专利名称：一种高纯度酵母免疫活性β-1,3-葡聚糖的制备方法
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种葡聚糖的制备方法，尤其是一种高纯度酵母免疫活性e -1,3-葡聚糖的制备方法。
背景技术：
早在二十世纪四十年代，Pillemer博士首次发现并报道酵母细胞壁中有一种物质具有提高免疫力的作用，进一步研究发现该物质是一种多糖即酵母卩-l,3葡聚
糖，并从面包酵母中分离出这种物质；从二十世纪七十年代开始，越来越多的科学家开始了对酵母葡聚糖生理功能的深入研究，现在对其生理机制已有共识，认为酵母葡聚糖是一种高效的机体免疫功能活化因子；2003年6月24日，美国NIAID(National Institute of Allergy and Infectious Diseases)禾卩AMRIID (Army MedicalResearch Institute of Infectious Diseases)的研究人员在其发表的研究报告中指出酵母卩-l,3/l,6-D葡聚糖可用作预防SARS病毒的一种重要的生物活性物质。
酵母葡聚糖的机体免疫激活功能可以概括为以下几个主要方面(l)能有效提高机体免疫力，这在许多动物包括人类试验在内都得到了证实；(2)抗癌、抗肿瘤作用，目前研究抗癌功能的主要目标就是加强人体组织中的巨噬细胞的活性；(3)抗氧化作用，酵母葡聚糖能够有效地清除提体内的自由基，保护巨噬细胞在遭受辐射期间和辐射后都能免受自由基的攻击，使这些巨噬细胞继续正常发挥作用；(4)抗辐射作用，国际上许多著名的研究机构，包括哈佛大学医学院、华盛顿大学以及美国空军放射生物学研究所等都证实酵母葡聚糖具有显著提高免疫力的作用。
目前，在国内有关制备e-l,3-葡聚糖方面及用酵母、啤酒废酵母制备6-1,3-葡聚糖方面已有文献报道，如酸法、碱法、自溶一酚碱法等，这些方法虽然得率高，纯度高，但是产品的活性被破坏，失去了葡聚糖作为功能因子增强人体免疫力的意义，而且工艺涉及到了强酸、强碱，产生大量的污水，不环保，不利于工业化生产；超声波法、发酵法，虽然避免了环境污染，产品活性高，但是得率低，生产成本较高，仅适合在实验室，不利于工业化生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种高纯度酵母免疫活性e -1，3-葡聚糖的制备方法，该制备方法提取条件较为温和、工艺简单、易操作、得率高，制备获得的酵母葡聚糖具有纯度高和免疫活性高的特点。
e -1,3-葡聚糖是酵母细胞壁中主要的多糖成分，是一种天然的高分子亲水胶体，具有较高的持水能力，不能溶于水，但可均匀分散于水中，也不溶于酒精、丙酮等常见的有机溶剂。以e-i,3-糖苷键连接为主，带有少量e-i，6-糖苷键分枝
的葡萄糖高聚物，e-l，3-葡聚糖平均分子量在20万以上，化学结构是以分子间
和分子内氢键构成的三股螺旋形式存在，三股多糖链平行排列并缠绕在一起，研究表明酵母葡聚糖的免疫活性源于葡聚糖骨架的三螺旋结构和螺旋结构的外表
面存在的亲水基团。
本发明提供的技术方案是将酵母原料经自溶预处理后，进行酶解，离心过滤收集沉淀，再经过碱处理后，加酸中和，洗涤，脱水，干燥，粉碎即得高纯度酵母免疫活性e -1,3-葡聚糖产品。
进一步的，本发明提供的高纯度酵母免疫活性e-i,3-葡聚糖的制备方法，包括以下步骤
(1) 自溶取酵母原料，加水，调节温度为100~130°C， pH为7，反应l 8h，
对酵母细胞壁进行破壁处理，提取酵母e-i， 3-葡聚糖；
(2) 酶解在步骤(l)所得葡聚糖溶液中加入蛋白酶和甘露聚糖酶，调节温度
为40 6(TC， pH为5 9，反应l 5h后，即得含酵母P-1，3-葡聚糖的溶液；
