生产发酵产品的方法

专利名称：生产发酵产品的方法
技术领域：
本发明涉及将植物材料发酵为所期望发酵产物的方法。该发明也涉及使用一种或 多种发酵生物自植物材料产生发酵产物的方法，以及可用于上述方法中的组合物。
背景技术：
由于化石燃料的有限储备和对排放温室气体的忧虑，人们越来越着眼于使用可再 生的能源，例如植物材料。许多通过发酵源自含淀粉和/或木质纤维素材料的糖产生发酵产物，特别是生物 燃料产品(例如乙醇和丁醇)的方法是本领域已知的。然而，自植物材料产生上述发酵产物仍然成本高昂。因此，需要提供可减少产生成 本的方法。

发明内容
在第一个方面，本发明涉及在发酵培养基中使用发酵生物将植物材料发酵成为发 酵产物的方法，其中一种或多种碳酸酐酶存在于所述发酵培养基中。在第二个方面，本发明涉及自含淀粉材料产生发酵产物的过程，包括下述步骤i)使用α -淀粉酶将含淀粉材料液化；ii)用糖源生成酶糖化所述经液化的材料；iii)根据本发明的发酵方法用一种或多种发酵生物进行发酵。在第三个方面，本发明涉及自含淀粉材料产生发酵产物的方法，包括下述步骤(a)在所述含淀粉材料的起始糊化温度以下的温度糖化含淀粉材料；(b)使用发酵生物进行发酵，其中发酵根据本发明的发酵方法进行。在第四个方面，本发明涉及自含木质纤维素的材料产生发酵产物的方法，包括下 述步骤(a)预处理含木质纤维素的材料；(b)将所述材料水解；(c)使用发酵生物根据本发明的发酵方法进行发酵。在第五个方面，本发明涉及包含一种或多种碳酸酐酶和一种或多种α-淀粉酶的 组合物。在第六个方面，本发明涉及使用碳酸酐酶在发酵过程中控制ρΗ波动。在第七个方面，本发明涉及使用碳酸酐酶改善酵母发酵产品收率和/或发酵速率。在最后一个方面，本发明涉及用一种或多种碳酸酐酶基因转化的转基因植物材 料。附图简述

图1显示了在一步发酵方法中，碳酸酐酶(CA)相对于α -淀粉酶(AAl)和葡糖淀粉酶(AMG A)组合的作用。发明详述本发明涉及将植物材料发酵为期望的发酵产物的方法。本发明也涉及使用一种 或多种发酵生物自植物材料产生期望的发酵产物的方法。最后，本发明涉及组合物，其包 含一种或多种酶和一种或多种发酵产物促进化合物(fermentation product boosting compound)。本发明人发现，在植物材料的酵母发酵过程中，在一些时间点pH降至pH 4.5 以下。该低PH值是缺点，因为一些酶(特别是α-淀粉酶)会发生变性和/或自剪切 (autocleavage) 0本发明人发现了该问题的解决方法。本发明的构思为使用碳酸酐酶将酵 母发酵的副产物CO2转化为碳酸氢盐。化学方程式C6H12O6 — 2C2H50H+2C02总结了乙醇发酵， 其中一个己糖分子转化为两个乙醇分子和两个二氧化碳分子。碳酸酐酶可可逆地催化将副 产物CO2和水变为碳酸氢根和质子(C02+H20 — HC03_+H+)的反应；该反应在生理pH是缓慢 的并且需要酶催化。不受任何特定理论的限制，认为将碳酸酐酶添加至发酵方法具有至少两个功能(1)由于碳酸酐酶催化，自糖发酵反应平衡中移除了二氧化碳副产物，并由此使所 述反应平衡向期望的乙醇产物方向移动。(2)减少或阻止了碳酸氢根重新转化为CO2，所得碳酸氢根可与发酵培养基中存在 的阳离子(钾离子、钙离子或镁离子)反应形成碳酸氢盐，并有效地充当缓冲剂以在发酵过 程中稳定PH的波动。利用碳酸酐酶作为一种维持pH(优选高于pH4. 5)的手段促进了使用酶自淀粉和 /或木质纤维素(即生物质)产生发酵产物，如生物燃料，所述酶在低PH下可较不稳定，但 对淀粉或其它底物(如纤维素或半纤维素)是高度活性的。此外，将PH维持在4. 5之上也 有利于发酵生物，如特别是酵母，其在约PH5. 0具有最优发酵性能。此外，据报道称碳酸氢根涉及酵母中一些代谢反应的无机羧化(BiochemJ. 391， 311-316)，尤其是当添加尿素作为氮源时。尿素由碳酸氢根依赖性尿素羧化酶代谢 (J. Biol. Chem. 247，1349-1353)。从而，使用碳酸酐酶可适当地提供酵母尿素代谢所需的碳 酸氢根。因此，在第一个方面本发明涉及在发酵培养基中使用发酵生物将植物材料发酵成 为发酵产物的方法，其中一种或多种碳酸酐酶存在于所述发酵培养基中。所述碳酸酐酶可 在发酵之前和/或过程中添加/导入，和/或通过所述发酵生物，优选酵母的过表达在原位 (in situ)产生。根据本发明，起始材料(即，发酵生物的底物)可为任何植物材料或其部分或组 分。在一个实施方案中，所述起始材料为含淀粉材料，在另一个实施方案中，所述起始 材料为含木质纤维素的材料。发酵生物术语“发酵生物”指任何适于产生所期望的发酵产物的生物，包括细菌和真菌生 物，包括酵母和丝状真菌。所述发酵生物可为C6或C5发酵生物，或其组合。C6和C5发酵 生物在本领域均众所周知。
