哺乳动物表达载体的利记博彩app

专利名称：：哺乳动物表达载体的利记博彩app哺乳动物表达载体本发明涉及用于表达目的多肽的哺乳动物表达载体，以及利用各自的载体和包含该载体的宿主细胞在哺乳动物宿主细胞中表达目的多肽的方法。近几年来，大量克隆和表达重组的肽和蛋白质的能力已经变得越来越重要了。纯化高水平蛋白质的能力在人类制药和生物
技术领域：
很重要，例如为了制备蛋白质药物，在基础研究的背景中也很重要，例如为了结晶蛋白质以测定其三维结构。否则难以大量获得的蛋白质可以在宿主细胞中过量表达，然后分离和纯化。对于重组蛋白质的生产来说，表达系统的选择取决于许多因素，包括治疗性蛋白质的生产中的细胞生长特征、表达水平、细胞内和细胞外表达、翻译后修饰和目的蛋白质的生物学活性，以及调控因素和经济学考虑。哺乳动物细胞相对于其他表达系统，如细菌和酵母菌来说，关键的优点是进行正确的蛋白质折叠、复杂的N-联糖基化和真正的0-联糖基化、以及广谱的其他翻译后修饰的能力。由于上述优点，目前哺乳动物细胞是选择用来生产复杂的治疗性蛋白质如单克隆抗体的表达系统。产生重组细胞系的第一步是构建表达载体。表达载体是在宿主细胞中驱动异源基因表达和提供用于产生重组细胞系的选择性标记的关键因素。哺乳动物表达载体的基本元件通常包括具有稳定强化的转录活性的组成型或诱导型启动子；最优化的mRNA加工和翻译信号(通常包括Kozak序列)、翻译中止密码子、mRNA切开和多腺苷酸化信号以及mRNA剪接信号；转录终止子；制备稳定细胞系和基因扩增的选择性标记；原核的复制原点和细菌中载体增殖的选择性标记。近年来，开发的焦点集中于用于在哺乳动物细胞中表达基因的改进载体的设计上。尽管可获得的载体很多，但是，在哺乳动物细胞中稳定强化的多肽/蛋白质生产仍然是一个挑战。几种因素可以影响哺乳动物细胞中的重组表达，包括启动子强度、5’非翻译区和翻译起始区域的组成、3’非翻译区的有效性、多腺苷酸化和终止转录、在宿主染色体中随机整合入的重组基因的插入位点和要表达基因被整合入的拷贝数。最普遍使用的是通过基因扩增来达成基因拷贝数的增加，该基因扩增使用缺失了诸如二氢叶酸还原酶(DHFR)或谷氨酰胺合成酶(GS)的酶的细胞系，联合含有编码这些酶的基因的表达载体，以及诸如抑制DHFR的甲氨蝶呤(MTX)和抑制GS的甲硫氨酸亚砜亚胺(methioninesulfoxamine，MSX)等制剂。使用含有在强启动子控制下的该重组基因和编码DHFR或GS基因的表达载体，首先分别得到DHFR+或GS+转染子，然后通过在浓度递增的MTX或MSX中生长该转染子得到基因扩增。本发明的目的是提供改进的表达载体和表达系统，以在哺乳动物细胞中表达目的多肽。所以，本发明提供了一种用于在哺乳动物细胞中表达至少一种目的多肽的载体核酸，包括(a)至少一个用于表达目的多肽的表达盒(P0I)；(b)包含哺乳动物选择性标记基因的表达盒(MSM)；(c)包含哺乳动物的可扩增的选择性标记基因的表达盒(MASM)；其中所述表达盒(P0I)5’侧翼连接表达盒(MASM)，表达盒(MSM)位于表达盒(P0I)的3’，而且其中表达盒(MASM)、(P0I)和(MSM)以相同的5’至3’方向排列。根据本发明的“载体核酸”是带有至少一个外来核酸片段的多核苷酸。载体核酸像“分子载体”一样发挥功能，把核酸片段各个多核苷酸输送到宿主细胞中。其包括至少一个包含调节序列和编码序列的表达盒。表达盒使得整合入的多核苷酸可以适当表达。下面将更加详细地说明本发明中关键的表达盒。外来的多核苷酸，例如编码目的多肽的多核苷酸，可以插入到该载体核酸的表达盒来表达。根据本发明的载体核酸可以以环状或线性形式存在。该位点可以是，例如多克隆位点(MCS)。表达盒(P0I)限定了表达目的多肽(nolyp印tideofinterest)的表达盒。该表达盒(P0I)或者包含编码目的多肽的多核苷酸，或者包含适于插入编码目的多肽的各个多核苷酸的位点。“多肽”是指包含由肽键连接到一起的氨基酸聚合物的分子。多肽包括任何长度的多肽，包括蛋白质(例如具有多于50个氨基酸)和肽(例如具有2-49个氨基酸)。多肽包括具有任何活性或生物活性的蛋白质和/或肽。适宜的例子在概述如下。表达盒(MSM)限定了包含哺乳动物选择性标记基因(mammalianselectablemarkergene)的表达盒。哺乳动物选择性标记基因使包含所述基因的哺乳动物宿主细胞得到选择，并由此选择包含该载体的哺乳动物宿主细胞。适宜的例子详述如下。表达盒(MASM)限定了包含哺乳动物可扩增的选择性标记基因(mammalianamplifiable,selectablemarkergene)的表达盒。哺乳动物可扩增的选择性标记基因使含有载体的哺乳动物宿主细胞得到选择并进行基因扩增。适宜的例子详述如下。术语“5’”和“3’”是用来描述核酸序列特征的常规表述，涉及遗传元件的位置和/或诸如RNA聚合酶转录或核糖体翻译等以5’至3’方向进行的事件的方向(5’至3’)。同义词是上游(5’)和下游(3’)。通常，DNA序列、基因图谱、载体卡和RNA序列以5’至3’的方向从左向右画，或者，5’至3’方向用箭头符号表示，其中箭头指向3’方向。所以当遵循此常规用法时，5’(上游)是指遗传元件向左手侧放置，而3’(下游)是指遗传元件向右手侧放置。本发明的载体中存在的表达盒的排列和取向很重要。根据本发明的教导，表达盒(P0I)5’侧翼连接表达盒(MASM)。因此，表达盒(MASM)位于邻近表达盒(P0I)的5’端，并基本上与其接近。当然，载体骨架序列可以分开表达盒(MASM)和(P0I)。但是，优选没有其他表达盒位于表达盒(MASM)和表达盒(P0I)之间。表达盒(MSM)位于表达盒(P0I)的3’方向。另外的表达盒可以插入到表达盒(P0I)和(MSM)之间，例如用于表达另一种目的多肽(下文中详述)的另外的表达盒(P0I’)。表达盒(MASM),(P0I)和(MSM)都以相同的5’至3’方向排列。发明人发现，这种特殊的载体核酸结构(configuration)使得快速产生高产率的细胞系成为可能。根据一个备选方案，表达盒(P0I)不包含编码目的多肽的多核苷酸。因此，提供了具有“空”表达盒(P0I)的表达载体。然而，表达目的多肽的该多核苷酸能够用适当的克隆方法插入到表达盒(P0I)中，例如，使用限制性内切酶以将编码目的多肽的多核苷酸插入到表达盒(P0I)中。为此目的，表达盒(P0I)可以包含例如能够如在所有阅读框中使用的多克隆位点(MCS)。适宜的MCS位点在下文中详述。例如，各个“空”载体核酸可以提供给顾客，然后顾客可以向表达盒(P0I)中插入他们要表达的具体目的多核苷酸。表达盒(P0I)也可以包含可以被剪切并被编码目的多肽的多核苷酸置换的置换多核苷酸或填充片段核酸序列。本发明还提供了如上所述的载体核酸，包括含有编码目的多肽的多核苷酸的表达盒(P0I)。该实施方式主要涉及经转染以在宿主细胞中表达的最终表达载体核酸。多核苷酸是通常在脱氧核糖或核糖之间连接的核苷酸的聚合物。术语“多核苷酸”没有任何大小限制，而且还包括具有修饰的多核苷酸，特别是修饰的核苷酸。根据一个实施方式，所述载体核酸为环状，而且表达盒(MSM)排列在表达盒(P0I)的3’端，而且表达盒(MASM)排列在表达盒(MSM)的3’端。根据本发明的教导，环状载体的另一种表述是，用于在哺乳动物细胞中表达至少一种目的多肽的环状载体核酸，包括(a)至少一个用于表达目的多肽的表达盒(P0I)；(b)包含哺乳动物选择性标记基因的表达盒(MSM)；(c)包含哺乳动物的可扩增的选择性标记基因的表达盒(MASM)；其中表达盒(MSM)位于表达盒(P0I)的3’端，而且表达盒(MASM)排列在表达盒(MSM)的3’端，其中表达盒(MASM)、(P0I)和(MSM)以相同的5’至3’方向排列。