专利名称：一种荧光实时定量pcr检测香港海鸥型菌的试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及淡水鱼肠道中的病原菌的检测试剂盒及检测方法，具体涉及一种
荧光实时定量PCR检测香港海鸥型菌的试剂盒及检测方法。
背景技术：
香港海鸥型菌属原核细菌(Proteobacteria) P亚纲，奈瑟氏球菌科 (Neisseriaceae)，学名为香港海区鸟型菌(Laribacter. hongkongensis)，有关该菌的报 道最先发表于2001年，由港大医学院微生物学系袁国勇教授和胡钊逸副教授等 在一名因高烧和呼吸短促入院的肝硬化病人的血液和胸腔浓汁中首先分离得到。 经过一系列生物化学分析和分子生物学检测表明该菌表型特征和基因型特征与 目前所有己知细菌均存在差异，属新发现细菌菌属，最初将之命名为HKU1。随 着对该菌的进一步研究深入，又相继在多名香港腹泄病人的粪便中分离到该菌的 不同菌株，加之其形态上的特殊性而被命名为香港海鸥型菌。
相关研究表明香港海鸥型菌只存在淡水鱼中，在其它肉类食品未被发现有该 菌的存在。约有25%的淡水鱼中存在香港海鸥型菌，其中含该菌最多的是草鱼和 鳙鱼。怀疑人是由于食入未经煮熟的鱼肉或是被交叉污染的食物而被感染，导致 可以在血液或粪便中被分离出来。目前该菌在香港、中国内地、日本、瑞士、非 洲及中美洲相继被发现，显示病菌己于全球广泛存在。随着各大传播媒体的报道， 香港海鸥型菌的发现及研究现状引起人们极大的关注，有关人士认为该菌是水产
品质量安全出现的新情况新问题，需要引起重视，对其进行密切监控成为当前一 大主要工作。我省作为水产品出口大省，缺少该菌相关基础性数据，在水产品贸 易中处于极其不利的地位。目前，关于香港海鸥型菌的检测方法还不成熟，方法
不统一，也给监管带来一定的困难，因此，研究该菌的检测方法及时提供快速的 检测方法，提高水产品质量安全性。
实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，是 指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程， 而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。
实时荧光定量PCR的化学原理包括探针类和非探针类两种，本试剂盒是属 于非探针类，即是利用荧光染料SYBR Greenl来指示扩增的增加，如SYBR Green I 。 SYBR Green I是一种特异结合双链DNA的染料，结合双链DNA后荧 光增强1000倍左右，且对DNA双链结构具有稳定作用，适合于检测PCR扩增 产物，能对PCR扩增产物进行连续的监测。由于SYBR Green I能结合于所有双 链，因而不能特异性地检测某一特定模板，但通过温度的变化对扩增产物解链温 度(Tm)的分析。通过扩增产物Tm值的不同，表现在熔解曲线上出现多个峰来区 别不同的扩增产物。通常有引物二聚体的熔解曲线在68'C 75'C间会有小波峰出 现。
普通的PCR技术需要进行凝胶电胶，非常麻烦，而且使用的试剂大部分属于 致癌性物质。实时荧光定量PCR技术则不需要进行凝胶电胶，非常迅速、准确， 检测的灵敏度和特异性都远高于普通的PCR，所需时间也已达到临床要求，这 对于难于培养的病毒(乙肝)，细菌(如结核、厌氧菌)和原虫(如梅毒螺旋体)等来说 尤为适用。该技术现已应用于分子生物学、生物工程、医学、法医学和农学等领 域，检测范围包括细菌、病毒(SARS及禽流感病毒H5N1等)、原虫及寄生虫、 霉菌、立克次体、衣原体和支原体等一切微生物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种荧光实时定量PCR检测香港海鸥型菌的试剂
