，用0. 25%胰酶消化制成单细胞悬液， 调整密度约1X107ml，接种于铺盖玻片的培养皿，放C02培养箱常规培养，待 细胞基本长成单层，取出盖玻片，弃培养液，0.01M PBS浸洗3次，常规HE染
5色，于光学显微镜下观察。可见SiHa/VP16与SiHa细胞无明显差别。(如图3、 4所示)。
2. 测定细胞生长曲线和群体倍增时间(MTT法)
取对数生长期SiHa、 SiHa/VP16细胞，用胰酶消化制单细胞悬液，调整细 胞密度。每种细胞均以2000/孔种于96孔板，设5个复孔。同时接种8块96孔 板。于实验的1 8天每天取出一块板，用MTT法检测595nm波长处0D值，通 过OD值一细胞数直线回归方程将OD值换算成细胞数。将8次的实验数据进行 分析，绘制生长曲线(如图5所示)。按Patterson公式Td = A T X lg2/lg(Nt/No) 计算细胞倍增时间，Td为倍增时间，Nt为终末细胞数，No为初始细胞数(此 处用0D值代替)，A T为Nt No的时间，算得SiHa和SiHa/VP16细胞群体倍增 时间分别为38.04土2. 39h、 43.30士1.41h，耐药细胞生长速度减慢(P<0.001)
3. 耐药谱分析(MTT法)
取对数生长期的SiHa、 SiHa/VP16细胞，用0. 25%胰酶消化，制单细胞 悬液，以4X107ml的密度接种于96孔板，每孔180 u 1 (7200个细胞/孔)。 常规培养24h。每孔加20ixl用培养液配制的化疗药物，使八种药物(依托泊 苷、顺铂、紫杉醇、长春新碱、5-氟尿嘧啶、氨甲喋呤、多柔比星、丝裂霉素 C)分别以7 8个梯度浓度作用于细胞(梯度浓度根据预实验所得，务必使半 数抑制浓度在此梯度范围中间位置)。每一浓度设3复孔，同时设仅接种细胞的 无药对照孔和仅加培养液的调零孔。于37°C、 5%C02、 95%湿度培养72h。每孔 加5mg/mlMTT液20iU，继续培养4h。吸弃上清液，每孔加DMS0150 u 1，震荡 仪震荡10min，用酶标仪检测595nm波长0D值，每三个复孔取其平均值。根据 0D值计算细胞抑制率，计算公式细胞抑制率=(1-实验组0D值/对照组0D值) X100%。根据每种药物不同浓度抑制率，利用SPSS15.0软件Regression中的 Probit过程计算该药半数抑制浓度(IC50)，从而计算每种药物的耐药指数RI， RP耐药细胞IC50/亲代细胞IC50，比较耐药细胞和亲代细胞的差异。分析表明， SiHa/VP16细胞对VP16的耐药指数(RI)为24.019，属高度耐药，除对VP16耐 药外，对MTX中度耐药，对DDP、 VCR、 5-Fu、 D0X呈低度耐药，对TAX、醒C无 耐药性。详细数据如表1所示。化疗药物IC50(SiHa) (li g/ml)IC50(SiHa/VP16) (w g/ml)RI
依托泊苷(VP16)6. 358152.71224.019
顺钼(cDDP)1. 8925.4322.871
紫杉醇(TAX)0.0110.0111.000
长春新碱(VCR)0. 0230.0672. 913
5-氟尿嘧啶(5-Fu)1. 7168. 1234. 734
氨甲喋呤(MTX)0. 4943. 5957. 277
多柔比星(D0X)0.0670. 3234. 821
丝裂霉素c(羅c)0. 0890. 0830.933
表l
保藏该生物材料样品的单位中国典型培养物保藏中心 地址湖北省武汉市武昌珞珈山
培养物名称人宫颈癌多药耐药细胞株SiHa/VP16 保藏日期2009年1月20日 保藏编号CCTCC一C200904
权利要求
1. 一种宫颈癌多药耐药细胞株，其特征在于细胞株命名为SiHa/VP16，系利用化疗药物依托泊苷(VP16)诱导人宫颈癌SiHa细胞株建立，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC—C200904。
2. 根据权利要求1所述的一种宫颈癌多药耐药细胞株，其特征在于宫颈癌多药 耐药细胞株按以下步骤建立(1)人宫颈癌SiHa细胞株，复苏后用画EM培养 液(含10%小牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100ug/ml)于37。C、 50线、95% 湿度条件下培养；(2)取对数生长期SiHa细胞，换新鲜培养液，加入VP16，使 其作用浓度为0. 1 u g/ml，在37°C、 5%C02、 95%湿度条件下继续培养，适时换液， 维持O.lUg/ml药物浓度直至存活细胞能在此浓度稳定生长、传代；(3)适当 增加VP16的作用浓度，在37'C、 5%C02、 95%湿度条件下继续培养，适时换液， 维持药物浓度直至存活细胞能在此浓度稳定生长、传代；(4)重复步骤(3)直 到获得能在4 " g/mlVP16中稳定生长、传代及复苏的SiHa/VP16细胞株。
3. 根据权利要求1和2所述的一种宫颈癌多药耐药细胞株，其特征在于步骤(3) 每次增加的VP16浓度为0. 5 2 u g/ml。
4. 根据权利要求1和2所述的一种宫颈癌多药耐药细胞株，其特征在于该细胞 株对VP16的耐药指数(RI)为24. 019，除对VP16耐药外，对MTX、 cDDP、 VCR、 5-Fu、 DOX有交叉耐药。
5. 权利要求1、 2、 3和4所述的一种宫颈癌多药耐药细胞株SiHa/VP16在肿瘤 研究中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种宫颈癌多药耐药细胞株，特征是选择人宫颈癌SiHa细胞株作为亲代细胞，从0.1μg/ml逐步增加化疗药物依托泊苷(VP16)的作用浓度至4μg/ml，建立SiHa/VP16耐药细胞株。SiHa/VP16细胞能在4μg/mlVP16中稳定生长、传代及复苏，对VP16的耐药指数(RI)为24.019，除对VP16耐药外，对MTX、cDDP、VCR、5-Fu、DOX有交叉耐药。本发明目的是为肿瘤相关研究提供耐药肿瘤细胞模型。
文档编号C12N5/08GK101503673SQ20091005826
公开日2009年8月12日 申请日期2009年2月2日 优先权日2009年2月2日
发明者刘珊玲, 和 王, 陈新莲 申请人:四川大学华西第二医院