专利名称：对虾桃拉病毒现场快速高灵敏检测试剂盒及检测方法
对虫下桃鹏毒鹏鹏高灵繊则试剂叙检测施
狱领域
本发明涉及海洋生物病原检测S7fc具体^X賴下桃fe^毒(Taura syndrome virus，简称TSV)的现 :^i^S高灵驗鹏齐i戯微测方法。 背景狱
对虫下桃拉病毒为单链RNA病毒，属于观顿反子病毒科，该病毒主要感染凡纳滨对虫下(ft a^ f&nwome/)和南II^X独下CPenara^0^rw细)，也可^^中国) 祖下(Pe膨itfctozmsis)、日本X賴下(/V鹏ws /cpoM/atf)、珍il X独下(尸^raeus mow必")等；其中以/lift^X啦下最为ifei， X郝下,病毒后死亡率高 达40 95%， i練毒曾引起美洲lX^!下^Sik的巨対员失。3&^*^着我国/^内^4下 ^鹏的急剧扩 大，TSV^^赠殺生的风险iilM转斶加。我们^^^t行全国XW摘毒病流行病糊査中发现，目前
我国南方翁直的/iii^(賴下、北方舗的中国) ^下和日本)m下麟Tsv的比例挪艮高。为了;ii^我国对
虫下熟1*±个鹏己90年代白斑^ 毒病爆发悲剧的重现，iS^快^^W下桃feM敏、M、'鹏的 5形豕參断技术，加3叙抽"Fffi种和J^下^e以及M7K俩境的监测，以预防病SM，切断病劍专播， 防止TSV的大规饑发流行。
目前，TSV检测还主要ftl^于病理切片法、电^M察法和RT-PCR检测法。病理切片法不^S翻
病毒进行检测，只旨统佣发病的组纟尸擴理征a)^a行检测，并J^局限于在实验室内进行；电子显微镜技
术虽然可以直接观察妾擴^r立子的,，但其操作filV、耗费时间长、M性低；用抗^^测法检测TSV 虽^JS^J:优于病理切片法，但其灵 5^總氐，在TSV尚未引^M^M的极早期船細抗^^检 测出来；TSV的RT-PCR检测法，虽然刻盯前面;U中方法的缺点，在实^^斜牛下能实i顺寸TSV的相 对腿、糊检测，但由于常规的RT-PCR检测需要昂贵的PCR仪、繊电》Wn成f縣统，使得RT-PCR 检测法难以用节贴汤的十^S榭则，这大大限制了 RT-PCR检测方法在妒中W^鹏。
进行舰桃鹏群期检测并采取预鹏施慰術辭直中斷,下桃鹏織行风险、齡舰发 病导致巨客藤5济损失的^i^手段，所以S5:简单、'鹏、高灵敏的检查方法，并开魏于救S鹏的对 卿,雜测湖盒繊寻尤为觀。
发明内容
本发明的目的是^M共一种适于4^贴汤自、',、高灵ma易操作的)^下槲满^^测方法，
并将樹则方法标准化，同B寸将检测i叙瞎中于规范的淑!l盒中，以划野见^S术的不足，使TSVfi^]^测 更糊、灵敏、舰、娃和方厄
首先，本发B月利用针对TSV衣壳蛋白基因中保守区麟计的4^^异引物、 一种反lf^n—种 具有艘换活性的飄聚娜，无需制,的核酸(腿)进行反録，在雖^gT保温一段时 间即可同步5MX寸目的核酸的反^^和扩增，实5，TSV的^i和高灵iC^测。为了进""i^i短检测时 间、消除检测过程中可兽拨生的污染、简化检测步骤，使检测实验會鹏在4mt汤开展，本发明对TSV 的实验室飽则方、i^i4行了优化。OT FTA "^ij备样品核酸的标准步骤中，需要将被样品匀浆液润湿的FTA斷在室温下刊輊少一个小时，然后才倉激衍激；本发明il3iS,品匀桨液棘显的FTA断 上滴加亲7jC易挥发的i^t/质(主要是M、伯麟n仲醇)，使润湿的FTA JDt^^温斜牛下只需 10粥中即可^g千Ma程，大彌短了样品核麟恪的时间。在利用^T增方法检测病原时，目前普
MM扩增ffi结束后向sm管中添加核麟料以判断检测结果的方法；由于^r增鹏的f"ta非
