适于表达用于基因治疗的编码序列的表达载体的利记博彩app

专利名称：适于表达用于基因治疗的编码序列的表达载体的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及用于基因治疗的表达载体，更特别地涉及包含转录调控元件(顺式调 控元件或者反式作用元件)新组合的用于基因治疗的表达载体，其包括启动子、增强子、内 含子、非翻译区(UTR)和基因座控制区(locus control region, LCR)，所述载体能够支持 靶基因在肝中以高水平持续表达。
背景技术：
肝的功能包括血液储存、糖转换和分泌多种细胞因子，以及表达影响许多疾病 (如遗传的、心血管的、代谢的、血液的和癌性疾病)的基因。已将多种肝特异性疾病(如感 染性肝炎)作为基因治疗的靶标进行了研究。肝细胞在形成后拥有很长的寿命，具有大多数病毒基因转运蛋白的受体而且直接 与血流相连，使其易于接触药物，因此肝被认为是基因治疗的重要候选器官。血友病是一种由位于X染色体上的因子VIII(FVIII、f8)或因子IX (FIX、f9)基因 的缺陷所引起的退行性出血疾病，依据突变或缺失的基因将其分成血友病A(FVIII缺陷) 或B (FIX缺陷)。对用于治疗血友病A或B的药物，只有当FVIII或FIX以其正常血液浓度 的1-5% (分别为100-200ng/ml和500ng/ml)或更高水平持续表达时，治疗效果才是可预 期的。在最近的血友病B基因治疗研究中，已报道的是，将带有人FIX(hFIX)基因的腺相 关病毒(AAV)引入血友病B小鼠模型中导致hFIX蛋白以高达1，500-1，800ng/ml的水平表 达(Snyder，R. 0.，Nat. Med.，5 :64_70 (1999) ；Manno, C. S.，Nat. Med.，12 :342_347 (2006))， 而在血友病B的狗模型中以高达730ng/ml的水平表达hFIX蛋白(Arruda，V. R.，Blood, 105 =3458-3464(2005)) 0然而，当将这种在动物模型中高效表达的载体临床应用于人患者 时，FIX的血液浓度仅为185ng/ml或更低，这低于有效临床治疗的阈值(500ng/ml)，另外的 难题是在人受试者中的hFIX表达水平不是持续的而是瞬时的(Kay，M.A. ,Nat. Genet. ,24 257-261 (2000) ；Manno，C. S. ,Nat. Med.，12 342-347 (2006)) 在血友病 A 的治疗模型中发 现了与上述相似的趋势。针对遗传疾病(如血友病)治疗的临床试验结果表明，首要条件是开发能够保持 在特定组织(如肝组织)中持续高水平表达治疗基因的高效组织特异性表达载体。此外， 逃脱针对载体的体液及细胞免疫应答以及诱导对所表达蛋白的免疫耐受被认为是成功的 基因治疗的关键因素。例如，为了将正常FVIII或FIX的表达水平提高到有效用于成功的 临床治疗的阈值，还必须考虑的是，注射高剂量的带有FVIII或FIX基因的病毒并且抑制体 内的免疫应答。然而为使这种方法获得成功，首先要通过改进表达载体来提高基因表达的 效率。仅在肝中产生的脂蛋白(a)是用于肝组织特异性表达载体开发的另一个重要靶 标。脂蛋白(a)是通过载脂蛋白(a)(—种糖蛋白)与apo B_100(低密度脂蛋白(LDL) 的主要蛋白质组分)结合而形成的(Fless，G.M.，J. Biol. Chem.，261 :8712_8717 (1986))。
4载脂蛋白(a)负责胆固醇的体内转运，已报道血浆中脂蛋白(a)浓度的提高是动脉硬化 和心脏病的主要风险因子(Armstrong, V. W.等，Arteriosclerosis, 62 :249_257 (1986)； Assmann, G.，Am. J. Cardiol. ,77 :1179_1184(1996))。载脂蛋白(a)含有与纤维蛋白溶酶 原kringle IV和V相似的两类kringle结构域，以及无活性的蛋白酶样结构域。众所周 知的是，具有kringle结构的蛋白质可抑制肿瘤的新血管形成及转移(Folkman J.，N Eng J Med,285 1182-1186(1971) ；Falkman J, Klagsbrun M.，Science,235 442-447(1987)； Scapaticci FA.，J Clin Oncol. ,20 =3906-3927 (2002)) 最近，本发明人及其他研究者发 现，载脂蛋白(a)的kringle结构域由于其显著的抗血管发生活性而具有抗癌和抗转移活 性(Sculter V等，Arterioscler Thromb Vasc Biol,21 433-438(2001) ；Trieu UN和Uckun FM.，Biochem Biophys Res Commun.，257 :714_718(1999) ；Kim JS 等，J. Biol Chem.，278 29000-29008(2003) ；Yu HK 等，Cancer Res.，64 :7092_7098 (2004) ；Kim JS 等，Biochem Biophys Res Commun.，313 534-540(2004) ；Lee K等，H印atology，43 :1063_1073(2006))。在抗转移和抗癌治疗中，公认的是，选择性作用在患病位点上的治疗方式会更有 效。因此，开发用于抗癌治疗(例如用于对肝癌或者转移肝肿瘤的有效基因治疗)的能组 织特异性地持续进行基因表达的载体非常重要。如上所述，持续的组织特异性基因表达是有效基因治疗的关键，这需要开发新的 改良表达载体。这可通过改进这种表达载体的转录调控元件(顺式调控元件或反式作用元 件)来实现。常用转录调控元件的实例包括启动子、增强子、内含子、非编码区、基因座控制区寸寸。在这种肝组织特异性表达的表达载体中所使用的是磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (PEPCK，为糖原异生酶)(Yang, Y. W.，J.等，Gene Med. ,5(5) :417_424 (2003))、α 1-抗胰 蛋白酶、白蛋白、FVII、有机阴离子转运多肽C(OATP-C)、乙型肝炎病毒核心蛋白(Kramer， M.G.，等，Mol. Ther. ,7(3) :375_385 (2003))和甲状腺素结合球蛋白(Wang，L.，等，Proc. Natl. Acad. Sci.，96 :3906_3910 (1999))的启动子；以及白蛋白(Kang, Y.，等，Blood, 106 (5) 1552-1558 (2005))、苯丙氨酸羟化酶(PAH)和α 1-微球蛋白/尿抑胰酶素 (bikunin)前体(AMBP) (Wang, L.，等·，Mol. Ther.，1 (2) 154-158 (2000))的增强子。由于与肝中所富含的HNF_4(肝细胞核因子-4)结合，FVII启动子(大小约为 500bp)在肝中的转录活化水平是其他组织中的10倍或更高。已报道的是，大多数转录因子 主要结合在 FVII 启动子 3，端的 300bp 片段上(Greenberg,D.，等，Proc. Natl. Acad. Sci.， 92:12347-12351 (1995))。当截短FVII启动子(大小为501bp)5，端的315bp片段时，启 动子的肝特异性活性提高约30%，但当截短210bp片段时活性降低大约20-30% (Pollak, W. S.，等，J.Biol. Chem. ,271 (3) :1738_1747 (1996))。由于与肝中所富含的HNF-I α结合，有机阴离子转运多肽C(OATP-C)的启动子 (大小约为900bp)在肝中的转录活化水平是其他组织中的3倍或更高。已报道的是， 大多数转录因子结合在启动子3’端的440bp片段上(Jung，D.，等，J. Biol. Chem.，276 37206-37214(2001))。可通过增强子的作用增强启动子的活性。苯丙氨酸羟化酶(PAH)增强子(大小约 为230bp，并具有HNF-I结合位点)位于PAH基因5’端上游-3. 5kb。已报道的是，由于存
5在肝富含的HNF-I的结合位点，PAH增强子使其所结合的启动子的活性提高为4倍或更高 (Lei, X. D.，等，Proc. Natl. Acad. Sci. ,95 :1500_1504(1998))。AMBP ( α 1-微球蛋白/尿抑胰酶素前体)增强子大小约为400bp，其从AMBP基因 5，端的-2945bp延伸到-2539bp。它主要包括HNF_1、2、3和4的结合位点，它的主要活性 区域对应于其-2802 到-2659bp 的片段(Route, P.，等，Biochem. J.，334 :577_584 (1998))。 已报道的是，AMBP增强子一般使启动子活性提高为两倍或三倍。位于基因5’和3’端的非翻译区(UTR)负责基因mRNA的结构稳定(Holcik，Μ.， Liebhaber S. A. , Proc NatlAcad Sci USA.，94 :2410_2414 (1997) ；Chkheidze，A. N.，等， Mol Cell Biol. ,19 =4572-4581 (1999)) 0已报道的是，3，UTR中的多腺苷酸化信号序列也 明显有助于 mRNA 的结构稳定(Kolev, N. G.，等，Genes Dev.，19 :2583_2592 (2005))。真核基因包括外显子(被翻译成蛋白质)和内含子(在外显子之间的非翻译序 列)。通过剪接去除这些内含子，使由DNA首先转录得到的mRNA前体转变为成熟的mRNA。 这些内含子包括以GT(U)开始的剪接供体和以AG结尾的剪接受体。此外，出现在内含子3’ 端的是多聚嘧啶片段、剪接因子、snRNP结合分支序列、三鸟嘌呤重复序列(3重G基序)等， 它们在形成剪接体(RNA与内含子剪接酶的复合物)的过程中起关键作用(Pagani，F.，等， Nat. Rev. Genet.，5 :389_396 (2004))。当与启动子和增强子组合时，内含子可作为用于持续高效基因表达的转录调控元 件。内含子通过与转录因子结合而参与提高基因表达效率和转录效率(Liu，K.，等，Proc. Natl. Acad. Sci.，92 :7724_7728 (1995) ；LeBlanc, S. E.，等，J. Biol. Chem.，(2005))，还 参与提高转录后的蛋白质翻译效率(Moore, M.J.，Cell, 108 :431_434 (2002))。已报道 的是，hFIX的内含子1引起hFIX蛋白表达的增加(Kurachi, S.