本发明的目的还在于提供利用上述荧光实时定量PCR试剂盒检测香港海鸥 型菌的方法。
为达到本发明的第一个目的，本发明提供的荧光实时定量PCR检测香港海 区鸟型菌的试剂盒，含有以下分离包装的试剂
(1) 裂解液，内含质量浓度为10%的CTAB溶液，质量浓度4.1%的NaCl溶 液和质量浓度0.1~0.5%的SDS;
(2) 蛋白酶K，内含lmg/mL蛋白酶K;
(3) 抽提液，内含酚、氯仿和异戊醇，所述酚氯仿异戊醇的体积比为25 :24 : 1;(4) TE缓冲液，内含0.1 0.5mol/LTris-HCl(pH7.0)缓冲液，50mmol/LEDTA;
(5) 荧光PCR反应液，内含1 2Uhot start Taq酶、3~5.5mmol/L的Mg2+、 100~200pmol/L dNTPs、 1 XPCR buffer、 1 X SYBR Green I solution、 100~300nmol/L 的上下游引物；
上游弓I物序列为TACCGCATACGCCCTGAG; 下游弓I物序列为TTCGCCATTGGTGTTCCT;
(6) ROX染料；
(7) 阳性对照液，内含香港海鸥菌总DNA;
(8) 阴性对照液，内含无菌水。 在上述试剂中
所述的荧光PCR反应液中IX PCR buffer含有0.2~0.3mmol/L KCL、 0.01-0.1腿ol/L Tris-HCl和0.01-0.05 mmol/L的MgCl2。
所述的阳性对照液中香港海鸥菌的总DNA含量不低于500ng。
本发明的原理是目前认识到的香港海鸥型菌有不同的种，但其16sRNA具 有保守性，可作为检测的依据，根据该菌的16sRNA保守片段设计引物，用实时 荧光定量PCR技术在生物体外对该菌特有片段进行扩增，实时观察PCR产物荧 光值，并在最后进行熔解曲线分析，确定所扩增的特异性片断，以此达到对香港 海鸥型菌定性鉴定的要求。
其中，裂解液主要是提供细菌细胞壁破裂的环境减少杂质的产生；蛋白酶K 是为了去除细菌细胞裂解之后溶液中的蛋白质；抽提液中的酚类和氯仿可使蛋白 质变性并有助于液相与有机相的分离而让核酸溶解于水相中，而异戊醇则有助于 消除抽提过程中出现的气泡；TE缓冲液是用于保存提取获得的DNA提取液一 个稳定的pH值体系，保持DNA的活性不受损害。
荧光PCR反应液中的hot start Taq酶是在第一步升高温度之前封闭酶的活 性，而且起到DNA链延伸的作用；dNTP是新DNA合成需要的碱基；含Mg2+ 的缓冲液主要是提供PCR反应缓冲体系及所需要的离子强度；SYBR Green I是 荧光染料来指示扩增的增加；ROX染料用于消除信号本底以及校正孔与孔之间 产生的信号误差。
阳性对照液具有海鸥菌的总DNA浓度达500ng以上，加入到上述Axygen 8
6联PCR管后可直接在荧光PCR仪进行反应。
阴性对照液只含有无菌水，同样可直接加入到上述Axygen 8联PCR管后可 直接在荧光PCR仪进行反应。
为达到本发明的第二个目的，本发明提供的利用上述荧光实时定量PCR试
剂盒检测香港海鸥型菌的方法，包括以下步骤
a) 样品预处理取样品，按样品与无菌水的重量体积比为0.125~0.5 : 1加入 无菌水，充分震荡悬浮，经离心处理后，弃去上清液；
b) 在步骤(l)所得沉淀物中加入0.5~1.5mL的裂解液，震荡使沉淀物彻底悬
浮；
c) 在步骤(2)所得悬浮液中加入50~100pl的蛋白酶K溶液，混匀，放置5min 后，在7(TC放置30 50min至溶液变澄清；
d) 在步骤(3)所得澄清液中加入等体积的按体积比为25 : 24 : 1配制的酚、 氯仿和异戊醇的混合溶液进行抽提，5000卬m离心10min，得上清液；
e) 取步骤(4)所得上清液，加入等体积的异丙醇，振荡充分混合，室温下放 置10min， 12000rpm离心5min，弃去上清液；
