专利名称：：海洋细菌交替假单胞菌lp621产右旋糖苷酶的方法及产品的利记博彩app
技术领域：
：本发明涉及一种利用从中国黄海连云港海域的海水中分离得到的交替假单胞菌LP621(尸化^o"/teramo"ossp.LP621)产右旋糖苷酶的方法与产品。
背景技术：
：右旋糖苷(Dextean)(ahomoglycanofD-glucopyranose)是95%为01-1,6糖苷键的多糖。右旋糖苷酶(Dextranase,a-D-1,6-Glucan-6-D-Glucanohydrolase，EC3.2丄11)，又叫a-葡聚糖酶，是专-'切割右旋糖苷(Dextean)中a-l，6糖苷键的水解酶(Khalikovaeta1.,2003)。右旋糖苷酶有很重要的应用价值，在龋齿防治、制糖工业和药用右旋糖苷的生产等方面发挥着越来越重要的作用(Khalikovaeta1.,2005)。右旋糖苷酶在龋齿防治中的应用。口腔中的细菌发酵食物中的蔗糖，生成水溶性右旋糖苷。这些水溶性右旋糖苷在牙齿面形成牙菌斑，一些乳酸菌在此大量繁殖并分泌出--'些酸性物质，破坏牙釉质，从而导致龋齿。牙菌斑是龋齿和牙周病重要的致病因素之一。因此为了预防和控制龋齿和牙周病，抑制牙菌斑的发生和发展至关重要。利用右旋糖苷酶能有效抑制牙菌斑形成(Marottaetal.，2002;Mehvaretal.，2000;Banaseta1，.2003)。右旋糖苷酶是一种生物制剂，使用和保存简便易行。无毒性，无耐药性，不影响口腔内的菌群的生态平衡，对不会刷牙的婴幼儿和不具备洗漱条件的情况下，是一种良好的预防牙龋齿斑的制剂。而每个人饭后，尤其是食用糖后应用添加有此酶的漱口剂，是一项很好的抑制菌斑形成，预防龋齿和牙周病的有效措施。近几年各国在这一领域已作了深入研究，将具有降解菌齿斑能力的右旋糖苷酶添加到牙膏、漱口水和口香糖中，取得了良好的防治龋齿的效果。右旋糖苷酶在制糖工业中的应用。由于微生物的污染，甘蔗在收割、运输、储藏、压搾过程中，蔗糖会转化成右旋糖苷，呈粘性。粘性的右旋糖苷对制糖工业的影响是不利的。它不仅消耗了蔗糖分子降低了收率，而且右旋糖苷的存在，造成甘蔗汁黏度增加，对沉淀过滤甚至传热带来不良影响，使煮糖时间增加，废蜜的提净率降低，助晶分离困难，增加了能耗。严重时，会导致管道不畅，迫使停机清扫。在甘蔗压榨过程中加入适量的右旋糖苷酶使右旋糖苷降解，可以解决上述问题(Egglestonaetal.,2005;Jime'nez2005)。右旋糖苷酶在药用右旋糖苷生产中的应用。医药工业上，右旋糖苷主要用作血浆增量剂，即代血浆。目前医药上用的右旋糖苷有中分子量和低分子量两种，中分子量限于70000左右，低分子量的为40000。目前，药用右旋糖苷的生产主要是采用酸水解法，条件激烈，得率低，要求生产设备条件苛刻，如能采用酶法生产，可提高产率，降低成本(程秀兰等，1992)。目前国内外报道的产生右旋糖苷酶微生物主要为青霉(Pem'"7/Zw附)、斯达油月旨酵母(Z^ow_yc&sstorfey/)、曲霉(爿s/erg/〃ws)、,连球菌(5Vreptococcws)、环状芽孢杆菌(Sa"'〃w"Vrw/ara)(Khalikovaetal.,2005)。Korpela等从土壤中筛选到一株能产生热稳定胞外右旋糖苷酶的芽孢杆菌，并对该酶进行了纯化(Khalikovaetal.,2003)。Lgarashi等将大鼠链球菌(5V^p/ococa^右旋糖苷酶在大肠杆菌中表达，重组酶与那些来自的变形链球菌deptococcwsm幽wto)禾口远缘链球菌deptococcusso6n'm/s)的右方定糖苷酶具有相似的性质如最适pH和最适温度(Lgarashietal.，2004)。DomanKim等报道斯达油脂酵母(丄.W^fej;/)的右旋糖苷酶在S.cwev/w'"e中表达(Kangetal.，2005)。Roca等将(尸em'cz7/^mw/m'o/wfetw)右旋糖苷酶在(毕赤酵母尸/c/n'"p^ton'^Mw")中表达(Rocaetal.，1996)。国内仅见对淡紫拟青霉和焦曲霉产右旋糖苷酶以及斯达油脂酵母的右旋糖苷酶的研究(程秀兰等，1992;Chenetal.,2008)。国内外对海洋细菌交替假单胞菌属(尸w^foa/terawowo)产右旋糖苷酶的研究尚未见报道。