，等，J. Biol. Chem.，270 5276-5281(1995)).抗凝血蛋白(如抗凝血酶和纤维蛋白溶酶原)和凝血因子(如凝血酶原)都在 肝中表达。通过分析这些蛋白为缺陷型的血栓形成或血友病患者的基因内含子，发现了 多种错义突变和/或无义突变，这提示这些蛋白质的内含子对肝中的基因表达起关键作用 (Jochmans, K.，等，Blood, 84 :3742_3748 (1994))。已发现在至少36种哺乳动物(包括人、大鼠、兔、山羊等等)中存在基因座控制区 (LCR)。LCR是含有DNase I敏感区(其对转录因子具有组织特异性)的核苷酸序列。人 β -珠蛋白 LCR 的功能是众所周知的(Harju S.等，Exp. Biol. Med. 227 :683_700 (2002))。肝细胞控制区(h印atocyte control region, HCR)因其增强肝特异性基因表达的 能力而众所周知，该区发现于载脂蛋白E(ApoE)基因的下游。HCR具有与肝特异性转录因子 结合的DNase I敏感区域。HCR作为ApoE基因的肝特异性表达的LCR。ApoE HCR具有在与 多种因子(如HNF3a、HNF4、GATA-1、C/EBP、TF-LF2和Alu家族)结合时被活化的位点。在 这些位点中，表现出DNase I超敏感性的HNF3 α结合位点具有TGTTTGC基序，DNase I可切 开第一个 G 和第二个 T 之间的连接(Dang Q.，等，J. Biol. Chem. 270 =22577-22585 (1995)) 事实上，已报道了向表达载体中引入ApoE HCR导致动物模型中hFIX表达提高(Miao C. H.， 等.，Mol. Ther. 1 :522_532(2000))。已报道了具有与人ApoE基因的HCR(包含TGTTTGC基序)、人的载脂蛋白A_I、载 脂蛋白B、转铁蛋白、甲胎蛋白、α 1-抗胰蛋白酶等、以及小鼠中的甲胎蛋白、白蛋白等相似·，J. Biol. Chem. 270 :22577-22585(1995))。发明概述因此，本发明的一个目的是提供可用作转录调控元件的多核苷酸，所述转录调控 元件用于以高水平持续表达肝组织特异性基因。本发明的另一目的是提供用于以高水平持续表达肝组织特异性基因的表达载体。根据本发明的一个方面，提供具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸。根据本发明的另一方面，提供多核苷酸，其包含具有SEQ ID NO :42之核苷酸序 列的多核苷酸以及与SEQ ID NO :42之多核苷酸有效连接的至少一个多核苷酸，后者选自具 有SEQ ID NO 44和45之核苷酸序列的多核苷酸。根据本发明的另一方面，提供多核苷酸，其选自具有SEQ ID NO :46到57之核苷酸 序列的多核苷酸。根据本发明的另一方面，提供多核苷酸，其选自具有SEQ ID NO :58到61之核苷酸 序列的多核苷酸。根据本发明的另一方面，提供表达载体，其包含转录调控元件和与所述转录调控 元件有效连接并受其控制的编码序列，其中所述转录调控元件包括1)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸；2)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸以及与SEQ ID NO 42之多核苷 酸有效连接的至少一个多核苷酸，后者选自具有SEQ IDNO :44和45之核苷酸序列的多核苷 酸；3)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸以及与SEQ ID NO 42之多核苷 酸有效连接的至少一个多核苷酸，后者选自具有SEQ IDNO :46到57之核苷酸序列的多核苷 酸；4)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸以及与SEQ ID NO 42之多核苷 酸有效连接的至少一个多核苷酸，后者选自具有SEQ IDNO :58到61之核苷酸序列的多核苷 酸；5)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸；选自具有SEQ IDNO 44和45之 核苷酸序列的多核苷酸的至少一个多核苷酸；以及选自具有SEQ ID NO :46到57之核苷酸 序列的多核苷酸的至少一个多核苷酸；所述多核苷酸彼此有效连接；6)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸；选自具有SEQ IDNO 44和45之 核苷酸序列的多核苷酸的至少一个多核苷酸；以及选自具有SEQ ID NO 58到61之核苷酸 序列的多核苷酸的至少一个多核苷酸；所述多核苷酸彼此有效连接；7)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸；选自具有SEQ IDNO 46到57之 核苷酸序列的多核苷酸的至少一个多核苷酸；以及选自具有SEQ ID NO 58到61之核苷酸 序列的多核苷酸的至少一个多核苷酸；所述多核苷酸彼此有效连接；或者8)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸；选自具有SEQ IDNO 44和45之 核苷酸序列的多核苷酸的至少一个多核苷酸；选自具有SEQ ID NO :46到57之核苷酸序列 的多核苷酸的至少一个多核苷酸；以及选自具有SEQ ID NO 58到61之核苷酸序列的多核 苷酸的至少一个多核苷酸；所述多核苷酸彼此有效连接。根据本发明的另一方面，提供表达载体，其包含转录调控元件和与所述转录调控
7元件有效连接并受其控制的编码序列，所述转录调控元件包含启动子和与所述启动子有效 连接的多核苷酸，所述多核苷酸选自选自具有SEQ ID NO :46到57之核苷酸序列的多核 苷酸的至少一个多核苷酸；选自具有SEQ ID NO 58到61之核苷酸序列的多核苷酸的至少 一个多核苷酸；以及与选自具有SEQ ID NO 58到61核苷酸序列之多核苷酸的至少一个多 核苷酸有效连接的选自具有SEQ ID NO :46到57核苷酸序列之多核苷酸的至少一个多核苷 酸。附图简述通过对本发明的下述描述结合下述附图，本发明上述的和其他的目的和特征将变 得显而易见，所述附图分别显示图IA 包含FVII启动子的pCR-FVII Pro质粒、包含有机阴离子转运多肽 C(OATP-C)启动子的pCR-OATP-C Pro质粒和包含α-抗胰蛋白酶(AAT)启动子/增强子的 pCR-AAT Enh/Pro质粒的示意图；图 IB :mRLuc 萤光素酶表达载体 pmRL-FVII Pro、pmRL_FVII Δ Pro 和 pmRL-OATP-C Pro的示意图，其分别含有FVII启动子、截短的FVII (FVIIA)启动子和OATP-C启动子；图2A:直方图，其显示FVII启动子和OATP-C启动子在人脐静脉内皮细胞系 (HUVEC)、人肝细胞癌细胞系(Huh-7)、人肾细胞系(HEK293)、人肺腺癌上皮细胞系(A549) 和人宫颈癌细胞系(HeLa)中的表达效率；图2B 含有FVII启动子和FVII Δ启动子的萤光素酶表达盒的示意图，以及比较 所述启动子表达效率的直方图；图2C 直方图，其通过与CMV启动子比较的方式显示FVII Δ启动子、OATP-C启动 子、乙型肝炎病毒核心蛋白(HBcP)启动子、内皮糖蛋白(Endoglin)启动子、细胞粘附分子 (ICAM2)启动子和酪氨酸激酶受体(Tie2)启动子的表达效率；图3A :pCR-PAH enh和pCR-AMBP enh质粒的示意图，其分别含有苯丙氨酸羟化酶 (PAH)增强子和α 1-微球蛋白/尿抑胰酶素前体(AMBP)增强子；图 3Β :pmRL-PF、pmRL-AF、pmRL-PAF、pmRL-P0、pmRL-A0 和 pmRL-PAO 表达载体的示 意图，其通过向含有FVII Δ启动子的pmRL-FVII Δ Pro表达载体或者含有OATP-C启动子的 pmRL-OATP-CPro表达载体中插入选自PAH增强子和AMBP增强子中的至少一种构建而成；图4A 直方图，其显示根据PAH增强子和AMBP增强子与FVIIA、0ATP-C、Tie_2和 ICAM2启动子组合方式的不同，在A549、HeLa和Huh_7中的体外萤光素酶表达水平；图4B 直方图，其通过与CMV启动子比较的方式显示当AMBP增强子与FVII启动 子组合时在HEK293、A549、HeLa、Huh-7、人肝癌细胞系0fep3B)和HUVEC中萤光素酶表达效 率；图4C 直方图，其显示在将每种表达载体与聚乙烯亚胺(PEI)或体内jetPEI的混 合物注射入小鼠尾静脉之后，带有表达盒的表达载体在肝组织中的萤光素酶表达效率，所 述表达盒含有PAH增强子、AMBP增强子、CMV增强子和SV40增强子以及图4A中显示的启动 子；图5 不含有UTR的hFIX表达质粒(FIX)和含有UTR的hFIX表达质粒(FIXUTR) ((a))以及含有多种内含子的FIXUTR质粒((b)、(c)和(d))的示意图(SD，剪接供体；SA， 剪接受体；(G)3,三鸟嘌呤基序；BS，分支序列)；
图6A =ELISA结果，其显示从小鼠中获得的血浆样品中的hFIX蛋白表达水平，所 述小鼠通过尾静脉注射 了带有 CMV-hFIXUTR-Synlint、CMV_hFIXUTR-Syn2int、CMV-hFIX 和 CMV-hFIXUTR表达盒的表达载体；图6B =ELISA结果，其显示在每周从免疫缺陷型小鼠获得的血浆样品中的hFIX蛋 白表达水平，所述小鼠中注射了带有CMV-hFIXUTR-Synlint表达盒的重组腺相关病毒的 1XIO9个感染性颗粒(IP)；图7A 萤光素酶表达盒的示意图，所述表达盒在受TK启动子控制的RLuc萤光素 酶基因中含有内含子；图7B:直方图，其显示在用带有表达盒(其含有图7A中多种内含子)的表达载体 转染的H印3B、HEK293和A549细胞中的萤光素酶表达水平；图8A 逆转录PCR (RT-PCR)结果，其显示在总RNA (从用图7B表达载体转染的A549 细胞中提取)中RLuc和β -肌动蛋白的mRNA表达水平；图8B:直方图，其显示用β-肌动蛋白对图8A中所获得的RLuc和β-肌动蛋白 mRNA条带强度进行归一化的RLuc mRNA表达水平；图9A =ELISA结果，其显示从小鼠中获得的血浆样品中的hFIX蛋白表达水平，所述 小鼠通过尾静脉注射了带有 CMV-hFIXUTR-SynlAT、CMV-hFIXUTR-Syn2AT、CMV-hFIXUTR-NA、 CMV-hFIXUTR-ANAL、CMV-hFIXUTR-ΔNAS 表达盒以及作为对照带有 CMV-hFIXUTR-0. 3kbFI Xint (CMV-hFIXm2)表达盒(含0. 3kb FIX内含子)的表达载体；图9B =Western印迹分析结果，其显示在用带有CMV-hFIX、CMV-hFIXUTR和 CMV-hFIXUTR- Δ NAL表达盒的表达载体转染的ΗΕΚ293Τ中的hFIX蛋白表达水平；

