能与scurfin结合的肽及其应用的利记博彩app

专利名称：能与scurfin结合的肽及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明通常涉及能与scurfin结合的肽及其应用。本发明特别涉及通过与 scurfin直接结合的方式抑制scurfin生物活性的肽，从而实现调控或阻断调控T (Treg)淋 巴细胞。所述肽可用于治疗适宜或必须以可控方式调控或阻断Treg淋巴细胞活性的病状， 例如感染性疾病和肿瘤疾病。
背景技术：
在19世纪70年代初，第一次描述了可以抑制免疫反应的T淋巴细胞的存在。那 时，认为所述抑制作用是由特定细胞亚群介导的，但所述亚群没有特定标记可设法得以克 隆或表征，丧失了部分对该细胞亚型的兴趣。然而，在1995年，Sakaguchi等(Sakaguchi et al. 1995. J Immunol 155 :1151_64)发现，共表达白细胞介素 2 受体 α 链(CD25)的 CD4+ 细胞(10%)的少数种群对于体内控制自身反应细胞和自身免疫是至关重要的。此后，多 个小组证实了这种⑶4+⑶25+细胞亚群是免疫抑制的，其也被称为Treg淋巴细胞或Treg 细胞(Takahashi et al. 1998. Int Immunol 10 1969-80 ;Thornton&Shevach. 1998. J Exp Med 188:287-96)。首先在小鼠中鉴定了这种细胞，之后在人中被广泛表征(Dieckmann et al. 2001. J Exp Medl931303-10 Jonuleit et al. 2001. J Exp Med 193 1285-94 ； Levings et al. 2001. J Exp Med 193:1295-302)。目前科学界广泛接受了特定免疫抑制亚 群的存在，并探索为临床应用而操纵其活性的方式。主要的问题是如何能调控它的活性。Treg淋巴细胞对于防止自身免疫疾病和预防移植的排异是很重要的；因此，增强 其活性的可能性在治疗自身免疫疾病和在器官移植中具有很大潜力。然而，由于肿瘤会表 达自体抗原，因此Treg淋巴细胞可以抑制针对癌症的免疫反应的激活。几个小组包括发明人的小组已证实，通过体内给予消耗性抗体简单清除 CD4+CD25+(Treg)细胞可促进抗肿瘤免疫的诱导和防止癌症发展(Casares et al. 2003. J Immunol 171 :5931_9 ；Onizuka et al.1999. Cancer Res59 :3128_33 ；Shimizu et al.1999. J Immunol 163 :5211_8 ；Steitz et al. 2001. Cancer Res 61 :8643_6 ；SutmuIler et al. 2001. J Exp Med 194:823-32)。从而认为 CD4+CD25+(Treg)细胞持续减缓效应 T 淋 巴细胞的激活以预防自身免疫过程，但同时致使难以正确激活抗肿瘤反应，当其必须时。免疫疗法对于癌症患者的治疗是很有前景的。所执行的多种临床方案证实了癌症 免疫疗法通常是安全的，所述临床方案是使用基于细胞因子的疗法、输注效应T细胞或接 种方案。然而，尽管在这些临床方案中观察到治疗之后诱导了免疫反应，但大部分患者不 能够发展有效的抗肿瘤反应。包括700多名患者在内的37个独立临床接种方案的后设分 析表明，针对肿瘤的部分或完全反应的百分比是很低的(3.8% ) (Rosenberg et al. 2004. Nat Med 10 :909_15)。最近证明，在黑素瘤(Wang,H. Y.，J Immunol, 2005. 174 :2661_2670 ； Viguier, M.，F. J Immunol, 2004. 173 1444-1453.)、肺癌(Woo，Ε. Y.，Cancer Res 61 4766-4772)、卵巢癌(Woo，Ε. Y. , Cancer Res, 2001. 61 :4766_4772，Curiel，Τ. J.，Nat Med, 2004. 10 942-949)、胰腺癌和乳腺癌(Liyanage, U. K.，J Immunol, 2002. 169 :2756_2761) 以& 月干· (Ormandy, L. A. Cancer Res, 2005. 65 2457-2464 ；Kobayashi, N. ， ClinCancerRes, 2007. 13 902-911)患者的肿瘤组织或淋巴结中存在Treg淋巴细胞，并描述了肿瘤组 织分泌将该亚群特异性吸引至肿瘤组织的趋化因子，这表明Treg淋巴细胞接近肿瘤是一 个动态过程，其产生了促进疾病发展的免疫抑制效应。在肿瘤以及外周淋巴结中存在Treg 可解释免疫疗法方案的低效力。同样，在感染性疾病中，由Treg淋巴细胞所发挥的控制可 限制效应子T反应的量值并造成感染控制的失败。因而描述了一些病毒例如乙型肝炎病毒 (Xu, D. J Immunol, 2006. 177 :739_747)、丙型肝炎病毒(Boettler, T.，J Virol, 2005. 79 7860-7867 ；Cabrera, R. Hepatology, 2004. 40 1062-1071 ；Rushbrook, J Virol,2005. 79 7852-7859 ；Sugimoto,K. Hepatology,2003. 38 1437-1448)和 HIV(Aandahl，Ε· M. J Virol, 2004. 78 2454-2459 ；Kinter,A. L. J Exp Med, 2004. 200 :331_343 ；Oswald-Richter,K. PLoS Biol2004. 2 :E198 ；Weiss, L. Blood, 2004. 104 :3249_3256)可使用 Treg 淋巴细胞阻断抗病 毒免疫反应从而允许持久的慢性感染的形成。由于这些，认为Treg淋巴细胞作用的调控对 于发展针对癌症或针对感染性疾病的免疫疗法是很重要的。关于Treg淋巴细胞的作用模式存在一些争议，但细胞因子TGF-β (转化生长因 子-β)在抑制效应T细胞过程中的作用似乎日趋一致(Powrie et al. 1996. J Exp Med 183 2669-74 ；Somasundaram et al. 2002. Cancer Res62 :5267_72)。此外，最近描述的是，转录因子scurfin(F0XP3，foxp3基因的表达产物)(Yagi et al. 2004. Int Immunol 16 1643-56. 20040ct 04)是 Treg 淋巴细胞的活性必不可少的， 以至它的存在决定这些细胞的抑制活性。编码鼠和人scurfin的cDNA序列是美国专利 6，414，129的目标，其还描述了调控scurfin的表达在多种疾病中有治疗效应；所述专利也 提到使用合成的肽和其他分子来调控foxp3基因的表达，但未提及任何有关抑制已表达的 scurfin活性的可能性。同样，基于通过使用中和单克隆抗体的方式清除Treg淋巴细胞，在哺乳动物中增 强免疫反应的方法的用途(W0 2006/044864)；但是，所述专利申请未提及任何有关通过抑 制scurfin活性(对所述细胞的免疫抑制效应很重要)的方式瞬时调控Treg淋巴细胞活 性。此外，消耗Treg淋巴细胞会增加诱导自身免疫的风险，以及这种单克隆抗体不能辨别 Treg淋巴细胞和效应T淋巴细胞的事实减少了它们的应用。目前，在实验中描述的抑制Treg淋巴细胞活性的唯一方法涉及通过使用消耗性 抗体的方式或通过阻断它们所产生的并负责它们的活性的细胞因子(TGF-β，IL-10)的方 式来清除它们，但不存在这种细胞亚群的特定抑制剂。基于消耗调控T细胞的方法的缺陷 是，它们会清除细胞并涉及引发自身免疫疾病的风险。而且，不存在调控T细胞的特异性抗 体且存在的那些也会清除效应T细胞。因此必须鉴别能调控或阻断Treg淋巴细胞活性的新化合物，其可能用于人治疗中。发明概述现在令人惊奇地发现，通过使用不仅能与scurfin结合而且能抑制其生物活性的 肽抑制scurfin活性，可瞬时或暂时调控或阻断Treg淋巴细胞的免疫抑制活性，scurfin 是所述Treg淋巴细胞发挥它们的免疫抑制效应的必需转录因子。能与scurfin结合的所 述肽，特别是能抑制其生物活性的那些肽，可潜在地用于治疗需要瞬时或暂时调控或抑制 Treg淋巴细胞的免疫抑制活性的病状，例如感染性疾病和肿瘤疾病。所述肽同样提供了研究scurf in和Treg淋巴细胞生物作用的工具。因此，本发明一方面涉及能与scurfin结合的肽。在具体和优选的实施方式中，所 述肽还能抑制scurfin的生物活性。另一方面，本发明涉及融合蛋白，其包含本发明所提供的肽和能将肽内化于细胞 内的载体肽。另一方面，本发明涉及包含本发明所提供的至少一种肽或一种融合蛋白的药物组 合物。另一方面，本发明涉及所述肽和融合蛋白在制备用于治疗需要瞬时调控或抑制 Treg淋巴细胞的免疫抑制活性的病状例如肿瘤疾病或感染性疾病的医药产品中的用途。另一方面，本发明涉及所述肽和融合蛋白在治疗需要瞬时调控或抑制Treg淋巴 细胞的免疫抑制活性的病状例如肿瘤疾病或感染性疾病中的用途。另一方面，本发明涉及编码所述肽或所述融合蛋白的核酸。另一方面，本发明涉及包含编码本发明所提供的肽或融合蛋白的核酸的基因构建 体。另一方面，本发明涉及包含所述核酸或所述基因构建体的载体。另一方面，本发明涉及包含所述核酸、所述基因构建体或所述载体的宿主细胞，例 如转化的宿主细胞。另一方面，本发明涉及产生本发明所提供的肽或融合蛋白的方法，其包括在允许 所述肽表达的条件下培养所述宿主细胞，如果需要，回收获得的肽或融合蛋白。另一方面，本发明涉及所述核酸和基因构建体在制备用于治疗需要瞬时调控或抑 制Treg淋巴细胞的免疫抑制活性的病状例如肿瘤疾病或感染性疾病的载体和细胞中的用 途。附图简要说明