发明内容本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的利用交替假单胞菌LP621产右旋糖苷酶的方法。本发明所要解决的另一技术问题是提供前述方法所产的右旋糖苷酶产口叩o以下对本发明的技术方案进行详细的描述。本发明所涉及的交替假单胞菌LP621(/^w必aterawo"wsp.LP621)菌株己于2008年10月14日在GenBank公开，登陆号为EU849123，网址为http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgidb=nuccore&id=209362346;该菌株为公知公用材料，在该专利申请日起二十年内，公众如果需要，淮海工学院海洋学院实验室可对外提供。一、交替假单胞菌LP621(尸wWofl/fera/wwassp.LP621)菌株(以下简称菌株LP621)的分离培养方法、形态特征与生理生化特征。1.1分离培养方法菌株LP621通过以下的分离培养方法得到用初筛培养基从连云港海域的牡蛎、海泥、海水、海蟹和紫菜等样品初步筛选到io多株透明圈大的菌株，再通过产酶培养基复筛获得菌株LP621。1.2形态特征对该菌进行革兰氏染色后，显微镜观察该菌为革兰氏阴性杆菌，有荚膜，无芽孢，大小为2.2-2.7pmx0.7-1.3nm。在含有右旋糖苷固体培养基上的菌落特征直径4mm-7mm，白色、湿润、边缘光滑、中间突起、能产生明显的透明圈，见图1。1.3生理生化特征菌株LP621的生理生化特征以及与其它交替假单胞菌的比较见表1、2。该菌株氧化酶为阳性，能发酵葡萄糖、甲基红，不能发酵VP，无氯化钠可生长，能液化明胶，能产生吲哚；能利用乳糖、纤维二糖、半乳糖、甘油、丙氨酸、谷氨酸、丙酮酸，而不能利用果糖、麦芽糖。通过Bergey，sManualofSystematicBacteriology(第二版)分析比较菌株GS230与i^e^foa/tercww"as属内其它种间理化特征，结果显示菌株LP621同尸化wcfoa/feraAmwm的其它菌均有一定相似性，但又不完全相同，结合进化树的结果初步推测该菌为交替假单胞菌的一表1菌株LP621的生理生化特征菌株LP621P.fl,c,/cGS230_/tov,》"/c/rraHH407氧化酶+++VP---口引哚++-甲基红+--革兰氏染色---苯丙氨酸脱氨酶+NDNDNaCl依赖性+-+明胶水解酶+硫化氢--葡萄糖发酵+-_"+"为阳性，"一"为阴性，"d"为11-89%的阳性，"nd"为不确定表2菌株LP621理化特征与其它交替假单胞菌的比较菌姓LP621Pfl/^/cflRc"refl^R/ifl/o/;/朋P做raWaJ^Mig"yicflW511.4菌株LP621的分子生物学鉴定用Takara试剂盒提取DNA模板，并于-4(TC保存。正向引物Pl:5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物P2:5'-CGGCTACCTTGTTACGAC-3'。反应体系50pl，Taq酶2U，反应条件为94。C预变性5min，94。C变性30s，54。C退火40s，72。C延伸lmin，35个循环，72。C延伸7min。PCR产物的纯化、克隆、测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。扩增菌株LP621的16SrDNA，其长度为1500bp。