f) 在步骤(5)所得沉淀物中加入0.5ml70。/o的乙醇，振荡30s， 12000rpm离心 5min，弃去上清液，室温干燥5min，加入20~5(^1 TE缓冲液漩涡振荡，得样品 PCR模板；
g) 荧光PCR反应
依次取荧光PCR反应液，样品PCR模板，阳性对照液，阴性对照液，0~lpl 的ROX内参染料，加入到PCR反应管中，将反应管置于荧光PCR仪上，按下 列条件进行扩增反应94。C3 5min预变性一94。C，30 50s—54。C,50s—72。C,lmin 20S (检测荧光值)一第二步至第四步35~40个循环一60。C,15s—以O.l'C/s的速 率升温，直到95'C，整个过程进行连续采集荧光一95'C，15s;
在步骤g)的荧光PCR反应中
对于荧光实时定量PCR型号为ABI5700， 7500,700， 7300， 7700， 7900HT， StepOneTM, StepOnePlusTM， Stratagene Mx3000P ， Mx3005PTM， Mx4000 时，需加入lplROX的内参染料。
对于荧光实时定量PCR型号为Rotor-Gene2+， DNA Engine OpticonTM，Opticon 2， Chrom4TM Real-Time Detector, Mastercycler ep realplex， Smart Cycler , Roche Light 480， Bio-Rad CFX96时，则不需要加入ROX内参染料。 h)结果及判断
阴性对照无扩增曲线，Ct值》40;熔解曲线无单一峰；
阳性对照出现典型的"S"扩增，Ct值〈19;熔解曲线在85 9(TC间有相应的
单一峰；
样品结果若样品Ct值^40，且熔解曲线无单一峰，即可判断样品为阴性，
可直接报告出未检测出香港海鸥形菌；若样品Ct值^30，且熔解曲线在85 9(TC 间有相应的单一峰，可判断样品为阳性；若样品Ct值〉30，而<40，则重做样品， 重做结果若是Ct值^40，熔解曲线无单一峰，则样品为阴性，否则为阳性。
其中，步骤a)的样品预处理的具体过程为取样品0.5~2g置于灭菌的 Eppendorf管中，加入4ml无菌水，充分震荡悬浮，4000rpm离心5min，取上 清液3.5mL转入无菌Eppendorf管中，6000rpm离心5min，取上清液3mL到无 菌Eppendorf管中12000rpm离心5 min，弃去上清液。
本发明的优点本发明公开的检测试剂盒包含了目标菌的特殊引物、反应稳 定剂和荧光PCR反应的所有必需其它特定最适浓度的试剂成分，使用者只需将 样品总基因提取液加入便可进行荧光PCR反应，然后进行熔解曲线分析，即可 知道结果，这样简化了实验步骤，提高检测限的目的，为检测部门及科研单位相 关研究提高便利。
图la和图lb是荧光实时定量PCR检测香港海鸥型菌的检测结果； 图2a和图2b是荧光实时定量PCR检测罗非鱼鱼肠道样品中香港海鸥型菌 检测的结果；
图3a和图3b是荧光实时定量PCR检测桂花鱼鱼肠道样品中香港海鸥型菌 检测的结果；
图4a和图4b是荧光实时定量PCR检测草鱼鱼肠道样品中香港海鸥型菌的 检测结果。
具体实施例
以下实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以下实施例。所述技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容和各参数所取范
围，均可实现本发明的目的。
实施例l
本实施例提供的荧光实时定量PCR检测香港海鸥型菌的试剂盒，含有以下
分离包装的试剂
(1) 裂解液1瓶，内含质量浓度为10%的CTAB溶液，质量浓度4.P/。的NaCl 溶液和质量浓度0.1~0.5%的SDS;
(2) 蛋白酶K1瓶，内含lmg/mL蛋白酶K;
(3) 抽提液1瓶，内含酚、氯仿和异戊醇，所述酚氯仿异戊醇的体积比 为25 : 24 : 1;