根据本发明特别合适的发酵生物能够将糖(如葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、甘露 糖和/或阿拉伯糖)直接或间接发酵(即转化)为所期望的发酵产物。发酵生物的实例包括真菌生物，例如酵母。优选的酵母包括酵母属 (Saccharomyces)的菌株，特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
母(Saccharomyces uvarum)的菌株，毕赤酵母属(Pichia)的菌株，优选树干毕赤酵母 (Pichia stipitis)如树干毕赤酵母CBS 5773或巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)； 假丝酵母属(Candida)的菌株，特别是产朊假丝酵母(Candida utilis)，阿拉伯糖发 酵假丝酵母(Candida arabinofermentans)，迪丹氏假丝酵母(Candidadiddensii)， Candida sonorensis，休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)，热带假丝酵母(Candida tropicalis)或博伊丁氏假丝酵母(Candida boidinii)的菌株。其它发酵生物包括 汉逊酵母属(Hansenula)，特别是多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)或异常汉逊 酵母(Hansenula anomala)；克鲁维酵母(Kluyveromyces)，特别是脆壁克鲁维酵母 (Kluyveromyces fragilis)或马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)；裂殖酵母 属(Schizosaccharomyces),特别是粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的菌株。优选的细菌发酵生物包括埃希氏菌属(Escherichia)，特别是大肠杆 菌(Escherichia coli)的菌株，发酵单胞菌属(Zymomonas)，特别是运动发酵单胞 菌(Zymomonas mobilis)的菌株，发酵细菌属(Zymobacter)，特别是棕榈发酵细菌 (Zymobactor palmae)的菌株，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，特别是产酸克雷伯氏 菌(Klebsiella oxytoca)的菌株，明串珠菌属(Leuconostoc)，特别是肠系膜明珠菌属(Leuconostoc mesenteroides)的菌株，梭菌属(Clostridium),特别是酪酸梭菌菌(Clostridium butyricum)的菌株，肠杆菌属(Enterobacter),特别是产气肠杆菌 (Enterobacter aerogenes)的菌属，以及嗜热厌氧菌属 (Thermoanaerobacter)的，特别是嗜热厌氧菌BGlLl (App 1. Microbiol. Biotech. 77 :61_86)和乙醇热厌氧杆 (Thermoanarobacter ethanolicus), 热解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterther mosaccharoIyticum)或 Thermoanaerobacter mathrani 的菌株。