图1是表示发生在肽P60 (SEQ ID NO 1)和scurfin之间的生物分子相互作用的 表面等离子体共振(SPR)分析图，其描述于实施例1(1. 3节)中。如所观察的，肽P60(SEQ ID NO :1)给出了证明其能特异性结合scurfin的阳性信号。所示结果代表了 3个独立实 验。R. U.相对单位(relative unit)。图2是表示发生在肽P60 (SEQ ID NO 1)和它的截短型即T (1-13) SEQ ID NO :2、 T (1-14) (SEQ ID NO 3)禾口 T (2-15) (SEQ ID N0:4)，禾口 scurfin (实施例 1，1. 4 节)之间的 生物分子相互作用的表面等离子体共振(SPR)分析图。如所观察的，在氨基末端位置清除 氨基酸，抑制了肽与scurfin结合的能力；然而，羧基末端的残基14或15的清除不会破坏 肽与scurfin结合的能力。图3是表示Karpas 299人细胞系(ACC_31，DSMZ，德国)的抑制活性的柱状图。用 这些细胞，进行混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte response，MLR)，其中测量了在存在 或缺乏Karpas 299人细胞系下培养来自2位供体的外周血单核细胞(PBMCs)之后所产生 的IFN-γ水平。当培养2位不同供体的PBMCs时，发生了称为混合淋巴细胞反应的免疫反 应，其涉及通过主要组织相容性复合物(MHC)和T细胞受体(TCR)之间的反应经异源基因 识别激活细胞增殖和产生细胞因子例如IFN- γ。如果添加Karpas 299细胞(具有Treg淋 巴细胞表型和活性)，则该反应受到抑制。图例PBMC1 (IX IO5个细胞/孔)，来自健康供体
6(1)的外周血淋巴细胞；PBMC2(1X105个细胞/孔)，来自不同于供体(1)的另一健康供体 ⑵的外周血淋巴细胞；KarpasKarpas 299细胞系(IX IO4个细胞/孔)。同一图显示了 肽P60(SEQID NO 1) (100 μ M)如何能够恢复T淋巴细胞产生IFN-γ (通过ELISA测定，在 培养上清液中测量，BD Biosciences)，从而抑制Karpas 299细胞的抑制作用。图4是表示在混合淋巴细胞反应(MLR)中肽P60(SEQ ID NO 1)对人Treg淋巴细 胞(使用Miltenyi Biotech试剂盒从健康供体的外周血中纯化的，Ref 130-091-301)作 用的效应的柱状图。将来源于两位血供体(每位供体IXlO5个细胞/孔)的PBMCs混合， 并在存在或缺乏Treg淋巴细胞(2X104个细胞/孔)(由他们之一所获得)和肽P60 (SEQ ID NO 1)(100μΜ)的情况下孵育。培养3天之后，通过常规氚标记的胸苷掺入法测量细胞 增殖。如所观察的，Treg淋巴细胞能抑制MLR，而肽P60 (SEQ ID NO 1)能降低人Treg淋巴 细胞对MLR的免疫抑制效应。图5是表示在效应细胞对珠结合抗-⑶3/⑶28抗体(Dynabeads ⑶3/⑶28，Ref 111-31，Dynal)刺激的反应中，肽P60 (SEQ ID NO 1)对天然人Treg淋巴细胞(从健康供 体的外周血中纯化的)作用的效应的柱状图。在存在或缺乏抗-CD3/CD28刺激物、Treg淋 巴细胞(2X104个细胞/孔)和肽P60(SEQ ID NO 1) (100 μ M)的情况下，培养从健康供体 获得的效应T淋巴细胞(1 X IO5个细胞/孔)。培养48小时之后，通过商业ELISA的方式 测量在培养上清液中存在的IFN-Y。如所观察的，肽Ρ60 (SEQ ID NO=D能抑制人Treg淋 巴细胞对抗-⑶3/⑶28激活的免疫抑制效应。图6是表示肽P60(SEQ ID NO :1)对天然鼠Treg淋巴细胞(使用Miltenyi Biotech试剂盒从小鼠脾细胞中纯化，Ref 130-091-041)在针对抗-⑶3抗体 (BD-Biosciences)刺激下由效应T细胞产生IFN-γ中作用的效应的柱状图。在存在或缺 乏抗-CD3抗体(0. 5μ g/ml)、Treg淋巴细胞(2 X IO4个细胞/孔)和肽P60 (SEQ ID NO 1) (ΙΟΟμΜ)的情况下，培养BALB/c小鼠脾细胞。如所观察的，肽P60 (SEQ ID NO 1)能抑制 Treg淋巴细胞对效应细胞响应抗-⑶3刺激产生IFN- γ (通过商业ELISA的方式测量)的 免疫抑制效应。图7是表示肽Ρ60 (SEQ ID NO 1)对天然鼠Treg淋巴细胞(从小鼠脾细胞中纯化 的)在效应细胞针对混合淋巴细胞反应(MLR)刺激的反应中作用的效应的柱状图(通过常 规氚标记的胸苷掺入法测量细胞增殖)。将从BALB/c小鼠中分离的效应淋巴细胞(IXlO5 个细胞/孔)与来自C57BL/6小鼠的纯化的树突细胞在存在或缺乏BALB/c Treg淋巴细胞 (2 X IO4个细胞/孔)和存在或缺乏肽P60 (SEQ ID NO 1) (100 μ Μ)的情况下进行共培养。 如所观察的，肽Ρ60 (SEQ ID NO 1)能抑制Treg淋巴细胞对效应细胞增殖的免疫抑制效应。图8是表示肽Ρ60 (SEQ ID NO 1)对天然鼠Treg淋巴细胞(从小鼠脾细胞中纯化 的)在效应细胞针对抗原刺激的反应中作用的效应的柱状图(测量为培养上清液中IFN-Y 的产生)。将从OTl转基因小鼠中分离的效应淋巴细胞(IX IO5个细胞/孔)(实施例 3(3. 2. 3节))与来自 C57BL/6 小鼠的树突细胞和肽SIINFEKL(SEQ ID NO 7) (10 μ g/ml)在 存在或缺乏BALB/cTreg淋巴细胞(2 X IO4个细胞/孔)和存在或缺乏肽P60 (SEQ ID NO 1) (100 μ M)的情况下进行共培养。如所观察的，肽Ρ60 (SEQ ID NO :1)能抑制Treg淋巴细 胞对这种肽抗原的特异性效应细胞产生IFN-Y的免疫抑制效应。图9是表示肽Ρ60 (SEQ ID NO 1)对scurf in抑制转录因子NF- κ B激活的效应的柱状图。在存在或缺乏质粒pcDNA、pcDNA-Foxp3和肽P60(SEQ ID NO 1) (100 μ Μ)的 情况下，以质粒pNF-kB-Luc(Clontech，Ref631904)转染293细胞，该质粒在可由转录因子 NF-κ B诱导的启动子下表达荧光素酶。如所观察的，细胞中scurfin的存在抑制荧光素酶 的表达，而肽P60 (SEQ ID NO 1)的存在恢复了这种表达。R. U.相对单位。图10表示给予肽P60 (SEQ ID NO 1)对增强接种肽AHl (SEQ ID NO 8)的抗肿瘤反 应的效应。以盐水(对照组η = 11)或与不完全弗式佐剂(IFA) (η = 22)乳化的肽AHl (SEQ ID NO 8)(如 Casares et al，2003. J Immunol 171 :5931_9 描述的)免疫小鼠 BALB/c 组。 在免疫之后的0、2、4、6、8和10天期间，用盐水治疗用肽AH1(SEQ ID NO 8)免疫的11只免 疫小鼠，而以溶解在盐水的50nm/小鼠的肽P60(SEQ ID NO 1)治疗11只剩余小鼠，并腹膜 内给药(i. P.)。并引入另一对照组(η = 11)的非免疫小鼠，这组小鼠仅用在磷酸缓冲盐水 (PBS)中的肽P60(SEQ ID NO 1)治疗，随后是与之前的组相同的治疗方案。图IOA显示了 在不同组的皮下接种5X IO5个肿瘤细胞(CT26)的BALB/c小鼠中平均肿瘤生长。不同组 表示了在缺乏治疗(对照组，白色三角形)，以疫苗抗原AHl单独治疗(黑色三角形)，以肽 P60 (SEQ ID NO 1)单独治疗(白色圆圈)或以疫苗抗原和肽P60 (SEQID NO 1)组合治疗 (黑色圆圈)中的平均肿瘤进展。图IOB表示不同实验组的存活曲线(Kaplan-Meier表示 法)。ρ <0. 001表明了对数秩检验(log-ranktest)方式的统计分析结果。发明的详细描述本发明的肽一方面，本发明涉及能与scurfin结合的肽，下文称为本发明的肽，其选自a)通式⑴的肽，通式⑴包含氨基酸序列Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe-Phe-X(I)其中X不存在或X存在且是X14或X14-X15，其中X14和X15是相互独立的，表示氨基酸；b) a)所定义的肽的变体；以及c) a)所定义的肽或b)所定义的变体的片段；以及其药物可接受盐。如本文所用的术语“肽”涉及α氨基酸通过肽键方式按确定顺序结合形成的聚合 体，包括其修饰体或衍生物，例如糖基化、磷酸化、乙酰化、酰胺化等。依据α碳原子的氨基方向，本发明的肽的氨基酸可属于L类或D类，优选L类。X14和X15所表示的氨基酸可以是天然氨基酸或修饰的或稀有氨基酸。天然氨基酸 包括脂族氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)、羟基化氨基酸(丝氨酸和 苏氨酸)、硫化氨基酸(半胱氨酸和甲硫氨酸)、二羧酸氨基酸和它们的酰胺(天冬氨酸、天 冬酰胺、谷氨酸和谷氨酰胺)、具有两个碱基的氨基酸(赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、芳族氨 基酸(苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)和环状氨基酸(脯氨酸)。修饰的或稀有氨基酸的示例 性非限制实例包括2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β -丙氨酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、 6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、2，4- 二氨基丁 酸、锁链素、2，2’ - 二氨基庚二酸、2，3_ 二氨基丙酸，N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、羟赖 氨酸、别羟赖氨酸、3-羟脯氨酸、4-羟脯氨酸、异锁链素、别异亮氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、6-N-甲基赖氨酸、N-甲基缬氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸等。本发明的肽的特征在于其能与scurfin结合，有利地能抑制scurfin的生物活性。 可通过任何允许测定两个分子间结合的任何适宜方式(例如通过亲和测定的方式)测定肽 与scurfin结合的能力，所述方法包括在允许所述肽与scurfin结合的条件下使scurfin 与待测定的肽接触，并评估肽与scurfin之间的结合。在具体实施方式