(4) TE缓冲液1瓶，内含O.l~0.5mol/L Tris-HCl (pH7.0)缓冲液，50mmol/L EDTA;
(5) 荧光PCR反应液1管，内含l~2Uhot start Taq酶、3 5.5mmol/L的Mg2+、 100~200nmol/L dNTPs、 1 X PCR buffer、 1 X SYBR Green I solution、 100~300nmol/L 的上下游引物，lxPCR buffer中含有0.2~0.3mmol/L KCL、 0.01~0.1mmol/L Tris-HCl和0.01-0.05 mmol/L的MgCl2，无菌去离子水补足，反应总体积通常为 20~50ul;
上游引物序列为TACCGCATACGCCCTGAG; 下游引物序列为TTCGCCATTGGTGTTCCT;
(6) ROX染料1管；
(7) 阳性对照液1管，内含较高浓度的香港海鸥菌总DNA，香港海鸥菌的 总DNA含量不低于500ng;
(8) 阴性对照液1管，内含无菌水。 将以上试剂置于盒体中，即构成整体式试剂盒。
本实施例利用上述荧光实时定量PCR试剂盒检测罗非鱼肠道中香港海鸥型 菌的方法，包括以下步骤
a)将罗非鱼处死后，置于解剖盘上，用75%酒精棉球消毒体表，用手术刀 及剪刀配合将鱼肠完整取出，小心处理避免肠道破裂，导致肠道内含物遗漏造成 污染，用摄子去除附着在肠上的脂肪，无菌条件下解剖取2g样品于经灭菌5mLEppendorf管，用剪刀将管中组织剪至均匀，加入4mL无菌水，充分振荡悬浮， 于离心机4000rpm离心5min，取上清液3.5mL转入无菌的5mL Eppendorf管中， 6000rpm离心5min，取上清液3mL到无菌的5mL Eppendorf管中离心12000rpm 离心5min，尽量吸净上清液；
b) 在沉淀物中加入0.5 1.5mL裂解液，振荡沉淀物使其彻底悬浮；
c) 加入50 100pl的蛋白酶K溶液，混匀，放置5min， 70。C放置30~50min 至溶液变澄清；
d) 加入等体积的按体积比为25 : 24 : l配制的酚氯仿异戊醇的混合溶液 抽提，5000rpm离心10min;
e) 取上清液到1.5mL Eppendorf管中，加入1倍体积的异丙醇，振荡充分混 合，室温下放置10min，以12000rpm的速度离心5min，弃去上清液；
f) 加入0.5ml 70%乙醇，振荡30s， 12000rpm离心5min，吸去上清液，室 温干燥5min，加入TE缓冲液漩涡振荡，得样品PCR模板；
g) 荧光实时定量PCR反应
将荧光PCR反应液加入到Axygen 8联PCR管(管数等于样品数n加上阴 阳性对照数)再分别取模板、阳性对照液和阴性对照液，将已加样的反应管置于 荧光PCR仪上，按下述条件扩增
荧光PCR反应程序一熔解反应程序
依次取荧光PCR反应液，样品PCR模板，阳性对照液，阴性对照液，0~lpl 的ROX内参染料，加入到PCR反应管中，将反应管置于荧光PCR仪上，按下 列条件进行扩增反应94°C3~5min预变性一94°C，30~50s—54。C，50s—72。C,lmin 20S (检测荧光值)一第二步至第四步35 40个循环—6(TC，15s—以0.rC/s的速 率升温，直到95'C，整个过程进行连续采集荧光一95'C,15s;
其中，荧光实时定量PCR型号为ABI5700， 7500, 700， 7300， 7700， 7900HT， StepOneTM, StepOnePlusTM， Stratagene Mx3000P ， Mx3005PTM， Mx4000
时，需要加入l^llROX内参染料；