图10 示意图，其显示甲胎蛋白、AAT和白蛋白基因的5’端侧翼区中，与在Apo E 基因的LCR中所发现TGTTTGC基序相同或相似的基序的分布；图IlA :pCR-HCR和pCR-HCRm质粒(分别含有HCR(已知为Apo E基因的肝细胞 控制区)和HCRm (已知为截短TGTTTGC基序的最小HCR结构))以及pCR_AAT78001 cr/ pCR-AAT1081cr、pCR-AFP38001cr和pCR_E61cr质粒(分别含有甲胎蛋白、AAT和白蛋白的 TGTTTGC基序)的示意图；图 IlB :pBS-HCRm-AATenh/pro (HmA)质粒(通过向 pBluescriptll 载体中插 入HCRm、AAT增强子和AAT启动子构建而成)和pBS-HCR-AATpro (HA)质粒(通过向 pBluescript II载体中插入HCR和AAT启动子构建而成)的示意图；图12A:表达盒的示意图，其通过向含有PAH增强子、FVIIA启动子和内含子 SynlPLA 的 hFIX 表达盒中引入多种 LCR (HCR、HCRm、AFP3800、AAT7800、AAT108 和 E6)而获 得；图12B =ELISA结果，其显示从小鼠中获得的血浆样品中hFIX蛋白表达水平，所述 小鼠通过尾静脉注射了带有图12A表达盒的表达载体和CMV-hFIXUTR-SynlPLA表达载体；图13A 示意图，其显示含有PAH增强子与FVII Δ启动子(PF)的组合或者PAH增 强子、AMBP增强子与FVII Δ启动子(PAF)的组合、NAL内含子以及AAT108LCR的表达盒； HmA (HCRm-AATenh/pro) -hFIXUTR- Δ NAL 表达盒；以及 HA (HCR-AATpro) -hFIXUTR-1. 4kbFIX int表达盒；图13B =ELISA结果，其显示从小鼠中获得的血浆样品中hFIX蛋白表达水平，所述
9小鼠通过尾静脉注射了带有图13A表达盒的表达载体以及CMV-hFIXUTR-ANAL表达载体；图13C和13D:使用图13B中获得的血浆样品，通过活化部分凝血活酶时间 (activated partial thromboplastin time, APTT)方法所测得的凝血时间和活性；图14A和14B 分别显示从血友病B小鼠中获得的血浆样品中的hFIX蛋白表达水 平(通过ELISA测量)和凝血活性(通过APTT方法测量)的结果，所述小鼠通过门静脉施 用 了带有 AAT108-PF-hFIXUTR- Δ NAL 和 AAT108-PAF_hFIXUTR- Δ NAL 表达盒以及作为对照 带有普通HA-hFIXUTR-1. 4kbFIXint和CMV-hFIXUTR-l. 4kbFIXint表达盒的重组腺相关病 毒的2 X IO9个传染性颗粒(IP)；图15A:表达载体的示意图，其通过向PF-LK68-ANAL_UTR表达盒中引入多种 LCR(HCR、HCRm、AFP3800、AAT7800、AAT108 和 E6)构建而成； 图 15B :AAT108-PF/PAF-LK68 表达载体、AAT108-PF/PAF-LK68-UTR 表达载体和 AAT108-PF/PAF-LK68- Δ NAL-UTR 表达载体的示意图；图16Α 显示从小鼠中获得的血浆样品中LK68蛋白表达水平的ELISA结果，所述 小鼠通过尾静脉注射了带有引入多种LCR(HCR、HCRm, AFP3800、ΑΑΤ7800、AAT108和Ε6)的 PF-LK68-Δ NAL-UTR表达盒的表达载体；图16Β 显示从小鼠中获得的血浆样品中LK68蛋白表达水平的ELISA结果，所述 小鼠通过尾静脉注射了带有已引入UTR或UTR和内含子ANAL的AAT108-PF/PAF-LK68表 达盒的表达载体；图17Α 在ΗΕΚ293细胞及其培养基中LK68蛋白表达水平的Western印迹分析结 果，所述细胞用带有CMV-LK68和CMV-LK68-Δ NAL-UTR表达盒的复制缺陷型腺病毒以不同 的感染复数比率(MOI)进行了转染；以及图17Β 从图17Α的Western印迹分析结果中获得的条带强度的直方图，以显示 UTR和内含子对基因表达的影响。发明详述除非另行定义，否则本文中所用的科技术语具有本发明所属领域的普通技术人员 通常所了解的相同意义。此外，本文中所提到的所有文件均通过参考以其整体并入本文。本文中所用的术语“表达载体”旨在理解为集合体(表达盒或构建体)或包含该 集合体的载体，所述集合体包含编码序列、启动子，并任选地包含与编码序列有效连接的一 个或多个转录调控元件。本文中所用的术语“编码序列”指编码氨基酸或者功能性RNA的DNA序列。本文中所用的术语“转录调控元件(顺式调节元件或顺式作用元件)”指位于编码 序列上游、内部或下游的核苷酸序列，其控制RNA转录，以及所转录RNA的加工、稳定性和随 后的翻译。转录调控元件包括启动子、增强子、内含子、5’和3’非翻译区(UTR)和基因座控 制区(LCR)。本文中所用的术语“启动子”和“增强子”是将编码序列转录成RNA所需的DNA序 列代表片段。通常，启动子是指与聚合酶和转录因子结合的DNA区段，增强子是指与聚合酶 活化结构域结合的DNA区段。本文中所用的术语“非翻译区(UTR) ”是位于编码序列3’端和5’端的序列，其包 含作为转录终止区的多腺嘌呤化信号等。
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本文中所用的术语“内含子”是位于外显子(转录后被翻译为蛋白质)之间的非 翻译核苷酸序列。在通过剪接移除内含子后，转录的mRNA前体转变为成熟mRNA。本文中 所用的术语“内含子”也旨在理解为剪接供体、剪接受体、三鸟嘌呤重复序列(三重G基序) 和/或分支序列。本文中所用的术语“基因座控制区(LCR) ”指具有DNase I敏感性位点的核苷酸序 列。组织特异性的转录因子结合于LCR。本文中所用的术语“有效连接”指一个或多个核酸序列与单个核酸片段偶联，以影 响所述单个片段的功能。例如，启动子与编码序列有效连接以增强所述编码序列的表达。在下文中对本发明进行详细描述。如前所述，对有效的基因疗法，应当在特定组织或细胞中以持续方式特异性表达 靶标基因，以使靶标基因替代致病基因。为实现组织特异性持续基因表达，需要包含改进的 转录调控元件的表达载体。因此，本发明提供截短的FVII(FVIIA)启动子，其具有如SEQ IDN0:42所示的 核苷酸序列，所述核苷酸序列通过从SEQ ID NO :41之核苷酸序列中缺失XhoI (5，端)和 BamHI (3’端)限制性位点而截去504bp FVII启动子的5’端上游207bp片段而产生。下述 实施例显示所述FVII Δ启动子具有的活性是未截短FVII启动子的2. 5倍或更高。FVII Δ启动子可与合适的增强子(例如选自具有如前所述SEQ IDNO 44中核苷 酸序列的PAH增强子和具有如前所述SEQ ID NO :45中核苷酸序列的AMBP增强子中的至少 一种)组合。本发明也提供内含子，其选自具有如前所述SEQ ID NO 46到57中核苷酸序列的
多核苷酸。SEQ ID NO :46、47和48的内含子分别由截短人抗凝血酶、纤维蛋白溶酶原和凝血 酶原的内含子1而产生。SEQ ID NO :49、50和51的内含子是合成的内含子，其分别包含SEQ ID NO :46、47和48之核苷酸序列，并共有剪接受体序列、来源于人α-珠蛋白内含子2的三 鸟嘌呤重复序列(三重G基序)、人纤维蛋白溶酶原的分支序列以及共有的剪接受体序列。 SEQ ID NO :52、53和54的内含子是合成的内含子，其分别缺少SEQ ID Ν0:49、50和51之 核苷酸序列的三重G基序和分支序列。SEQ ID NO :55的内含子是合成内含子，其包含抗凝 血酶的全长内含子1、剪接供体序列和共有的剪接受体序列；SEQ ID NO 56和57的内含子 是合成的内含子，其由截短SEQ ID NO :55之核苷酸序列而产生。在上述内含子中，更优选 SEQ ID NO 57的内含子。本发明还提供基因座控制区(LCR)，其选自具有如SEQ ID NO 58到61所示核苷 酸序列的多核苷酸。SEQ ID NO :58、59、60和61的LCR分别位于人α 1-抗胰蛋白酶基因上游_108bp 和-7. 8kb处、人甲胎蛋白上游-3. 8kb处和人白蛋白基因上游-6kb处，其中优选SEQ ID NO 58 的 LCR。与本发明中所提到的序列基本相同且功能相似的多核苷酸也在本发明的范围之 内。术语“基本相同且功能相似的多核苷酸”指某一多核苷酸与另一多核苷酸至少有70%、 优选80%、更优选90%、最优选95%的同一性，其中所述同一性由计算机算法或软件所确定。