中，可采用表面等 离子体共振(SPR)技术(实施例1. 3)或使用放射性标记的scurfin或可选地放射性标记 待测定的肽的的类似技术，实施所述亲和测定。这种类型的亲和测定通常包括使例如固定 在平板孔中的scurfin与已知能与scurfin结合的肽接触，之后孵育适宜时间，分析肽与 scurfin的结合。通过洗涤的方式清除具有低scurfin亲和力的肽，而具有更高亲和力的肽 仍然保持与scurfin结合，并可通过破坏两个分子间的分子相互作用而被释放，这可通过 例如降低PH来进行。本发明的肽的有利特征在于，不仅能与scurfin结合而且能抑制scurfin的生物 活性，以及由此间接地瞬时或暂时调控或阻断Treg淋巴细胞的免疫抑制活性。尽管，不希 望受任何理论的限制，但认为肽抑制scurfin生物活性的能力是由于所述肽与scurfin直 接结合所致。可通过任何适宜的解释这种效应的方法体外分析肽抑制scurfin的生物活性 的能力，例如a)在存在抗-⑶3抗体、Treg淋巴细胞和氚标记胸苷下，和存在或缺乏待测定的肽 的情况下，通过基于测量效应T淋巴细胞培养物中的细胞增殖的测定；或b)在存在抗原[肽SIINFEKL(SEQ ID NO :7)]、存在或缺乏Treg淋巴细胞，以及存 在或缺乏待测定的肽的情况下，通过基于将来自OT-I转基因小鼠(小鼠的T淋巴细胞具有 卵白蛋白的肽SIINFEKL(SEQID NO 7)的特异性T细胞受体)的脾细胞与Treg淋巴细胞共 培养的测定；或者；可选地c)在存在或缺乏从一种品系的小鼠(例如BALB/c)获得的Treg淋巴细胞和存在 或缺乏待测定的肽的情况下，通过基于来自小鼠(例如BALB/c)的效应细胞与从另一小鼠 品系(例如C57BL/6)获得的树突细胞混合的混合淋巴细胞反应(MLR)的测定。同样，可使用人来源的Treg淋巴细胞进行类似实验。实施例3详细描述了旨在评 估待测定的肽(例如本发明的肽)体外抑制scurfin的生物活性的能力的不同测定。在具体实施方式
中，本发明的肽是通式(I)的肽，通式(I)包含氨基酸序列Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe-Phe-X其中X具有之前所述的与通式⑴相关的含义。在另一具体实施方式
中，本发明的肽是通式(Ia)的肽[通式⑴的肽，其中X是 X14-X15]且包含以下氨基酸序列或由其形成Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe-Phe-X14-X15(Ia)其中X14和X15是相互独立的，表示天然氨基酸(例如Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、 Thr、Cys、Met、Asp、Asn、Glu、Gln、Lys、Arg、His、Phe、Tyr、Trp 或 Pro)或修饰的或稀有氨基 酸(例如 Aad、bAad、bAla、Abu、4Abu、Acp、Ahe、Aib、bAib、Apm、Dbu、Des、Dpm> Dpr > EtGly、 Et Asn、Hy 1、aHy 1、3Hyp、4Hyp、I de、al 1 e、MeGl y、Me 11 e、MeLy s、MeVal、Nva、Nl e 或 Orn)。尽 管X14和X15可以是相同或不同的，在具体实施方式
中，X14和X15是不同的，例如X14是Ala而Xli^Met0在另一特定且优选的实施方式中，本发明的肽是包含以下氨基酸序列或由其形成 的肽Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe-Phe-Ala-Met(SEQ ID NO 1)SEQ ID NO 1所形成的肽有时在本发明中描述为肽P60。在另一具体实施方式
中，本发明的肽是通式(Ib)的肽[通式⑴的肽，其中X是 X14]且包含以下氨基酸序列或由其形成Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe-Phe-X(Ib)其中X 是 X14，X14 表示天然氨基酸，例如 Gly、Ala、Val、Leu、lie、Ser, Thr, Cys, Met、Asp、Asn、Glu、Gin、Lys, Arg、His、Phe, Tyr, Trp 或 Pro，或修饰的或稀有氨基酸(例 如 Aad> bAad、bAla、Abu、4Abu、Acp> Ahe> Aib> bAib、Apm、Dbu> Des、Dpm、Dpr > EtGly、EtAsn、 Hyl、aHyl、3Hyp、4Hyp、Ide、alle、MeGly、Melle、MeLys、MeVal、Nva、Nle 或 Orn)，优选 Ala。在另一具体实施方式
中，本发明的肽是包含以下氨基酸序列或由其形成的肽Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe-Phe-Ala(SEQ ID NO 2)在另一具体实施方式
中，本发明的肽是通式(Ic)的肽[通式(I)的肽，其中X不 存在]且包含以下氨基酸序列或由其形成Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe(Ic)在另一具体实施方式
中，本发明的肽是一下氨基酸序列所形成的肽Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe(SEQ ID NO 3)本发明人进行的测定表明了通式⑴的肽的氨基末端对肽与scurfin结合的能力 发挥了重要作用，因为氨基末端(Arg)氨基酸的清除显著降低了肽与scurfin结合的能力， 而羧基末端残基即“X”部分的14或15的清除不会影响肽结合scurfin的能力(实施例 1.4，图 2)。在另一具体实施方式
中，本发明的肽是a)节中所定义的通式⑴的肽的变体。如 本文所用的术语“变体”涉及与a)节中所定义的通式(I)的肽基本同源且功能等同的肽。如 本文所用的，当肽氨基酸序列的同一性程度为至少50%、有利地至少60%、优选至少70%、 更优选至少80 %、还更优选至少90 %、甚至更优选至少95 %时，肽与另一肽是“基本上同源 的”。同样，如本文所用的表述“功能等同”是指所讨论的肽(变体)保持与scurfin结合 且有利地以及在体内和/体外抑制scurfin生物活性的能力。通过之前所提及的任何适宜 的常规方法可测定肽与scurfin结合的能力，例如通过亲和测定，例如基于表面等离子体 共振(SPR)技术的亲和测定(实施例1. 3)。同样，通过之前所提及的任何适宜的常规方法， 可测定肽抑制scurfin的生物活性的能力，例如通过实施例3所述的任何测定。在具体实 施方式中，本发明的肽是变体，其具有a)节所示的氨基酸序列中一个或多个氨基酸的一个 或多个插入、缺失和/或修饰，且保持与scurfin结合的能力。在具体实施方式
中，针对之
10前所提及的氨基酸序列，所述变体包含一个或多个氨基酸的保守取代。在另一具体实施方式
中，本发明的肽是a)节所定义的通式(I)的肽或b)节所定 义的变体的片段。如本说明书所用的术语“片段”是指包含a)节所定义的通式(I)的肽或 b)节所定义的变体的至少5个连续氨基酸部分的肽，即包含于a)节所提到的通式(I)或 b)节所定义的变体的氨基酸序列内的至少5个连续氨基酸的序列，其保持与scurfin结合 的能力。在具体实施方式
中，本发明的肽是a)节所定义的通式(I)的肽或b)节所定义的 变体的片段，其包含a)节所提到的通式(I)或b)节所定义的变体的氨基酸序列中的5个 或更多(即6、7、8、9、10、11、12、13、14或15)个连续氨基酸，其中从氨基末端或从羧基末端 或两端清除了一个或多个氨基酸，并保持与scurfin结合的能力且有利地抑制scurfin的 生物活性的能力。通过之前所提及的任何适宜的常规方法可测定肽片段与scurfin结合的 能力，例如通过亲和测定，例如基于sra技术的亲和测定(实施例1. 3)。同样，通过之前所 提及的任何适宜的常规方法可测定肽片段抑制scurfin的生物活性的能力，例如通过实施 例3所述的任何测定。同样，本发明的肽的药物可接受盐也在本发明的范围内。如本文所用的术语“药物 可接受盐”包括常用于形成金属盐或酸加成盐的盐。盐的特性不重要，只要它是药物可接受 的。本发明的肽的药物可接受盐可由有机或无机酸或碱获得。通过本领域技术人员公知的 常规方法，可获得所述盐。在具体且优选的实施方式中，本发明的肽是能与scurfin结合并抑制其生物活性 的肽，其氨基酸序列包含SEQ ID NO :1、其变体或片段以及其药物可接受盐，或由SEQ ID NO :1、其变体或片段以及其药物可接受盐形成。如本说明书所附的实施例所示，所述肽能 与scurfin结合并抑制其生物活性，并间接地瞬时调控或阻断Treg淋巴细胞的免疫抑制活 性。本发明的融合蛋白本发明的肽可与另一肽融合，从而形成融合蛋白。因为本发明的肽与scurfin之 间的相互作用必定发生在细胞内(例如在细胞质和/或在细胞核中)，所以与本发明的肽融 合的肽有利地是能促进本发明的肽进入细胞内的肽。因此，另一方面，本发明涉及本发明的融合蛋白，其包含(i)本发明的肽，以及(ii)能将肽内化于细胞内的载体肽。本发明的肽的特征已经在之前提及。“能将肽内化于细胞内的载体肽”在本说明书中有时也称为“载体肽”，是能穿过细 胞膜和从外面穿透细胞的肽，即(本发明的融合蛋白)所融合的肽(例如本发明的肽)可被 赋予的特征，从而为将目的肽(例如本发明的肽)转运于靶细胞内提供可选方案。肽进入 细胞的这种机制称为“蛋白转导或送递”已知多种能将肽内化于细胞内的载体肽(Schwarze S. R. etal.，Science，1999Sep 3 ；285 (5433) 1569-72 ；Niesner U. et al.，Bioconjug. Chem. 2002Jul-Aug ； 13 (4) 729-36 ；Ford K. G. et al.，Gene Therapy，2001 ;8 1-4 ;and Gusarova G. A. et al. , J. Clin. Invest. 2007Jan ；117(1) :99_111)。事实上，任何能将肽内化于细胞内的载体肽都可用于实践本发明；尽管如此，在具 体实施方式中，所述载体肽是包含“PTD” ( “蛋白转导结构域”)区段的肽。包含蛋白转导结构域(PTDs)的蛋白的示例性非限制实例包括，人免疫缺陷病毒I(HIV-I)TAT(“反式翻译 蛋白”)蛋白、触角足果蝇(Drosophila antennapedia)同源异型转录因子(Antp)和单纯 疱疹病毒1 (HSV-I) VP22DNA-结合蛋白，尽管建议其他蛋白也具有这种将肽内化于细胞内 的特性，例如流感病毒血凝素、乳铁蛋白、成纤维细胞生长因子-1、成纤维细胞生长因子_2 和 Hoxa-5、Hoxb-4 和 Hoxc-8 蛋白(Ford K. G. et al.，Gene Therapy, 2001 ；8 :1_4)。在具体实施方式
