专利名称：常用广谱肿瘤化疗药物疗效检测的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本发明涉及一种检测个体常用广 谱肿瘤化疗药物疗效的试剂盒，通过检测常用广谱肿瘤化疗药物用药靶向位点CYP3A4基 因和CYP2C9基因多态性位点来评估个体常用广谱肿瘤化疗药物疗效。
背景技术：
肿瘤是机体在各种致瘤因素作用下，局部组织的细胞在基因水平上失去对其生长 的调控，导致克隆性异常增生而形成的新生物。肿瘤被人类发现已有3000多年历史，一般 分为良性肿瘤和恶性肿瘤两大类，通常所讲的“癌症”指的是所有的恶性肿瘤。目前调查研究显示，肿瘤已成为常见病，多发病，其中恶性肿瘤是目前危害人类健 康最严重的一类疾病。我国最为常见和危害性最严重的肿瘤为肺癌、肝癌、大肠癌、食管癌、 胃癌、乳腺癌和白血病等。在肿瘤的治疗中，化疗占有十分重要的地位，是手术后辅助治疗的必要手段。然而 各种抗肿瘤药物因具有细胞杀伤能力而潜藏着严重的药物毒副作用，且因人而异的发挥着 难以预测的治疗作用。因此，随着人们对药动学、药效学和药物基因组学的深入了解和把 握，使得通过更加灵敏、有效的基因检测手段来预测药物疗效和规避不良反应成为可能。抗肿瘤类药物，如紫杉醇、多烯紫杉醇、长春新碱等主要就是通过CYP3A4，5代谢 清除，而环磷酰胺和异环磷酰胺则要通过CYP3A4，5代谢转化为具有抗肿瘤活性物后发挥 治疗作用。因此，CYP3A4，5基因多态性导致的酶活性改变将直接影响抗肿瘤类药物的用药 效果，CYP3A4，5基因的分型检测对于临床广谱抗癌药用药指导有重要意义。CYP3A4*18是目前已确定的CYP3A4 SNP中等位基因突变率最高的位点，为外显子 10上T878C突变，引起第293位亮氨酸(L)被脯氨酸(P)所取代。L293氨基酸残基被包裹 在CYP3A4蛋白质的里面。由于L293P非组成性突变，影响了 CYP3A4蛋白的构成，底物结合 能力和酶催化活性。Gotoh(1992)证明了哺乳动物CYP450存在6种底物识别位点。根据这 一结论，L293P就位于第4种底物识别位点，而这种位点在不同动物中是高度保守的，并与 底物特异性相关。目前对CYP3A4*18等位基因对该酶活性的影响存在着不同的意见。有研 究认为该等位基因可能会提高CYP3A4酶活性，比如CYP3A4*18增加了对睾酮、氯螨硫磷的 催化活性；也有研究认为该等位基因降低了 CYP3A4酶活性。这种相互矛盾的结果可能与作 用底物，及试验设计有关，因此有必要研究该位点对特定药物的影响。肝、肠、食道、胃、胆囊、胆管、胰腺、肺、气管、鼻黏膜、肾、肾上腺、甲状旁腺、前列 腺、乳腺、卵巢、脑、垂体前叶等组织均有CYP3A5表达，提示它在这些组织中具有重要的生 理功能。CYP3A5曾经一度被认为是缺乏功能意义的假基因，但是近年来逐渐成为新的研 究热点，已发现的等位基因有多种，包括CYP3A5*1A、CYP3A5*1B、CYP3A5*1C、CYP3A5*2、 CYP3A5*3A、CYP3A5*3B、CYP3A5*3C、CYP3A5*4、CYP3A5*5、CYP3A5*6、CYP3A5*7。CYP3A5 的表 达在人群中呈多态分布，它的功能仅在10 20%的白人，33%的东方人和55%的美国黑人 中存在，这主要是因为CYP3A5*3突变导致了不适当的mRNA剪接，使终止密码子提前，导致CYP3A5缺乏。CYP3A5*3等位基因的发生频率的变化范围由50% (美国黑人)到90% (白 人)。CYP3A5*3/*3纯合子的肝微粒体表达CYP3A5的水平很低，表现为咪达唑伦的代谢活 性降低。CYP3A5*3/*3纯合子个体CYP3A5活性低于CYP3A5*3/*1杂合子，而CYP3A5*1/*1 纯合子活性最高，表现出明显的基因剂量效应。CYP3A5*5、CYP3A5*6、CYP3A5*7也可形成可 变剪切，从而导致编码的提前结束或外显子的丢失。迄今已在CYP2C9基因的编码区和非编码区发现多个等位基因多态性或突变，其 中编码区的11种单核苷酸多态性(SNP)，依次被编为*2 *12号，*1定义为无突变的野生 型。研究较多主要是CYP2C9*2 *6五种多态性，而针对另外的CYP2C9*7 *12开展的工 作很少。除此之外，在基因的非编码区也发现多个SNP，如内含子2上的两个SNP和5’端调 控区域的7个SNP等。它们能通过改变CYP2C9基因转录水平而影响酶活性。上述突变的 发生频率具种族差异。CYP2C9底物的体内代谢与其基因型相关。在日本人和英国人中发现CYP2C9*3的 杂合子病人所需华法令的平均剂量为*1野生型的60%，而*3的合子病人的剂量仅为*1野 生型的10%，即正常人的剂量为4 8mg/d，而CYP2C9*3纯合子仅需0. 4mg/d。CYP2C9*2同 样存在类似现象，杂合子和突变纯合子分别降低15 20%和40%。而且，携带CYP2C9*2和 *3的病人应用华法令时发生出血并发症等不良反应和INR比值增高(> 4. 0)的概率显著 高于正常人。在土耳其人和日本人中发现*2和*3杂合子个体服用苯妥因后12小时血药 浓度比正常人高30%，而有*3纯合子个体的苯妥因体内口服清除率降低79%。CYP2C9*3 纯合子个体对甲苯磺丁脲和格列吡嗪的体内口服清除率较正常人低80%，或者其半衰期延 长3 4倍。最近的研究表明，氟伐他汀在不同基因型的个体中有明显的药代学差异，而在 药效学上无显著差别。在白种人中研究发现，洛沙坦的药代学和药效学均无基因型的显著 差异，而在日本人中的研究却表明有显著的基因剂量效应。由此可见，CYP2C9基因型对不 同药物的影响有不同，而且存在种族差异性。