常大，这种打开鹏管嚇加核麟料的方法极易导躯謝寺检样品被污染而使检测结果出现假附性； 有鹏和糊細在扩增鹏鄉J中添加尿嘧使DNA糖^iW (UNG酶)的施消除污染风险，但却 增加了赫；本发明先将核麟料粘附到扩增鹏管的内侧上^M子内侧，^T增Hi^束后再舰 上下反，荡使扩增ffi液和核,料混合，i^lf不打开扩增，管就能^ft扩增，的^fe，消除了 打开扩增皿管^^加核 料过程中^^ 能溅出^^^對寺检样品被污染的风险。■ FTA^SJ 备样品核酸的标職骤中，需要用Whatman公司(英国)专门的纯化i敬仮節離FTA斷；本发明 无需专门的纯化淑!J，，普通的蒸馏水m即可^FTAMJt的纯化，不仅简化了检测W^作步骤， 还斷氐了实 *。为了使该检测方法在^^鹏汤具有更强的实用性，本发明&id^优f^^检测方法 的敏出上，将检测TSV病毒所需的淑吸器材进行了组装，将之标准化、酉虔化，形成了翻试艦。 本发明的舰桃鹏寧鹏腿高灵驗W齐瞌包括
(1) 釆样管，用来^S文、石开磨待检样品；
(2) 飄管，内驗衝K
(3) 核敝性管，内装TE缓冲液；
(4) 扩增检测管，内,增鹏液和核^^料，扩增MiS游SM分如下扩增弓l物的上游引物l 和下游引物l各1 2 mM，扩增弓嫩的上游引物2和下游引物2各0.1 0.4 pM， dATP、 dTTP、 dGTP 和dCTP各0.8 2.0 mM, MgCl2 4 10 mM， Betaine (甜舰)0.6 1.2 M， Tris-HCl 10 40 mM， KC110 20mM， MgS041 4mM， (NH^SQt6 12mM， TritonX-1000.05% 1.0%，反 t^l 20U，加DNA 聚合酶2 20U:核,料为好生物学石鹏中常用的核麟料，包括但不限于SYBRGreen、 GelRed、 GelGrem、 GokMew^、 GeneFinder^等；且核麟料^5fe粘附于扩增检测管管壁内侧上;5^扩增检测 管盖子内侧；
(5) 阴ttX寸照管，内装^X寸虫下桃^^^酸的FTA,;
(6) 阳ttX寸照管，内装吸附了^lll下桃fe fi,酸的FTA)in";
(7) 鹏千麟，为亲水'胆易挥发的l^/质；
(8) FTATO、研磨棒、3^和吸管分别封装预菌袋中；
(9) ^，内装一賊多个小孔的泡沫 §绵块；
(10) 使用说明书。
战TSV救汾鹏高灵 # 式齐憶中戶脱6^增引物是根据TSV衣壳蛋白基因保守区序列设计 的' ^,列如下
上游弓物1: 5'-CGGGCAAAGTAACCAAATCGCTnTATGTrAACTAGACGlTCCAGT 下游弓胸1: 5'-CCTTTGGCACAGATAAITCAnACGTnTGCTACCATGAGTGAACCTA 上游引物2: 5'-AACAGTTTGTCTCTCTCAGA
5下游引物2: 5'國TCGCCCTTArTCTTAGGAAT
用本发明J^检测WflJ^tW^下TSV的方法，按下列步WS行
(1) 取样品对虫下组织约0.02 1.0g置于采样管中，用研磨樹每样品5^下组织 ^^状；
(2) 用研磨棒m^状的样品鄉下组织将FTAMM"充分蹄显；
(3) 吸取'鹏千麟滴于战FTA膜片上，静置l(^20min;
(4) 用3^将说FTA斷微封mW内，震荡飄管3 5min以洗涤FTA斷；
(5) 再用3^将i^核^^性管内的FTA断转移到扩增检测管内，榭广增检测管置于55 65t 餅下保温40 70min;
(6) )(,增检测管上下反皿动1-3 min，使扩增MiS液与粘附于扩增检测管管壁或管^i:的核酸 染料充分混匀；
(7) 用力向下甩动扩增撤则管，使管内混有IM^料的扩增反应^^H于扩增检测管底部，湖躕 观察鹏液，如果SISMM鹏絶则^^样品的TSV检测结果为阳性，如果S^^MSS^黄色贝i腕 该样品的TSV检测结果为阴性。