中，所述载体肽是来源于HIV-ITAT蛋白的肽，其包含负责肽转 导的序列，它的碱性结构域(PTD)包含所述HIV-ITAT蛋白的49-57部分，特别是氨基酸 序列RKKRRQRRR(SEQ ID NO 9)，或所述HIV-ITAT蛋白的47-57部分，例如氨基酸序列是 YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO: 10)的肽或氨基酸序列是 CGISYGRKKRRQRRR(SEQ IDNO 11)的肽。在另一具体实施方式
中，所述载体肽是来源于触角足果蝇Antp蛋白的肽，其包含 触角足同源结构域(AntpHD)，所述触角足同源结构域包含负责肽转导(PTD)[所述Antp蛋 白的43-58部分)的结构域，其包含氨基酸序列RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO 12)或其功 能片段。在另一具体实施方式
中，所述载体肽是来源于HSV-1VP22蛋白的肽，其包含负责 肽转导(PTD)的结构域。在另一具体实施方式
中，所述载体肽是来源于ARF(“可选读框”)肿瘤抑制蛋白的 肽，其包含负责肽穿透细胞的能力的氨基酸序列，例如包含所述ARF蛋白的26-44部分，特 别是氨基酸序列KFVRSRRPRTASCALAFVN(SEQ ID NO 13)的片段，或其含有所述ARF蛋白的 37-44部分，特别是氨基酸序列SCALAFVN(SEQ ID NO 14)的片段。本发明的肽可与能将本发明的肽内化于细胞内的载体肽的任何(氨基或羧基)末 端结合。因此，在具体实施方式
中，本发明的肽的羧基末端与所述载体肽的氨基末端结合， 而在另一具体实施方式
中，本发明的肽的氨基末端与所述载体肽的羧基末端结合。本发明的肽可以与或可以不与能将本发明的肽内化于细胞内的所述载体肽直接 结合。因此，在具体实施方式
中，本发明的肽[肽(i)]与所述载体肽[肽(ii)]直接结合， 而在另一具体实施方式
中，本发明的肽[肽(i)]与所述载体肽[肽(ii)]通过所述肽(i) 和(ii)之间的连接体或间隔肽结合。因此，如果需要，本发明的融合蛋白还可以含有位于 本发明的所述肽[肽(i)]和所述载体肽[肽(ii)]之间的间隔肽。所述间隔肽有利地是 具有结构灵活性的肽，例如可产生非结构性域的肽。事实上，具有结构灵活性的任何肽都可 用作间隔肽；尽管如此，所述间隔肽的示例性非限制实例包括，含有氨基酸部分例如Gly和 /或Ser重复，或任何其他适宜的氨基酸部分重复的肽。如果需要，本发明的融合蛋白可任选地包括用于分离或纯化本发明融合蛋白的 氨基酸序列。所述序列将位于本发明融合蛋白的区域内，其对本发明的肽的功能没有负 面影响。事实上，可用于分离或纯化融合蛋白的任何氨基酸序列(通常称为标签肽(tag peptide))都可存在于本发明所述的融合蛋白中。作为非限制示例，用于分离或纯化融合 蛋白的所述氨基酸序列可以是，例如精氨酸标签(Arg-标签)、组氨酸标签(His-标签)、 FLAG-标签、Strep-标签、可由抗体识别的表位例如c_myc-标签、SBP-标签、S-标签、钙调 蛋白结合肽、纤维素结合结构域、壳多糖结合结构域、谷胱甘肽S-转移酶-标签、麦芽糖结 合蛋白、恥8八、扑1八、08匕八、八￥士-标签等(Terpe K.，Appl. Microbiol. Biotechnol. (2003)、 60 523-525)、β -半乳糖苷酶、VSV-糖蛋白(YTDIEMNRLGK) (SEQ ID NO 15)或氨基酸序列，例如 Ala His Gly His Arg Pro (SEQ ID NO : 16) (2、4、和 8 个拷贝)、Pro lie His Asp His Asp His Pro His Leu Val lie His Ser (SEQ ID NO 17)等。本发明的肽和融合蛋白的应用本发明的肽能与SCUrfin结合，而且有利地能抑制SCUrfin的生物活性，因此其间 接地能瞬时调控或阻断Treg淋巴细胞的免疫抑制活性。因此，本发明的肽的重要优势在于 以下事实，即通过使用它，可瞬时或暂时调控或阻断Treg淋巴细胞的免疫抑制活性。与其 他已知的基于使用针对表面标记的抗体来抑制Treg淋巴细胞活性的方法相反，使用本发 明的肽，即能与scurfin结合且特别是能通过与scurf in直接结合抑制所述蛋白的生物活 性的肽，不会清除Treg淋巴细胞，这可允许更好地暂时控制它们的活性。尽管不希望受任 何理论的限制，但认为由于本发明的肽小，其可被导入细胞以阻断scurfin的作用。由于Treg淋巴细胞在许多生物过程中的作用和scurfin是其免疫抑制活性必须 的这一事实，使用本发明的肽为有效发展有可能用于治疗肿瘤疾病和感染性疾病的新型药 物开启了一扇窗。抑制Scurfin的生物活性允许本发明的肽瞬时或暂时调控或阻断Treg 淋巴细胞的免疫抑制活性，因此可发展用于治疗肿瘤疾病或感染性疾病的疗法，其中所述 Treg淋巴细胞的作用受到选择性和瞬时的控制，以便降低清除它们所引起的诱导自身免疫 的风险。因此，本发明的肽以及本发明的融合蛋白可用于治疗适宜或必须瞬时调控或阻断 Treg淋巴细胞的免疫抑制活性的病状，如在肿瘤疾病或感染性疾病情况中所发生的，其中 Treg淋巴细胞具有免疫抑制作用，从而防止有效免疫反应的正确激活。已知在人类中，在黑 素瘤(Wang，H. Y.，JImmunol，2005. 174 :2661_2670 ；Viguier, M.，F. J Immunol, 2004. 173 1444-1453)、肺癌(ffoo,E. Y.，Cancer Res, 2001 61 :4766_4772)、卵巢癌(ffoo,E. Y. , Cancer Res, 2001. 61 :4766_4772，Curiel，Τ. J.，Nat Med，2004. 10 :942_949)、胰腺癌和乳腺癌 (Liyanage，U. K.，J Immunol, 2002. 169:2756-2761)以及肝癌(Ormandy，L. A. Cancer Res, 2005. 65 2457-2464 ；Kobayashi, N. , Clin Cancer Res, 2007. 13 :902_911)的情况下，Treg 淋巴细胞能抑制抗肿瘤T细胞的有益作用。在感染性疾病中，Treg淋巴细胞所发挥的控 制可限制效应子T反应的量值并造成感染控制的失败。因此，一些病毒例如乙型肝炎病毒 (Xu, D. J Immunol, 2006. 177 :739_747)、丙型肝炎病毒(Boettler, T.，J Virol, 2005. 79 7860-7867 ；Cabrera, R. Hepatology,2004. 40 1062-1071 ；Rushbrook, J Virol,2005. 79 7852-7859 ；Sugimoto, K. Hepatology, 2003. 38 1437-1448)和人类免疫缺陷病毒(HIV) (Aandahl，Ε·Μ· J Virol, 2004. 78 :2454_2459 ；Kinter,A. L. J Exp Med,2004. 200 :331_343 ； Oswald-Richter, K. PLoS Biol2004. 2 :E198 ；Weiss, L. Blood, 2004. 104 :3249_3256)可使 用Treg淋巴细胞阻断抗病毒免疫反应从而允许持久的慢性感染的形成，已有描述。本发明的肽和融合蛋白有可能治疗的病状的示例性实例包括，肿瘤疾病和感染性 疾病。如本文所用的，术语“肿瘤疾病”包括肿瘤(即造成体积增大的组织病症，尤其是由 于在形成它的细胞数量上的增加而导致的肿块，而无论它们是良性的还是恶性的)和癌症 (以能入侵邻近组织并扩散至远距离器官中的异常细胞的不受控制增殖为特征的疾病)。 同样，术语“感染性疾病”通常涉及由感染性媒介例如病毒、细菌、真菌、寄生虫等引起的疾 病。在这种类型的感染性或肿瘤(癌性)过程中，Treg淋巴细胞发挥负面效应，因为它们 能抑制有益于痊愈的针对感染或肿瘤过程的免疫反应的激活。