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本发明还提供表达载体，其包含转录调控元件和与所述转录调控元件有效连接并 受其控制的编码序列，其中所述转录调控元件包括1)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸；2)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸以及与SEQ ID NO 42之多核苷 酸有效连接的至少一个多核苷酸，后者选自具有SEQ IDNO :44和45之核苷酸序列的多核苷 酸；3)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸以及与SEQ ID NO 42之多核苷 酸有效连接的至少一个多核苷酸，后者选自具有SEQ IDNO :46到57之核苷酸序列的多核苷 酸；4)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸以及与SEQ ID NO 42之多核苷 酸有效连接的至少一个多核苷酸，后者选自具有SEQ IDNO :58到61之核苷酸序列的多核苷 酸；5)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸；选自具有SEQ IDNO 44和45之 核苷酸序列的多核苷酸的至少一个多核苷酸；以及选自具有SEQ ID NO :46到57之核苷酸 序列的多核苷酸的至少一个多核苷酸；所述多核苷酸彼此有效连接；6)具有SEQ ID NO :42之核苷酸序列的多核苷酸；选自具有SEQ IDNO 44和45之 核苷酸序列的多核苷酸的至少一个多核苷酸；以及选自具有SEQ ID NO 58到61之核苷酸 序列的多核苷酸的至少一个多核苷酸；所述多核苷酸彼此有效连接；7)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸；选自具有SEQ IDNO 46到57之 核苷酸序列的多核苷酸的至少一个多核苷酸；以及选自具有SEQ ID NO 58到61之核苷酸 序列的多核苷酸的至少一个多核苷酸；所述多核苷酸彼此有效连接；或者8)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸；选自具有SEQ IDNO 44和45之 核苷酸序列的多核苷酸的至少一个多核苷酸；选自具有SEQ ID NO :46到57之核苷酸序列 的多核苷酸的至少一个多核苷酸；以及选自具有SEQ ID NO 58到61之核苷酸序列的多核 苷酸的至少一个多核苷酸；所述多核苷酸彼此有效连接。本发明还提供表达载体，其包含转录调控元件和与所述转录调控元件有效连接并 受其调控的编码序列，所述转录调控元件包含启动子和与所述启动子有效连接的多核苷 酸，所述多核苷酸选自选自具有SEQ IDNO :46到57之核苷酸序列的多核苷酸的至少一个 多核苷酸；选自具有SEQ ID NO :58到61之核苷酸序列的多核苷酸的至少一个多核苷酸； 以及与选自具有SEQ ID NO :58到61核苷酸序列之多核苷酸的至少一个多核苷酸有效连接 的选自具有SEQ ID NO :46到57核苷酸序列之多核苷酸的至少一个多核苷酸。优选地，表达载体还可包含在编码序列5，和3，端具有SEQ ID NO 62和63之核 苷酸序列的多核苷酸。SEQ ID NO 62和63的核苷酸序列可来自FIX基因的5，和3，UTR0编码序列可选自编码肝特异性蛋白质的核苷酸序列，所述蛋白质包括但不限于 白蛋白、甲胎蛋白、α-葡萄糖苷酶、α -抗胰蛋白酶、抗凝血酶、脂蛋白、血浆铜蓝蛋白、 FVII, FVIII、FIX、红细胞生成素、纤维蛋白原、葡糖脑苷脂酶、触珠蛋白、IGF-1、胰岛素、纤 维蛋白溶酶原、凝血酶原和转铁蛋白。编码序列与启动子、增强子、内含子、UTR和LCR有效且可控地连接。如上所述，本发明转录调控元件的适当组合能够实现靶标编码序列的肝组织特异性表达，并有助于mRNA稳定，因此使编码序列的表达被提高。包含上述转录调控元件的各 种组合的表达盒或载体能够使靶标编码序列在肝组织中以高水平持续表达，因此可广泛应 用于血栓形成、血友病、肝癌等的治疗。下述实施例旨在举例说明本发明而不限制其范围。实施例1 肝组织特异性表达启动子和增强子的分离和活性分析<步骤1>肝组织特异性表达启动子的分离和活性分析使用DNeasy Tissue Kit(Qiagen)从人肝细胞系(Chang细胞)的细胞裂解物中提 取基因组DNA。为了分离FVII启动子，使用作为模板的基因组DNA、SEQ ID NO :1和2的引 物组和DNA聚合酶(Ex-TaqJakara)进行PCR，以获得具有SEQ ID NO 41之核苷酸序列的 DNA片段。具体地，PCR按照如下条件进行首先在94°C变性5分钟；94°C变性30秒、56°C退 火30秒和72°C延伸1分钟的30个循环；72 °C最终延伸3分钟。将PCR产物通过凝胶提取 进行纯化，并插入到PCR2. 1-T0P0质粒载体中。具有SEQ ID NO 41之核苷酸序列的FVII启 动子通过限制性酶切图谱和序列分析进行鉴定。含有FVII启动子的质粒命名为“pCR-FVII pro”。此外，如前文所述进行PCR(但使用OATP-C启动子的引物组(SEQ ID NO :3禾P 4)和 AAT启动子的引物组(SEQ ID NO 5和6)之外，将PCR产物插入到pCR2. 1-TOPO质粒载体 中。OATP-C启动子(具有SEQ ID NO :43之核苷酸序列)和AAT启动子通过限制性酶切图 谱和序列分析进行鉴定。含有OATP-C启动子和AAT启动子的质粒分别命名为“pCR-OATP-C pro” 禾口“pCR-AAT enh/pro，，。pCR-FVII pro,pCR-OATP-C pro 禾口 pCR-AAT enh/pro 的示意 图显示于图IA中。将表达Renilla萤光素酶的phRL-null载体(Promega)中的SV40晚期poly (A)替 换成人生长激素的poly(A)，并且从其中去除T7启动子和内含子，以构建pmRL-null载体。 将所述pmRL-null载体用限制性酶BglII进行消化并用虾碱性磷酸酶进行处理。用BamHI消化pCR-FVI I pro和pCR-OATP-C pro质粒。所得到的DNA片段通过凝 胶提取进行纯化，并插入到预先制备好的pmRL-null载体中。通过限制性酶切图谱在每个 质粒载体中鉴定所需DNA片段。所述质粒载体命名为“pmRL-FVII Pro”和“pmRL_0ATP-C Pro”。同时，用EcoRI限制性酶截掉pmRL-FVII Pro中FVII启动子5，端约200bp的片 段，然后通过连接来构建带有截短FVII (FVIIA)启动子(具有SEQ ID NO :42之核苷酸序 列)的 pmRL-FVII Δ Pro 质粒。pmRL-FVII Pro、pmRL-OATP-C Pro 和 pmRL-FVII Δ Pro 的示意图显示于图 IB 中。在人肝细胞系(Huh-7、H印G2、H印3B)、肾细胞系(HEK293)、肺癌细胞系(A549)和 宫颈癌细胞系(HeLa)中测量 pmRL-FVII Pro、pmRL_FVII Δ Pro 和 pmRL-OATP-C Pro 的萤光 素酶表达水平。具体地，用聚乙烯亚胺(PEI)试剂(Polyplus, Illkirch, France)在六孔 板的每一个孔中培养细胞，以达到70到80%的汇合。将培养的细胞用2 μ g的pmRL-FVII Pro、pmRL-FVII Δ Pro 和 pmRL-OATP-C Pro 质粒中每一种和 pcDNA-lacZ 质粒 1 μ g 进行转 染，并于37°C培养24小时。对细胞进行收集，并以3，OOOrpm离心5分钟以分离细胞和培养 基。在 100 μ 1 裂解缓冲液(25mM Tris-磷酸、pH 7. 8、2mM DTT (二硫苏糖醇)、2mM 1，2_ 二 氨基环己烷N，N，N，N'-四乙酸、10%甘油、Triton X-100)中重悬细胞，然后冻融(3 次)以完全裂解细胞。细胞裂解物以10，OOOrpm离心1分钟。对所得上清液进行半乳糖苷
13酶测定和Bradford测定，以使转染效率归一化，启动子活性通过萤光素酶活性分析进行测 定。结果显示于图2A中。如图2A中所示，FVII启动子和OATP-C启动子在肝细胞系Huh_7中诱导更高水平 的萤光素酶表达。在他11-7细胞中斤￥11八启动子表现出的活性为FVII启动子的2.5倍(见图2B)。在他11-7细胞中斤￥11八启动子表现出的表达效率为CMV启动子的1.4%，在来源 于肝组织之外的其他组织的细胞系中平均为CMV启动子表达效率的0. 07%。然而，与CMV 启动子不同，FVII Δ启动子对肝组织的特异性是其他组织的20倍(见图2C)。这一结果显 示，FVIIA启动子提高靶标基因的表达效率而对肝组织特异性无不利影响，因此其适用于 在肝组织中选择性作用的表达载体。在图2C，(-)代表阴性对照(缺少启动子)，ICAM2代 表细胞内粘附分子的启动子，Tie2代表酪氨酸激酶受体的启动子，内皮糖蛋白代表内皮糖 蛋白的启动子，HBcP代表乙型肝炎核心蛋白启动子。〈步骤2>分离增强子为了分离PAH增强子，如〈步骤1>所述进行PCR，但使用PAH增强子的弓丨物组(SEQ ID N0:7和8)。将PCR产物通过凝胶提取进行纯化，并插入到pCR2. 1-T0P0质粒载体中。 具有SEQ ID NO :44之核苷酸序列的PAH增强子通过限制性酶切图谱和序列分析进行鉴定。 所述质粒命名为“pCR-PAHenh”。此外，重复上述步骤，但使用AMBP增强子的引物组(SEQ ID NO 9和10)，以构建带有AMBP增强子(具有SEQ ID NO 45之核苷酸序列)的pCR-AMBPenh 质粒。pCR-PAHenh和pCR-AMBPenh质粒的示意图显示于图3A中。将PAH 和 AMBP 增强子通过用 SpeI 和 XbaI 消化 pCR-PAHenh 和 pCR-AMBPenh 质 粒加以分离，通过凝胶提取进行纯化，并插入到 < 步骤1>中所制备的pmRL-FVII ΔΡΓ0和 pmRL-OATP-C Pro 载体的 SpeI 位点。与 PAH 增强子组合的 pmRL-FVII Δ Pro 和 pmRL-OATP-C Pro分别命名为“pmRL-PF”和“pmRL-P0”。与AMBP增强子组合的pmRL-FVII Δ Pro和 pmRL-OATP-C Pro 分另Ij 命名为 “pmRL—AF，，禾口 “pmRL—AO，，。使用 SpeI 禾口 XbaI 从 pmRL-PF 中提取PAH增强子，并将其插入到pmRL-AF和pmRL_A0的SpeI位点。所得的载体命名为 "pmRL-PAF"禾口 “pmRL-PAO，，。pmRL-PF、pmRL-P0, pmRL—AF、pmRL—AO、pmRL-PAF 禾口 pmRL-PAO 载体的示意图显示于图3B中。根据上述步骤，向OATP-C和FVII启动子的上游插入能以非组织特异性的方式增 强启动子活性的CMV和SV40增强子。<步骤3>根据启动子与增强子的组合分析靶标基因的表达效率<3_1>体外测试在人肝细胞系(Huh-7)和对照细胞系(即人肺细胞系(A549)和人宫颈癌细胞系 (HeLa))中，以与 < 步骤1>中相同的方式测量 < 步骤2>中所构建的载体的基因表达效率。 结果显示于图4A中。如图4A中所示，带有PAH增强子和FVII Δ启动子的载体在肝细胞系Huh_7中的特 异性平均为其他细胞系的28. 4倍。这显示PAH增强子使FVII Δ启动子的组织特异性提高 了 1.42倍。AMBP增强子使FVIIA启动子的组织特异性提高了 213. 7倍或更多，这大约是 由AMBP增强子引起的OATP-C启动子组织特异性提高(65. 6倍)的3倍。上述结果显示， 增强子可显著提高FVII Δ启动子的肝选择性。