将菌株LP621的16SrRNA基因序列提交GenBank数据库，通过16SrDNA序列同源性比较，生长因子酶9%NaCI利用乳糖D-果糖D-半乳糖D-纤维二糖麦牙糖甘油蔗糖乙酸盐丙酮酸盐DL-a-丙氨酸L-谷氨酸D+++++++nd+++dnd+++dd+dddd+d++d++++++d+DD+DD+D++要素粉长。c需色淀生"M可以初步确认该两种菌为交替假单胞菌属(/^e"^ateromo"w)。将亲缘关系较近的菌株16SrDNA应用MEGA软件进行多重比较，用中邻接法(Neibor-joiningmethod)建系统进化树，如图2所示，从进化树可以看出菌株LP621与尸化WGtoa/feramowasefraocfom'j亲缘关系最近，且在一个分支中，根据菌株的形态特征、生理生化特征、16SrDNA序列以及系统进化树的结果，可鉴定菌株LP621为交替假单胞菌LP621(Aewt/oa/teramo"wsp.LP621)，菌株LP621的16SrDNA序列己提交到GenBank，其登陆号为EU849123。二、交替假单胞菌LP621的生长特性2.1本发明中涉及的培养基2216E培养基蛋白胨0.5%，酵母粉0.1%，琼脂2%，陈海水配制，pH8.5。初筛培养基蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，右旋糖苷0.2%，琼脂2%，陈海水配制，pH8.0;产酶培养基酵母膏0.1%，蛋白胨0.1%，右旋糖苷1%，陈海水配制，pH8.0。微量矿物盐(每升)CuS04'5H20,O.Olg;ZnS04'7H20,O.lg;CoCl2'6H20,0.005g;MnCl2-4H20,0.2g;Na2Mo04.2H20,O.lg;KBr,0.05g;KI,0.05g;H3B03,O.lg;NaF，0.05g;LiCl，0.05g;Al2(SO4)3,0.05g;NiCl2-6H20，O.Olg;VoS04'2H20,0.005g;H2W04.2H20，0.002g;Na2Se04，0.005g;SrC1.6H20,0.005g;BaCl2,0.005g。2.2种子液的制备将保藏在2216E培养基的交替假单胞菌LP621接种到2216E培养基中，转速180r/min，装液量20%，培养16h。2.3不同温度对交替假单胞菌LP621生长的影响将种子液以2y。接种量于2216E培养基，转速180r/min，装液量20%，分别在不同温度下培养，每隔一段时间测定细胞浓度，选择在600nm波长下测定OD值，结果发现该菌株能够在4t:下生长，其生长温度范围为4-37"C，最适生长温度为25。C。2.4pH对交替假单胞菌LP621生长的影响在2216E培养基中加入终浓度为10mmol/L的磷酸醋酸硼酸(1:1:1)作为缓冲液，使培养基的pH分别为4.0-11.0之间，在25"C培养24小时，测定细胞浓度，生长pH范围为5-10，最适生长pH为7.0。2.5NaCl对交替假单胞菌LP621生长的影响按照2.2方法制备种子液，在2216E培养基(将用海水配制改用微量矿物盐溶液代替，每升培养基加入10ml)中加入NaCl，使之为0%到12。/。的NaCl，在25'C培养24小时，测定细胞浓度，生长的NaCl浓度为0.5。/。-12Q/。，最适生长的NaCl浓度为7%。三、产酶条件对酶产生的影响发明人对交替假单胞菌LP621产海洋右旋糖苷酶的产酶条件进行了较深入的研究，研究了不同因素对产酶的影响，在各种单因素优化的基础上，选取了多因素进行了正交试验，最终的优化结果较大的提高了产酶。3.1发酵时间对产酶的影响将种子液接入到发酵培养基中，在25"C、180r/min下，振荡培养48h，每4h取出测酶活力及OD,。右旋糖苷酶活在24h之前，产酶量上升速度较快，到发酵24h时(即菌体生长到稳定期)产酶量最高，随时间增加，酶活力逐渐下降，见图3。