荧光实时定量PCR型号Rotor-Gene2+， DNA Engine OpticonTM， Opticon 2， Chrom4TM Real-Time Detector,Mastercycler⑧ep realplex， Smart Cycler , Roche Light 480， Bio-Rad CFX96则不需要加入ROX内参染料；
10h)结果及判断
阴性对照无扩增曲线，Ct值^40;熔解曲线无单一峰；
阳性对照出现典型的"S"扩增，Ct值〈19;熔解曲线在85 9(TC间有相应的
单一峰；
样品Ct值^0，且熔解曲线在85 9(TC间有相应的单一峰，该样品为阳性。 实施例2
本实施例提供的荧光实时定量PCR检测香港海鸥型菌的试剂盒参照实施例1。
本实施例利用上述荧光实时定量PCR试剂盒检测桂花鱼鱼肠道中香港海鸥 型菌的方法，包括以下步骤
a) 将桂花鱼处死后，置于解剖盘上，用75%酒精棉球消毒体表，用手术刀及 剪刀配合将鱼肠完整取出，小心处理避免肠道破裂，导致肠道内含物遗漏造成污 染，用摄子去除附着在肠上的脂肪，无菌条件下解剖取l 2g样品于经灭菌5mL Eppendorf管，用剪刀将管中组织剪至均匀，加入4mL无菌水，充分振荡悬浮， 于离心机4000rpm离心5min，取上清液3.5mL转入无菌的5mL Eppendorf管中， 6000rpm离心5min，取上清液3mL到无菌的5mLEppendorf管中离心12000rpm 离心5min，尽量吸净上清液；
b) 在沉淀物中加入0.5 1.5mL裂解液，振荡沉淀物使其彻底悬浮；
c) 加入50 100nl的蛋白酶K溶液，混匀，放置5min， 70'C放置30~50min 至溶液变澄清；
d) 加入等体积的按体积比为25 : 24 : 1配制的酚氯仿异戊醇的混合溶液 抽提，5000rpm离心10min;
e) 取上清液到1.5mLEppendorf管中，加入等体积的异丙醇，振荡充分混合， 室温下放置10min，以12000rpm的速度离心5min，弃去上清液；
f) 加入0.5ml 70%乙醇，振荡30s， 12000rpm离心5min，吸去上清液，室 温干燥5min，加入20~50^1 TE缓冲液漩涡振荡，得样品PCR模板；
g) 荧光实时定量PCR反应
将荧光PCR反应液加入到Axygen 8联PCR管(管数等于样品数n加上阴 阳性对照数)再分别取模板、阳性对照液和阴性对照液，将已加样的反应管置于荧光PCR仪上，按下述条件扩增
荧光PCR反应程序一熔解反应程序
依次取荧光PCR反应液，样品PCR模板，阳性对照液和阴性对照液加入到 PCR反应管中，选取荧光实时定量PCR型号Rotor-Gene2+， DNA Engine OpticonTM， Opticon 2， Chrom4TM Real-Time Detector,Mastercycler ep realplex， Smart Cycler , Roche Light 480， Bio-Rad CFX96，不需加入ROX内参燃料， 将反应管置于荧光PCR仪上，按下列条件进行扩增反应94'C3 5min预变性一 94。C,30 50s—54。C，50s—72。C，lmin20S (检测荧光值)一第二步至第四步35~40 个循环一6(TC,15s—以0.1°C/s的速率升温，直到95-C，整个过程进行连续采集 荧光一95°C,15s;
h)结果及判断
阴性对照无扩增曲线，Ct值^40;熔解曲线无单一峰；
阳性对照出现典型的"S"扩增，Ct值〈19;熔解曲线在85 90'C间有相应的
单一峰；
样品Ct值240，且熔解曲线无单一峰，该样品为阴性，未检测出香港海鸥形菌。
实施例3
本实施例提供的荧光实时定量PCR检测香港海鸥型菌的试剂盒参照实施例1。
本实施例利用上述荧光实时定量PCR试剂盒检测草鱼鱼肠道中香港海鸥型
菌的方法，包括以下步骤