还想到的是乳杆菌属 (Lactobacillus)以及谷氨酸棒状杆菌 R(Corynebacterium glutamicum R)，热葡糖苷 酶芽孢杆菌(Bacillus thermoglucosidaisus)和热葡糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)的菌株。在一个实施方案中，所述发酵生物为C6糖类发酵生物，例如，酿酒酵母的菌株。对于发酵木质纤维素来源材料，考虑了 C5糖发酵生物。多数C5糖发酵生物也发 酵C6糖。C5糖发酵生物的实例包括毕赤酵母，例如树干毕赤酵母菌种的菌株。C5糖发酵 细菌也是已知的。而且，一些酿酒酵母菌株发酵C5(和C6)糖。实例为能够发酵C5糖的 酵母属菌种的经遗传修饰的菌株，包括，例如，Ho等，1998，Applied and Environmental Microbiology, p. 1852—1859 和 Karhumaa 等，2006，Microbial Cell Factories 5 :18 禾口 Kuyper 等，2005，FEMS YeastResearch 5，ρ· 925-934 中涉及的菌株。某些发酵生物的发酵性能可受存在于发酵培养基中的抑制剂抑制，从而减少了乙 醇产生能力。已知在生物质水解物中的化合物和高浓度的乙醇抑制某些酵母细胞的发酵能 力。预适应或适应方法可减少该抑制作用。通常酵母细胞的预适应或适应涉及在发酵前顺 序地培养酵母细胞，以增加所述酵母的发酵性能并增加乙醇产生。酵母预适应和适应方法在本领域为已知的。这样的方法可包括，例如，在粗生物质水解物的存在下培养酵母细胞， 在抑制剂例如酚化合物、糠醛和有机酸的存在下培养酵母细胞；在非抑制量的乙醇存在下 培养酵母细胞；以及在酵母培养物中补充乙醛。在一个实施例中，所述发酵生物为在发酵之 前进行一种或多种预适应或适应方法的酵母菌株。某些发酵生物如酵母需要足够的氮源以供繁殖和发酵。许多氮源可供使用，且这 些氮源在本领域为众所周知。在一个实施方案中，使用了低成本的氮源。这样的低成本氮 源可为有机的，如尿素，DDG，湿饼(wet cake)或玉米醪(corn mash)，或无机的，例如氨或
氢氧化铵。适用于乙醇产生的商业上可得到的酵母包括，例如，ETHANOL RED 酵母(可 由 Fermentis/Lesaffre, USA 得到)，FALI (可由 Fleischmann，s Yeast, USA 得到)， SUPERSTART 和 THERM0SACC 新鲜酵母(可由 EthanolTechnology，WI，USA 得到)，BIOFERM AFT 禾Π XR(可由 NABC-NorthAmerican Bioproducts Corporation, GA, USA 得到)，GERT STRAND (可由 GertStrand AB, Sweden 得到)，以及 FERMIOL (可由 DSM Specialties 得到)。在一个实施方案中，将所述发酵生物添加至发酵培养基中从而使得每ml发酵培 养基的中活的发酵生物(如酵母)计数为IO5至1012，优选IO7至IOki的范围内，特别是约 5xl07。根据本发明能够自可发酵的糖类，例如葡萄糖、果糖和/或麦芽糖产生期望的发 酵产物的发酵生物，优选在准确的条件下以特定的生长速率生长。当将所述发酵生物导入 /添加入所述发酵培养基时，接种的发酵生物经过许多阶段。起初，生长并未发生。该期间 称为“迟滞期”，且可看作适应期。在下一个称为“指数期”的阶段，生长速率逐渐增加。经 过一个最大生长的期间，生长速率停止，且所述发酵生物进入“稳定期”。又一段时间后所述 发酵生物进入“死亡期”，其间活细胞数减少。在一个实施方案中，当所述发酵生物处于迟滞期时，将所述碳酸酐酶添加至所述
发酵培养基。在一个实施方案中，当所述发酵生物处于指数期时，将所述碳酸酐酶添加至所述