^Lbi步骤中，，(4)步开始应樹乍为阴',照的^X賴下桃te^毒核酸的FTA 、作为阳性 对照的吸附了对lW很彌毒核酸的FTA膜片，以及吸附了样品核酸的FTAilM"^^fc理， 测鹏。
本发明的积极效果在于在试剂盒中汇集TSV鹏^^I检测所需的FTA,、 TE缓冲液、扩增反 应液、核麟料等淑iJfW开磨棒、雅、吸^t^^材，使得TSV的检观憎嫩KM"序itea行，势见了检 测过程的禾im^f晰准化，使ff^作规范、不易出错；本发明依M^的TSV衣壳蛋白基因保守区序列 TO计的扩增引辦g有^^测TSV的所有^ft，而与其{1^毒的衣壳蛋白基因又无同源性，检顶鹏异性 非離；細Sf^物^f取样后的FTA断进行Kit千mKi，使f辦品核酸的制备时间大彌短采
用内置核m^料，在M^束后不用打开ffi管即可直接x寸反应^a行她，避免了打开^sm管s^加
核麟料i顿纟對寺检样品被扩增 ^tr污染而ig^假阳性的结果，从而大娥高了i^&在检测中顿的 可靠性。本发明将目的核酸(RNA)的反ft^P扩增结^来同步进行，节省了时间，仅需1.5~2小时 就可^(他下TSV的检测；并且检测M^呈无需昂贵的仪器设备如离心机、PCR仪和;IMM象系统，仅 需水M^1浴甚至更简单的保温縫即可；而且检测结果非體易判别；与)^下TSV己有检测技术
相比，本发明的樹则方 *#常低，^a程稀及有毒试剂，)^1#作人员和环 非常娃，并且
检测灵驗极高，可以割^!fe下桃織毒之前的相关检测肃去如病理切片法、电傲见察法、抗l^"测法 和RT-PCR检测法；本发明的检测淑J盒不仅可在^輕内f顿，也可S^外的^5鹏^f柳，柳口强 TSV的流行病学监测和繊胞意mfc具有很高的,卿价值。
以下M^ffi例对本发明作进"^说明。
鄉例l:舰桃鹏寧鹏麟高灵驗 本发明的淑l搶由以下部件i贼(可检测4个样品的鹏) (1)采样管，4个，用 ^文、研磨待辦品；(2) 漂體，6个，^t内薪lml的蒸馏水；
(3) 核麟性管，6个，齡管内装有20 mL的TE缓冲液(含10 mM Tris-HCl和1 mM EDTA， p腦)；
(4) 扩增检测管，6个，Wt内親25nL扩增鹏液和l^的核^^料，扩增MiSM^M分 如下扩增引物的上游引物1和下游引物1各1.6MM，扩增弓I物的上游弓卿2和下游弓嫩2各0,2MM， dATP、 dTIP、 dGTP和dCIP各1.4mM， MgCl28mM, Betaine (甜 ) 1.2M, Tris-HCI20mM， KCI 10mM， MgS042mM， (NH^SOi lOraM， TritonX-1000.1%，反ff^R5U， 5[rfDNA聚彌8U;核 ^^料成分为稀释10倍的GeneFinder ,且核M^料已粘附固定于扩增检测管的管盖内侧。
(5) 阴tt^照管，l个，内装^X賴下桃 满離酸的FTA斷；
(6) 阳'舰照管，l个，内装吸附了)(賴下桃J满雜酸的FTA斷；
(7) 'KJS干赚，l管，内装500nL^7jC乙醇；
(8) FTA膜片(4片)、研磨棒(4个)、牙签(6个)和吸管(1个)分别封装预菌袋中；
(9) ^#(1个)，内装"i贿多个小孔的海绵块，海绵土处有小孔4x6个；
(10) 使用说明书，1份。
鄉例2本发明的細下桃織^^广增检测施
i顿实施例i中的检测试齐瞌，按下列步wa行
(1) 取样品X^下组织教0.1g置于采样管中，用研磨棒K^将样品磨碎S^汰
(2) 用研磨棒tt^突状的样品将FTAMIt充分润湿
(3) 吸取'i^I千^^滴于战FTA膜片上，将FTA斷室温静置10min;
(4) 用3^将战FTA斷鄉到m管内，将at剧烈震荡3min;
(5) 再用3^将J^核^t4管内的FTAM^转移至ljr增检测管内，^T增^t测管置于57T^f牛 下保温60min;
(6) 縱增检测管上下反魏动2min,使扩增鹏液与管紅的核,料充分混匀；