载体核酸可以其环状形式转化到宿主细胞中。超螺旋载体分子通常会在核中由于内切核酸酶和外切核酸酶的活性而转化成线性分子。然而，在转染之前载体核酸是线性化通常会改善稳定转染的效率。如果在转染前将载体线性化，这也是可以控制线性化的关键。因此，根据本发明的一个实施方式，表达载体包括预定义的限制性酶切位点，其可以用来在转染之前线性化该载体核酸。该线性化限制性酶切位点的精巧放置很重要，因为该限制性酶切位点决定了该载体核酸打开/线性化的位置，因此决定了当该构建体整合入哺乳动物细胞基因组中时表达盒的顺序/排列。因此，该载体核酸可包含用于线性化所述载体的线性化限制性酶切位点，其中所述线性化限制性酶切位点位于表达盒(MSM)和(MASM)之间。优选地，该线性化限制性酶切位点是唯一的，而且仅仅在表达载体核酸中存在一次，例如，可以使用切割频率低的限制性内切酶所识别的线性化限制性酶切位点，以保证载体仅仅在该线性化限制性酶切位点切开，而不会(或只是非常少地)在表达盒内或载体骨架内切开。这可以通过例如提供限制性内切酶的限制性酶切位点来促成，该限制性内切酶具有多于6个碱基对的识别序列，或者该酶识别在染色体DNA中出现很少(under-r印resented)的序列。适宜的实例是Swal酶，因此该载体包含Swal识别位点作为唯一的线性化限制性酶切位点。如果该线性化限制性酶切位点在载体核酸序列(包括编码目的多肽的多核苷酸)中出现超过一次，或者如果使用在该载体核酸序列中切割几次的限制性内切酶，例如改变/突变除了位于表达盒(MSM)和(MASM)之间的线性化限制性酶切位点之外的限制性酶切位点，以消除那些附加的酶切位点并得到唯一的或至少是稀少的线性化限制性酶切位点等，也落入本发明的范围内。如果该载体用作标准表达载体，以作为例如工具用于表达几种不同的多肽，那么优选提供包含多个酶识别位点的线性化限制性酶切位点，这些酶具有低剪切频率。选择用来线性化的限制性内切酶应优选不在选择性标记的表达盒内切割，也不在其他载体骨架序列内切割，以保证该酶仅仅切一次，以正确地线性化该载体。通过为具有低剪切频率的限制性内切酶提供包含多个识别位点的线性化限制性酶切位点，使用者可以从提供的选项中选择合适的限制性内切酶来线性化，以安全地避免在编码目的多肽的多核苷酸内造成限制性酶切。然而，如上所述，另外的限制性酶切位点可以突变掉，或可进行部分限制性酶消化。在表达盒(MSM)和表达盒(MASM)之间放置线性化限制性酶切位点，具有表达盒(P0I)(和用于表达目的多肽的进一步的表达盒——如果有的话)的5’侧翼连接表达盒(MASM)的效果。线性化后，表达盒(MSM)位于表达盒(P0I)的3’端。因此，在环状载体核酸线性化后，表达盒(MSM)和(MASM)被分开。如果存在用于细菌选择性标记的表达盒(PSM)(参见下文)，线性化限制性酶切位点优选放置在表达盒(PSM)和(MASM)之间。这具有该细菌选择性标记是3’端，并因此在线性化的载体核酸的“哺乳动物”部分之外的效果。因为细菌序列可以导致哺乳动物细胞中增加的甲基化或其他沉默效果，所以推测细菌基因是不利于哺乳动物表达的，因此这样的排列是有利的。能够包含在表达盒(MSM)中的哺乳动物选择性标记基因的非限制性实例包括抗生素抗性基因，例如赋予对G418抗性、潮霉素抗性(hyg或hph，可商购自LifeTechnologies,Inc.Gaithesboro,Md.)、新霉素抗性(neo,可商购自LifeTechnologies,Inc.Gaithesboro,Md.)、zeocin抗性(ShBle,可商购自Pharmingen,SanDiegoCalif.)>嘌呤霉素抗性(pac，嘌呤霉素-N-乙酰基转移酶，可商购自Cl0nteCh，Pal0AltoCalif.)、乌本苷抗性(oua，得自Pharmingen)和杀稻瘟素抗性(购自Invitrogen)的基因。各个哺乳动物选择性标记基因是公知的，而且使包含所述基因的哺乳动物宿主细胞得到选择，并由此选择包含该载体的宿主细胞。此处使用的术语“基因”是指天然或合成的、编码提供所需抗性的选择性标记的功能变体的多核苷酸。因此，野生型基因的截短或突变形式或合成的多核苷酸也包含其中，只要它们提供所需的抗性。根据优选的实施方式，所述表达盒(MSM)包含编码酶促功能性新霉素磷酸转移酶(I或II)的基因。该实施方式在与作为可扩增选择性标记基因的编码酶促功能性DHFR的基因联合使用时，运作良好。哺乳动物可扩增的、选择性标记基因使其含有载体的哺乳动物宿主细胞得到选择并进行基因扩增。哺乳动物可扩增的、选择性标记基因的非限制性实例是二氢叶酸还原酶(DHFR)基因。目前使用的其他系统有，谷氨酰胺合成酶(gs)系统(Bebbington等人，1992)和组氨醇驱动的选择系统(Hartmarm和Mulligan，1988)。这些可扩增的标记也是选择性标记，因此能够用于选择那些获得了上述载体的细胞。DHFR和谷氨酰胺合成酶提供了良好的结果。在两种情况下，没有适宜的代谢物存在时(对于DHFR是次黄嘌呤和胸苷，对于GS是谷氨酰胺)，通常都会发生选择，防止了未转化的细胞的生长。禾U用诸如DHFR系统的可扩增系统，可以通过将细胞暴露于某些促进基因扩增的试剂(例如在DHFR系统的情况下，使用抗叶酸剂(antifolate)如甲氨蝶呤(MTX))中来增加重组蛋白质的表达。促进基因扩增的适宜的GS抑制剂是甲硫氨酸亚砜亚胺(MSX)。暴露于MSX也会导致基因扩增。根据一个实施方式，表达盒(MASM)包含编码酶功能性谷氨酰胺合成酶(GS)或二氢叶酸还原酶(DHFR)的基因。根据一个实施方式，所述表达盒(MSM)包含编码酶功能性新霉素磷酸转移酶的基因，而且所述表达盒(MASM)包含编码酶功能性二氢叶酸还原酶(DHFR)的基因。该载体可以包含至少一个用于表达另一种目的多肽的附加的表达盒(P0I’)。该附加的表达盒(P0I’)位于表达盒(P0I)和表达盒(MSM)之间。该表达盒(P0I’)以与表达盒(P0I)和(MSM)相同的5’至3’方向排列。根据一个实施方式，其包含编码另一种目的多肽的多核苷酸。所以，根据本发明的载体核酸可包含多于一个的表达目的多肽的表达盒。因此，也可能是用于表达不同目的多肽的几个表达盒((POI)，(POD,(POI”)等)排列于根据本发明的表达载体核酸中。这些表达盒的5’侧翼连接表达盒(MASM)，3’侧翼连接表达盒(MSM)。因此，本发明还提供了包含多于一个表达盒的载体核酸，这些表达盒编码例如二聚体或更高级别多聚体蛋白质的亚基。编码多聚体蛋白质的不同亚基(各个亚基插入到不同的表达盒中)的表达盒可以互相毗邻地放置。对于由至少两个不同的基因编码的多聚体蛋白(例如，免疫球蛋白轻链和重链或其功能片段，如至少是免疫球蛋白轻链和重链的可变区)，编码目的多肽所需亚基的多核苷酸被插入到表达盒(POI)和(POI’)中。使用至少两个表达盒(POI)和(POI’)来表达目的多肽的各自的实施方式特别有利于表达免疫球蛋白分子，例如抗体或其功能性片段。所以，提供一种载体核酸，用于表达免疫球蛋白分子，该载体核酸包含在各表达盒(POI)和(POI’)中的编码免疫球蛋白分子的轻链或重链或其片段的多核苷酸，其中表达盒(POI)和(POI’)各自包含所述多核苷酸之一。因此，表达盒(P0I)可以或者包含表达免疫球蛋白分子的轻链的多核苷酸，或者包含表达免疫球蛋白分子的重链的多核苷酸。根据一个优选实施方式，表达盒(P0I)包含编码至少部分的所述免疫球蛋白分子的轻链或其功能片段的多核苷酸，表达盒(POI’)包含编码至少部分的所述免疫球蛋白分子的重链或其功能片段的多核苷酸。