发酵培养基。在一个实施方案中，当所述发酵生物处于稳定期时，将所述碳酸酐酶添加至所述 发酵培养基。发酵产物术语“发酵产物，，意指使用发酵生物通过包括发酵步骤的方法生成的产物。根据 本发明所包括的发酵产物包括任何发酵产物，特别是生物燃料产物，例如乙醇和丁醇。发酵根据本发明在常规使用的条件下进行发酵。优选的发酵方法为厌氧方法。为了产生乙醇，在一个实施方案中发酵可持续6至120小时，特别为24至96小时。 在一个实施方案中发酵在25至40°C，优选28至35°C，如30至34°C，和特别是约32°C的温 度进行。在一个实施方案中，在发酵起始时PH在pH3至6，优选约4至5的范围内。涵盖同时进行水解/糖化和发酵(SHF/SSF)，其中对水解/糖化无单独的保持阶段 (holding stage)，意思是水解/糖化酶、发酵生物和碳酸酐酶可一起添加。然而应理解的 是碳酸酐酶也可分开添加。当发酵与水解/糖化同时进行时，温度优选为25至40°C，优选28至35°C，如30°C至34°C，特别是约32°C，此时发酵生物为酿酒酵母的菌株而期望的发酵 产物为乙醇。其它发酵产物可在本领域技术人员已知为适于所述发酵生物的温度进行发酵。本发明的方法可作为分批或作为连续方法进行。本发明的发酵方法可在超滤系统 中进行，此时渗余物在固体、水和发酵生物的存在下保持再循环，或渗透物为含液体的期望 的发酵产物。同样涵盖的是所述方法在具超滤膜的连续的膜反应器中进行，且此时渗余物 在固体、水和发酵生物的存在下保持再循环时，或渗透物为含液体的发酵产物。发酵后，可由发酵的浆料分离发酵生物并将其再循环至发酵培养基。回收在发酵之后，可自发酵培养基中分离发酵产物。可蒸馏浆料以提取期望的发酵产 物，或可自发酵培养基中通过微滤或膜过滤技术提取期望的发酵产物。或者，可通过提馏 (stripping)回收发酵产物。回收技术在本领域为众所周知的。自含淀粉材料产生发酵产物自经糊化的含淀粉材料中产生发酵产物的方法在此方面，本发明涉及自含淀粉材料产生发酵产物(特别是乙醇)的方法，所述方 法包括液化步骤，以及顺序或同时进行的糖化和发酵步骤。本发明涉及自含淀粉材料产生发酵产物的方法，包括下述步骤i)用α _淀粉酶液化含淀粉材料；ii)用糖源生成酶糖化所述经液化的材料；iii)使用一种或多种发酵生物进行发酵，其中发酵根据本发明的发酵方法进行， 即，在碳酸酐酶的存在下进行。糖化步骤ii)以及发酵步骤iii)可顺序或同时进行。碳酸酐酶可在发酵步骤之 前和/或过程中添加。所述发酵产物，如特别是乙醇，可任选地在发酵后回收，例如，通过蒸馏进行。合适 的含淀粉的起始材料列于下面“含淀粉材料”部分。涵盖的酶列于下面“酶”部分。液化步 骤优选在α-淀粉酶，优选细菌α-淀粉酶或酸性真菌α-淀粉酶存在的条件下进行。所 述发酵生物优选是酵母，优选酵母属的菌株。合适的发酵生物列于上面“发酵生物”部分。在特定实施例中，本发明的方法在步骤(i)之前还包括下述步骤χ)减小含淀粉材料的粒度，优选通过磨制(milling)；y)形成包含含淀粉材料和水的浆料。含水浆料可含有10_55衬％含淀粉材料的干固体，优选25_45wt%的干固体(DS)， 更优选30-40%干固体。将浆料加热到糊化温度以上，并可添加α-淀粉酶，优选细菌和/ 或酸性真菌α -淀粉酶以起始液化(稀化(thinning))。在一个实施方案中，在进行本发明 步骤(i)中的α-淀粉酶处理前，浆料可经喷射蒸煮(jet-cooked)以进一步使其糊化。更加具体而言，液化过程可作为三步热浆方法来进行。将浆料加热至60_95°C， 优选80-85 °C，并添加α-淀粉酶以起始液化(稀化)。然后可将浆料在95-140°C，优选 105-125°C的温度喷射蒸煮1-15分钟，优选3_10分钟，特别是约5分钟。使浆料冷却至 60-95°C并添加更多的α-淀粉酶以完成水解(二次液化)。液化方法通常在ρΗ4. 5-6. 5， 特别是在ΡΗ5-6进行。经磨制和液化的全谷粒称为醪。