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本发明的肽和融合蛋白可治疗的病毒感染的示例性非限制实例事实上包括，病 毒来源的任何感染，例如由以下病毒引起的感染乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒，HIV，人乳 头瘤病毒，疱疹病毒，例如人疱疹病毒，如1型单纯疱疹病毒(HSV-I)、2型单纯疱疹病毒 (HSV-2)，水痘带状疱疹病毒(VZV)，巨细胞病毒(CMV)，人疱疹病毒6 (HHV-6)，人疱疹病毒 7 (HHV-7) ,Epstein-Barr 病毒(EBV)，卡波氏疱疹病毒(Kaposi's herpesvirus,HHV-8)等。本发明的肽和融合蛋白可治疗的细菌感染的示例性非限制实例包括但不限于， 由麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)引起的感染、由结合分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的感染、由鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)引起的感染、由幽门螺 杆菌(Helicobacter pylori)引起的胃部感染等。本发明的肽和融合蛋白可治疗的真菌感染的示例性非限制实例包括但不限于由 白色念珠菌(Candida albicans)引起的感染、由红色毛藓菌(Trichophyton rubrum)引起 的感染、由曲霉(Aspergillus sp.)引起的感染等。本发明的肽和融合蛋白可治疗的寄生虫感染的示例性非限制实例包括但不限于 利什曼病例如内脏利什曼病，感染例如由疟原虫(Plasmodium)寄生虫引起的疟疾，弓形虫病等。本发明的肽和融合蛋白可治疗的肿瘤疾病的示例性非限制实例包括但不限于，乳 头状瘤、腺瘤、脂瘤、骨瘤、肌瘤、血管瘤、痣、成熟畸胎瘤、癌、肉瘤或未成熟畸胎瘤，例如黑 素瘤、骨髓瘤、白血病、霍奇金淋巴瘤、基底细胞瘤、脊柱细胞瘤(spinalioma)、乳腺癌、卵巢 癌、子宫癌、肺癌、支气管癌、前列腺癌、结肠癌、胰腺癌、肾癌、食道癌、肝癌、头颈癌等。通常，本发明的肽可治疗Treg淋巴细胞发挥免疫抑制作用因而影响个体所患有 的病状痊愈的任何感染或肿瘤过程。同样，本发明的肽和融合蛋白可用于增强抗病毒或抗肿瘤疫苗，因为接种后给予 它们，在给予它们期间随后由本发明的肽阻断Treg淋巴细胞，会增强对疫苗成分的反应。此外似乎Treg淋巴细胞在抗原的口服耐性中发挥关键作用(Huibregtse， I. L. Gastroenterology, 2007. 133 =517-528)，因此本发明的肽可用于口服给予抗原的耐性 受到破坏的情况。药物组合物为了将本发明的肽或融合蛋白给予个体，可将本发明的肽或融合蛋白配制在适宜 药物组合物中。如本文所用的，术语“个体”是指哺乳动物物种的任何成员，包括但不限于 家养动物、灵长类和人；个体优选是任何年龄或种族的男性或女性。因此，另一方面，本发明涉及药物组合物，下文称为本发明的药物组合物，其包含 治疗有效量的本发明的肽或本发明的融合蛋白，以及至少一种药物可接受赋形剂。所述药 物组合物可被给予和/或应用到人体或动物体，优选人体。本发明的药物组合物可含有一种或多种本发明的肽或融合蛋白，以及任选地一种 或多种不同于本发明的肽和融合蛋白的调控或抑制Treg淋巴细胞的免疫抑制活性的可选 化合物。事实上，如果需要，本发明的药物组合物中可存在不同于本发明的肽和融合蛋白、 独立于其作用机制(例如通过抑制scurfin或通过其他机制)、抑制或调控Treg淋巴细胞 的免疫抑制活性的任何化合物。可与本发明的肽和融合蛋白一起使用、不同于本发明的肽 和融合蛋白、抑制或调控Treg淋巴细胞的免疫抑制活性的可选化合物的示例性非限制实例，包括但不限于抗CD25、抗CTLA4、抗GITR抗体、抑制细胞因子TGF_beta、IL-10或IL-9 的化合物、化学疗法化合物例如环磷酰胺氟达拉宾(cyclophosphamide fludarabine)，或 趋化因子CCL17或CCL22的抑制剂等。使用本发明的肽替代抗体具有许多优势，因为所述肽是小分子，它们具有更高的 弥散能力和更短的半衰期。本发明的肽具有高scurfin亲和力但比抗体降解的更快，通过 适宜剂量的本发明的肽可以控制可能的不良副作用。此外，大部分抗Treg淋巴细胞的抗 体会引起所述细胞的清除，因此，它们的效应更为长效，由此诱导自身免疫疾病的风险会增 加(St印hens，L. A.，Proc Natl Acad Sci USA, 2005. 102:17418-17423)。使用本发明的融 合蛋白也具有许多优势，因为它们可促进本发明的肽进入细胞，由此本发明的肽对scurfin 活性的抑制性活性会增加，因为本发明的肽和scurfin之间的相互作用必定是在细胞内进 行的(例如在细胞质或可能在细胞核中)。为了所示病状的治疗，例如感染性或肿瘤疾病，可通过使本发明的肽与人或动物 体内的其作用位点接触的方式给予本发明的肽和融合蛋白。存在于本发明所提供的药物组 合物中的本发明的肽、其衍生物或药物可接受盐或本发明的融合蛋白的量，可在宽宽泛范 围内变化。用于治疗所述病状的本发明的肽、融合蛋白和/或药物组合物的剂量取决于许多 因素，包括患者的年龄、状态，疾病或病状的严重性，给药的途径和频率和被给予的本发明 的肽或融合蛋白。含有本发明的肽或融合蛋白的药物组合物可以呈现为任何剂型，例如固体或 液体，可通过任何适宜途径给予，例如口服、肠胃外、直肠或局部途径，为此，它们包括 配制所需剂型必需的药物可接受赋形剂，所述剂型为例如软膏(脂凝胶(Iipogel)、 水凝胶等)、滴眼剂、气雾喷射剂、可注射溶液、渗透泵等。可在例如“Tratado de Farmacia Galenica", C.Faulii Trillo,1993, Luzan 5, S. A. Ediciones, Madrid ； and in Remington' sPharmaceutical Sciences(A.R.Gennaro, Ed·),20th edition, Williams&ffilkins PA,USA(2000)中得到医药产品的不同药物剂型以及获得它们所需的赋 形剂的综述。本发明的肽和融合蛋白在制备本发明药物组合物中的用途构成了本发明的另一 方面。因此，另一方面，本发明涉及本发明的肽或本发明的融合蛋白在制备用于治疗适宜或 必需瞬时或暂时调控或阻断Treg淋巴细胞的免疫抑制活性的病状的医药产品中的用途， 例如感染性疾病(例如病毒感染、细菌感染、真菌感染、寄生虫感染等)和肿瘤疾病例如癌 症和肿瘤。同样，另一方面，本发明涉及本发明的肽或本发明的融合蛋白在治疗适宜或必需 瞬时或暂时调控或阻断Treg淋巴细胞的免疫抑制活性的病状中的用途，例如感染性疾病 (例如病毒感染、细菌感染、真菌感染、寄生虫感染等)和肿瘤疾病例如癌症和肿瘤。获得本发明的肽可通过常规合成方法例如通过固体相合成技术的方式获得本发明的肽，并通过 常规方法例如通过高效液相色谱法(HPLC)的方式纯化。此外，如果需要，可通过常规技 术对其进行分析，例如通过测序和质谱法，氨基酸分析，核磁共振等方式。作为非限制 性示例，可通过使用 Atherton' sFmoc 变体(Atherton, Ε. , Logan, J. C. and Sheppard,R. C. 1989.Peptidesynthesis II.Procedures for sol id phase synthesis using N-fluorenylmethoxycarbonyl amino acids on polyamide supports.Synthesis of substanceP and of acyl carrier protein 65-74decapeptide. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 538)遵循常规程序(Merrifield RB. J Am Chem Soc 1963 ；85 :2149_2154)，通过 肽合成获得本发明的肽。可通过例如反向HPLC和/或质谱法的方式测定所获得的肽的纯 度。可通过本发明的肽与能将肽内化于细胞内的载体肽的偶联反应获得本发明的融 合蛋白，其可通过常规合成方法获得，例如之前所提及的(例如固相化学合成)，或通过重 组技术。可选地，可通过重组DNA技术获得本发明的肽和本发明的融合蛋白。因此，另一方 面，本发明提供了编码本发明的肽或融合蛋白的DNA序列。所述DNA序列可容易地从本发 明的肽或融合蛋白的氨基酸序列推导出来。所述DNA序列可包含在DNA构建体中。因此，另一方面，本发明提供了包含编码本 发明的肽或融合蛋白的DNA序列的DNA构建体。所述DNA构建体含有可操作地结合的调控 编码本发明的肽或融合蛋白的DNA序列表达的序列。控制序列是控制和调控本发明的肽或 融合蛋白的转录以及如果适当调节翻译的序列，其包括启动子、终止子序列等，其在包含所 述DNA序列或构建体的转化的宿主细胞中是有功能的。在具体实施方式
中，所述表达控制 序列在细菌中是有功能的。所述DNA构建体还有利地包含编码基序或表型的标记或基因， 所述基序或表型允许选择带有所述DNA构建体的转化宿主细胞。本发明提供的DNA构建体 可通过使用本领域众所周知的技术(Sambrook et al. ,"Molecular cloning,aLaboratory Manual (分子克隆实验室手册)”，2nd ed. ,Cold Spring HarborLaboratory Press,N. Y.， 1989Vol 1-3)获得。可将本发明所提供的DNA序列或DNA构建体插入适宜的载体中。因此，另一方面， 本发明涉及含有所述DNA序列或构建体的载体，例如表达载体。载体的选择取决于其随后 被导入的宿主细胞。通过实例的方式，导入所述DNA序列的载体可以是质粒或载体，当其被 导入宿主细胞时，其会或不会整合到所述细胞的基因组中。所述载体可通过本领域技术人 员已知的常规方法获得(上文提及的Sambrook et al.，1989)。另一方面，本发明涉及含有本发明所提供的DNA序列或DNA构建体或之前提及的 载体的宿主细胞，例如转化的宿主细胞。所述细胞可以是原核细胞或真核细胞。同样，另一方面，本发明涉及产生本发明的肽或本发明的融合蛋白的方法，其包括 在允许本发明所述肽或融合蛋白产生的条件下，培养包含本发明所提供的序列、DNA构建体 或载体的宿主细胞，以及如果需要，回收本发明的所述肽或融合蛋白。优化培养所述宿主细 胞的条件取决于所用的宿主细胞。如果需要，产生本发明的肽或融合蛋白的方法还包括分 离和纯化所述肽或融合蛋白。