就免疫球蛋白的表达率来说，证明将轻链的表达盒排列在重链表达盒的5’方向是有益的。根据一个实施方式，设计表达载体核酸以使得表达盒已经包含了编码至少部分的免疫球蛋白分子的恒定区的多核苷酸。然后用户/顾客可以利用适宜的克隆策略将编码免疫球蛋白分子的可变部分的多核苷酸片段插入到表达盒中，以得到最终的表达载体。存在于本发明的表达载体中的表达盒被设计为允许插入的多核苷酸/基因在哺乳动物细胞中表达。为了这个目的，表达盒通常包含必需的调节序列，例如启动子和/或转录终止序列，例如多聚腺苷酸位点。用于表达目的多肽的载体通常含有适于驱动转录的转录控制元件，例如启动子、增强子、多聚腺苷酸化信号、转录中止或终止信号等作为表达盒的元件。为了适当表达多肽，优选在载体中包括适宜的翻译控制元件，例如引导5’帽结构的5’非翻译区，以招募核糖体，以及终止翻译过程的终止密码子。特别地，作为选择性标记基因的多核苷酸，以及编码目的多肽的多核苷酸，可以在适宜的启动子中存在的转录元件的控制下转录。得到的选择性标记基因的转录产物和目的多肽的转录产物中包藏了促进实质水平的蛋白质表达(即翻译)和适当的翻译终止的功能性翻译元件。在此，能够适当地驱动所插入的多核苷酸表达的功能性表达单元也称为“表达盒”。优选，其包含3’UTR区域。所以提供了载体核酸，其中表达盒包含至少一个启动子和/或启动子/增强子元件。虽然这两种控制元件间的物理界限并不总是很清晰，术语“启动子”通常指核酸分子上RNA聚合物和/或任何相关因子结合、以及转录起始的位点增强子时间上和空间上加强启动子活性。许多启动子在宽范围细胞类型中是转录活性的。启动子可以分为两类，组成型发挥功能的启动子和诱导或去阻遏调节的启动子。在哺乳动物细胞中用于高水平生产蛋白质的启动子应该是强启动子，优选在宽范围的细胞类型中有活性，以允许重组多肽的定性和定量评价。启动子可以选自由SV40启动子、CMV启动子、EFl-a启动子、RSV启动子、BR0AD3启动子、小鼠rosa26启动子、pCEFL启动子和0-肌动蛋白启动子组成的组中。在许多细胞类型中驱动表达的强组成型启动子包括但不限于，腺病毒主要晚期启动子、人巨细胞病毒立即早期启动子、SV40和Rous肉瘤病毒启动子和小鼠3-磷酸甘油酸激酶启动子和EFla。当启动子和/或增强子来自CMV和/或SV40时，用本发明的表达载体得到良好的结果。根据一个实施方式，表达目的多肽的表达盒包含比表达选择性标记的表达盒中的启动子和/或增强子强的启动子和/或增强子。这种安排的效果是，产生比选择性标记物多的目的多肽转录物。因为单个细胞生产异源蛋白质的能力不是无限的，应该集中到目的多肽上，所以与选择性标记的生产相比，分泌的目的多肽的生产占主导是有利的。根据一个实施方式，用于表达目的多肽的表达盒(P0I)和(P0I’)(如果存在的话)包含CMV启动子/增强子。具体例子详述如下。优选表达DHFR和新霉素标记基因的表达盒(MSM)和(MASM)，包含SV40启动子或SV40启动子/增强子。CMV启动子已知是可用于哺乳动物表达的最强的启动子之一，可得到非常好的表达率。认为其能得到比SV40启动子更多的转录物。并且，表达盒可以包含适宜的转录终止位点。当从上游启动子通过第二转录单元继续转录时，这可能会抑制下游启动子的功能，这一现象被称为启动子封堵或转录干扰。在原核生物和真核生物中都已经报道过这种现象。在两个转录单元之间的转录终止信号的适当放置能够防止启动子封堵。转录终止位点被很好地表征，它们在表达载体中的加入已经表明对于基因表达具有多种有益效果。大多数真核生物初期的mRNA在其3’末端具有多聚腺苷酸尾巴，该多聚腺苷酸尾巴是在一个复杂的过程中加入的，该过程涉及初始转录物的断裂和伴随的多聚腺苷酸化反应。多聚腺苷酸尾巴有利于mRNA稳定性和可转移性。因此，根据本发明的载体的表达盒通常包含多聚腺苷酸化位点。有几种能够用于哺乳动物表达载体的有效多聚腺苷酸信号，包括那些衍生自牛生长激素(bgh)、小鼠3球蛋白、SV40早期转录单元和单纯疱疹病毒胸苷激酶基因的信号。但是，还已知一些合成的多聚腺苷酸化位点(参见例如Promega的pCI-neo表达载体，其基于Levitt等人，1989，GenesDev.3，(7)1019-1025)。多聚腺苷酸化位点可以选自下组中SV40polyA位点，例如SV40晚期和早期poly-A位点(参见例如质粒PSV2-DHFR，如公开在Subramani等人，1981，Mol.Cell.Biol.854-864)；合成的polyA位点(参见例如Promega的pCI-neo表达载体，其基于Levitt等人，1989，GenesDev.3，(7)1019-1025)和bghpolyA位点(牛生长激素)。表达盒可以包含增强子(参见上文)和/或内含子。根据一个实施方式，用于表达目的多肽的表达盒包含内含子。大部分来自高等真核生物的基因包含在RNA加工过程中被切除的内含子。发现在转基因系统中，基因组构建体比缺乏内含子的相同构建体能更有效率地表达。通常，内含子位于开发阅读框的5’末端。所以，内含子可以包含在表达目的多肽的表达盒中，以提高表达率。该内含子可以位于启动子和/或启动子/增强子元件与要表达的多肽的开放阅读框的5’末端之间。因此，提供了一种载体核酸，其中至少表达盒(P0I)包含排列在启动子和表达目的多肽的多核苷酸的起始密码子之间的内含子。本领域已知可以用于本发明的几种适宜内含子。根据一个实施方式，在表达目的多肽的表达盒中使用的内含子是合成的内含子，例如SIS或RK内含子。RK内含子是强合成内含子，其优选位于目的基因的ATG起始密码子之前。RK内含子包括CMV启动子的内含子供体剪接位点和小鼠IgG重链可变区的受体剪接位点(参见例如Eaton等人，1986,Biochemistry25，8343-8347，Neuberger等人，1983，EMBOJ.2(8)，1373-1378；该内含子可以从pRK_5载体(BDPharMingen)获得)。此外，惊奇地发现将内含子放置在DHFR基因开放阅读框的3’末端，在该构建体的表达/扩增率方面具有有益效果。用于DHFR表达盒的该内含子导致了较小的非功能性的DHFR基因变体(Grillari等人，2001，J.Biotechnol.87，59-65)。因此，降低了DHFR基因的表达水平。这导致了对MTX的升高的敏感性和更加严苛的选择条件。所以，提供了一种载体核酸，其中表达盒(MASM)包含位于可扩增选择性标记基因的3’端的内含子。适宜的内含子可以得自PSV2-DHFR载体(参见上文)。该载体可以包含至少一个附加的表达盒(PSM)，包含原核细胞的选择性标记基因。该表达盒(PSM)位于表达盒(MSM)和(MASM)之间。该选择性标记可以提供对诸如氨苄青霉素、卡那霉素、四环素和/或氯霉素等抗生素的抗性。该表达盒(PSM)优选以与其他表达盒(P0I)、(MSM)和(MASM)相同的5’至3’方向排列。DHFR基因作为标记物和基因扩增基因而起作用。可以通过在不含适当的代谢物(次黄嘌呤和胸苷)条件下培养细胞，从而防止未转化的细胞生长的方法进行选择。用DHFR系统，目的多肽的表达能够通过将细胞暴露于抗叶酸剂(例如甲氨蝶呤(MTX)，阻断DHFR活性的药物)而得到提高。在暴露至MTX—段时间之后，大多数细胞死亡，但是过量产生DHFR的少量细胞通常存活。在MTX处理时，随着浓度的升高，存活的细胞经常可以包含高达几百至几千拷贝的整合的载体，这些载体嵌入到时常得到延长的染色体中。大部分各自扩增的细胞比未扩增细胞生产更多的重组蛋白质。几种适宜的DHFR酶及其基因为现有技术已知，能够用于本发明。