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为了测量AMBP增强子和FVII Δ启动子控制下的表达载体相对于CMV启动子控制 下的表达载体的活性，在人肝细胞系(Huh-7、Hep3B)和对照细胞系(即肾细胞系(HEK293)、 肺癌细胞系(A549)、宫颈癌细胞系(HeLa)和血管内皮细胞系(HUVEC))中测量了萤光素酶 的表达水平。结果显示于图4B中。如图4B中所示，在肝细胞系中，含有AMBP增强子和FVIIA启动子的表达载体表 现出的萤光素酶表达效率为含有CMV启动子的表达载体的8. 7% ；在其他细胞系中，其平均 为含有CMV启动子的表达载体的萤光素酶表达效率的0. 14%。这显示含有AMBP增强子和 FVII Δ启动子的表达载体的肝组织特异性约为其他组织的62倍高。<3_2>体内测试为了测量在肝中的体内基因表达效率，向小鼠尾静脉中注射 < 步骤2>的pmRL质 粒与聚乙烯亚胺(PEI) (Polyplus, Illkirch,France)或体内 jetPEI (Polyplus, Illkirch, France)的每种复合物。两天后，从所述小鼠中取出肝，并测量萤光素酶表达水平。具体而言，在5%葡萄糖溶液中将 40 μ g 的 pmRL-P0、pmRL-PF、pmRL-A0 和 pmRL_AF 质粒中每一种和pcDNA-LacZ质粒10 μ g以与PEI或体内jetPEI的复合物的形式注射入 小鼠(六周龄)尾静脉中。两天后，将肝、肾、心脏、脾和肺组织从小鼠中分离，并在PBS溶 液中用勻浆器进行勻浆。然后，将500μ 1所得组织溶液与500μ 1 2Χ裂解缓冲液(50mM Tris-磷酸、pH 7. 8、4mM DTT (二硫苏糖醇)、4mM 1，2-二氨基环己烷N，N，N，N'-四乙酸、 20%甘油、2%TritOn X-100)混合，其后进行冻融(3次)以完全裂解细胞。细胞裂解物 以10，OOOrpm离心1分钟。所得上清进行半乳糖苷酶测定和Bradford测定以使转染效率 归一化，基因表达效率通过萤光素酶活性测定进行测量。结果显示于图4C中。如图4C中所示，在肝组织中，由含有FVII Δ启动子/PAH增强子的表达载体与PEI 的复合物诱导的萤光素酶表达水平等于由CMV启动子诱导的14%，这是萤光素酶表达体外 测定的14倍或更高。由FVII △启动子/AMBP增强子诱导的肝特异性萤光素酶表达水平等 于由CMV启动子诱导的80%，这是萤光素酶表达体外测定的10倍或更高。用体内jetPEI代替PEI提高了肝中的基因表达效率。具体地，由含有OATP-C启 动子/PAH增强子的表达载体与体内jetPEI的复合物诱导的肝特异性萤光素酶表达水平等 于由CMV启动子诱导的约38%，由FVII Δ启动子/PAH增强子诱导的萤光素酶表达水平等 于由CMV启动子诱导的约80%。由FVII Δ启动子/AMBP增强子和体内jetPEI的复合物诱 导的肝特异性萤光素酶表达水平与由CMV启动子诱导的相似。这些结果显示，本发明启动 子和增强子的活性在体内优于体外。实施例2 分离hFIX UTR和肝特异性基因的内含子，并分析UTR和内含子的基因 表达效率<步骤1>鉴定hFIX的UTR并构建包含UTR的表达载体使用RNA提取试剂盒(Pharmacia Biotech)从Ig人肝组织中提取了 1. 2mg的总 RNA,预先用勻浆器对所述组织进行勻浆。使用作为模板的所提取RNA、M-MuLV逆转录酶 (Takara)和oligo_dT17引物(Takara)合成单链DNA，使用DNA聚合酶I (Takara)由单链 DNA合成双链cDNAo为了评估FIX UTR对基因表达效率的影响，使用作为模板的cDNA、从FIX核苷酸序 列(Genbank登录号ΝΜ000133)设计的引物组(SEQ ID NO 11和12)和Ex-Taq进行PCR，
15以获得具有 5，UTR(SEQ ID NO 62)和 3，UTR(SEQ ID NO 63)的 FIX cDNA。PCR 条件如下: 首先94°C变性5分钟；94°C变性1分钟、56 °C退火1分钟、72 °C延伸1分钟的30个循环 ’最 后72 °C延伸3分钟。除了使用SEQ ID NO 13和14的引物组之外，重复上述步骤，以获得不含UTR的 FIX cDNA作为对照。将扩增的DNA片段用限制性酶NotI和SalI进行消化，通过凝胶提取进行纯化，并 插入到pBluescript SK(+)载体的NotI和SalI限制性位点。包含所需UTR的FIX和不含 UTR的FIX通过限制性酶切图谱和序列分析进行鉴定。所述载体分别命名为“pBS-hFIXUTR” 和 “pBS-hFIX”(见图 5(a))。<步骤2>分离肝特异性基因的内含子并构建包含内含子的表达载体<2_1>构建 pCR-int首先，进行PCR以获得包含人抗凝血酶、纤维蛋白溶酶原和凝血酶原内含子1中 5'端约300bp的片段。具体而言，使用实施例1〈步骤1>中所述的基因组DNA(作为模板)以及人抗凝 血酶内含子(SEQ ID N0:15和16)、人纤维蛋白溶酶原内含子(SEQ ID N0:17和18)和人 凝血酶原酶内含子(SEQ ID NO 19和20)的引物组在下述条件下进行PCR 首先94°C变 性5分钟；94°C变性1分钟、60°C退火1分钟、72°C延伸2分30秒的30个循环；最后72°C 延伸3分钟。将PCR产物通过凝胶提取进行纯化，并插入到pCR2. 1-T0P0载体中。SEQ ID NO :46、47和48的内含子通过限制性酶切图谱和序列分析进行鉴定。所述质粒分别命名为 "pCR-ATint，，、“pCR-PLAint，，禾口 "pCR-PTint，，。进一步地，为了分离Kurachi S所报道的FIX内含子1，重复上述PCR步骤，但使用 FIX内含子1的引物组(SEQ ID NO :21和22)，并将所获得的PCR产物插入到pCR2. 1-TOPO 载体中。所产生的质粒载体用限制性酶PvuI或ScaI进行消化，并进行自连。具有不 同大小的FIX内含子通过限制性酶切图谱和序列分析进行鉴定。所述质粒分别命名为 "pCR-1. 4kbFIXint” 和 “pCR-0. 3kbFIXint，，。<2-2> 构建 pBS-FIX-Synlint在FIX的外显子1和2之间插入<2-1>中所制备的pCR-ATint、pCR-PLAint和 pCR-PTint内含子片段。具体而言，重复<2-1>的PCR，但使用FIX 5，UTR的有义引物(SEQ ID NO 11)和 共有剪接供体序列GTAA和三重G基序(来源于人α-珠蛋白的内含子2)的反义引物(SEQ ID NO :23)，以获得包含FIX的5’ UTR和外显子1、剪接供体和人α-珠蛋白三重G基序的 DNA片段。进一步地，重复上述PCR，但使用人纤维蛋白溶酶原的分支序列和共有剪接受体 序列TCGA的有义引物(SEQ ID NO 24)和FIX3，UTR的反义引物(SEQ ID NO 12),以获得 包含分支序列、剪接受体、外显子2至8和FIX 3’UTR的DNA片段。将PCR产物通过凝胶提 取进行纯化，并插入到PCR2. 1-T0P0载体中。所需的DNA片段通过限制性酶切图谱和序列 分析进行鉴定。所述质粒分别命名为“pCR-5’ hFIX”和“pCR-3’ hFIX”。将pCR-5，hFIX和pCR-3'hFIX分别用限制性酶NotI和NdeI以及NdeI和SalI进 行消化，均插入到pBluescript的NotI和SalI限制性位点。所得质粒用NdeI进行消化， 并插入用相同的酶(NdeI)预处理的<2-1>的pCR-ATint、pCR-PLAint和pCR-PTint中。所需的SEQ IDN0:49、50和51内含子通过限制性酶切图谱和序列分析进行鉴定。所述质粒分 别命名为 “pBS-hFIXUTR-SynlAT” “pBS-hFIXUTR-SynlPLA” 和 “pBS-hFIXUTR-SynlPT，，。所 述质粒的示意图显示于图5(b)中。<2-3> 构建 pBS-FIX_Syn2int将<2-2>的pBS-FIXUTR-SynlPLA质粒用XhoI和AatII进行消化(针对与剪接 供体和受体相邻的XhoI和AatII限制性位点)，并插入用相同的酶(XhoI和AatII)预处 理的 <2-1> 的 pCR-ATint、pCR-PLAint、pCR-PTint、pCR-1. 4kbFIXint 和 pCR-0. 3kbFIXint 中。Syn2AT、Syn2PLA 和 Syn2PT (SEQ ID NO : 52、53 和 54)的内含子以及 1. 4kbFIXint 和0.3kbFIXint的内含子通过限制性酶切图谱进行鉴定。所述质粒分别命名为 “pBS-hFIXUTR-Syn2AT”、“pBS-hFIXUTR-Syn2PLA”、“pBS-hFIXUTR-Syn2PT”、“pBS-hFIXUTR-1. 4kbFIXint (hFIXml) ”和“pBS-hFIXUTR-O. 3kbFIXint (hFIXm2) ”。所述质粒的示意图显示 于图5(c)中。<2-4>分离抗凝血酶全长内含子1并构建缩短的抗凝血酶内含子重复<2_1>的PCR，但使用SEQ ID NO 15和25的引物组，以扩增包含抗凝血 酶全长内含子1的片段。将大约2. 3kb的PCR产物插入到pCR2. 1-T0P0载体中，其命名 为“pCR-NAint”。所得的质粒用XhoI和AatII进行消化，并根据<2_3>的步骤插入到 pBS-hFIXUTR 中，以获得包含 SEQ ID NO 55 内含子的 pBS-hFIXUTR-NA。使用Kilo-Sequence Deletion Kit(Takara)从 PvuII 位点截短在 pBS-hFIXUTR-NA中所插入的内含子。具体地，将pBS_FIXUTR_NA用PvuII进行消化，用核 酸外切酶III在25°C降解15秒、30秒、45秒和1分钟，用绿豆核酸酶和klenow酶进行末 端补平，最后进行自连。将所得的构建体转化到大肠杆菌中。将所得的转化体在氨苄青霉 素平板上进行培养并从其中筛选单菌落，来源于所述菌落的质粒中内含子的大小使用限制 性酶通过电泳进行鉴定。对带有正确大小内含子的质粒进行纯化和测序，以获得包含SEQ ID NO 56 的 811bp 内含子的质粒 pBS-hFIXUTR-ΔNAL 以及包含 SEQ ID NO 57 的 640bp 内含子的质粒 pBS-hFIXUTR- Δ NAS。