专利名称：布氏锥虫亮氨酰tRNA合成酶活性蛋白的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物技术领域的活性蛋白的制备方法，具体是一种布氏锥虫亮氨 酰tRNA合成酶活性蛋白的制备方法。
背景技术：
热带寄生虫病是全球危害人类健康的重要疾病之一，它已经影响了世 界范围内数亿人口，造成了大量的死亡，产生了严重的社会后果。非洲睡眠病 (Africantrypanosomiasis)，也被称之为昏睡病，是因为致病性寄生虫锥虫入侵中央神经 系统后所引起的昏睡而得名的。到目前为止，已上市的用于治疗非洲人类锥虫病的四种药 物都存在着一些缺陷，药物毒性、缺乏胃肠外管理和有保障的供应以及出现的抗药性等都 是需要解决的问题。近年来，随着生物化学的大力发展，以及锥虫基因组序列的陆续破解，为我们寻找 新的药物作用靶点提供了很好的基础。最近，氨酰tRNA合成酶(AARS)便成为研究者们开 发该类药物的重点。通过抑制AARS的活力，可以抑制某些病原菌的蛋白质生物合成而抑制 病原菌的生长，为人类设计新型药物提供新思路。已上市的莫匹罗星(商品名Bactroban) 就是AARS抑制剂临床应用的一个重要实例。此外，人类许多疾病的发生与蛋白质生物合成 精确性的失控有关。因此，研究AARS不仅具有重要的生物学意义，而且随着研究的深入还 可以应用于人类疾病的防治，服务于人类的健康和改善人类生存环境。本发明主要是用基 因工程的方法，构建布氏锥虫(Trypanosoma brucei)亮氨酸tRNA合成酶(LeuRS)的重组 质粒，表达纯化出布氏锥虫亮氨酸tRNA合成酶蛋白，可以广泛的作为药物作用的靶标，从 而为抗寄生虫药物的筛选奠定了基础。经对现有技术的文献检索发现，孟宪芳、施静、刘晓春等在《中国病理生理杂志》 2005年21卷第12期2407-2409页发表了题为《人类组氨酰tRNA合成酶类似物的原核表 达及其多克隆抗体的制备》一文，文章中给出了表达纯化人类组氨酰tRNA合成酶类似物的 方法，但是该方法对布氏锥虫亮氨酰tRNA合成酶的表达效率较低。
发明内容
本发明的主要目的在于克服现有技术的不足，提供一种布氏锥虫亮氨酰tRNA合 成酶活性蛋白的制备方法。本发明所得的亮氨酰tRNA合成酶可以作为药物筛选的靶标，广 泛的应用于药物筛选领域。本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括如下步骤步骤一，设计特异引物，扩增布氏锥虫全基因组；步骤二，切胶回收，得到布氏锥虫亮氨酰tRNA合成酶基因；步骤三，将步骤二得到的基因连接到克隆载体中，构建基因克隆质粒；步骤四，将克隆质粒亚克隆进表达载体，鉴定，转化大肠杆菌，培养转化的大肠杆 菌单克隆，诱导；
步骤五，纯化表达的融合蛋白，得到布氏锥虫亮氨酰tRNA合成酶活性蛋白。步骤一中，所述特异性引物为，GGCTGGCATATGTCGACTGTACGAC, TTCGGATCCGCTGCCTTCTTGTC。步骤四中，所述培养具体为，将转化的大肠杆菌单克隆接种到含氨卞青霉素 100μ g/ml的LB培养基中，37°C过夜培养，之后将培养的菌液按体积分数为1%。的接种量接 种到含氨卞青霉素的LB培养基的培养瓶中，培养至A55tlOD为0. 6-0. 8时停止培养，冰上冷 却。步骤四中，所述诱导具体为向冷却后的菌液中加IPTG至其终浓度为0.2mM， 20 °C _25°C 过夜。本发明通过以下步骤得到布氏锥虫亮氨酰tRNA合成酶活性蛋白PCR扩增布氏锥 虫全基因组；得到布氏锥虫亮氨酰tRNA合成酶基因片段；构建基因克隆质粒；亚克隆进表 达载体，鉴定，转化大肠杆菌，培养；最后纯化表达的融合蛋白。本发明具有如下的有益效果本发明所得的布氏锥虫亮氨酰tRNA合成酶可以作 为抗锥虫药物体外筛选的靶标，广泛的应用于抗锥虫药物筛选与抗锥虫作用机制研究领 域。本发明中所涉及的菌株大肠杆菌DH5ci已在《汪玲玲，杨辑，黄诚之，王海洪；大 肠杆菌holo-ACP的过表达、分离纯化及长链脂酰ACP的合成，微生物学报，2008，48 (7) 963-969》文献中公开。本发明涉及的菌株可通过公开市售的商业渠道取得，如上海天根生 物公司，公司地址上海市漕溪路258弄27号航星商务楼1号楼606室。本发明涉及的大肠杆菌BL21 (DE3)RIPL已在《张美祥，张小梅，范三红，罗龙海， 闫晓华，郭蔼光；拟南芥Alpha-dioxygenase 2原核表达、纯化及亚细胞定位预测，农业 生物技术学报，2007，15(5) :816-820》可通过公开示售的商业渠道取得，如可以从美国 stratagene公司购得，菌株编号为B0003。