发明内容
基于常用广谱肿瘤化疗药物用药靶向位点CYP3A4基因和CYP2C9基因多态性可用 来评估个体常用广谱肿瘤化疗药物疗效的基础上，本发明提供一种检测个体常用广谱肿瘤 化疗药物疗效的试剂盒。该试剂盒包括检测常用广谱肿瘤化疗药物用药靶向位点CYP3A4基因和CYP2C9基因多态性位点 的特异性引物对及特异性荧光探针对；荧光定量PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反应缓冲液、去离 子水等)。本试剂盒中所述的特异性荧光探针对是能够轻易完成设计的，特异性荧光探针对 可用常规的探针合成技术进行合成。本发明试剂盒的组分和含量包括IOX荧光定量PCR反应缓冲液2 μ 1，25mM dNTP 混合液 0. 2 μ 1，25mM MgC12 溶液 1. 2μ 1，
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5units/ μ 1 Taq DNA 聚合酶 0. 05 μ 1，20 μ M特异性引物对每条引物各0. 225 μ 1，
10 μ M特异性荧光探针对每条探针各0. 25 μ 1，去离子水 10. 65 μ 1。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验 方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。实施例检测试剂盒的使用步骤1:DNA模板的抽取用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。步骤2 荧光定量PCR反应使用检测试剂盒中的荧光定量PCR套装，进行2次独立的荧光定量PCR反应，每个 反应的体系为总体积10 μ 1，包含浓度为20ng/μ 1的DNA模板2 μ 1、1 μ 1 IOX荧光定量PCR 反应缓冲液、0. 1 μ 1 25mM dNTP 混合液、0. 6 μ 1 25mM MgCl2 溶液、0. 025 μ 1 (5units/ μ 1) Taq DNA聚合酶、20 μ M的有义引物和反义引物各0. 225 μ 1、10 μ M的带VIC荧光探针和带 FAM荧光探针各0. 25 μ 1，去离子水5. 325 μ 1。在PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50°C、2分钟，95°C、10分钟，进行60个循环 的95°C、30秒，60°C、1分钟。反应结束后在荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。步骤4:基因型分析根据试剂盒使用说明书标示的基因分型图示对SNP位点进行基因型分析。熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示 的最终样品荧光量，根据不同序列探针荧光信号的强弱即可确定所检测的SNP位点的基因 型。
权利要求
一种检测个体常用广谱肿瘤化疗药物疗效的试剂盒，其特征在于包括检测常用广谱肿瘤化疗药物用药靶向位点CYP3A4基因和CYP2C9基因多态性位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括 IOX荧光定量PCR反应缓冲液2 μ 1，；25mM dNTP 混合液 0. 2 μ 1，；25mM MgCl2 溶液 1. 2 μ 1，；5units/ μ 1 Taq DNA 聚合酶 0. 05 μ 1，；20 μ M特异性引物对每条引物各0. 225 μ 1，；10 μ M特异性荧光探针对每条探针各0. 25 μ 1，去离子水10. 65 μ I0本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C。
全文摘要
本发明公开了一种检测个体常用广谱肿瘤化疗药物疗效的试剂盒。该试剂盒包括检测常用广谱肿瘤化疗药物用药靶向位点CYP3A4基因和CYP2C9基因多态性位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、荧光定量PCR常规组件等。本发明的试剂盒通过检测常用广谱肿瘤化疗药物用药靶向位点CYP3A4基因和CYP2C9基因多态性位点来评估个体常用广谱肿瘤化疗药物疗效。
文档编号C12Q1/68GK101928753SQ20091005394
公开日2010年12月29日 申请日期2009年6月26日 优先权日2009年6月26日
发明者冯哲民, 邹祖烨 申请人:上海主健生物工程有限公司