DHFR可以是野生型DHFR或其功能性变体或衍生物。术语“变体”或“衍生物”包括相对于各自的DHFR酶的氨基酸序列，有一个或多个氨基酸序列调换(例如删除、置换或添加)的DHFR酶；包含DHFR酶或其功能片段的融合蛋白；和已经修饰来提供附加的结构和/或功能的DHFR酶，以及上述各种的功能性片段，其仍然具有DHFR酶的至少一种功能。DHFR基因优选选自下组中野生型DHFR、与野生型DHFR相比具有降低的MTX敏感度的DHFR变体和与野生型DHFR相比具有增强的MTX敏感度的DHFR变体。根据一个实施方式，DHFR基因是野生型DHFR基因。根据一个不同的实施方式，DHFR基因编码DHFR的较差功能的变体。这导致了对MTX的升高的敏感性和更加严苛的选择条件。这可以通过在DHFR基因的3’末端放置一个内含子来做到(见上文)。不同的备选方案可以依赖于使用具有比野生型DHFR高的MTX敏感性的DHFR突变体/变体。当载体用于DHFR—的宿主细胞时，这些实施方式特别有益。如果希望在其自身基因组中包含DHFR拷贝的宿主细胞((例如CH0DHFR+))中使用DHFR系统，优选使用DHFR基因的突变体/变体，这种突变体/变体比野生型DHFR对抗叶酸剂(如MTX)不敏感，并因此在某些程度上具有抗叶酸剂特别是MTX抗性，例如，由于基因中的突变，DHFR基因对MTX的敏感性可以显著下降，因此该变体能够在较高浓度的抗叶酸剂(MTX)浓度下使用。该抗叶酸剂特别是MTX低敏感度的DHFR变体可以具有，例如降低的抗叶酸剂/MTX结合亲和性。各自的DHFR变体可以用于“过滴定”野生型细胞系中的内源性DHFR表达。各“抗性”或较低敏感性DHFR变体为本领域所公知。该表达载体可选自下组中(a)环状或线性载体核酸，包含所示排列中的下列遗传元件，其中5’至3’方向描述为一I.(MASM)表达盒的启动子(一)II.(MASM)表达盒的编码哺乳动物可扩增选择性标记的基因(一)III.任选的(MASM)表达盒的内含子(一)IV.(MASM)表达盒的PolyA位点(一)V.(P0I)表达盒的启动子(一)VI.(P0I)表达盒的内含子(一)VII.编码目的多肽的多核苷酸，该多核苷酸被插入到(P0I)表达盒中(一)VIII.(P0I)表达盒的PolyA位点(—)IX.(P0I，)表达盒的启动子(一)X.(P0I，)表达盒的内含子(一)XI.编码另一种目的多肽的多核苷酸，该多核苷酸被插入到(P0I’)表达盒中(―)XII.(P0I，)表达盒的PolyA位点(—)XIII.(MSM)表达盒的启动子(一)XIV.(MSM)表达盒的编码哺乳动物选择性标记的基因(一)XV.(MSM)表达盒的PolyA位点(一)XVI.PSM表达盒(一)或(一)XVII.如果载体核酸是环状的话，线性化限制性酶切位点；(b)如Seq.IDNo.1或Seq.IDNo.16所示的载体核酸或其衍生物，其包含以相同结构分别排列的遗传元件。环状形式变体(a)的优选实施方式如图1和相应的表1所示。根据本发明的载体可以通过以如上文中详细描述的适宜的顺序和方向排列表达盒来获得。表达盒/遗传元件的排列可以用适宜的限制性内切酶和克隆策略来完成，以装配表达载体。所以，也提供了制备如上所述的载体核酸的方法，其中所述方法包括排列至少下列遗传元件(a)至少一个用于表达目的多肽的表达盒(P0I)；(b)包含哺乳动物选择性标记基因的表达盒(MSM)；(c)包含哺乳动物的可扩增的选择性标记基因的表达盒(MASM)；以使得表达盒(MASM)位于表达盒(P0I)5'侧翼，表达盒(MSM)位于表达盒(P0I)的3'端，而且其中表达盒(MASM)、(P0I)和(MSM)以相同的5’至3’方向排列。在制备环状载体核酸的情况下，组装遗传元件以使表达盒(MSM)位于表达盒(P0I)的3'端，而表达盒(MASM)位于表达盒(MSM)的3’端。本发明的载体可以用于在许多不同的哺乳动物宿主细胞中表达目的多肽。本发明的表达载体通常被整合到基因组中，并保持在其中。宿主细胞有两种主要的形式，贴壁细胞培养物和悬浮培养物。优选悬浮培养物。大部分已建立的细胞系保持了它们的贴壁依赖特征，除非进行了使它们适于悬浮生长的特殊努力。可商购的培养基配方促进了这种转化。基本上，任何哺乳动物宿主细胞都可以用于本发明，只要它们能够表达多肽。适用于本发明目的的哺乳动物宿主细胞包括但不限于源于小鼠(例如COP、L、C127、Sp2/0、NS-O,NS-UAt20或ΝΙΗ3Τ3)、大鼠(PC12、PC12h、GH3、MtT)、仓鼠(例如BHK、CHO和DHFR基因缺陷型CH0)、猴(例如COSl、C0S3、C0S7、CVl和Vero)和人类(例如Hela,HEK-293、视网膜来源的PER-C6、源自人二倍体成纤维细胞的细胞、骨髓瘤细胞和H印G2)的细胞。优选宿主细胞是CHO细胞。根据本发明的载体构建体特别适于在啮齿目细胞中生产多肽，例如CHO细胞和DHFR基因缺陷型CHO细胞。本发明还提供了包含本发明的表达载体的哺乳动物宿主细胞。本发明还提供了在其基因组上包含本发明表达载体或其片段的稳定细胞系。该片段应该至少包含本发明决定性的表达盒。因为上文详细描述了载体及其特征和适宜的宿主细胞，在此引用上述公开。所以，本发明还提供了制备上述宿主细胞的方法，其中该宿主细胞用如权利要求1-16中至少一项所述的载体核酸转染。现有技术中已知几种适宜的将表达载体引入哺乳动物宿主细胞的方法。各个方法包括但不限于磷酸钙转染，电穿孔、脂质体转染、生物射弹和聚合物介导的基因转移。适宜的宿主细胞如上所述。在表达载体核酸引入到宿主细胞中之后，在适宜于检测表达盒(MSM)中包含的哺乳动物选择性标记基因的选择性条件下培养得到的转化体。这意味着，例如当哺乳动物选择性标记基因是抗生素抗性基因时，转化体培养在含有对哺乳动物细胞有活性的相应抗生素的培养基中，选择出在这样的条件下存活的转化体，从而能够得到表达标记基因因此包含该载体的转化体。另外，可以进行第二选择步骤在适于选择表达盒(MASM)中包含的可扩增的选择性标记基因的选择性培养基中培养转化体。例如，当DHFR用作可扩增的选择性标记基因时，可以把转化体培养在存在DHFR抑制剂的无核苷酸或嘌呤的培养基中。当在至少一个表达盒中使用可诱导启动子时，应该提供相应的诱导信号，以开始该多肽的表达。为了使用DHFR选择/扩增系统，可以在DHFR抑制剂存在下培养该宿主细胞。适宜的DHFR抑制剂是抗叶酸剂，例如MTX。使用的抗叶酸剂/MTX的浓度取决于宿主细胞和载体中插入的DHFR变体。可以为DHFR_宿主细胞中的多步骤扩增过程选择浓度范围，例如，约5nM-20nM的值至500nM_1000nM，或者第二或进一步扩增步骤中甚至更高的浓度。对于DHFR+细胞，起始浓度通常较高，为IOOnM至750nM的范围内，优选在第一步骤为500nM，进一步的扩增步骤中为500nM至IOOOnM或更高。适宜的DHFR变体如上所述。为了利用GS选择/扩增系统，可以在例如MSX存在下培养该宿主细胞。使用的MSX浓度取决于宿主细胞。浓度范围可以选自大约15至150μΜ、20至ΙΟΟμΜ和25至50μΜ。这些范围特别适用于NSO和CHO细胞。利用本发明的表达载体，可以表达/生产几种不同的目的多肽。术语多肽是指包含由肽键连接到一起的氨基酸的聚合物的分子。多肽包括任何长度的多肽，包括蛋白质(例如具有多于50个氨基酸)和肽(例如2-49个氨基酸)。多肽包括具有任何活性或生物活性的蛋白质和/或肽，包括，例如生物活性多肽，如酶蛋白或肽(例如蛋白酶、激酶、磷酸酶)、受体蛋白质或肽、转运蛋白或肽、杀菌素(bactericidal)和/或内毒素结合蛋白、结构蛋白或肽、免疫多肽、毒素、抗生素、激素、生长因子、疫苗等。