图1为LeuRS的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；图2为重组质粒pET21a_LeuRS的构建图；图 3 为重组菌 BL21 (DE3) RIPL-pET2Ia-LeuRS 的 IPTG 诱导表达图谱；图4为融合蛋白诱导后经His-Tag亲和层析柱纯化后的图谱。
具体实施例方式下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解为这些实施例仅用于说明本发 明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规 条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册见New York ColdSpring Harbor Laboratory 出版社1989年版中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。步骤一，布氏锥虫亮氨酰tRNA合成酶基因的获得(1)取布氏锥虫的基因组cDNA 20 μ g作为模板，扩增用的引物为是PAGE纯化的上 下游两条引物，其中，引物 1 序列GGCTGGCATATGTCGACTGTACGAC ；
引物 2 序列TTCGGATCCGCTGCCTTCTTGTC。用KODdash(TOYOBO)聚合酶进行PCR反应，聚合酶链式反应时先分别将反应液 a (组份见表1)和反应液b (组份见表2)混勻。表 权利要求
一种布氏锥虫亮氨酰tRNA合成酶活性蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤步骤一，设计特异引物，扩增布氏锥虫全基因组；步骤二，切胶回收，得到布氏锥虫亮氨酰tRNA合成酶基因；步骤三，将步骤二得到的基因连接到克隆载体中，构建基因克隆质粒；步骤四，将克隆质粒亚克隆进表达载体，鉴定，转化大肠杆菌，培养转化的大肠杆菌单克隆，诱导；步骤五，纯化表达的融合蛋白，得到布氏锥虫亮氨酰tRNA合成酶活性蛋白。
2.根据权利要求1所述的布氏锥虫亮氨酰tRNA合成酶活性蛋白的制备方法，其特征 是，步骤一中，所述特异性引物为，GGCTGGCATATGTCGACTGTACGAC，TTCGGATCCGCTGCCTTCTTGTC。
3.根据权利要求1所述的布氏锥虫亮氨酰tRNA合成酶活性蛋白的制备方法，其特征 是，步骤四中，所述培养具体为，将转化的大肠杆菌单克隆接种到含氨卞青霉素100 μ g/ml 的LB培养基中，37°C过夜培养，之后将培养的菌液按体积分数为1%。的接种量接种到含氨 卞青霉素的LB培养基的培养瓶中，培养至A55tlOD为0. 6-0. 8时停止培养，冰上冷却。
4.根据权利要求1所述的布氏锥虫亮氨酰tRNA合成酶活性蛋白的制备方法，其特征 是，步骤四中，所述诱导具体为向冷却后的菌液中加IPTG至其终浓度为0. 2mM,20°C -25°C 过夜。
全文摘要
一种生物技术领域的布氏锥虫亮氨酰tRNA合成酶活性蛋白的制备方法，步骤包括设计特异引物，扩增布氏锥虫全基因组；切胶回收，得到布氏锥虫亮氨酰tRNA合成酶基因；将步骤二得到的基因连接到克隆载体中，构建基因克隆质粒；将克隆质粒亚克隆进表达载体，鉴定，转化大肠杆菌，培养转化的大肠杆菌单克隆，诱导；纯化表达的融合蛋白，得到布氏锥虫亮氨酰tRNA合成酶活性蛋白。本发明所得的亮氨酰tRNA合成酶可以作为药物筛选的靶标，广泛的应用于药物筛选领域。
文档编号C12R1/19GK101935638SQ20091004824
公开日2011年1月5日 申请日期2009年3月26日 优先权日2009年3月26日
发明者周虎臣, 姚璎, 李大伟 申请人:上海交通大学