(3) 纯化将步骤(2)所得含酵母e-l,3-葡聚糖的溶液离心、过滤，收集沉淀，所得沉淀经碱处理后，加酸中和，洗涤，脱水，干燥，粉碎即得高纯度酵母免疫活性e-l，3-葡聚糖产品。
上述制备方法中，
步骤(l)中所述酵母原料为啤酒酵母或面包酵母。步骤(l)中所述酵母原料和水的重量份配比为1: 2~15。步骤(2)中所述蛋白酶和甘露聚糖酶的重量含量为酵母原料的1~10%。。步骤(2)中所述蛋白酶是由枯草芽孢杆菌经发酵提取制得的中性蛋白酶，所述甘露聚糖酶是地衣芽孢杆菌经发酵提取制得的P -甘露聚糖酶。步骤(3)中所述洗涤过程为首先经碱液洗涤后，加酸中和，离心过滤，收集沉淀，所得沉淀再用水洗涤1~3次。
步骤(3)中所述碱液洗涤的过程为加氢氧化钠调节溶液PH为7.5~9，温度为70~80°C，反应1~3小时。
与现有技术相比，本发明具有以下优点
(1) 本发明制备方法条件温和、工艺简单、易操作、得率高；
(2) 本发明制备方法清洁环保，无污染，符合国家清洁生产的相关政策；
(3) 本发明制备方法制得的酵母葡聚糖纯度和活性高，最大程度的保留了其原本的免疫活性；
(4) 本发明制备方法制得的酵母葡聚糖能够显著增强人体的免疫力，抑制肿瘤的生长，降低胆固醇，可广泛应用于食品、医药、化妆品行业中。
具体实施例方式
以下列举具体实施例对本发明进行说明。需要指出的是，实施例只用于对本发明作进一步说明，不代表本发明的保护范围，其他人根据本发明的提示做出的非本质的修改和调整，仍属于本发明的保护范围。实施例l
取啤酒酵母原料100kg，加水500kg,密封加压，升温到11(TC， pH为7，持续搅拌反应3h，对酵母细胞壁破壁溶出葡聚糖，在常压下降温到45'C，加入150g中性蛋白酶和200克甘露聚糖酶，调节pH为6恒温持续搅拌反应2.5h，采用吊袋式离心机，离心转速为1000rpm，滤袋采用涤纶材料，400目孔径，离心收集得到沉淀l，加入原料5倍的水，搅拌均匀后用氢氧化钠调节水溶液到PH为7.5， 7(TC反应1小时，然后用盐酸中和反应液，采用吊袋式离心机离心收集得到沉淀2，加入原料10倍的自来水到沉淀2中，搅拌25min，采用吊袋式离心机离心收集得到沉淀3，然后加入原料5倍的无水乙醇，在室温下搅拌l小时，进而抽滤，将抽滤得到的产品烘干，打粉，所得的产品外观是白色粉末状，产品纯度达到70%，这种高纯度酵母免疫活性(3-l,3-葡聚糖可广泛应用于食品、保健品、化妆品等行业中。实施例2
取啤酒酵母原料100kg，加水800kg，密封加压，升温到125。C， pH为7，持续搅拌反应5h，对酵母细胞壁破壁溶出葡聚糖，在常压下降温到5(TC，加入100g中性蛋白酶和150克甘露聚糖酶，调节pH为6恒温持续搅拌反应3h，采用吊袋式离心机，离心转速为1000rpm,滤袋采用涤纶材料，400目孔径，离心收集得到沉淀l，加入原料5倍的水，搅拌均匀后用氢氧化钠调节水溶液到PH为8， 75r反应2小时，然后用盐酸中和反应液，采用吊袋式离心机离心收集得到沉淀2，加入原料10倍的自来水到沉淀2中，搅拌25min，采用吊袋式离心机离心收集得到沉淀3，加入原料10倍的自来水到沉淀3中，搅拌25min，采用吊袋式离心机离心收集得到沉淀4，然后加入原料5倍的无水乙醇，在室温下搅拌1小时，进而抽滤，将抽滤得到的产品烘干，打粉，所得的产品外观是白色粉末状，产品纯度达到74%，这种高纯度酵母免疫活性P-l,3-葡聚糖可广泛应用于食品、保健品、化妆品等行业中。实施例3