该多肽可以选自由肽激素、白介素、组织纤溶酶原激活物、细胞因子、免疫球蛋白(特别是抗体或其抗体片段或变体)组成的组中。该免疫球蛋白可以是任何同种型。IgG(例如IgGl)分子最经常被制备/需要作为治疗蛋白。抗体片段是抗体的任何片段，包含所述整个抗体的至少20个氨基酸，优选至少100个氨基酸，其至少仍然具有抗原结合能力。抗体片段可以包括抗体的结合区，例如Fab片段、F(ab)2片段；包含多个结合结构域的多体，例如双抗体、三链抗体或四链抗体(tetrabody)；单结构域抗体；或亲和体(affibodies)。抗体变体是抗体或抗体片段的衍生物，具有相同的结合功能，但是具有例如不同的氨基酸序列。该抗体和/或抗体片段可以包含鼠轻链、人轻链、人源化轻链、人重链和/或鼠重链，及其活性片段或衍生物。因此，其可以是例如鼠源的、人源的、嵌合的或人源化的。本发明还提供了生产目的多肽的方法，该方法包括在细胞培养基中，在允许所述目的多肽表达的条件下培养至少一种包含根据本发明载体核酸的宿主细胞。下一步骤中，可以从该细胞培养物中分离/收获该多肽。可以破碎宿主细胞来得到表达的目的多肽。该多肽还可以例如分泌表达到培养基中，并从中获取。也可以使用各个方法的组合。所以，可以以高产量生产并高效获取/分离产物，特别是多肽。获得的多肽也可以进行进一步的加工步骤，例如纯化和/或修饰步骤，以制备所需质量的目的产物。根据一个备选方式，该目的多肽被分泌到细胞培养基中，并随后从细胞培养基中分离。优选该多肽是免疫球蛋白分子，例如抗体或其功能性片段。为了促进目的多肽的分泌，可以使用前导序列。优选地，使用免疫球蛋白分子的前导序列。本发明的表达载体以及适宜的宿主细胞和目的多肽如上所述，我们引用上述公开。制备目的多肽的方法包括至少一个下列步骤-从所述细胞培养基和/或所述宿主细胞分离目的多肽；和/或-加工该分离的目的多肽。根据本发明制备的目的多肽可以用本领域已知的方法回收，然后纯化、分离和/或修饰。例如，产物可以用包括但不限于离心、过滤、超滤、抽提或沉淀的常规过程从营养培养基中回收。可以用本领域已知的各种方法进行纯化，包括但不限于，层析(例如离子交换层析、亲和层析、疏水层析、层析聚焦和分子排阻色谱)、电泳程序(例如准备的等电聚焦电泳)、溶解度差异(例如硫酸铵沉淀)或抽提。根据一个特别有利于制备药物蛋白/肽的实施方式，宿主细胞在没有血清的条件下悬浮培养。然后可纯化得到的多肽，例如用层析方法(例如亲和纯化)纯化存在于细胞培养物上清中的多肽。根据本发明的方法制备的多肽呈现良好的稳定性性质。该结果还表明该多肽以功能形式表达，因此具有正确构象。所以，本发明还提供了使用如上所述的表达载体由本发明的制备方法获得的多肽。如上所述，多肽以良好产量获得。优选该多肽是免疫球蛋白分子，例如抗体或其功能性片段。图1展示了根据本发明的一个优选的实施方式的环状载体核酸。图2展示了图1的载体核酸的线性化版本，以说明线性化限制性酶切位点的位置的影响。图1和2中的数字1至17指示该载体核酸的遗传元件/特征，在下表1中详细说明。如果没有另外定义，白色箭头表示启动子或启动子/增强子元件；条纹框表示内含子元14件，黑色箭头象征表示目的多肽的多核苷酸；格子花纹的框表示多聚腺苷酸位点；格子花纹的箭头表示表达盒(MSM)和(MASM)的哺乳动物标记基因；条纹箭头表示原核生物的选择性标记基因。可见，所有的遗传元件都以相同的5'至3’方向(以箭头的方向指示)排列。分别构建了载体核酸PBW147、pBW154和pBW160，下文中进一步详细描述。表1-图1和2中所示的载体核酸的遗传元件的取向和排列接下来，给出了上述载体元件的适宜实例，但是这些实例是非限制性的。作为哺乳动物可扩增的选择性标记基因，优选使用DHFR。野生型小鼠DHFR多核苷酸的适宜实例提供为Seq.IDNo.5，其优选与DHFR—宿主细胞联合使用。适宜的DHFR的突变形式提供为Seq.IDNo.6。各个突变形式优选与DHFR+细胞一起使用。Seq.IDNo.12表示突变的DHFR，包括适用于进一步提高选择压力(见上文)的内含子。还可以使用前面提到的功能性变体或片段。作为哺乳动物选择性标记基因，优选使用neo。适宜的序列提供为Seq.IDNo.7。还可以使用其功能性变体或片段。作为驱动目的多肽表达的启动子序列，优选使用CMV启动子。适宜的序列提供为Seq.IDNo.8。还可以使用其功能性变体或片段。作为驱动选择性标记基因MSM和MASM表达的启动子序列，优选使用SV40启动子。适宜的序列提供为Seq.IDNo.9。还可以使用其功能性变体或片段。作为目的多肽和/或MASM的多聚腺苷酸化序列，可以使用SV40多聚腺苷酸位点。适宜的序列提供为Seq.IDNo.10。还可以使用其功能性变体或片段或反方向使用(晚期或早期SV40多聚腺苷酸位点)。作为编码目的多肽的表达盒(POI)的内含子序列，可以使用Rk内含子。适宜的序列提供为Seq.IDNo.11。还可以使用其功能性变体或片段。可以例如联合哺乳动物选择性标记(MSM)使用的合成多聚腺苷酸化位点示为Seq.IDNo.13。还可以使用其功能性变体或片段。适宜的细菌选择性标记(PSM)为例如提供氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。适宜的序列提供为Seq.IDNo.14。还可以使用其功能性变体或片段。另外，载体核酸可以包含至少一个多克隆位点(MCS)，用于插入例如编码目的多肽的多核苷酸。MCS可以提供在编码目的多肽的多核苷酸的3’端和5’端。适宜的MCS位点提供为Seq.IDNo.4(优选位于5’位点/区域)和Seq.IDNo.15(优选位于3’位点/区域)。可以使用这些MCS位点，以引入编码目的蛋白的多核苷酸。特别优选的载体核酸示于Seq.IDNo.1(包含野生型DHFR基因，该载体特别适用于DHFR-系统)和Seq.IDNo.16(包含突变的DHFR基因，该载体特别适用于DHFR+系统)。此处使用的所有参考文献都通过引入本申请作为参考，因此构成本发明的一部分。实施例现在通过非限制性实施例说明本发明，但是这些实施例构成本发明的优选实施方式。I.细胞培养方法和转染下面，通过实施例描述用于表达目的多肽的本发明宿主细胞的转染和培养的适宜方法。实施例1:细胞培养将CHO细胞在适宜的CHO培养基中培养，例如ExCell81134(购自SAFCBiosciences)。每周将细胞向新鲜培养基中传代2_3次，而且在整个研究中细胞保持在对数生长期。实施例2:转染策略使用存活率大于90%的指数生长期的亲本CHO细胞用于转染。根据生产商(Invitrogen)的建议用DMRIE-C反应物以脂转染的方法进行转染。在OptiMEMI培养基(Invitrogen)中，将细胞数量调节至IxlO6个细胞OptiMEMI培养基(Invitrogen)。对于脂转染，2μg或4μg的表达载体和4μ1的DMRIE-C反应物在室温下一起混合28分钟，然后加入到细胞中，37°C，4小时。然后将细胞稀释至每毫升培养基2xl05个细胞，并在37°C和5%CO2条件下孵育2天。实施例3新霉素选择和基因扩增位于表达载体核酸中的新霉素选择标记使其可以进行G418抗性选择。对于转染物的选择，在0.8mg/mlG418(Invitrogen)存在下培养细胞大约两周。转染和G418选择后两周，形成主要由G418抗性细胞组成的集合细胞群。然后在没有核苷酸存在的条件下培养约两周。然后向培养基中加入20nMMTX来起始基因扩增。培养三周之后，产生扩增的异质细胞群。DHFR(二氢叶酸还原酶)选择/扩增标记使其可以通过向培养基加入叶酸类似物甲氨蝶呤(MTX)进行DHFR基因以及转基因的扩增，导致转染群的升高的滴度。