在发酵前期主要是生长菌体，而进入稳定期后，菌体增殖到最大密度，碳源即将耗尽时，酶开始大量形成和分泌，酶活力达到最高峰。继续培养进入衰亡期，菌体大量裂解，大量的酶进入胞外液，胞内酶活降低。3.2发酵温度对产酶影响在不同温度下进行发酵培养，结果显示20-25t:时右旋糖苷酶产量达到最高，低于20°C、高于25。C的情况下产酶均迅速下降。15'C和30。C时分别只有最高产酶量60%和73.1%的产酶量。低于2CTC时菌体生长缓慢，产酶量也相应降低；而温度高于25"C后，菌体代谢太快，衰老快，不利于产酶，见图4。3.3培养基pH对产酶的影响在不同pH条件下发酵培养24h后测定右旋糖苷酶活力。实验结果证明随着pH的升高，酶产量逐渐增加，当pH达到6.0时产酶量达到最大；pH继续升高，在pH7.0-9.0之间酶产量下降较小，趋势平稳，酶活相当稳定；自pH9后,酶产量迅速下降。在低于pH5.0或高于pH10.0时酶产量均很低，见图5。3.4不同NaCl浓度对产酶的影响如图6所示，产右旋糖苷酶的量随NaCl浓度的增加而逐渐增加，当培养基NaCl浓度升至4。/。时，产右旋糖苷酶最高，进一步升高NaCl浓度则会对菌体生长和右旋糖苷酶酶活积累产生一定的抑制作用。3.5装液量对产酶的影响摇瓶装液量分别为10%、15%、20%、25%、30°/。和40%进行发酵试验，结果表明，装液量太少溶氧过大，对菌体造成伤害不利于产酶，装液量太多溶氧太差，不利于菌体生长，同样降低产酶，结果显示装液量在25%时产酶最高。3.6不同碳氮源对产酶的影响分别在培养基中添加不同的碳源和氮源进行发酵培养，发酵24h后测定发酵液酶活力，结果发现，在碳源的比较中，麦芽糖最能促进产酶，乳糖和可溶性淀粉次之，葡萄糖、纤维素不利于产酶，培养基中添加不同碳源对产酶的影响较大；不同氮源的发酵结果显示，胰蛋白胨最有利于产酶，酵母膏和酪蛋白、蛋白胨、玉米粉次之，无机氮源不利于产酶，见表3。本实验证明适当调整培养基中的碳氮源，可以较高地促进右旋糖苷酶的产出。_表3碳氮源对产酶的影响_相对酶活(％)相对酶活(％)3.7响应曲面法(RSM)优化发酵条件3.7.1响应面设计实验结果由响应面软件设计的实验方案进行实验后，得出的结果如表4。从表上可以看出在培养基pH为7.0，时间为24h，麦芽糖浓度为1%，装液量为25%观1」得的酶活最高。表4响应面实验设计及其实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>28200.252038.128.036280.252035.936.748280.25203939.756200.752055.659.668200.752062.868.876280.7520S4.354.288280.752076.576.096200.253044.747.5108200.253039.241.6116280.253043.740.1128280.253048.546.8136200.753078.980.5148200.753091.993.4156280.753056.168.6168280.7530卯.l940175240.52547.841.9189240.52556.457.7197160.52562.361.3207320.52564.761.02172402511.118.62272412510087.9237240.51547.450.1247240.53585.578.1257240.5258179.026了240.52576.979.03.7.2二次回归拟合以及方差分析以相对酶活为响应值，经回归拟合后各试验因子对响应值的影响可以用以下函数表示Y二a0+a'A+a2B+a3c+a4D+a5A2+a6B2+a7c2+a8D2+a9AB+a^AC+a"AD+ai2BC+a13BD+a"CD应用响应面软件对26个响应值进行分析所得到的拟合全变量二次回归方程各变量的偏回归系数估计值及方差分析表见表5，由表5可知，决定系数R2=0.9013，说明回归方程的拟合程度较好，因此可以用该回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析。