a) 将草鱼处死后，置于解剖盘上，用75%酒精棉球消毒体表，用手术刀及 剪刀配合将鱼肠完整取出，小心处理避免肠道破裂，导致肠道内含物遗漏造成污 染，用摄子去除附着在肠上的脂肪，无菌条件下解剖取0.5~2g样品于经灭菌5mL Eppendorf管，用剪刀将管中组织剪至均匀，加入4mL无菌水，充分振荡悬浮， 于离心机4000rpm离心5min，取上清液3.5mL转入无菌的5mL Eppendorf管中， 6000rpm离心5min，取上清液3mL到无菌的5mLEppendorf管中离心12000rpm 离心5min，尽量吸净上清液；
b) 在沉淀物中加入0.5 1.5mL裂解液，振荡沉淀物使其彻底悬浮；c) 加入50 100nl的蛋白酶K溶液，混匀，放置5min， 70'C放置30~50min 至溶液变澄清；
d) 加入等体积的按体积比为25 : 24 : 1配制的酚氯仿异戊醇的混合溶液 抽提，5000rpm离心10min;
e) 取上清液到1.5mLEppendorf管中，加入1倍体积的异丙醇，振荡充分混 合，室温下放置10min，以12000rpm的速度离心5min，弃去上清液；
f) 加入0.5ml 70%乙醇，振荡30s， 12000rpm离心5min，吸去上清液，室 温干燥5min，加入20 50^dTE缓冲液漩涡振荡，得样品PCR模板；
g) 荧光实时定量PCR反应
将荧光PCR反应液加入到Axygen 8联PCR管(管数等于样品数n加上阴 阳性对照数)再分别取模板、阳性对照液和阴性对照液，将已加样的反应管置于 荧光PCR仪上，按下述条件扩增
荧光PCR反应程序一熔解反应程序
依次取荧光PCR反应液，样品PCR模板，阳性对照液，阴性对照液，选取 荧光实时定量PCR型号为ABI5700， 7500， 700， 7300， 7700， 7900HT， StepOneTM， StepOnePlusTM， Stratagene Mx3000P ， Mx3005PTM， Mx4000 ，加入l|ilROX 内参染料到PCR反应管中，将反应管置于荧光PCR仪上，按下列条件进行扩增 反应94。C3 5min预变性一94°C，30~50s—54。C,50s—72。C，lmin 20S (检测荧光 值)一第二步至第四步35~40个循环一6(TC，15s—以O.l'C/s的速率升温，直到 95°C，整个过程进行连续采集荧光一95'C,15s;
h) 结果及判断
阴性对照无扩增曲线，Ct值^40;熔解曲线无单一峰；
阳性对照出现典型的"S"扩增，Ct值〈19;熔解曲线在85 9(TC间有相应的
单一峰；
样品Ct值〈30，且熔解曲线在85 90。C间有相应的单一峰，该样品为阳性， 报告检测出香港海鸥形菌。
1权利要求
1、一种荧光实时定量PCR检测香港海鸥型菌的试剂盒，其特征在于，含有以下分离包装的试剂(1)裂解液，内含质量浓度为10％的CTAB溶液，质量浓度4.1％的NaCl溶液和质量浓度0.1～0.5％的SDS；(2)蛋白酶K，内含1mg/mL蛋白酶K；(3)抽提液，内含酚、氯仿和异戊醇，所述酚∶氯仿∶异戊醇的体积比为25∶24∶1；(4)TE缓冲液，内含0.1～0.5mol/LTris-HCl(pH7.0)缓冲液，50mmol/L EDTA；(5)荧光PCR反应液，内含1～2Uhot start Taq酶、3～5.5mmol/L的Mg2+、100～200μmol/L dNTPs、1×PCR buffer、1×SYBR Green I solution、100～300nmol/L的上下游引物；上游引物序列为TACCGCATACGCCCTGAG；下游引物序列为TTCGCCATTGGTGTTCCT；(6)ROX染料；(7)阳性对照液，内含香港海鸥菌总DNA；(8)阴性对照液，内含无菌水。
2、 根据权利要求1所述的荧光实时定量PCR检测香港海鸥型菌的试剂盒， 其特征在于，所述的荧光PCR反应液中1 xPCRbuffer含有0.2 0.3mmol/LKCL、 0.01~0.1mmol/LTris-HCl和0.01~0.05 mmol/L的MgCl2。