关键回收(crisisrecovery)之后，对转化群用更高MTX浓度进行第二和第三次扩增步骤(IOOnM和500nMMTX)，每次大约两周。在每个步骤，在群回收之后，冷冻细胞。实施例4克降细胞系的津立为了得到克隆细胞系(即，源自单个细胞的细胞系)，稳定转化的细胞池可以稀释并接种到96孔板中，接种细胞密度为0.3-0.5细胞每孔(极限稀释)。用标准程序将形成独特克隆的细胞规模放大。最后，评价单个克隆的重组多肽表达，在培养和分析后留下最高的生产菌株。从这些候选者中，选择具有适宜的生长和生产力特性的细胞系用于重组蛋白质的生产。通常可以通过建立/调整培养条件(即加入添加剂例如蛋白胨)进一步提高生产力。II.载体构建根据本发明教导的几个载体装配是可行的。由于载体的单个元件为本领域已知，可以通过例如以所需的取向测序或扩增和适宜克隆基本遗传元件和表达盒来装配适宜的载体。各种克隆的方法为本领域现有技术，上述遗传元件的序列也记载在本领域的现有技术中。下面，以举例的方式描述几个载体构建体的产生。然而，本领域技术人员应理解，若干其他实施方式和得到各个载体的方式是适用和容易得到的。为了促进此处以举例方式描述的载体构建体及其前体载体的排列的理解，表1和2提供了包含在这些载体中的主要遗传元件、它们的顺序和取向的概述。当然，仅仅示出了主要元件，但是该载体可以包含附加的遗传元件或骨架序列。表中各列表示一个载体构建体。从最上一行至最后一行，以在载体上排列和取向的顺序列出了表达盒的遗传元件。如果所描述的载体是环状的，各列最后一行中所示的元件实际上与第一行中所示的遗传元件相邻(当然，可以存在骨架序列)。用箭头符号表示各个遗传元件的取向。箭头指向各个遗传元件的3’方向。表2-前体载体中遗传元件的顺序表3_表达载体中遗传元件的顺序上文表1至表3和图1和2中的缩写具有本领域技术人员明显了解的和如上所述的常规含义，具体具有如下含义MCS=多克隆位点mAB-HC=单克隆抗体重链mAB-LC=单克隆抗体轻链内含子=参见Grillari等人，2001,3.Biotechnol.87，59-65prom/enhan=启动子/增强子实施例5表达载体pBW147的构建在此建立中，试验了mAB基因和DHFR*(具有比野生型DHFR低的MTX敏感性的突变变体)以及联合bghpA-位点的串列结构。DHFR*盒在表达盒(POI)的5，端，包含mAB-LC，因此所有的开放阅读框都以一个阅读方向放置。PBW147的装配示于表3中。pBW147可以由pBW133构建(还请参见表2)。pBW147的构建如此所述。pBW133的构建下述载体构建基于可商购的pCI-neo表达载体(PromegaCooperation，USA)。完整的DNA序列是公众可得到的((GenBank/EMBL登录号U47120))。向pCIneo中引入新的多克隆位点。该多克隆位点的两个链是从头合成的。用NheI和XmaI酶切pCIneo。通过凝胶电泳去除旧的MCS。新的多克隆位点以下列方式合成反义链的5’端的末端4个核苷酸和上面的DNA链的3，末端没有合成。两个链退火后，形成NheI和XmaI的可配伍末端。新多克隆位点的序列如下所示(参见Seq.IDNo.2)为了说明的目的，连接新MCS和pCIneo得到的质粒称为pCI-neo-2。通过引入来自pRK5(BDPharMingen)WpRK内含子进一步修饰pCI-neo-2。所以，用ApaI消化pCI-neo-2。用T4聚合酶处理形成平末端。然后用NdeI消化质粒。用NdeI和NruI(平末端切割酶)消化PRK5。分离含RK内含子的片段，并与pCIne02骨架连接。得到的质粒是pCIne02RK。为了向一个载体中引入两个表达盒，可以获得载体pCIneoDHFRtRK。pCIneoDHFR*-RK以如下方法获得DHFR*表达盒用PCR从载体pCHI-LC(SimulectSP2/0轻链表达载体)扩增。引物是BB35(GGGCACTACGTGCCGCGGATTTAAATGCGGCCGCATATGGTGCACT-Seq.IDNo.3)；和BB36(GGGCACGTAGTGTTTATTAGGGGAGCAGAGAACTTGAA-Seq.IDNo.4)。通过DraIII限制性酶切将PCR片段克隆到pCIneoRK，得到载体pCIneoDHFR*-RK。用Eco0109I消化打开pCIne0DHFR*-RK。为了形成平末端，随后进行Klenow酶处理。pCIneo2RK的表达盒通过用BglII、NgoMIV和StuI消化该质粒而切除。连接这两个片段后，形成“空”表达载体pCH02neON。通过MluI和SalI限制性酶切位点向pCH02neON中插入抗体轻链基因，从而形成载体构建体，我们称之为PBW108。因此用含有两个限制性酶切位点的引物扩增了该抗体基因。通过PmeI和AscI消化载体，向pBW108中插入mAB重链，从而得到载体构建体，为说明的目的，称为PBW111。用PCR扩增重链，其5’末端产生平末端，基因的3’末端含有AscI限制性酶切位点。在pBWlll中，调换轻链的5，非翻译区域末端，因为在轻链cDNA前存在另外的ATG密码子。这通过从pBWlll切除Bglll/Mlul片段，并用正确的片段取代来做到。新质粒记作PBW133。PBW133是在一个质粒上具有所有基因的第一个载体。基因的排列是LC-DHFR(相反反向)-neo-HC(还参见表2)。该载体是可以用于得到根据本发明教导的载体的起始材料之一。然而，显然有几种其他方式得到各个载体。pBW139的构建可以用于得到pBW147的第二载体构建体具有pBW139的结构。pBW139可以从PBW115制备。为了构建pBW115，将重链基因克隆到pCIneoRK中(参见上文)。所以，用MluI和NruI(平末端切割酶)消化pCIneoRK，然而重链PCR片段用AscI(3，)(与MluI配伍)消化，为5，端平端。得到的质粒是PBW115。用ScaI和BglII消化pBW115。然后进行Klenow填充，形成平末端。用ScaI和DraIII从pBW133切除轻链表达框。为了形成平末端，进行T4-DNA聚合酶处理。连接，得到具有如pBW139结构的载体(见表2)。pBW147的组装为了得到pBW147，用SpeI，XhoI消化pBW133。分离含有部分CMV启动子和重链第一部分的片段，并连接到也用SpeI，XhoI切割的pBW139。在得到的载体中，发现重链表达框没有干扰的附加ATG密码子。为了将轻链恢复至该载体中，用SpeI消化pBW139。将含LC的片段插入至用SpeI打开的pBW148中。得到的质粒具有如pBW146的结构(见表2)。在pBW146中，插入了来自pBW112(另一方案的表达载体)的DHFR基因。但是，DHFR基因也可以从不同的来源得到，这取决于所需的DHFR变体类型。用BglII消化pBW146。随后，用含有BglII和BamHI限制性酶切位点的引物PCR扩增DHFR框。用这两个酶消化该PCR片段，并将其插入到PBW146的适配BglII位点中。得到的质粒具有如pBW147的结构，其中所有的表达框具有相同的取向。结构示于表3中。该表达载体可用于获得稳定的转化体。为了进一步提高表达产量，可以选择MTX非常“敏感”的野生型DHFR变体，其中MTX浓度也应该充分适合。实施例6表达载体PBW154的构建为此载体试验来自pSV2DHFR(具有对MTX高敏感度的DHFR的野生型版本)的mAB基因和DHFR基因框的串联结构。用PCR扩增来自pSV2DHFR(ATCC#374146)的DHFR表达框。该片段包含启动子和多聚腺苷酸位点。