(7) 然后用力向下甩动扩增检测管，使管内混有核^M斗的扩增^a^SII于扩增检测管底部，用眼
睛观敏mS^液，如^S鹏ife则^^样品的TSV检测结果为阳性，如mS5ja黄色则^^样品
的TSV1^测结果为阴性。
^Lh^步骤中M 4步开始，应将^X賴下槲彌^^酸的FTA 、吸附了X^下桃J满^W的 FTA斷和吸附了样品核酸的FTA膜片一Mta超3^t"测腿，分别用^^测的附性和阳'tt^照。
本发明中所述的FTA ,是英国Whataan公司用鄉i恪核酸的FTA卡片;将FTA卡)tiJt刀^XS 为b宽不小于1綠l默的船或打孑L^S径不小于1就的纟K^即可制成FTA斷。
本发明洲顿的i翁诉附料弓物由上^4物工程有限责任公司合成；乙二胺四乙酸二钠、三羟甲 基錢甲烷、dNTP、甜 (Betaine)、 dATP、 dGTP、 dCTP和dTTP、 KC1、 MgS04、 (NH^SCV MgCb、 TritonX-lOO购自上敏物lS呈有限责任公司；^M扩增用的版DNA聚娜、反^R^购自NEB公 司；核lg^料GeneFinde^购自厦门百维信生物禾il^有限公司。 7<110〉中国水产科学研究院^^海水产研^^
<120>对虫下桃醜毒现场鹏高灵繊测试剂叙检测施
<160> 4
<10> 1
<211> 46
<212> DNA
<213> AX序列
<220〉
<223>根据对虫下桃拉病毒衣壳蛋白基因序列和等温扩增引物设计要求而设计，用作对 虫下桃拉病毒離扩增检测的上游引物1
<400> 1
cgggcaaagt aaccaaatog ctttta妙aactagacgt tccagt 46
<210> 2
<211> 48
<212> DNA
<213> AI序列
<220>
<223>根据对虫下桃拉病毒衣壳蛋白基因序列和，扩增引物设计要求而设计，用作对 虫下桃拉病毒紫显扩增检测的下游弓,1
<400> 2
cctttggcac agataattca ttacgttttg ctaccatgag tgaaccta 48
<210> 3
《11〉 20
<212> DNA
<213> AX序列〈23>根据)(^下桃拉病毒衣壳蛋白基因序列和^^扩增引物设计要求而设计，用作对 虫下桃拉病毒^M扩增检测的上游弓胸2<400> 3aacagtttgt ctctctoaga 20<210> 4<211> 20〈12> DNA〈13> AX序列<220><223>根据X^下桃拉病毒衣壳蛋白基因序列和^a扩增引物设计要求而设计，用作对 虫下桃拉病毒^^扩增检测的下游弓胸2<400> 4tcgcccttat tcttaggaat 20
权利要求
1.一种对虾桃拉病毒现场快速高灵敏检测试剂盒，其特征是该检测试剂盒包括(1)采样管，用来盛放、研磨待检样品；(2)漂洗管，内装蒸馏水；(3)核酸变性管，内装TE缓冲液；(4)扩增检测管，内装扩增反应液和核酸染料；(5)阴性对照管，内装无对虾桃拉病毒核酸的FTA膜片；(6)阳性对照管，内装吸附了对虾桃拉病毒核酸的FTA膜片；(7)快速干燥液；(8)FTA膜片、研磨棒、牙签和吸管分别封装于无菌袋中；(9)包装盒，内装一块有多个小孔的泡沫板或海绵块；(10)使用说明书。
2. 如权利要求1所述的检测试剂盒，其中所述的核酸染料为分子生物学中应用 的核酸染料，包括但不限于SYBR Green 、 GelRed 、 GelGreen 、 GoIdView 或 GeneFinder 。
3. 如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于所述的快速干燥液是亲水性且 易挥发的醇类物质。
4. 如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于上述扩增检测管内的核酸染料 粘附于扩增检测管管壁内侧上方或扩增检测管管盖内侧。