所述质粒 pBS-hFIXUTR-NA、pBS-hFIXUTR- Δ NAL 和 pBS-hFIXUTR-ANAS的示意图显示于图5(d)中。<步骤3>分析UTR和内含子对FIX表达的影响将〈步骤1>和〈步骤2>中所制备的pBS-hFIX、pBS-hFIXUTR、 pBS-hFIXUTR-Synlint(AT, PLA, PT)和 pBS_hFIXUTR-Syn2int(AT、PLA, ΡΤ、1· 4kbFIXint、 0. 3kbFIXint)质粒用NotI和SalI进行消化，并插入到含有CMV启动子和牛poly (A) 的pTRUF6腺相关病毒载体中，以获得hFIX表达载体CMV_hFIX、CMV_hFIXUTR、 CMV-hFIXUTR-Synlint(AT, PLA, PT)和 CMV_hFIXUTR-Syn2int(AT、PLA, ΡΤ、1· 4kbFIXint、 0.3kbFIXint)。将25 μ g上述表达载体的质粒DNA注射到C57BL/6小鼠尾静脉中。第二天，收集 血液样品用于下述ELISA。将所得血液样品在HBS-BSA-EDTA-T20 缓冲液(0. 1MHEPES-0. IM NaCl-I % BSA-IOmM EDTA-0. 1 % Tween-20)中稀释100倍。将稀释的血液样品加入到包被了人 FIX (hFIX)抗体(Affinity Biologicals)的 96 孔板中，于室温培养 90 分钟，用 PBS-0. 1% Tween-20洗涤，并与过氧化物酶标记的二抗孵育。将平板再次用PBS-0. 1% Tween-20进
17行洗涤，并向其中加入溶有0-苯二胺和H2O2的底物缓冲液。将平板孵育5分钟，并用2. 5M H2SO4 终止反应。用分光光度计(Spectra Shell Microplate Reader, STL Spectra,Milan, Italy)在490nm测量吸光度，根据标准吸光度对标准浓度的标准曲线计算样品中的hFIX浓 度。结果显示于图6A中。如图6A中所示，注射后第二天，由CMV-hFIXUTR所诱导的hFIX蛋白的血液浓度约 为910ng/ml，是由不含UTR的CMV-hFIX所诱导蛋白(540ng/ml)的约1. 7倍。这表明UTR 有助于hFIX的表达。CMV-hFIXUTR-SynlPLA 的 hFIX 表达水平(1，480ng/ml)高至 CMV_hFIXUTR(910ng/ ml)的 1. 6 倍，CMV-hFIXUTR-Syn2AT 的 hFIX 表达水平(2，170ng/ml)高至 CMV-hFIXUTR(910ng/ml)的2. 4倍。这表明该内含子参与hFIX基因表达及最初的hFIX蛋 白诱导。同时，使用表达载体 CMV-hFIX、CMV-hFIXUTR 和 CMV-hFIXUTR-Synlint (AT、 PLA, PT)产生重组腺相关病毒 rAAV-CMV-hFIX、rAAV-CMV-hFIXUTR 和 rAAV-CMV-hFIXUTR-Synlint (AT、PLA, PT)。具体地，在 500mlSpinner 瓶中制备 200ml 的 HEK293T细胞，用低钙DMEM培养基(0. ImM Ca++、0. 1 % PL-68U % FBS)将所述细胞调整成 1 X IO6个细胞/ml的浓度。向细胞中载入包含33 μ g的表达载体中每一种、167 μ g的腺病 毒辅助质粒PDG和650 μ 1的10 μ M PEI的DNA-PEI混合物，并将所述细胞在5% CO2培养 箱中以30rpm悬浮培养6小时。然后，将培养基更换成100 μ g硫酸葡聚糖低钙DMEM。培养 48小时后，收集细胞，对其进行冻融(3次)并以2000rpm离心5分钟。所得上清液通过碘 克沙醇梯度超速离心法进行纯化(Zolotukhin，S.等，Gene Ther.，6 :973_985 (1999))。将 IX IO9个感染性颗粒(IP)注射到免疫缺陷型裸鼠(Japan SLC Inc)的尾静脉中。两周后， 每周收集一次血液样品，并将其用于上文所描述的ELISA。结果显示于图6B中。如图6B中所示，病毒注射后14周时，包含本发明内含子的病毒的hFIX表达水平 是不含内含子的病毒的10到20倍。具体地，带有CMV-hFIXUTR-SynlAT的病毒的hFIX蛋 白浓度为19，996pg/ml，而带有CMV-hFIXUTR的病毒的hFIX蛋白浓度为2，024pg/ml。这表 明本发明内含子在增强基因表达方面发挥关键作用。<步骤4>分析内含子对萤光素酶表达效率及mRNA稳定性的影响<4-1>向由TK启动子控制的萤光素酶表达载体中引入内含子将pRL-TK表达载体(promega)用Hindlll/Nhel消化以去除SV40内含子，其后进 行末端补平及自连。内含子截短的PRL-TK载体命名为“pRL-Aint”，含有SV40内含子的 pRL-TK 载体命名为 “pRL-SV40”。将<2-2> 和 <2-3> 中得到的 pBS-hFIXUTR-SynlAT、pBS-hFIXUTR-SynlPLA 和pBS-hFIXUTR-0. 3kbFIXint用Xhol/Aatll进行消化及末端补平。将所得片段插入 到上述表达载体pRL- Δ int0所得载体分别命名为“pRL-SynlAT”、“pRL-SynlPLA”和 “pRL-hFIXm2”(见图 7A)。<4_2>分析萤光素酶表达效率如实施例1〈步骤1>中所述，将2yg<4-l>的萤光素酶表达载体、Iyg β-半 乳糖苷酶表达载体和6yg PEI(polyplus)的复合物注射到肝细胞系0fep3B)、肾细胞系 (HEK293)和肺细胞系(A549)中。48小时后，收集细胞并根据与实施例1<步骤1>中相同
18的方法测量萤光素酶表达效率。结果显示于图7B中。如图7B中所示，由含有内含子的表达载体所诱导的萤光素酶表达高达由不含内 含子的表达载体所诱导的200倍(SynlAT在H印3B肝细胞系中表达的情况)。特别地， SynlAT表达载体明显有助于萤光素酶活性的诱导以及如 < 步骤3>中所述的FIX表达的诱导。<4-3>分析mRNA表达稳定性根据与<4_2>中相同的方法，将<4_1>的萤光素酶表达载体转染到A549肺细胞系 中，48小时后收集细胞。使用FastPure RNA试剂盒(Takara)从所述细胞中提取总RNA。使 用500ng每种总RNA (作为模板)和AMV逆转录酶(Takara)制备单链DNA。然后，使用上述 单链DNA(作为模板)以及检测萤光素酶和肌动蛋白的引物组进行PCR。结果显示于图 8Α禾口 8Β中。如图8Α和8Β中所示，由pRL_SynlAT载体所诱导的RLuc mRNA相对量是由 pRL-Δ int所诱导的RLuc mRNA的1. 7倍。这表明，本发明内含子导致了 mRNA的更高稳定 性，这种更高的稳定性导致增强的基因表达。<步骤5>分析抗凝血酶内含子对FIX表达的影响为了确定抗凝血酶内含子对hFIX蛋白表达的影响，根据与〈步骤3>中相同的方 法，将 <2-4> 中所制备的 pBS-hFIXUTR-NA、pBS-hFIXUTR- Δ NAL 和 pBS-hFIXUTR-NAS 质粒 插入到pTRUF6腺相关病毒中，以获得表达载体CMV-hFIXUTR-NA、CMV-hFIXUTR-ΔNAL和 CMV-hFIXUTR- Δ NAS0根据与 < 步骤3>中相同的方法，将表达载体CMV_hFIX、CMV_hFIXUTR、 CMV-hFIXUTR-0. 3kbFIXint (CMV_hFIXm2)、CMV-hFIXUTR-SynlAT、CMV_hFIXUTR_Syn2AT、 CMV-hFIXUTR- Δ ΝΑ、CMV-hFIXUTR- Δ NAL 和 CMV-hFIXUTR- Δ NAS 的质粒 DNA 注射到小鼠尾 静脉中，并通过ELISA测量受试者血液hFIX浓度。结果显示于图9A中。如图9A中所示，含有合成或天然抗凝血酶内含子的表达载体的hFIX蛋白浓 度是 CMV-hFIXUTR 的 1. 7 到 3. 5 倍(1，730 到 3，540ng/ml 对 1，000ng/ml)。特别地， CMV-hFIXUTR- Δ NAL表达载体表现出的表达效率是以前所构建的CMV_hFIXm2表达载体的 约1. 7倍(2，010ng/ml对1，000ng/ml)。这表明ANAL内含子非常适于hFIX的过表达。同时，为了在体外评估内含子八嫩1^对1^1乂表达的影响，将表达载体01^-1^1父、 CMV-hFIXUTR和CMV-hFIXUTR- Δ NAL转染到ΗΕΚ293Τ肾细胞系中。转染后两天，收集细胞及 培养基并进行裂解。裂解物中hFIX蛋白水平通过使用hFIX抗体的电泳法进行测量，结果 显示于图9B中。如图9B中所示，CMV-hFIXUTR-Δ NAL表达载体诱导的hFIX表达水平是CMV-hFIX 和CMV-hFIXUTR表达载体的1. 55倍。这一结果表明Δ NAL内含子对于hFIX过表达是很有 效的。实施例3 分离肝特异性LCR并分析LCR的基因表达效率<步骤1>分离肝特异性LCR并构建包含LCR的质粒载体在仅表达于肝组织中的α 1-抗胰蛋白酶、甲胎蛋白和白蛋白基因的下游分析 TGTTTGC基序的位置。结果显示于图10中。如图10中所示，七个TGTTTGC基序分布在α 1_抗胰蛋白酶基因的_7. 8kb，六个基 序为正向的，一个基序为反向的；还有一个正向的基序位于α 1-抗胰蛋白酶基因的-108bp位点。在甲胎蛋白-3. 8kb位点，两个TGTTTGC基序以正向分布，一个基序为反向；在白蛋白 基因的-6kb位点，一个基序为反向。此外，TGTTTGC基序在α 1_抗胰蛋白酶基因_800bp位 点、甲胎蛋白基因-1. 5kb和-500bp位点以及白蛋白基因-IOkb, -3. 5kb和-2. 6kb位点聚 簇。在这些位点中，对α 1-抗胰蛋白酶基因-7. 8kb和_108bp位点、甲胎蛋白基因的-3. 8kb 位点和白蛋白基因_6kb位点进行分离。具体而言，为了分离位于α 1-抗胰蛋白酶基因-108bp位点的LCR，使用实施例1< 步骤1>的基因组DNA (作为模板)、SEQ ID NO 26和27的引物组和DNA聚合酶(EX_Taq、 Takara)根据与实施例1<步骤1>中相同的方法进行PCR。将PCR产物通过凝胶提取进行 纯化，并插入到PCR2. 1-T0P0载体中。所需具有SEQ ID NO :58之核苷酸序列的α 1-抗胰 蛋白酶LCR通过限制性酶切图谱和序列分析进行鉴定。所述质粒命名为“pCR-AAT1081cr”。