如上所述，该寡核苷酸具有Bglll/BamHI限制性酶切位点。DHFR表达框插入到pBW146的BglII限制性酶切位点，得到具有与pBW154相同结构的载体构建体。PBW154的结构如表3所示，而且可以从图1和图2得出，图1和2展示了具有各个遗传元件的整体结构/构型的载体构建体的一般实例。PBW154的序列提供%Seq.IDNo1。在Seq.IDNo.1中，轻链多核苷酸标记为“η”(在优先权申请中用占位符V表示)，重链多核苷酸标记为“η”(在优先权申请中用占位符Y表示)。PBW154的特征总结于表4中。当然，也可以使用其他载体元件，例如不同的启动子、不同的增强子、不同的多聚腺苷酸位点和其他元件，例如不同的复制原点。另外，还可以交换免疫球蛋白的轻链和重链的表达框。然而，所示出的载体元件的选择和排列是优选的。如上所述，还可以使用免疫球蛋白分子的功能性片段。因此，所使用的“nrm”仅仅用于说明的目的，而不意味着任何大23小的限制，因为在相应的位置可以存在更小或更大的免疫球蛋白序列。为了减轻与展示本发明优选实施方式的载体的一般构建的图1和2的比较，我们已经指明了图1和2中相应元件的编号。表4所有的遗传元件以相同的5’至3’方向排列。利用此采用野生型DHFR的载体构建体，进行了非常有效的如上所述的基因扩增。标准批次实验中的滴度可以升高10-20倍。此处，一旦MTX扩增，观察到了抗体表达滴度的极大增长。从G418处理开始，经过没有核苷酸的处理，直至几个不同浓度MTX(20和IOOnMMTX)处理，滴度不断显著上升。但是，即使可以使用各个高浓度，使用非常高的MTX浓度(例如500nMMTX)通常不会导致对CHO细胞更进一步的益处。当用标准培养规程时，在选择/扩增过程中获得的用于库的抗体滴度范围为2至大于60mg/L。在从该库建立克隆细胞系并用定制的培养基增强细胞表达时，可以进一步提高表达滴度，因为，可得到的滴度还取决于所使用的培养基。实施例7表汰载体DBW160的构津这些实验还说明了载体中DHFR基因的取向是决定性的。在pBW146(见上文)中，存在EcoRI限制性酶切位点。为了在最终表达载体中具有EcoRI作为单一的切割位点，该位点可以通过用EcoRI消化pBW146、Klenow填充和移位(relegation)而除去。这得到具有如pBW158结构的质粒(未示出)。如上所述，DHFR框可以整合到pBW158中。由于两个取向(如pBW159和pBW160所示的取向，见表2和3)都自动产生，可以试验这两种取向情况下的表达水平。我们的结果表明，所有开放阅读框都以一个5’至3’方向取向的结构具有更优越的性能。其中DHFR取向与mAB基因相反的具有诸如pBW159载体结构的载体(见表2)通常仅仅表现出非常低的表达滴度，即使是在MTX扩增之后(通常少于lmg/L)。其中DHFR取向与mAB基因取向一致(inframe)的具有诸如pBW160设计的载体(见表3)能够提供高于5mg/L的较高的抗体滴度，甚至高于10mg/L，或甚至高于15mg/L(可从库中得到)。此外，当使用根据本发明的载体构建体时，通过建立克隆细胞系和通过使用高性能培养基，可以进一步提高滴度产量。这些实验可以说明根据本发明的教导使用的选择性标记和mAB编码基因“取向一致结构”的优点。该结果支持如下发现载体元件的5’至3’取向是高表达载体的重要因素。并且，本发明表达载体的表达稳定性非常有利。根据本发明的载体结构使其能够直接产生具有高细胞特异性生产力的细胞库。关键要素是5，至3，取向，选择的DHFR变体和DHFR选择性标记在载体上的放置，以及抗体基因和第二选择性标记(neo)在质粒上的排列。该载体也可以用于制备非抗体蛋白质或肽。如上所述，通过DHFR框的轻微改动，该系统还可以用于DHFR阳性CHO-KlPD细胞系的基因扩增。DHFR基因的突变版本用于DHFR+宿主细胞中的基因扩增(见上文)。包含突变版本的DHFR基因的载体(如pBW117)的完整的DHFR表达框可以用加入BamHI位点的引物来PCR扩增。然后将该片段克隆到PBW158的BglII位点，得到载体pBW165。利用包含突变的DHFR基因的具有诸如PBW165结构的载体(并且接着而来的是其他抗体)，能够在DHFR+细胞系CHO-Kl-PD宿主细胞中产生高产量的细胞系。一个单独的载体序列的实例提供为Seq.IDNo.16。当然，还可以使用除已经示出的载体元件之外的不同载体元件，例如不同的启动子、不同的增强子、不同的多聚腺苷酸位点和/或其他元件，例如不同的复制原点。另外，还可以交换免疫球蛋白的轻链和重链的表达框。然而，所示出的载体元件的选择和排列是优选的。如上所述，可以从该载体表达全长的免疫球蛋白分子，以及免疫球蛋白分子的功能片段。在Seq.IDNo.16中，只有该指明的位点为插入位点，在这个位点单个的免疫球蛋白序列可以位于/插入在最终的表达载体中。任何免疫球蛋白序列都可以存在于相应位置。并且，如上所述，还可以表达不同的目的多肽。25实施例8用转染的CHO细胞的小规樽抗体牛产为了在悬浮培养中检测，将细胞以IxlO5细胞/ml的密度接种在250ml圆底滤盖培养瓶中的50mlExCell81134培养基(SAFCBiosciences)中。在该研究持续的时间内，在KuhnerShakerISF-4-W/培养箱中，在37°C，10%CO2环境条件下以65rpm振摇细胞。在细胞悬浮的第4天开始，根据固定的给料方案，给以带有专卖溶液的单独给料。在第13天，收获Iml样品，用标准HPLC和蛋白质A柱测量滴度。最佳克隆的摇瓶培养中得到的细胞培养上清用蛋白质A亲和层析纯化。实施例9所表汰的抗体的蛋白质A纯化对于蛋白质A纯化，大约27mL不含细胞含有大约32.4mg抗体的培养上清载至0.5x10cmMabSelect亲和柱上。上样以后，有效冲洗和洗涤该柱。然后在pH3_4洗脱抗体。用标准HPLC用蛋白质A柱分析洗脱液。得到大约30.5mg抗体。III.细胞比生产力的实施例和产率检测克隆扩展后选择的克隆的生产率。实施例10JgGl抗体的表汰表达IgGl抗体。克隆生长在可商购的培养基Ex_Cell81134(SAFCBiosciences)中。加入进料溶液和常规添加剂，如蛋白胨。当使用根据本发明的载体时可以得到高生产力率。Qp=细胞比生产力。实施例11=IrGI抗体和IgG4抗体的表汰表达IgGl抗体和IgG4抗体。在合适的培养基中生长克隆。加入进料溶液和常规添加剂，如蛋白胨。当使用根据本发明的载体时可以得到高生产力率。Qp=细胞比生产力实施例12用转染的CHO细胞大规模生产多肽可以在例如wave、玻璃或不锈钢生物反应器中进行大规模的多肽生产。为此目的，扩展细胞，通常从单个冷冻试管开始，例如来自Master细胞库的试管。融化这些细胞，并通过若干步骤扩展。用适量的细胞接种不同规模的生物反应器。可以通过加入进料溶液和添加剂至该生物反应器中来提高细胞密度。在长期时间段将细胞保持在高生存力。在这种大规模生产中反应器中的产品滴度达到从每升几百毫克高至每升几克。可以用标准层析方法进行纯化，可包括亲和层析、离子交换、疏水相互作用或分子排阻色谱步骤。在最后的规模中，生物反应器的大小可以高达几千升体积(还参见例如F.Wurm，NatureBiotechnologyVol.22，11，2004，1393-1398)。棚列13甚·Φ弓丨入膽■剛·■插入新目的多肽的一个策略如下所述(用具有某种结构的载体如PBW154通过举例的方式解释)羟链基因的克隆用在ATG密码子的5，端引入MluI位点和该基因的3，端引入SalI位点的引物用PCR扩增轻链基因。用这两个限制性内切酶将PCR产物引入pBW154。这产生只由轻链组成的中间载体。