由响应面软件可以得出全变量二次回归方程为Y=79.30+3.95A-0.063B+17.32C+7.00D-7.38A2-4.53B2-6.52C2-3.79D2+3.16AB+4.69AC+0.93AD-1.13BC-1.64BD+2.74CD表5回归分析结果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>3.7.3最佳发酵条件的确定根据响应面软件绘出的等高线和响应面立体分析图可以得出培养基pH、麦芽糖浓度和装液量对产酶的影响较大，这与方差分析中显著性的分析结果相符。为了进一步确定最佳点的值，通过回归方程可以计算出四个因素的最佳值为pH7.07，发酵时间21.94h，麦芽糖浓度0.42%，装液量为21.88%时所得的相对酶活最高。四、右旋糖苷酶的性质4.1粗酶液的制备将种子液以2%的接种量接种于发酵培养基，180r/min，25。C培养24h，10000r/min离心5min，沉淀即为菌体。用缓冲液悬浮菌体，冰水浴中经超声波破碎5min，12000r/min离心10min，取上清液即为右旋糖苷酶粗酶液。4.2酶作用温度对酶活性的影响将右旋糖苷酶置于不同温度下与底物发生反应，测定酶活力，结果见图7，酶的最适作用温度为30°C，2(TC仍有70%的酶活力。4.3酶的热稳定性取适量酶液分别在不同温度(30°C、40°C、50。C和80°C)下保温2.5h，每隔0.5到lh取出一组样品，迅速置于4。C冰箱内，待保温结束后统一在标准条件下测定残余酶活，以未处理酶液的酶活设为100%。结果见图8，50°C保温2.5h后该酶依然有65。/。的活性，8(TC保温2h，残余酶活为50%以上。4.4酶的作用pH对酶活性的影响将酶液与在不同pH的1.07。的右旋糖苷溶液中在3(TC下进行酶活力测定，不同pH值的缓冲液为50mM柠檬酸钠缓冲液(pH3.0至lj6.0);50mM磷酸钠缓冲液(pH6.0到8.0);50mMTris-盐酸缓冲液(pH8.0to9.0);50mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH9.0到10.0)。结果见图9，pH8.0-8.5该酶的活性最高，在pH5.5时酶活性有另一个峰值，由此可推测粗酶液中有两种甚至两种以上的酶。4.5酶的pH稳定性将50ul酶液与150ul不同pH的缓冲液混合，缓冲液为伯瑞坦-罗宾森(Britton-Robi歸n)缓冲溶液，pH分别为3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7,0、7.5、8.0、9.0、10.0，在30。C水浴锅中保温lh取出测定残余酶活，将未处理酶液的酶活设为100%。结果见图10，结果表明在30。C保温下lh后，右旋糖苷酶在pH6.0-8.0范围内稳定，残余酶活力保持在80%以上，在pH4.0和pH10.0分别有78%和72%的酶活力。4.6金属离子、化学试剂对酶的作用将各种金属离子与酶液混合，使其最终浓度达到1.0mM、5.0mM，然后在3(TC下测酶活，结果见表6。将各种化学试剂与酶液混合，使其达到预定浓度，测定酶活，结果见表7。结果发现Ag+、Na+、Ba2+、K+对右旋糖苷酶有激活作用。低浓度的(^2+对右旋糖苷酶有激活作用，高浓度的<^2+会抑制该酶活性。Hg2+、Pb2+、Mn2+、Mg2+、Li2+、Al3+、Cu2+、Zn2+对酶有不同程度的抑制作用。其它金属离子如Co2+、C一和F^+对该酶的影响不大。