相似地，重复上述PCR步骤，但使用引物组SEQ ID N0:28和29、SEQ ID NO 30禾口 31以及SEQ ID NO :32和33，以分别扩增位于人α 1-抗胰蛋白酶的-7. 8kb位点、人甲胎蛋 白的-3. 8kb位点和人白蛋白基因的_6kb位点的LCR。将PCR产物插入到pCR2. 1-T0P0载 体中。所需具有SEQ ID NO :59、60和61之核苷酸序列的LCR通过限制性酶切图谱和序列分 析进行鉴定。所述质粒分别命名为“pCR-AAT78001cr”、“pCR-AFP38001cr”和“pCR-E61cr”。同时，为了分离Dang Q.所报道的人载脂蛋白E (ApoE)基因的肝细胞控制区(HCR) 和最小结构HCR(HCRm)，使用引物组SEQ IDN0:34和35以及SEQ ID NO :34和36进行PCR， 并将所得的PCR产物插入pCR2. 1-T0P0载体中。人ApoE基因的HCR和HCRm通过限制性酶 切图谱和序列分析进行鉴定。所述质粒分别命名为“pCR-ApoEHCR”和“pCR-ApoEHCRm”。这 些质粒的示意图显示于图IlA中。进一步地，将AAT基因的增强子和启动子与HCRm的组合插入到pBluescript II 载体中以构建pBS-HCRm-AATenh/pro (HmA)，将AAT基因的启动子与HCR的组合插入到 pBluescript II载体中以构建pBS-HCR-AATpro (HA)。这些质粒的示意图显示于图IlB中。〈步骤2>分析LCR的基因表达效率对 < 步骤1>中所分离的LCR与启动子、增强子及内含子的组合，对FIX表达效率 的影响进行评估。具体而言，将〈步骤1> 中所制备的 pCR-AAT1081cr、pCR_AAT7800cr、 pCR-AFP38001cr、pCR_E61cr、pCR-HCR 和 pCR-HCRm 质粒用 HindIII/EcoRV 进行消化， 并插入到实施例1<步骤2>中所制备的pBS-PF的HindIII/EcoRI (稍后补平)限制 性位点，以分别获得 pBS-AAT108-PF、pBS-AAT7800_PF、pBS-AFP3800_PF、pBS_E6_PF、 pBS-HCR-PF和pBS-HCRm-PF。将这些质粒用KpnI和NotI再次进行消化，并插入到 实施例2<步骤5>中所制备的pBS-CMV-hFIXUTR-SynlPLA的KpnI/NotI限制性位 点，以获得 pBS-AAT108-PF-hFIXUTR-SynlPLA、pBS-AAT7800-PF-hFIXUTR-SynlPLA、 pBS-AFP3800-PF-hFIXUTR-SynlPLA、pBS-E6-PF-hFIXUTR-SynlPLA、 pBS-HCR-PF-hFIXUTR-SynlPLA 和 pBS-HCRm-PF-hFIXUTR-SynlPLA。这些质粒的示意图显示 于图12A中。将所述质粒用KpnI和SalI进行消化，并插入到pTRUF6腺相关病 毒的KpnI/Sall限制性位点，以获得表达载体AAT108-PF_hFIXUTR-SynlPLA、 AAT7800-PF-hFIXUTR-SynlPLA, AFP3800-PF_hFIXUTR-SynlPLA、E6-PF_hFIXUTR-SynlPLA、
20HCR-PF-hFIXUTR-SynlPLA 和 HCRm-PF-hFIXUTR-SynlPLA。将所述表达载体的质粒 DNA 根据 与实施例2〈步骤3>中的相同方法注射到小鼠尾静脉中，通过ELISA测定hFIX蛋白的表达 水平。结果显示于图12B中。如图12B中所示，注射两天后，包含LCR的表达载体表现出的hFIX表 达水平高达 CMV-hFIXUTR-SynlPLA 的 7 倍(AAT7800-PF-hFIXUTR-SynlPLA 7, 640ng/ml 对 CMV-hFIXUTR-SynIPLA 1，090ng/ml)。特别地，直到注射后 4 周， AAT108-PF-hFIXUTR-SynlPLA仍持续表达390ng/ml或更高的hFIX，这一表达水平高达 HCR-PF-FIX-SynlPLA (250ng/ml)的1.6倍。该结果表明AAT108内含子非常适于hFIX的持 续表达。实施例4 评估本发明表达载体对血友病B的治疗效果根据与实施例3<步骤2>中相同的方法，用实施例1<步骤2>中所制备的 pBS-PAF构建表达载体AAT108-PAF-hFIXUTR-SynlPLA。然后，将实施例2<2_4>中所构建的 pBS-CMV-hFIXUTR- Δ NAL用NotI和SalI进行消化，并插入到实施例3<步骤2>中所构建的 AAT 108-PF-hFIXUTR-SynIPLA 和 AAT108-PAF_hFIXUTR-SynlPLA 的 Notl/Sall 限制性位点， 以获得 AAT108-PF-hFIXUTR- Δ NAL 和 AAT108-PAF_hFIXUTR- Δ NAL。同时，将实施例1<步骤1>的pCR-AAT enh/pro用SpeI (稍后补平末端)/NotI 进行消化，并插入到实施例3<步骤2>的pCR-HCRm的EcoRV/NotI限制性位点，以获得 pCR-HCRm-AATenh/pro 表达载体(HmA)。将 pCR-HCRm-AATenh/pro (HmA)表达载体用 KpnI 和NotI进行消化，并插入到实施例2<步骤5>中所构建的CMV-hFIXUTR-Δ NAL的KpnI和 NotI限制性位点，以获得HmA-hFIXUTR-NAL表达载体。将实施例1<步骤1>中所描述的pCR-AAT enh/pro用BglII (稍后补平)/NotI进 行消化，并插入到实施例3<步骤2>中所描述的pCR-HCR的EcoRV/NotI限制性位点，以获 得 pBS-HCR-AATpro (HA)表达载体。将 pBS-HCR-AATpro (HA)表达载体用 KpnI/NotI 进行消 化，并插入到实施例2<步骤3>中所描述的CMV-hFIXUTR-1. 4kbFIXint的KpnI/NotI限制 性位点，以获得HA-hFIXUTR-1. 4kbFIXint表达载体。所述表达载体的示意图显示于图13A中。将25 μ g 的 AAT108-PF-hFIXUTR-ANAL、AAT108-PAF-hFIXUTR-ANAL、 HmA-hFIXUTR- Δ NAL和CMV-hFIXUTR-Δ NAL(实施例2<步骤5>中所制备)表达载体的每 一种质粒DNA注射到血友病B小鼠的尾静脉中，并通过ELISA测定hFIX蛋白浓度和凝血活性。如图13B中所示，相对于由HmA-hFIXUTR-ΔNAL表达载体所诱导的hFIX表达水 平，由AAT108-PAF-hFIXUTR-ANAL表达载体所诱导的hFIX表达水平在注射后第1天为 9.8%，第2天为30.6%、第7天为82%，第2周为108%，第9周为208%。此外，相对于由 HmA-hFIXUTR- Δ NAL表达载体所诱导的hFIX表达水平，由AAT108-PF_hFIXUTR- Δ NAL表达 载体所诱导的hFIX表达水平在注射后第1天为9 %，第2天为19. 2 %，第7天为41. 9 %，第 2周为56. 9%，第9周为73. 0%。用hFIX表达载体注射的血友病B小鼠和正常小鼠的凝血活性通过如下的活化部 分凝血活酶时间(APTT)方法进行测定。将FIX缺陷型血浆、10倍稀释的小鼠血浆、活化的 肌动蛋白(各50 μ 1)相混合，并在37°C孵育3分钟。向其中加入CaCl2，用血液凝集检测
21器KClOA(Amelung)测定样品凝结所消耗的时间。正常小鼠的凝血时间约为44秒，血友病B 小鼠约为65秒。如图13C中所示，直到注射后3天，施用了 hFIX表达载体的血友病B小鼠 才显示出正常凝血时间的约80%。7天后，施用了 CMV-hFIXUTR-ΔNAL的小鼠的凝血时间 回复到注射前的水平，而施用 了 AAT108-PF-hFIXUTR- Δ NAL 和 AAT108_PAF_hFIXUTR- Δ NAL 的小鼠表现出凝血时间改善为50到60秒。进一步地，根据标准活性对标准凝血时间的标准曲线计算所述样品的凝血活性。 如图 13D 中所示，用 AAT108-PF-hFIXUTR- Δ NAL 和 AAT108_PAF_hFIXUTR- Δ NAL 表达载体处 理的血友病B小鼠的凝血活性在注射后8周分别为正常小鼠的34. 和29.3%。特别地， 用AAT108-PAF-hFIXUTR-ANAL表达载体处理的小鼠的凝血活性在注射后8周为正常小鼠 的 31. 9%。同时，根据与实施例2<步骤3>中相同的方法，将使用HA-hFIXUTR-1. 4kbFIXint、 AAT108-PF-hFIXUTR- Δ NAL, AAT108_PAF_hFIXUTR-Δ NAL 和 CMV-hFIXUTR-l. 4kbFIXint 的 2 X IO9IP的重组腺相关病毒注射到血友病B小鼠的门静脉中，并通过如前所述的ELISA和 APTT方法测定hFIX蛋白浓度和凝血活性。结果显示于图14A和14B中。如图14A中所示，带有AAT108-PF-hFIXUTR- Δ NAL的病毒诱导高达2，379ng/ ml 的 hFIX 蛋白，带有 AAT108-PAF-hFIXUTR-ANAL 的病毒诱导高达 1，431ng/ml 的 hFIX蛋白。另一方面，对照病毒(即，带有CMV-hFIXUTR-1. 4kbFIXint的病毒和带有 HA-hFIXUTR-1. 4kbFIXint的病毒)所诱导的hFIX表达水平分别为1，542ng/ml和380ng/ ml。特别地，含AAT108-PF-hFIXUTR-ANAL的病毒到注射后68周还诱导500ng/ml或更高 的hFIX表达。这一结果表明，本发明含有LCR的表达载体适用于需要长期基因表达的基因 治疗。如图14B中所示，施用了带有AAT108-PF-hFIXUTR-ANAL的rAAV的小鼠到注射后 7周表现出正常小鼠凝血活性的59. 或更高。上述结果表明，本发明的基因表达系统对于血友病治疗所需的稳定而持续的表达 是有效的。实施例5 构建包含抗血管发生蛋白Apo(a)kringle结构域KIV9-KTV10_KV(LK68) 基因的肝特异性表达载体并评估LK68蛋白表达效率为了向LK68表达载体中引入ANAL内含子和FIX UTR，首先使用作为模板的 pAAV-LK68(专利号 KR10-0681762)、引物组 SEQ IDNO 37 和 38、SEQ ID NO 39 和 40 以及 EX-Taq进行PCR，以获得FIX 5，UTR信号序列片段和LK68-FIX 3，UTR片段。