重链基因的克隆用在ATG密码子的5’端引入平端和在该基因的3’端引入XbaI位点的引物用PCR扩增重链基因，该平端用于载体的NruI位点。用这两个限制性内切酶将PCR产物引入PBW154。这样得到具有旧的轻链和新的重链的中间载体。最终载体的装配用SalI消化从该HC载体切下新的含mAB-HC的片段。然后通过SalI插入到LC-中间载体中，得到最终新LC-HC载体。权利要求一种适用于在哺乳动物细胞中表达至少一种目的多肽的载体核酸，包括(a)至少一个适用于表达目的多肽的表达盒(POI)；(b)包含哺乳动物选择性标记基因的表达盒(MSM)；(c)包含哺乳动物的可扩增的选择性标记基因的表达盒(MASM)；其中所述表达盒(POI)5’侧翼连接表达盒(MASM)，表达盒(MSM)位于表达盒(POI)的3’，而且其中表达盒(MASM)、(POI)和(MSM)以相同的5’至3’方向排列。2.如权利要求1所述的载体核酸，其中所述表达盒(POI)包含编码目的多肽的多核苷酸。3.如权利要求1或2所述的载体核酸，所述载体核酸为环状，而且其中所述表达盒(MSM)排列在表达盒(POI)的3’端，而且其中表达盒(MASM)排列在表达盒(MSM)的3’端。4.如权利要求3所述的载体核酸，其中所述载体包含用于线性化所述载体的唯一线性化限制性酶切位点，其中所述线性化限制性酶切位点位于表达盒(MSM)和(MASM)之间。5.如权利要求1-4中至少一项所述的载体核酸，其中所述表达盒(MSM)包含编码酶功能性新霉素磷酸转移酶的基因，而且其中所述表达盒(MASM)包含编码酶功能性二氢叶酸还原酶的基因(DHFR)。6.如权利要求1-5中至少一项所述的载体核酸，其中所述载体包含至少一个用于表达其它目的多肽的其它表达盒(Ρ0Ι’)，而且其中所述其它表达盒(POI')位于表达盒(POI)和表达盒(MSM)之间，其中表达盒(Ρ0Ι’)以与表达盒(POI)和表达盒(MSM)相同的5’至3’方向排列。7.根据权利要求6的载体核酸，用于表达免疫球蛋白分子，所述载体核酸包含在表达盒(POI)和(Ρ0Ι’)中的每一个中的编码免疫球蛋白分子的轻链或重链或其功能性片段的多核苷酸，其中表达盒(POI)和(Ρ0Ι’)各自包含所述多核苷酸之一。8.根据权利要求1-7中至少一项所述的载体核酸，其中所述表达盒包含启动子和/或转录终止位点。9.根据权利要求1-8中至少一项所述的载体核酸，其中所述表达盒包含增强子和/或内含子。10.根据权利要求8或9所述的载体核酸，其中表达盒(POI)和/或如果存在的表达盒(Ρ0Ι’)包含CMV启动子/增强子，和/或其中表达盒(MSM)和(MASM)包含SV40启动子/增强子或SV40启动子。11.如权利要求9或10所述的载体核酸，其中至少表达盒(POI)包含排列在所述启动子和表达目的多肽的多核苷酸的起始密码子之间的内含子。12.如权利要求9-11中至少一项所述的载体核酸，其中表达盒(MASM)包含位于哺乳动物可扩增选择性标记基因的3’端的内含子。13.如权利要求1-12中至少一项所述的载体核酸，包含至少一个包含原核生物选择性标记基因的其它表达盒(PSM)，其中表达盒(PSM)位于表达盒(MSM)和(MASM)之间。14.如权利要求13所述的载体核酸，其中所述原核生物选择性标记基因提供抗生素抗性，其中所述抗生素选自由氨苄青霉素、卡那霉素、四环素和氯霉素组成的组中。15.如权利要求5-14中至少一项所述的载体核酸，其中DHFR基因选自如下组中野生型DHFR、与野生型DHFR相比具有降低的MTX敏感性的DHFR变体和与野生型DHFR相比具有2增强的MTX敏感性的DHFR变体。16.如权利要求1-15中至少一项所述的载体核酸，其中所述表达载体选自如下组中(a)环状或线性载体核酸，包含所示排列中的下列遗传元件，其中5’至3’方向描述为I.表达盒(MASM)的启动子(一)II.表达盒(MASM)的编码哺乳动物可扩增选择性标记的基因(一)III.表达盒(MASM)的内含子(一)IV.表达盒(MASM)的PolyA位点(一)V.表达盒(POI)的启动子(一)VI.表达盒(POI)的内含子(一)VII.编码目的多肽的多核苷酸，该多核苷酸被插入到表达盒(POI)中(一)VIII.表达盒(POI)的PolyA位点(—)IX.表达盒(Ρ0Ι’)的启动子(一)X.表达盒(Ρ0Ι’)的内含子(一)XI.编码另一种目的多肽的多核苷酸，该多核苷酸被插入到表达盒(Ρ0Ι’)中(一)XII.表达盒(Ρ0Γ)的PolyA位点(—)XIII.表达盒(MSM)的启动子(一)XIV.表达盒(MSM)的编码哺乳动物选择性标记的基因(一)XV.表达盒(MSM)的PolyA位点(—)XVI.表达盒PSM(—)或(一)XVII.如果载体核酸是环状的话，线性化限制性酶切位点；(b)如Seq.IDNo.1或Seq.IDNo.16所示的载体核酸或其衍生物，其包含相同的遗传元件排列。17.一种制备如权利要求1-16中至少一项所述的载体核酸的方法，其中所述方法包括排列至少下列遗传元件(a)至少一个用于表达目的多肽的表达盒(POI)；(b)包含哺乳动物选择性标记基因的表达盒(MSM)；(c)包含哺乳动物的可扩增的选择性标记基因的表达盒(MASM)；以使得表达盒(POI)5’侧翼连接表达盒(MASM)，表达盒(MSM)位于表达盒(POI)的3’，而且其中表达盒(MASM)、(POI)和(MSM)以相同的5，至3，方向排列。18.如权利要求17所述的制备环状载体核酸的方法，包括排列所述遗传元件以使得表达盒(MSM)排列在表达盒(POI)的3’端，而且其中表达盒(MASM)排列在表达盒(MSM)的3，端。19.一种哺乳动物宿主细胞，包含如权利要求1-16中至少一项所述的载体核酸。20.如权利要求19所述的哺乳动物宿主细胞，其中所述宿主细胞选自下组中C0P、L、C127、Sp2/0、NS-O,NS-UΝΙΗ3Τ3、PC12、PC12h、BHK和CHO,COSl、C0S3、C0S7、CVl、Vero,HeLa,ΗΕΚ-293、视网膜衍生的PER-C6、衍生自二倍体成纤维细胞的细胞、骨髓瘤细胞和H印G2。21.一种制备如权利要求19或20所述的宿主细胞的方法，其中所述宿主细胞用如权利要求1-16中至少一项所述的载体核酸转化。22.—种制备目的多肽的方法，所述方法包括在允许所述目的多肽表达的条件下在细胞培养基中培养至少一种如权利要求19所述的宿主细胞。23.如权利要求22所述的方法，其中所述目的多肽被分泌到所述细胞培养基中，并从所述细胞培养基中分离出来。24.如权利要求22或23所述的方法，其中所述目的多肽是免疫球蛋白分子或其功能片段。25.一种多肽，通过如权利要求22-24中至少一项所述的方法制得。26.如权利要求25所述的多肽，其中所述多肽是免疫球蛋白分子或其功能片段。全文摘要本发明提供了用于在哺乳动物细胞中表达至少一种目的多肽的载体核酸，包括(a)至少一个用于表达目的多肽的表达盒(POI)；(b)包含哺乳动物选择性标记基因的表达盒(MSM)；(c)包含哺乳动物的可扩增的选择性标记基因的表达盒(MASM)；其中所述表达盒(POI)5’侧翼连接表达盒(MASM)，表达盒(MSM)位于表达盒(POI)的3’，而且其中表达盒(MASM)、(POI)和(MSM)以相同的5’至3’方向排列。本发明还提供了包含所述载体的宿主细胞和用于使用各自的宿主细胞制备多肽的方法。文档编号C12N15/79GK101903523SQ200880122117公开日2010年12月1日申请日期2008年12月18日优先权日2007年12月21日发明者B·威尔姆斯,H-P·科诺普夫申请人:诺瓦提斯公司