步骤(ii)中的糖化可使用本领域众所周知的条件进行。举例而言，完全的糖化方 法可持续约24至约72小时，然而，通常仅在30-65°C，通常约60°C的温度进行通常40-90分 钟的预糖化，然后是在同时发酵和糖化方法(SSF方法)中在发酵过程中的完全糖化。糖化 通常在20-75°C，优选40-70°C，通常约60°C的温度，在pH4_5的pH，通常在约pH4. 5进行。发酵产物，特别是乙醇生产中最广泛使用的方法为同时糖化和发酵(SSF)方法。 其中对糖化没有保持阶段，意思是发酵生物(如酵母)和酶可一起添加。SSF可通常在 250C -400C，如28°C -35°C，如30°C -34°C，优选约32°C的温度进行。根据本发明，该温度可 在发酵过程中上调或下调。根据本发明，发酵步骤(iii)包括但不限定于本发明用于产生如上面在“发酵产 物”部分中的例示的发酵产物的发酵方法。自未糊化的含淀粉材料产生发酵产物的方法。在此方面，本发明涉及自含淀粉材料产生发酵产物，而无含淀粉材料的糊化(通 常称作“烹制”)。根据本发明，可产生期望的发酵产物，如乙醇，而不液化含有含淀粉材料 的含水浆料。在一个实施方案中，本发明的方法包括在起始糊化温度以下，优选在α-淀粉 酶和/或糖源生成酶的存在下对(例如，经磨制的)含淀粉材料，例如粒状淀粉进行糖化以 产生糖类，所述糖类可由合适的发酵生物发酵成期望的发酵产物。在该实施方案中，期望的发酵产物(优选乙醇)自未糊化的(即，未烹制的)，优选 经磨制的谷物/玉米(corn)产生。因此，在此方面，本发明涉及自含淀粉材料产生发酵产物的方法，包括下述步骤(a)在所述含淀粉材料的起始糊化温度以下的温度糖化含淀粉材料；(b)使用发酵生物进行发酵，其中发酵根据本发明的发酵方法，即，在碳酸酐酶的存在下进行。在一个优选实施方案中，步骤(a)或(b)同时(即，一步发酵)或顺序进行。所述发酵产物，如特别是乙醇，可任选地在发酵后回收，例如，通过蒸馏进行。合适 的含淀粉的起始材料列于下面“含淀粉材料”部分。涵盖的酶列于下面“酶”部分。使用的 α -淀粉酶优选为酸性α -淀粉酶，优选酸性真菌α -淀粉酶。发酵生物优选为酵母，优选 酵母属的菌株。合适的发酵生物列于上面“发酵生物”部分。术语“起始糊化温度”意指淀粉糊化发生的最低温度。通常，在水中加热的淀粉 在50°C _75°C开始糊化；糊化的准确温度取决于特定的淀粉，并可方便的由本领域技术人 员确定。从而，起始糊化温度可根据植物物种，植物物种的特定变种以及生长条件而改变。 在本发明的上下文中，给定含淀粉材料的起始糊化温度可确定为使用由Gorinstein. S.和 Lii. C. ,Starch/ Starke,Vol. 44(12)pp. 461-466(1992)描述的方法 5%的淀粉颗粒丧失双 折射的温度。在步骤(a)之前，可制备含淀粉材料，如粒状淀粉的浆料，其具有10_55wt%含淀 粉材料的干固体(DS)，优选25-45衬％干固体，更优选30-40%干固体。浆料可包含水分和 /或工艺水(process water)，例如釜馏物(逆流)、洗涤水、蒸发器冷凝液或馏出物、来自蒸 馏的侧线汽提器水(side-stripper water)或来自其它发酵产物设备的工艺水。由于本发 明的方法在糊化温度以下进行，因此不发生显著的粘度增加，如果需要，可使用高水平的釜 馏物。在一个实施方案中，含水浆料包含约1至约70vol%的釜馏物，优选15-60vol%的釜
9馏物，特别为自约30至50vol%的釜馏物。可通过优选以干磨或湿磨将其粒度减小到0. 05至3. Omm,优选0. 1-0. 5mm来制备 含淀粉材料。在进行本发明的方法后，含淀粉材料中至少85 %，至少86 %，至少87 %，至少 88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少 96%，至少97%，至少98%，或者优选至少99%的干固体转化为可溶的淀粉水解物。本发明的方法在低于起始糊化温度的温度进行，其意指步骤(a)进行的温度通常 在30-75 °C，优选45-60 °C的范围内。在一个优选实施方案中，步骤(a)和步骤(b)作为同时糖化和发酵方法进行。在 这样的优选实施方案中，所述方法通常在25-40°C，如28-35°C，如30°C _34°C，优选约32°C 的温度进行。在一个实施方案中，进行同时糖化和发酵从而使得糖水平，如葡萄糖水平保持在 低水平，如6wt%以下，优选约3wt%以下，优选约2衬％以下，更优选约Iwt %以下，甚至更 优选约0. 5%以下，或甚至更优选0. 25wt%，如约0. 以下。