此外，本发明提供的所述DNA序列和DNA构建体可用于制备用于治疗适宜或必需 瞬时或暂时调控或阻断Treg淋巴细胞的免疫抑制活性的病状的载体和细胞。因此，另一 方面，本发明涉及所述DNA序列和DNA构建体在制备用于治疗适宜或必需瞬时调控或阻断 Treg淋巴细胞的免疫抑制活性的病状的载体和细胞中的用途，例如病毒、细菌、真菌、寄生 虫感染等，和肿瘤疾病。根据本发明的这个方面，可使所述DNA序列或构建体与基因转移载体例如病毒或非病毒载体接触。实现本发明的这个实施方式的适宜病毒载体包括但不限于 腺病毒载体、腺相关载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、α病毒载体、疱疹病毒载体、冠状 病毒衍生的载体等。实现本发明的这个实施方式的适宜非病毒载体包括但不限于裸DNAJg 质体、聚胺、树突状聚合物、阳离子聚乙二醇、脂质体-聚阳离子复合物、蛋白质、受体介导 基因转移体系等。本发明融合蛋白的初始鉴定噬菌体文库相关技术被用于初始鉴定能与scurfin结合的肽。该技术允许鉴定 具有与特定蛋白(例如scurfin)高亲和力结合的肽，之后通过体外测定的方式对它们抑 制所讨论蛋白的生物活性的能力进行定量。在这种情况中，所述蛋白是scurfin，抑制其生 物活性可允许间接调控或阻断Treg淋巴细胞的免疫抑制活性。与scurfin结合、抑制其 生物活性的肽的序列可经几轮生物淘筛(bioparming)通常3轮之后从相应DNA序列推导 出来。噬菌体文库鉴别特定产物抑制剂的用途，由例如Chirinos-Rojas C. L. et al. , in Immunology, 1999, Jan. 96(1) :109_113 ；McConnell S.J.，et al.，in Genel994, Dec. 30, 151(1-2) :115-118 ；或由 Smith G. P.，Science, 1985，Jun. 14,228(4705) :1315_1317 做了 描述。因此，另一方面，本发明涉及鉴定能与scurfin结合的肽的方法，其包括(i)使用包含多个丝状噬菌体的噬菌体文库，每个所述噬菌体的基因组含有编码 不同肽、与噬菌体包被蛋白基因相连的核苷酸序列，由此每个噬菌体含有与噬菌体包被蛋 白基因融合的不同肽。(ii)通过亲和测定，选择含有以更高亲和力与scurfin结合的肽的噬菌体；以及(iii)由插入步骤(ii)所选的噬菌体中并编码所述与scurfin结合的肽的相应 DNA序列，测定与scurfin结合的肽的序列在具体实施方式
中，为获得长度为15个氨基酸、可以高亲和力结合scurfin并可 能对其生物活性具有抑制活性的肽，使用由多个丝状细菌噬菌体(M13)形成的噬菌体文 库，其中每个都含有15个氨基酸的、与噬菌体包被蛋白基因融合的不同肽，在这种情况中， 与PlII包被蛋白的N末端结合。因而噬菌体在其表面上展示出5个分子的表面蛋白中每 个分子的15个氨基酸的肽，而其内部含有编码所述肽的DNA。在噬菌体文库中，编码肽的序 列来自带有20个天然氨基酸的15个位置中每个位置的简并序列，其允许在不同噬菌体中 展示15个氨基酸的1. IX IO12个可能的序列。在细菌噬菌体中肽序列和编码其的DNA之间 1 1的物理比例允许从大量变体中选择与scurfin特异性结合的那些序列。通过亲和测 定，执行这个方法。在具体实施方式
中，所述亲和测定由称为生物淘筛的体外选择方案组成。简而言 之，所述技术由在包被scurfin的平板上孵育一组噬菌体组成，出于实用目的，所述一组噬 菌体代表了 15个氨基酸(在这种情况)的肽的所有变体，正确地展示scurfin与由噬菌体 所携带的肽的相互作用。孵育之后，通过洗涤的方式清除未结合的噬菌体，之后通过降低PH 破坏scurfin和噬菌体所示的肽之间的分子相互作用的方式洗脱特异性结合的噬菌体。然 后通过感染细菌株的方式扩增洗脱的噬菌体。将该过程总共重复3轮，以便提高以高亲和 力特异性结合scurfin的噬菌体含量。逐渐降低每轮中用于封闭平板的scurfin的浓度， 例如从2. 5 μ g/mL至0. 02 μ g/mL和最终0. 002 μ g/mL。因而每轮所选的噬菌体具有更高程度的scurfin亲和力。在方法结束时，用引物对根据scurfin亲和力所选的噬菌体进行测 序。这允许获得在噬菌体中所展示的肽的序列。进行这种筛选之后，通过生物分子相互作 用表面等离子体共振(SPR)技术，实施证实所述肽与scurfin之间的相互作用的能力的测 定，如图1所示，其表明通过这种技术鉴定肽P60 (SEQ ID NO 1)如何与scurf in特异性结 合的。以下实施例解释了本发明，但不应理解为限制本发明的范围。实施例1 选择能与scurfin结合的肽通过基于由噬菌体文库发展而来的体外选择技术，实施选择能与scurfin结合并 可能对其生物活性具有抑制活性的肽。1. Iscurfin 的产生为了产生scurfin，用质粒pDEST15-F0XP3即与谷胱甘肽_S_转移酶(GST)结合 的scurfin表达载体作为融合蛋白，该质粒由Ignacio Casal博士(Centro Nacional de Investigaciones Oncologicas, CNIO, Madrid, Espana )友情提供。将所述质粒克隆到大 肠杆菌(Escherichia coli)BL21感受态细菌中以表达和之后纯化蛋白(scurfin)。在0. 5 升LB培养基(Sigma，St Louis)的培养物中，进行所述蛋白的表达。在弗压碎器(French press, ThermoElectron Corporation)中裂解细菌团块，以便scurf in保留在上清液中。通 过使用GSTrap亲和柱(Ref 17513001, Amersham, Pharmacia)和FPLC (快速蛋白液相色谱) 层析仪平台(Akta FPLC, Amersham Biosciences)的亲和层析，进行scurf in纯化。使用抗 Foxp3抗体(abl0564，Abeam)，对混合级份进行Western印迹，以证明蛋白的存在。一旦分 离并纯化scurfin，即可开始噬菌体文库的结合/洗脱轮回。1. 2通过噬菌体文库和生物淘筛技术选择肽已用噬菌体文库相关的技术鉴定能与scurfin结合的肽。该技术允许鉴别具有与 特定蛋白(在这种情况中是scurfin)高亲和力结合的肽，之后通过体外测定定量不同肽 抑制所述蛋白的生物活性的能力。与scurfin结合的肽的序列可在几轮生物淘筛(通常3 轮)后由相应DNA序列推导出来。用于进行本实施例的噬菌体文库含有2X IO8个不同克隆，并由GeorgeP. Smith实 验室(Division of Biological Sciences Tucker Hall,University ofMissouri,USA)提 供。进行选择(生物淘筛)之前，扩增和纯化所述噬菌体文库中存在的噬菌体。为此，使用 E.coli K9IKan(supplied by George P. Smith,Division of Biological Sciences Tucker Hall,University of Missouri)作为宿主菌株，扩增10 μ 1所述噬菌体文库，之后通过2次 聚乙二醇(PEG)/NaCl沉淀和CsCl梯度离心进行纯化。由分光光度计算的噬菌体悬浮液的 滴度是3. 82X IO14个病毒体/ml，感染颗粒的数量是1. 3X 1013TU/ml。选择测定开始之前， 对所述噬菌体悬浮液的级份进行测序，以证明扩增不影响克隆的多样性。选择能与scurfin结合力并有可能作为其生物活性抑制剂的肽的方法包括，使 scurfin与噬菌体文库所展示的肽接触。为此，以scurfin包被96孔板的孔(将碳酸缓冲液 中的scurfin添加至所述孔中并4°C温育16小时)，添加10 μ 1噬菌体文库浓度，为3Χ IO4 个病毒/ml，并在室温(20-22°C )下保持孵育1_2小时。然后通过用PBS/Tween (磷酸缓冲 盐水/山梨醇脂肪酸酯的聚氧烯基衍生物)洗涤，清除未结合的噬菌体，以便只有scurfin 的特异性噬菌体保留结合在板上。通过降低PH(洗脱缓冲液)破坏scurfin与噬菌体所展
18示的肽之间的分子相互作用，洗脱特异性结合scurfin的噬菌体。通过感染细菌株(E. coli K91Kan)的方式，扩增洗脱的噬菌体，该过程总共重复3次以上的结合/洗脱轮回，每次具有 更少量的scurfin粘附在孔上(在每轮中逐渐减低，从2. 5 μ g/ml至0. 02 μ g/ml，最终至 0. 002 μ g/ml)，以便在每轮中选择具有更高scurfin结合亲和力的噬菌体。因而，在最后轮 中，单个噬菌体所感染的细菌菌落，在噬菌体基因组的简并区域具有编码单个肽的单个序 列(在存在四环素的情况下进行细菌克隆的选择，由噬菌体基因组中存在的所述抗体的抗 性基因赋予对四环素的抗性，以便通过这种方式，仅有感染噬菌体的菌落生长且每个菌落 含有单个噬菌体的基因组，在噬菌体表面所展示的单个肽的序列与其相对应)。这个区域的 测序允许知道它的DNA序列以及由的知道能与scurfin结合并可能是scurfin活性抑制剂 的肽的序列。来自噬菌体所感染的细菌克隆，来源于最后生物淘筛选择轮回，提取其DNA，并使 用特异性引物(SEQ ID NO :5)对基因组的部分，包括对应于噬菌体pill蛋白中所展示的肽 的区域在内，进行测序，所述引物与该区域紧密杂交。由此，获得47个肽。为限制待测定的肽的数量，基于噬菌体的抗M13单克隆抗体(HRP/抗M13单克隆 偶联物(Ref 27942101，Amersham Pharmacia Biotech))进行商业 ELISA，以实现仅选择 具有更高scurfin亲和力的噬菌体。简而言7之，使用包被有scurfin的Maxisorp平板 (Nunc, Ref =442404)进行ELISA。将所选噬菌体分散在ELISA平板的孔中，连续洗涤之后， 用抗M13单克隆抗体将平板显影。光密度高于其各自阴性对照(无scurfin的孔)的孔含 有scurfin的最特异性肽。因而，从47个初始噬菌体中选择25个。在发明人实验室中使 用Fmoc技术化学合成所选的25个肽，用于随后的测定。