取面包酵母原料100kg，加水1200kg，密封加压，升温到13(TC， pH为7，持续搅拌反应8h，对酵母细胞壁破壁溶出葡聚糖，在常压下降温到6(TC，加入300g中性蛋白酶和350克甘露聚糖酶，调节pH为8恒温持续搅拌反应5h,采用吊袋式离心机，离心转速为1000rpm，滤袋采用涤纶材料，400目孔径，离心收集得到沉淀l，加入原料5倍的水，搅拌均匀后用氢氧化钾调节水溶液到PH为9， 8(TC反应3小时，然后用硫酸中和反应液，采用吊袋式离心机离心收集得到沉淀2，加入原料10倍的自来水到沉淀2中，搅拌25min，采用吊袋式离心机离心收集得到沉淀3，加入原料15倍的自来水到沉淀3中，搅拌25min，采用吊袋式离心机离心收集得到沉淀4，然后加入原料5倍的无水乙醇，在室温下搅拌l小时，进而抽滤，将抽滤得到的产品烘干，打粉，所得的产品外观是白色粉末状，产品纯度达到80%，这种高纯度酵母免疫活性P-l，3-葡聚糖可广泛应用于食品、保健品、化妆品等行业中。
权利要求
1、一种高纯度酵母免疫活性β-1，3-葡聚糖的制备方法，其特征在于将酵母原料经自溶预处理后，进行酶解，离心过滤收集沉淀，再经过碱处理后，加酸中和，洗涤，脱水，干燥，粉碎即得高纯度酵母免疫活性β-1，3-葡聚糖产品。
2、 根据权利要求i所述高纯度酵母免疫活性e-i,3-葡聚糖的制备方法，其 特征在于包括如下步骤(1) 自溶取酵母原料，加水，调节温度为100~130°C， pH为7，反应l 8h， 对酵母细胞壁进行破壁处理，提取酵母P-1， 3-葡聚糖；(2) 酶解在步骤(l)所得葡聚糖溶液中加入蛋白酶和甘露聚糖酶，调节温度 为40 60。C， pH为5 9，反应l 5h后，即得含酵母P-1，3-葡聚糖的溶液；(3) 纯化将步骤(2)所得含酵母P-l,3-葡聚糖的溶液离心、过滤，收集沉淀， 所得沉淀经碱处理后，加酸中和，洗涤，脱水，干燥，粉碎即得高纯度酵母免疫活性e-i，3-葡聚糖产品。
3、 根据权利要求2所述高纯度酵母免疫活性P-l,3-葡聚糖的制备方法，其 特征在于步骤(l)中所述酵母原料为啤酒酵母或面包酵母。
4、 根据权利要求2所述高纯度酵母免疫活性e-l，3-葡聚糖的制备方法，其 特征在于步骤(l)中所述酵母原料和水的重量份配比为1: 2~15。
5、 根据权利要求2所述高纯度酵母免疫活性e-l,3-葡聚糖的制备方法，其 特征在于步骤(2)中所述蛋白酶和甘露聚糖酶的重量含量为酵母原料的1~10%。。
6、 根据权利要求2所述高纯度酵母免疫活性e-l,3-葡聚糖的制备方法，其 特征在于步骤(2)中所述蛋白酶是由枯草芽孢杆菌经发酵提取制得的中性蛋白酶，所述甘露聚糖酶是地衣芽孢杆菌经发酵提取制得的e -甘露聚糖酶。
7、 根据权利要求2所述高纯度酵母免疫活性P-l,3-葡聚糖的制备方法，其 特征在于步骤(3)中所述洗涤过程为首先经碱液洗涤后，加酸中和，离心过滤， 收集沉淀，所得沉淀再用水洗涤1~3次。
8、 根据权利要求7所述高纯度酵母免疫活性e-l，3-葡聚糖的制备方法，其 特征在于所述碱液洗漆的过程为加氢氧化钠调节溶液PH为7.5~9，温度为70~80 °C，反应1 3小时。
全文摘要
本发明公开了一种高纯度酵母免疫活性β-1，3-葡聚糖的制备方法，该制备方法是将酵母原料经自溶预处理后，进行酶解，离心过滤收集沉淀，再经过碱处理后，加酸中和，洗涤，脱水，干燥，粉碎即得高纯度酵母免疫活性β-1，3-葡聚糖产品。本发明制备方法条件温和、工艺简单、易操作、得率高，符合国家清洁生产的政策，是一条较为环保、工业可行的工艺路线。采用本发明制备方法获得的产品具有纯度高、活性高的特点，能够显著增强人体的免疫力，抑制肿瘤的生长，降低胆固醇，可广泛应用于食品、医药、化妆品行业中。
文档编号C12P19/00GK101463373SQ20091003641
公开日2009年6月24日 申请日期2009年1月4日 优先权日2009年1月4日
发明者李春荣, 詹耀才, 钟细娥, 高展炬 申请人:广东省食品工业研究所