3、 根据权利要求1所述的荧光实时定量PCR检测香港海鸥型菌的试剂盒， 其特征在于，所述的阳性对照液中香港海鸥菌的总DNA含量不低于500ng。
4、 一种利用权利要求1所述的荧光实时定量PCR试剂盒检测香港海鸥型菌 的方法，其特征在于，包括以下步骤a) 样品预处理取样品，按样品与无菌水的重量体积比为0.125~0.5 : 1加入 无菌水，充分震荡悬浮，经离心处理后，弃去上清液；b) 在步骤(l)所得沉淀物中加入0.5~1.5mL的裂解液，震荡使沉淀物彻底悬浮；c) 在步骤(2)所得悬浮液中加入5(K100fd的蛋白酶K溶液，混匀，放置5min后，在7(TC放置30~50min至溶液变澄清；d) 在步骤(3)所得澄清液中加入等体积的按体积比为25 : 24 : 1配制的酚、 氯仿和异戊醇的混合溶液进行抽提，5000rpm离心10min，得上清液；e) 取步骤(4)所得上清液，加入等体积的异丙醇，振荡充分混合，室温下放 置10min， 12000rpm离心5min，弃去上清液；f) 在步骤(5)所得沉淀物中加入0.5ml70。/。的乙醇，振荡30s， 12000rpm离心 5min，弃去上清液，室温干燥5min，加入20~50nl TE缓冲液漩涡振荡，得样品 PCR模板；g) 荧光PCR反应依次取荧光PCR反应液，样品PCR模板，阳性对照液，阴性对照液，0~1^1 的ROX内参染料，加入到PCR反应管中，将反应管置于荧光PCR仪上，按下 列条件进行扩增反应94°C3~5min预变性一94°C,30~50s—54°C,50s—72。C,lmin 20S (检测荧光值)一第二步至第四步35 40个循环一6(TC,15s—以0.rC/s的速 率升温，直到95。C，整个过程进行连续采集荧光—95。C，15s;h) 结果及判断阴性对照无扩增曲线，Ct值》40;熔解曲线无单一峰；阳性对照出现典型的"S"扩增，Ct值〈19;熔解曲线在85 90'C间有相应的单一峰；样品结果若样品Ct值^40，且熔解曲线无单一峰，即可判断样品为阴性，可直接报告出未检测出香港海鸥形菌；若样品Ct值^30，且熔解曲线在85 9(TC 间有相应的单一峰，可判断样品为阳性；若样品Ct值〉30，而<40,则重做样品， 重做结果若是Ct值^40，熔解曲线无单一峰，则样品为阴性，否则为阳性。
5、根据权利要求4所述的利用荧光实时定量PCR试剂盒检测香港海鸥型菌 的方法，其特征在于，步骤a)的样品预处理的具体过程为取样品0.5 2g置于 灭菌的Eppendorf管中，加入4ml无菌水，充分震荡悬浮，4000rpm离心5min， 取上清液3.5mL转入无菌Eppendorf管中，6000rpm离心5min，取上清液3mL 到无菌Eppendorf管中12000rpm离心5 min，弃去上清液。
全文摘要
本发明提供了一种荧光实时定量PCR检测香港海鸥型菌的试剂盒及其检测方法，该试剂盒含有以下分离试剂裂解液、蛋白酶K、抽提液、TE缓冲液、荧光PCR反应液、ROX染料、阳性对照液和阴性对照液；通过对样品进行前处理后得样品PCR模板，将荧光PCR反应液，样品PCR模板，阳性对照液和阴性对照液，或内参染料，加入到PCR反应管中，进行扩增反应，通过对Ct值和溶解曲线的分析，可对淡水鱼肠道中是否含有香港海鸥型菌进行定量检测；该方法简便快速，特异性好，灵敏度高，对提高淡水产品食用安全性有很大的社会经济效益，具有很高的实用价值。
文档编号C12Q1/68GK101619349SQ200910041708
公开日2010年1月6日 申请日期2009年8月6日 优先权日2009年8月6日
发明者刁石强, 吴燕燕, 周婉君, 岑剑伟, 勃 戚, 李来好, 杨贤庆, 红 石, 郝淑贤, 陈胜军, 马海霞, 涯 魏, 卉 黄 申请人:中国水产科学研究院南海水产研究所