进行几个测量这些肽抑制Treg细 胞免疫的能力的体外测定之后，选择鉴定为P60(SEQ ID NO 1)的肽，因为在这些测定中它 的抑制活性最高(实施例2)。1. 3通过表面等离子体共振(SPR)测定肽P60(SEQ ID NO 1)与scurfin结合的 能力通过生物分子相互作用表面等离子体共振(SPR)，使用BiosensorBIAcore X (BIAcore，AB，Uppsala，Sweden)，证明肽 P60 (SEQ ID NO 1)能与 scurfin 结合。将在 E. coli中产生的并使用GSTrap柱(Amersham，Pharmacia)通过亲和力纯化的scurfin，共 价固定在 CM5 芯片(Sensor ChipCM Ref 116Br-1000-14, BIAcore, General Electrics)的 流动池 2(FC2)的表面上，如 De Crescenzo et al. (JBC 2001，Vol 276 ；29632-29643)所 述。用在其表面上未固定scurfin的流动池I(FCl)作为参照回流池。将在pH 7. 4的含有 150mM NaCl的IOmM Hepes缓冲液中的每种肽(10 μ M)溶液以30 μ 1/分钟的流速注入三 次。通过从FC2所获的反应中减去FCl中反应，加工结合曲线。在肽P60(SEQ ID NO 1)与 相同大小(长度)的无关对照肽特别是下述肽之间比较平衡下的反应，即对应于人CD81受 体的氨基酸123-137、氨基酸序列如SEQ ID NO :6所示的肽。每个反应乘以质量校正因子 丽( 60)/丽( )，其中丽( 60)是肽P60(SEQ ID NO 1)的分子量，而MW(P)是对照肽的分子 量。如图1所观察的，肽P60(SEQ ID NO :1)给出了证明其能与scurfin蛋白特异性结合的 阳性信号。1. 4通过从氨基或羧基末端缺失氨基酸产生肽P60 (SEQ ID NO 1)的截短型，并评 估其与scurfin结合的能力
为评估位于肽P60 (SEQ ID NO 1)氨基末端和羧基末端的氨基酸的重要性，如上所 述，化学合成所述肽P60 (SEQ ID NO 1)的截短型，根据之前1. 3节所述的方案通过SPR的 方式，测定所述截短型与scurfin结合的能力。化学合成的截短型是肽或P60的截短型，其被鉴定为T (1-13) (SEQ ID NO 2) [P60 的 1-13 位氨基酸]，T (1-14) (SEQ ID NO :3) [P60 的 1-14 位氨基酸]，以及T (2-15) (SEQ ID NO 4) [P60 的 2-15 位氨基酸]。同样，在之前所述条件下，通过SPR，测定所述肽(SEQ ID NO 2, SEQID NO :3和SEQ ID NO 4)与scurf in结合的能力。所获结果表明，清除氨基末端位置上的氨基酸抑制肽与 scurfin结合的能力。但是，从羧基末端清除残基14或15不破坏肽与scurfin结合的能力 (图 2)。实施例2 肽P60 (SEQ ID NO 1)对Karpas 299人细胞系的免疫抑制活性的效应证明和证实它的特征谱之后，使用Karpas 299人细胞系(ACC_31，DSMZ，德国)进 行体外测定，其来源于具有调控T细胞[Treg淋巴细胞]特征谱的人淋巴瘤(Wolke et al Int J Mol Med. 2006Feb ； 17 (2) :275_8)，因而防止分离 CD4+CD25+细胞的需要。为评估肽P60(SEQ ID NO 1)对Karpas 299细胞系的免疫抑制活性的效应，在存 在或缺乏Karpas 299人细胞系的情况下，使用来自2位供体的外周血单核细胞(PBMCs)进 行“混合淋巴细胞反应”(MLR)测定。该测定(MLR)是基于共培养的不同来源的具有不同 组织相容性的淋巴细胞，其会彼此识别为外来的。这个反应使得淋巴细胞增殖，分泌细胞因 子。对于这个测定，将每个供体的100000个细胞(阳性MLR对照)单独或在存在Karpas 299人细胞系的10000个细胞的情况下培养在96孔板中。48 小时之后，提取上清液，通过商业 ELISA(Ref 555138, Pharmingen, San Diego, CA, United States)测量干扰素γ (IFN-γ )。在这种情况下，不可能测量细胞增殖，因为 Karpas 299细胞系的存在掩盖了对MLR增殖的任何可能影响。IFN-γ的测量结果如图3所 示，并提供了有关Karpas 299细胞系的抑制活性的信息。在由于Karpas 299细胞系的存在 而抑制MLR的测定中，分析了由于MLR导致肽Ρ60 (SEQ ID NO 1)恢复产生IFN-γ的能力。 图3显示了在MLR和Karpas 299细胞系的共培养物中添加肽Ρ60 (SEQ ID NO 1) (100 μ Μ) 能部分恢复IFN- γ的产生，这在缺乏Karpas 299细胞系时可观察到。实施例3 肽Ρ60 (SEQ ID NO 1)对人和小鼠Treg淋巴细胞的免疫抑制活性的效 应3. 1肽Ρ60 (SEQ ID NO 1)对人Treg淋巴细胞的免疫抑制活性的效应通过2个不同的测定，分析了肽Ρ60 (SEQ ID NO 1)对人Treg淋巴细胞的免疫抑 制活性的抑制能力a)通过基于混合淋巴细胞反应(MLR)测定的方式；以及b)通过基于测量在人⑶4效应T淋巴细胞培养物中产生的IFN-Y测定的方式，所 述人CD4效应T淋巴细胞与含有粘附在其表面的抗CD3和抗CD28抗体的微球体，在存在或 缺乏Treg淋巴细胞的情况下，一起培养。3. 1. 1基于混合淋巴细胞反应(MLR)的测定为进行基于混合淋巴细胞反应(MLR)的测定，例如实施例2中所示，通过使用商业试剂盒(Ref 130091072,Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach，德国)按照生产商的说明 书，将来自2位供体的外周血单核细胞(PBMCs)以及从2为供体之一纯化的⑶4+⑶25+Treg 细胞(Treg淋巴细胞)混合在一起。纯化之后，通过流式细胞计仪，分析细胞，在所有测 定中获得大约90%的纯度。进行该MLR测定，在存在或缺乏肽P60 (SEQ ID NO 1)的情况 下，温育来自每位供体的IO5个PBMC细胞和2 X IO4个Treg淋巴细胞以实现测定其阻断人 Treg淋巴细胞的抑制效应的能力。培养3天之后，0. 5 μ Ci/孔的氚标记的胸苷(Amersham， Pharmacia)，16 小时之后，使用采集器(Filtermate 96 采集器；Packard Instrument, Meriden, CT)采集收获平板，通过闪烁计数器(Topcount ；Packard Instrument)，对掺入细 胞DNA的放射活性进行计数(作为细胞增殖的量度)。该测定的结果如图4所示，其中可 观察到2位供体的PBMCs混合物促进了细胞增殖，其测量为掺入的放射活性胸苷，以及添加 Treg淋巴细胞能抑制所述细胞增殖；还观察到，向这些共培养物中添加肽P60 (SEQ ID NO 1)能部分恢复MLR，从而阻断人Treg淋巴细胞的免疫抑制效应。3. 1. 2基于测量IFN- γ的测定该测定是基于测量在IO5个人⑶4效应T淋巴细胞培养物中产生的IFN-γ，人⑶4 效应T淋巴细胞与含有粘附在其表面的抗CD3和抗CD28抗体的微球体(Dynabeads ⑶3/⑶28;Ref 111.31，Dynal)，在存在或缺乏2X IO4个人Treg淋巴细胞(如以上所示纯 化的)的情况下，一起培养。在存在或缺乏肽P60 (SEQ ID NO 1)的情况下，进行该测定， 以评估它对Treg淋巴细胞的抑制效应。培养48小时之后，通过商业ELISA(Ref 555138， Pharmingen)，测量培养上清液中存在的IFN- γ。图5显示了含有抗⑶3和抗⑶28抗体的 微球体刺激了 T淋巴细胞产生IFN- γ，且向培养中添加Treg细胞能抑制所述IFN- γ的产 生。向这些共培养物中添加肽P60(SEQID NO 1)还能阻断人Treg淋巴细胞的抑制效应，从 而部分恢复响应刺激产生IFN- γ。3. 2肽P60 (SEQ ID NO 1)对小鼠Treg淋巴细胞免疫抑制活性的效应通过3个不同测定，分析了肽P60 (SEQ ID NO 1)对小鼠Treg淋巴细胞的免疫抑 制活性的抑制能力a)通过基于激活脾细胞的测定；b)通过基于混合淋巴细胞反应(MLR)测定；以及b)通过基于共培养转基因小鼠脾细胞和Treg淋巴细胞的测定。3. 2. 1基于激活脾细胞的测定首先，在存在抗CD3抗体(Ref 553057，BD Biosciences)的情况下，进行激活 BALB/c小鼠脾细胞(Charles River)的测定。为此，在存在或缺乏抗CD3抗体、2X IO4个 小鼠Treg淋巴细胞和肽P60 (SEQ ID NO 1)的情况下，培养IO5个BALB/c小鼠脾细胞，观 察到肽P60(SEQ ID NO 1) (100 μ M)能抑制Treg淋巴细胞对效应细胞响应抗⑶3的刺激产 生IFN- γ的抑制效应(图6)。3. 2. 2混合淋巴细胞反应测定(MLR)其次，进行混合淋巴细胞反应(MLR)测定。在存在或缺乏BALB/cTreg淋巴细胞和 存在或缺乏肽P60 (SEQ ID NO 1) (100 μ M)的情况下，共培养从BALB/c小鼠(IO5个细胞/ 孔)分离的效应淋巴细胞和来自C57BL/6小鼠的纯化的树突细胞(Charles River0通过 之前所述的常规氚标记的胸苷掺入法测量细胞增殖。所获结果表明，肽P60 (SEQ ID NO 1)能抑制Treg淋巴细胞对效应细胞响应MLR增殖的免疫抑制效应(图7)。3. 2. 2基于共培养转基因小鼠脾细胞和Treg淋巴细胞的测定第三，在基于存在或缺乏抗原(SEQ ID NO 7)和存在或缺乏Treg淋巴细胞的情况 下共培养来自OT-I转基因小鼠(它的T淋巴细胞具有卵白蛋白的肽SIINFEKL(SEQ ID NO 7)的特异性T细胞受体，其由CIMAPamplona的Melero博士友情提供)的脾细胞和Treg淋 巴细胞的测定中，测量肽P60(SEQ ID NO 1)的效应。