5. 如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于所述的FTA膜片为英国Whatman 公司用来制备核酸的FTA卡片裁切成尺度1毫米的纸片而成。
6. 如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于上述的扩增反应液由以下组份 组成扩增引物的上游引物1和下游引物1各l 2pM，扩增引物的上游引物2和下 游引物2各0.1 0.4 pM， dATP、 dTTP、 dGTP和dCTP各0.8 2.0 mM， MgCl2 4 10 mM，甜菜碱0.6 1.2 M， Tris-HCl 10 40 mM， KC1 10 20 mM， MgS04 1 4 mM， (NH4)2S04 6 12 mM， Triton X-100 0.05% 1.0%，反转录酶1 20U,具有链置换活 性的DNA聚合酶2 20U。
7.如权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于扩增反应液中扩增引物的核酸序列如下上游引物1: 5'-CGGGCAAAGTAACCAAATCGCTTTTATGTTAACTAGACGTTCCAGT下游引物1: 5'-CCTTTGGCACAGATAATTCATTACGTTTTGCTACCATGAGTGAACCTA上游引物2: 5'-AACAGTTTGTCTCTCTCAGA下游引物2: 5'-TCGCCCTTATTCTTAGGAAT
8.使用权利要求1所述检测试剂盒检测对虾桃拉病毒的方法，其特征在于该方 法包括下列步骤(1) 取样品对虾组织约0.02 1.0g置于采样管中，用研磨棒将样品磨碎至浆状；(2) 用研磨棒蘸取浆状的样品将FTA膜片充分润湿；(3) 吸取快速干燥液滴于上述FTA膜片上，静置10 20min;(4) 用牙签将上述FTA膜片转移到漂洗管内，震荡漂洗管3-5min以洗涤FTA膜片；(5) 再用牙签将上述核酸变性管内的FTA膜片转移到扩增检测管内，将扩增检 测管置于55 65 。C条件下保温40 70 min;(6) 将扩增检测管上下反复甩动1-3 min，使扩增反应液与粘附于扩增检测管管 壁或管盖上的核酸染料充分混匀；(7) 向下甩动扩增检测管，使管内混有核酸染料的扩增反应液集聚于扩增检测 管底部，直接观察扩增反应液颜色，如果扩增反应液呈现绿色则表示该样品的对虾桃 拉病毒检测结果为阳性，如果扩增反应液呈现橙黄色则表示该样品的对虾桃拉病毒检 测结果为阴性。
全文摘要
本发明涉及一种对虾桃拉病毒现场快速高灵敏检测试剂盒及检测方法。本发明的检测试剂盒包括采样管、内装蒸馏水的漂洗管、内装TE缓冲液的核酸变性管、内装扩增反应液和核酸染料的扩增检测管、阴性对照管、阳性对照管、FTA膜片及其快速干燥液等。本发明的检测方法具有比TR-PCR检测方法更高的特异性、灵敏性和便捷性，并且成本非常低，无毒，安全，使用方便，检测更准确、快速，且灵敏度极高，可以替代已有的相关检测方法如病理切片法、电镜观察法、抗体检测法和TR-PCR检测法。本发明的检测试剂盒和检测方法不仅可在室内的实验室使用，也可在野外的生产现场使用，对加强对虾桃拉病毒的流行病学监测和疾病防控意义重大，具有很高的推广应用价值。
文档编号C12Q1/70GK101643792SQ20091001789
公开日2010年2月10日 申请日期2009年8月18日 优先权日2009年8月18日
发明者宋晓玲, 张庆利, 冰 杨, 倢 黄 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所