PCR条件如下 首先94 V变性5分钟；94 V变性1分钟、60 V退火1分钟、72 °C延伸1分钟的30个循环；72 °C 最后延伸3分钟。将所述5’ UTR信号序列片段和LK68-3’UTR片段分别插入到实施例2<2_4> 中所制备的pBS-hFIXUTR-ANAL载体的Notl/Xhol和Aatll/Sall限制性位点。所需DNA片 段通过限制性酶切图谱和序列分析进行鉴定，所述质粒命名为“PBS-LK68- Δ NAL-FUTR”。将 通过用限制性酶NotI和SalI处理pBS-LK68- Δ NAL-FUTR质粒所得到的LK68- Δ NAL-FUTR 片段插入到实施例4中所制备的AAT108-PF-hFIXUTR-NAL的Notl/SalI限制性位点， 以获得表达载体AATl08-PF-LK68-Δ NAL-FUTR。在存在不同LCR或者缺少LCR时重复 上述步骤，以获得表达载体 E6-PF-LK68- Δ NAL-FUTR, AAT7800-PF-LK68- Δ NAL-FUTR, AFP3800-PF-LK68- Δ NAL-FUTR, HCRm-PF_LK68- Δ NAL-FUTR、HCR-PF-LK68- Δ NAL-FUTR 和PF-LK68-ΔNAL-FUTR。所述表达载体的酶切图谱显示于图15Α中。根据与实施例2<步骤3>中相同的方法，将所述表达载体注射到小鼠尾静脉中。从 小鼠中收集血液样品，并通过ELISA测量LK68蛋白的表达水平。如图16Α中所示，在不同LCR中，ΑΑΤ108显示出最高的基因表达效率。特别地，相 对于 PF-LK68- Δ NAL-FUTR 表达载体的 LK68 表达效率，AAT108-PF-LK68- Δ NAL-FUTR 表达 载体的LK68表达效率在注射后第1天为158. 4%，第2天为104. 8%，第7天为155. 8%，第 2周为160. 2%，第3周为162. 7%，第4周为144. 1%0
进一步地，重复上述步骤以获得包含表达盒MT108-PF-LK68、MT108-PF-LK68-FUTR、 AAT108-PF-LK68-ΔNAL-FUTR、 AAT108-PAF-LK68、 AAT108-PAF-LK68-FUTR 禾P AAT108-PAF-LK68-ΔNAL-FUTR的表达载体。所述表达载体的示意图显示于图15Β中。根据与实施例2<步骤3>中相同的方法，将所述表达载体注射到小鼠尾静脉中。从 小鼠中收集血液样品，并通过ELISA测量LK68蛋白的表达水平。如图16Β中所示，相对于AAT108-PF-LK68表达载体的LK68表达效率， AAT108-PF-LK68-FUTR 和 AAT108-PF-LK68- Δ NAL-FUTR 表达载体的 LK68 表达效率分别在 注射后第1天为197. 7%和425. 4%，第2天为478. 6%和891. 2%，第7天为233. 2%和 319. 3%，第 2 周为 203. 0%和 253. 7%，第 3 周为 113. 8%和 243. 3%，第 4 周为 170. 4%和 277. 6%。相对于 AAT108-PAF-LK68 表达载体的 LK68 表达效率，AAT108-PAF-LK68-FUTR 和 AAT108-PAF-LK68-Δ NAL-FUTR表达载体的LK68表达效率分别在注射后第1天为147. 0% 和 344. 6%，第 2 天为 351. 0%和 824. 5%，第 7 天为 220. 2%和 260. 3%，第 2 周为 140. 8% 和 203. 0%,Μ 3 周为 146. 5%禾口 288. 4%，第 4 周为 177. 8%禾口 323. 8% 0这些结果表明，与不存在内含子和UTR的情况相比，基因表达在内含子和/或UTR 存在下是持续高水平的。实施例6 评估细胞内由UTR和内含子引起的抗血管发生蛋白Ap0(a)kringle结 构域KIV9-KIV10-KV(LK68)的表达效率将通过用NotI 和 SilI 消化实施例 5 所述 MT108-PF-LK68 和 MT108-PF-LK68- Δ NAL-FUTR 载体所得到的LK68和LK68-Δ NAL-FUTR片段插入到腺病毒穿梭载体 pENTR2B(Invitrogen, Carlsbad, CA)中，以获得 pENTR_LK68 和 pENTR_LK68_ΔNAL-FUTR 载体。将这些穿梭载体和靶标载体pAd/CMV/V5-DEST (Invitrogen, Carlsbad, CA)用 Clonase (Invitrogen, Carlsbad, CA)进行体外同源重组，以获得 pAd-CMV_LK68 和 pAd-CMV-LK68- Δ NAL-FUTR 载体。将所述 pAd-CMV_LK68 和 pAd-CMV_LK68- Δ NAL-FUTR 载体 用PacI限制性酶进行线性化，并转染到HEK 293肾细胞系中，以分别获得带有CMV-LK68和 CMV-LK68- Δ NAL-FUTR 的复制缺陷型腺病毒 rAd_LK68 和 rAd_LK68_UN。将所述 rAd_LK68 和rAd-LK68_UN注射到HEK 293肾细胞系中，并测量LK68蛋白的表达水平。以0. 1,0. 5、2和10的多种感染复数(MOI)感染HEK 293肾细胞系。在腺病毒感 染后2天收集细胞和培养基。使用抗LK68抗体，通过电泳测定LK68蛋白的表达水平。结 果显示于图17A和17B中。如图17A和17B中所示，当MOI为0. 1,0. 5和2时，LK68蛋白的表达水平很低且 相等，然而当MOI为10时，与由rAd-LK68所诱导的相比，由rAd_LK68_UN所诱导的LK68蛋 白表达水平在细胞内提高了 420%，在培养基中提高了 242%。
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这些结果表明，UTR和内含子存在下细胞和培养基中的基因表达效率都高于缺少 UTR和内含子的情况。尽管通过上述具体实施方案对本发明进行了描述，但应当理解，可以进行多种修 改和改变，而仍属于由下述权利要求书所定义的本发明范围。
权利要求
具有SEQ ID NO42之核苷酸序列的多核苷酸。
2.多核苷酸，其包含具有SEQID NO :42之核苷酸序列的多核苷酸；以及与所述SEQ ID NO :42之多核苷酸有效连接的至少一个多核苷酸，后者选自具有SEQ ID NO :44和45之核 苷酸序列的多核苷酸。
3.多核苷酸，其选自具有SEQID NO :46至57之核苷酸序列的多核苷酸。
4.多核苷酸，其选自具有SEQID NO :58至61之核苷酸序列的多核苷酸。
5.表达载体，其包含转录调控元件和与所述转录调控元件有效连接并受其控制的编码 序列，其中所述转录调控元件包含1)具有SEQID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸；2)具有SEQID NO :42之核苷酸序列的多核苷酸，以及与所述SEQID NO :42之多核苷 酸有效连接的至少一个多核苷酸，后者选自具有SEQ ID NO :44和45之核苷酸序列的多核 苷酸；3)具有SEQID NO :42之核苷酸序列的多核苷酸，以及与所述SEQID NO :42之多核苷 酸有效连接的至少一个多核苷酸，后者选自具有SEQ ID NO :46到57之核苷酸序列的多核 苷酸；4)具有SEQID NO :42之核苷酸序列的多核苷酸，以及与所述SEQID NO :42之多核苷 酸有效连接的至少一个多核苷酸，后者选自具有SEQ ID NO :58到61之核苷酸序列的多核 苷酸；5)具有SEQID NO :42之核苷酸序列的多核苷酸，选自具有SEQID NO :44和45之核苷 酸序列的多核苷酸的至少一个多核苷酸，以及选自具有SEQ ID NO :46到57之核苷酸序列 的多核苷酸的至少一个多核苷酸，所述多核苷酸彼此有效连接；6)具有SEQID NO :42之核苷酸序列的多核苷酸，选自具有SEQID N0:44和45之核苷 酸序列的多核苷酸的至少一个多核苷酸，以及选自具有SEQ ID NO :58到61之核苷酸序列 的多核苷酸的至少一个多核苷酸，所述多核苷酸彼此有效连接；7)具有SEQID NO :42之核苷酸序列的多核苷酸，选自具有SEQID N0:46到57之核苷 酸序列的多核苷酸的至少一个多核苷酸，以及选自具有SEQ ID NO :58到61之核苷酸序列 的多核苷酸的至少一个多核苷酸，所述多核苷酸彼此有效连接；或者8)具有SEQID NO :42之核苷酸序列的多核苷酸，选自具有SEQID NO: 44和45之核苷 酸序列的多核苷酸的至少一个多核苷酸，选自具有SEQ ID NO 46到57之核苷酸序列的多 核苷酸的至少一个多核苷酸；以及选自具有SEQ ID NO 58到61之核苷酸序列的多核苷酸 的至少一个多核苷酸，所述多核苷酸彼此有效连接。
6.表达载体，其包含转录调控元件以及与所述转录调控元件有效连接并受其控制的编 码序列，所述转录调控元件包含启动子和与所述启动子有效连接的多核苷酸，所述多核苷 酸选自选自具有SEQ ID NO :46到57之核苷酸序列的多核苷酸的至少一个多核苷酸；选 自具有SEQ IDNO 58到61之核苷酸序列的多核苷酸的至少一个多核苷酸；以及与选自具有 SEQ ID NO :58到61核苷酸序列之多核苷酸的至少一个多核苷酸有效连接的选自具有SEQ ID NO 46到57核苷酸序列之多核苷酸的至少一个多核苷酸。
7.权利要求5或6的表达载体，其中所述编码序列是编码肝特异性蛋白质的序列，所述 蛋白质选自白蛋白、甲胎蛋白、α-葡萄糖苷酶、α 1-抗胰蛋白酶、抗凝血酶、脂蛋白、血浆铜蓝蛋白、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、红细胞生成素、纤维蛋白原、葡糖脑 苷脂酶、触珠蛋白、IGF-1、胰岛素、纤维蛋白溶酶原、凝血酶原和转铁蛋白。
8.权利要求5或6的表达载体，其还包含分别位于所述编码序列5'和3'端的具有 SEQ ID NO :62和63之核苷酸序列的多核苷酸。
全文摘要
提供了用于基因治疗的表达载体，其含有转录调控元件的新组合，包括启动子、增强子、内含子、非翻译区(UTR)和基因座控制区(LCR)。所述表达载体能够持续表达肝组织特异性基因，因而能有效地用于治疗血栓形成、血友病、肝癌等等。
文档编号C12N15/67GK101952440SQ200880126705
公开日2011年1月19日 申请日期2008年2月14日 优先权日2008年2月14日
发明者尹成泰, 李圭铉, 李贤 , 赵义哲, 高垡经 申请人:财团法人牧岩生命工学研究所