表6金属离子对酶活力的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表7化学试剂对酶活力的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>4.7右旋糖苷酶活测定。①右旋糖苷酶活测定方法取"/。右旋糖苷溶液100pL加入10(VL酶液，空白不加酶液，代之以100^iL的去离子水，3(TC反应15min，立即放入冰浴中终止反应，加入200iiLDNS10(TC煮沸5min，终止反应并显色，加入3mL去离子水振荡混匀，取300)tiL于96孔酶标板上于520nm下进行吸光值测定；将10ul酶液加入到190ul1。/o的口T溶性淀粉Tris-HCl缓冲液(50mM，pH8.0)中，在3(TC水浴中反应15min,用DNS测定还原糖量。②酶活力单位定义酶活力单位的定义上述反应条件下每分钟水解右旋糖苷产生l吗麦芽糖所需的酶量，定义为一个酶活力单位(U)。经试验证明，本发明所述的方法所产右旋糖苷酶和其它右旋糖苷酶一样，也可以用于防治龋齿；或者在甘蔗压榨过程中用用降解右旋糖苷；或者用作血浆增量剂。图1为菌株LP621在含右旋糖酐的平板上的透明圈。图2菌株16SrRNA进化树分析图。图3时间对产酶和菌株生长的影响图。图4为温度对产酶的影响图。图5为pH对产酶的影响图。图6为NaCl浓度对产酶的影响图。图7为温度对酶活性的影响图。图8为温度对酶热稳定性的影响图。图9为pH对酶活力的影响图。图10为pH对酶稳定性的影响图。具体实施例方式以下参照附图，进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。实施例1。参照图1-2。一种利用交替假单胞菌LP621sp.LP621)产右旋糖苷酶的方法，其步骤如下，将交替假单胞菌LP621(尸^Mcfoa/terawowoysp響LP621)菌株接种到2216E培养基中，转速180r/min，装液量20%，培养16h，得种子液；将种子液以2%的接种量接种于发酵培养基，180r/min，25。C培养24h，10000r/min离心5min，沉淀即为菌体；用缓冲液悬浮菌体，冰水浴中经超声波破碎5min，12000r/min离心10min，取上清液即为右旋糖苷酶粗酶液。实施例2。实施例1所述的方法中，所述的交替假单胞菌LP621(/^Mc/oa/feramo"^sp.LP621)菌株具有以下特征革兰氏阴性杆菌，有荚膜，无芽孢，大小为2.2—2.7^1111><0.7—1.3^1111;菌株生理生化特征为，该菌氧化酶为阳性，能发酵葡萄糖、甲基红，不能发酵VP，无氯化钠可生长，能液化明胶，能产生吲哚；能利用乳糖、纤维二糖、半乳糖、甘油、丙氨酸、谷氨酸、丙酮酸，不能利用果糖、麦芽糖。实施例3。参照图1。实施例1所述的方法中，所述的交替假单胞菌LP621(户化z^oa/terawo"wsp.LP621)菌株在含有右旋糖苷固体培养基上的菌落特征为直径4mm-7mm，白色、湿润、边缘光滑、中间突起、能产生明显的透明圈。实施例4。参照图3-5。实施例1所述的方法中，所述的交替假单胞菌LP62118(户化w^a/fera奶o"ossp.LP621)菌株的生长温度范围为4-37°C;生长pH范围为6-ll;生长的NaCl浓度范围为0.5。/。-12。/。。实施例5。参照图3-5。实施例1所述的方法中，所述的交替假单胞菌LP621(P化wcfoa/teramo"oysp.LP621)菌株最适生长温度为25°C，最适生长pH为10.0，最适生长的NaCl浓度为7%。实施例6。参照图6-10。一种如实施例1—5中任何一项所述的利用交替假单胞菌LP621产右旋糖苷酶的方法所产右旋糖苷酶，所述的右旋糖苷酶的理化性质为右旋糖苷酶的适合作用温度为30°C，5(TC以下酶具有热稳定性，在80。C保温2.5h后该酶仍具有40%以上的活性；在pH6.0-8.0该酶稳定；Hg2+、Pb2+、Mn2+、Mg2+、Li2+、Al3+、Cu，PZn2+则对酶有抑制作用；Ag+、Na+、Ba2+、K+对该酶有激活作用；EDTA、TCA和NBS对该酶有抑制作用。