图8显示了肽P60 (SEQ ID N0:1)对天 然鼠调控T细胞(从小鼠脾细胞中纯化的)在效应细胞针对抗原刺激的反应中作用的效应 (如培养上清液中IFN-Y的产生所测量的)。将从OT-I转基因小鼠中分离的效应淋巴细胞 (IO5个细胞/孔)与来自C57BL/6小鼠的树突细胞和肽SIINFEKL(SEQ ID NO 7) (10 μ g/ ml)，在存在或缺乏2 X IO4个细胞/孔的BALB/c调控T细胞和存在或缺乏肽P60 (SEQ ID NO :1) (100 μ M)的情况下，进行共培养。如所观察的，肽Ρ60 (SEQ ID NO 1)能抑制Treg 淋巴细胞对这种肽抗原的特异效应细胞产生IFN-Y (通过商业ELISA测量(Ref :555138， Pharmingen，San Diego, CA))的免疫抑制效应。实施例4 =Scurfin对激活转录因子NF- κ B的抑制效应已经描述了在293细胞中Scurfin的存在可抑制转录因子NF-κ B的激活 (Betelli et al，Proc Natl Acad Sci U S A. 2005102 :5138_43)。在这个工作的基础 上，研究了向由Oukka博士友情提供且之前所述(Betelli et al, ProcNatl Acad Sci U S A. 2005102 :5138-43)的转染了表达foxp3基因的质粒的293细胞培养物中和向转 染了对照质粒以及在可由NF-K B诱导的启动子下表达荧光素酶的质粒(Ref 631904， pNF-kB-Luc, Clontech)的293细胞培养物中添加肽P60 (SEQ ID NO 1)的效应。在存在或 缺乏质粒pcDNA、pcDNA-Foxp3和肽P60(SEQ ID NO 1) (100 μ M)下，通过使用阳离子脂质体 (Iiofectamine)转染293细胞，所述阳离子脂质体具有在可由转录因子NF_kB诱导的启动 子下表达荧光素酶的质粒pNF-kB-Luc。培养24小时之后，收获细胞，并通过使用适宜的试 剂盒(Promega，Maddison，USA)和光度计(Orion微板光度计，Berthold检测系统(Berthold detection systems)，Germany)，测量细胞提取物中的荧光素酶活性。获得的结果如图9所 示，其中可以看出，细胞中scurfin的存在抑制了荧光素酶的表达，以及肽P60 (SEQ ID N0: 1)的存在恢复了荧光素酶的表达。实施例5 通过给予scurfin抑制肽在体内增强抗肿瘤疫苗的免疫鉴于之前所获得的结果，进行体内测定以测量给予scurfin抑制肽对抗肿瘤接种 的免疫增强效应。该测定所用的肿瘤模型是基于CT26结肠癌系的模型，如发明人实验室之前的 工作所述(Casares et al,2001.Eur J Immunol 31 1780-9 ；Casares etal. ,2003. J Immunol 171 :5931_9)，因为发明人之前证明，在这种模型中，Treg淋巴细胞具有促进肿瘤 生长的免疫抑制效应(上文提到的Casares etal.，2003)。用合成的肽(SEQ ID NO 8)作为疫苗抗原，该肽含有CT26系的细胞毒性T决定簇 (Huang, Α. Y. et al,Proc Natl Acad Sci U S A，1996. 93 :9730_9735)，且其免疫作用一定 程度上延迟了肿瘤生长，由于Treg淋巴细胞的存在而无需不清除它(上文提到的Casares et al.，2003)。简而言之，如上文提到的Casares et al.，2001所述，在存在或缺乏肽P60 (SEQ IDNO :1)的情况下，用肽AHl (SEQ ID NO :8)免疫6只六周龄BALB/c小鼠(Charles River) 组。免疫10天之后，小鼠皮下注射5X IO5个CT26细胞，并测量肿瘤进展。如图10所示的，在用肽AHl免疫之后数天内给予所述肽P60(SEQID N0:1)，保护 小鼠免于肿瘤发作。事实上，用肽AHl免疫并用肽P60 (SEQ ID NO=D治疗的11只小鼠中 仅有2只发展了明显的肿瘤(82%的保护率)，而剩余组中的保护率明显更低，发展了致命 的肿瘤(单独用AH1(0% )、单独用肽P60(SEQ ID NO 1) (10% )或单独用PBS (0%)免疫 的小鼠)(在所有情况中，η = 11)。图IOA表示肿瘤生长曲线，而图IOB表示不同实验组的生存曲线(Kaplan-Meier 表示法)。ρ < 0. 001表示通过对数秩检验进行统计分析的结果。
2权利要求
能与scurfin结合的肽，选自a)通式(I)的肽，其包含氨基酸序列Arg Asp Phe Gln Ser Phe Arg Lys Met Trp Pro Phe Phe X(I)其中X不存在或X存在且是X14或X14 X15，其中X14和X15是相互独立的，表示氨基酸；b)a)所定义的肽的变体；以及c)a)所定义的肽或b)所定义的变体的片段；以及其药物可接受盐。
2.如权利要求1所述的肽，还具有体外或/或体内抑制scurfin的生物活性的能力。
3.如权利要求1所述的肽，包含以下氨基酸序列或由其形成 Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Ly S-Met-Trp-Pro-Phe-Phe-X14-X15 (Ia)其中X14和X15是相互独立的，表示氨基酸。
4.如权利要求3所述的肽，其中X14是Ala，且X15是Met。
5.如权利要求1所述的肽，包含以下氨基酸序列或由其形成 Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-LyS-Met-Trp-Pro-Phe-Phe-X (Ib)其中X是x14，其中X14表示氨基酸。
6.如权利要求5所述的肽，其中X14是Ala。
7.如权利要求1所述的肽，选自包含SEQID N0:1、SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3的 肽，其变体或片段，和其药物可接受盐。
8.如权利要求1所述的肽，选自SEQID NO =USEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3所形成的肽
9.融合蛋白，其包含(i)权利要求1-8中任一项的肽，以及 ( )能将肽内化于细胞内的载体肽。
10.如权利要求9所述的融合蛋白，其中所述载体肽包含选自SEQIDN0:9、SEQ ID NO 10、SEQ ID N0:11、SEQ ID NO 12, SEQ ID N0:13、或 SEQ ID NO : 14 的氨基酸序列。
11.如权利要求10所述的融合蛋白，还包含位于权利要求1-8中任一项的所述肽[肽 (i)]和所述载体肽[肽(ii)]之间的间隔肽。
12.如权利要求10所述的融合蛋白，还包含用于分离或纯化本发明的融合蛋白的氨基 酸序列。
13.药物组合物，包含治疗有效量的权利要求1-8中任一项的肽，或权利要求9-12中任 一项的融合蛋白，以及至少一种药物可接受赋形剂。
14.如权利要求13所述的药物组合物，除了至少一种权利要求1-8中任一项的肽或权 利要求9-12中任一项的融合蛋白以外，还包含一种或多种抑制或调控不同Treg淋巴细胞 的免疫抑制活性的化合物。
15.权利要求1-8中任一项的肽或权利要求9-12中任一项的融合蛋白，在制备用于治疗肿瘤疾病或感染性疾病的药物组合物中的应用。
16.如权利要求15所述的用途，其中所述感染性疾病选自由病毒感染、细菌感染、真菌 感染和寄生虫感染引起的疾病。
17.如权利要求16所述的用途，其中所述感染性疾病选自由丙型肝炎病毒引起的疾病 和由乙型肝炎病毒引起的疾病。
18.如权利要求15所述的用途，其中所述肿瘤疾病是乳头状瘤、腺瘤、脂瘤、骨瘤、肌 瘤、血管瘤、痣、成熟畸胎瘤、癌、肉瘤或未成熟畸胎瘤。
19.如权利要求18所述的用途，其中所述肿瘤疾病是黑素瘤、骨髓瘤、白血病、霍奇金 淋巴瘤、基底细胞瘤、脊柱细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、肺癌、支气管癌、前列腺癌、结肠 癌、胰腺癌、肾癌、食道癌、肝癌或头颈癌。
20.权利要求1-8中任一项的肽或权利要求9-12中任一项的融合蛋白在治疗肿瘤疾病 或感染性疾病中的用途。
21.核酸，其编码权利要求1-8中任一项的肽或权利要求9-12中任一项的融合蛋白。
22.基因构建体，其包含权利要求21的核酸。
23.如权利要求22的基因构建体，还包含可操作结合的调控所述核酸表达的序列。
24.载体，其包含权利要求21的核酸或权利要求22或23中任一项的基因构建体。
25.宿主细胞，其包含权利要求21的核酸或权利要求22或23中任一项的基因构建体 或权利要求24的载体。
26.产生权利要求1-8中任一项的肽或权利要求9-12中任一项的融合蛋白的方法，包 括在允许产生所述肽的条件下培养权利要求25的宿主细胞，以及如果需要，回收所述肽或 所述蛋白。
27.权利要求21的核酸或权利要求22或23中任一项的基因构建体在制备用于治疗肿 瘤疾病或感染性疾病的载体和细胞中的用途。
全文摘要
本发明涉及通式(I)的肽、其功能性变体和片段及其药物可接受盐，其中X不存在，或X存在且是X14或X14-X15，其中X14和X15是相互独立的，表示氨基酸；因为能与scurfin结合并抑制其生物活性，因此它们调控或阻断调控T(Treg)淋巴细胞的活性。它们可应用于感染性疾病和肿瘤疾病的治疗。Arg-Asp-Phe-Gln-Ser-Phe-Arg-Lys-Met-Trp-Pro-Phe-Phe-X(I)。
文档编号C12N5/0783GK101903514SQ200880121732
公开日2010年12月1日 申请日期2008年11月14日 优先权日2007年11月19日
发明者伊尼斯·诺丽亚·凯撒瑞斯拉贾尔, 帕布鲁·萨罗韦乌加里萨, 弗朗西斯科·博拉斯奎斯塔, 胡安·何塞·拉萨尔特萨加斯蒂韦尔萨, 赫苏斯·普列托巴尔图埃纳 申请人:西玛生物医学信息公司