权利要求1、一种利用交替假单胞菌LP621(Pseudoalteromonassp.LP621)产右旋糖苷酶的方法，其特征在于，其步骤如下，将交替假单胞菌LP621(Pseudoalteromonassp.LP621)菌株接种到2216E培养基中，转速180r/min，装液量20％，培养16h，得种子液；将种子液以2％的接种量接种于发酵培养基，180r/min，25℃培养24h，10000r/min离心5min，沉淀即为菌体；用缓冲液悬浮菌体，冰水浴中经超声波破碎5min，12000r/min离心10min，取上清液即为右旋糖苷酶粗酶液。2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的交替假单胞菌LP621(尸化Woa/feramowwsp.LP621)菌株具有以下特征革兰氏阴性杆菌，有荚膜，无芽孢，大小为2.2—2.7)iimx0.7—1.3pim;菌株生理生化特征为，该菌氧化酶为阳性，能发酵葡萄糖、甲基红，不能发酵VP，无氯化钠可生长，能液化明胶，能产生吲哚；能利用乳糖、纤维二糖、半乳糖、甘油、丙氨酸、谷氨酸、丙酮酸，不能利用果糖、麦芽糖。3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的交替假单胞菌LP621(尸化wcfoa/toww"msp.LP621)菌株在含有右旋糖苷固体培养基上的菌落特征为直径4mm-7mm，白色、湿润、边缘光滑、中间突起、能产生明显的透明圈。4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的交替假单胞菌LP621(PseM^a/teramo"assp.LP621)菌株的生长温度范围为4-37。C;生长pH范围为6-11;生长的NaCl浓度范围为0.5%-12%。5、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的交替假单胞菌LP621(尸wwtfoa/terawo"必sp.LP621)菌株适合生长温度为25°C，适合生长pH为10.0，适合生长的NaCl浓度为7%。6、一种如权利要求l一5中任何一项所述的利用交替假单胞菌LP621产右旋糖苷酶的方法所产右旋糖苷酶，其特征在于，所述的右旋糖苷酶的理化性质为右旋糖苷酶的最适作用温度为3(TC，5(TC以下酶具有热稳定性，在8(TC保温2.5h后该酶仍具有40。/o以上的活性；在pH6.0-8.0该酶稳定；Hg2+、Pb2+、Mn2+、Mg2+、Li2+、Al3+、012+和Zn2+则对酶有抑制作用；Ag+、Na+、Ba2+、K+对该酶有激活作用；EDTA、TCA和NBS对该酶有抑制作用。全文摘要本发明是一种利用海洋细菌交替假单胞菌LP621(Pseudoalteromonassp.LP621)产右旋糖苷酶的方法，其特征在于，其步骤如下，将交替假单胞菌LP621(Pseudoalteromonassp.LP621)菌株接种到2216E培养基中，转速180r/min，装液量20％，培养16h，得种子液；将种子液以2％的接种量接种于发酵培养基，180r/min，25℃培养24h，10000r/min离心5min，沉淀即为菌体；用缓冲液悬浮菌体，冰水浴中经超声波破碎5min，12000r/min离心10min，取上清液即为右旋糖苷酶粗酶液。本发明还涉及按该方法得到的右旋糖苷酶产品，该右旋糖苷酶在龋齿防治、制糖工业和药用右旋糖苷的生产等方面发挥着重要的作用。文档编号C12R1/38GK101519656SQ20091002958公开日2009年9月2日申请日期2009年3月27日优先权日2009年3月27日发明者姝刘,吕明生,房耀维,朱广超,王淑军,丽陈申请人:淮海工学院