所述低水平的糖可通过简 单的使用经调整量的酶和发酵生物来实现。本领域技术人员可方便地确定使用的酶和发酵 生物的量。酶和发酵生物所述量也可经选择以保持麦芽糖在发酵液中的低浓度。举例而言， 麦芽糖水平可保持为约0. 5衬％以下或约0. 2wt%以下。本发明的方法可在pH3-7，优选pH3. 5至6，或更优选pH4至5进行。含淀粉材料根据本发明，可使用任何合适的含淀粉的起始材料，包括粒状淀粉。所述起始材料 通常基于期望的发酵产物而选择。适用于本发明方法的含淀粉的起始材料的实例包括块 茎、根、茎、全谷粒、玉米、玉米穗轴、小麦、大麦、黑麦、买罗高粱、西米、木薯、树薯、高粱、稻、 豌豆、大豆或甘薯，或它们的组合，或谷类。也涵盖蜡质和非蜡质类型的玉米和大麦。术语“粒状淀粉”意指未烹制的淀粉，即，以其天然形式存在于谷类、块茎或谷粒中 的淀粉。淀粉在植物细胞中作为微小的不溶于水的颗粒形成。当置于冷水中时，淀粉颗粒 可吸收少量液体并膨胀(swell)。在高至50°C至75°C的温度，膨胀可为可逆的。然而，在更 高温度开始称为“糊化”的不可逆膨胀。待加工的粒状淀粉可为高度精制的淀粉质量，优选 至少90 %，至少95 %，至少97 %或至少99. 5 %纯，或者其可为更加粗制的含淀粉材料，其含 有包括非淀粉部分(例如胚残余物和纤维)的经磨制的全谷粒。原材料(如全谷粒)通过 例如磨制减小粒度以打开其结构并允许进一步的加工。根据本发明优选两个方法，湿磨和 干磨。在干磨中，将整粒磨碎并使用。湿磨给出胚和粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)的良好分 离，并通常用于使用淀粉水解物产生糖浆的场合(location)。干磨和湿磨在淀粉加工领域 都是众所周知的，并等同地涵盖于本发明的方法中。在一个实施方案中，粒度减少至约0. 05 到3. Omm,优选0. 1-0. 5mm,或使得至少30 %，优选至少50 %，更优选至少70 %，甚至更加优 选至少90%的含淀粉材料可穿过具有0. 05到3. Omm筛网，优选0. 1到0. 5mm筛网的筛。自含木质纤维素的材料产生发酵产物在此方面，本发明涉及自含木质纤维素的材料产生发酵产物的方法。将含木质纤 维素的材料转化为发酵产物，如乙醇，具有大量原料(包括木材、农业残余物，草本作物，城 市固体废物等)现成可用的优势。含木质纤维素的材料主要由纤维素、半纤维素和木质素 组成，并常常称作“生物质”。
木质纤维素的结构使其无法直接的接受酶水解。因此，含木质纤维素的材料 必需经预处理，例如，通过在足够的压力和温度条件下的酸水解，这是为了打破木质 素的密封(seal)并破坏纤维素的晶体结构。这导致半纤维素和纤维素组分的溶解 (solubilization)。所述纤维素和半纤维素可随即用酶水解，例如通过纤维素分解酶，以将 碳水化合物聚合物转化为可发酵的糖类，其可经发酵成为所期望的发酵产物，例如乙醇。任 选地，所述发酵产物可通过，例如，蒸馏加以回收。在此方面，本发明涉及自含木质纤维素的材料产生发酵产物的方法，包括下述步 骤(a)预处理含木质纤维素的材料；(b)将该材料水解；(c)根据本发明的发酵方法用发酵生物进行发酵，即，在碳酸酐酶存在的情况下进 行。所述碳酸酐酶可在发酵之前和/或过程中添加。水解步骤(b)和发酵步骤(C)可 顺序或同时进行。在一个优选实施方案中，所述步骤以SHF或HHF方法步骤进行，所述步骤 将进一步在下面描述。SSF ,HHFfPSHF水解和发酵可作为同时水解和发酵步骤(SSF)进行。通常这意味组合的/同时水 解和发酵在对所述发酵生物为合适，优选最佳的条件(例如，温度和/或PH)下进行。水解和发酵也可作为杂合水解和发酵(HHF)进行。HHF通常以单独的部分水解步 骤开始，并以同时水解和发酵步骤结束。单独的部分水解步骤为酶法纤维素糖化步骤，通常 在对所述的水解酶为合适，优选最佳的条件(例如，在较高温度)下进行。后续的同时水解 和发酵步骤通常在对发酵生物合适的条件(常常在比所述单独水解步骤更低的温度)下进 行。水解和发酵也可作为单独的水解和发酵步骤进行，其中所述水解在起始发酵之前 已经完成。这常常称作“SHF”。预处理所述含木质纤维素的材料可根据本发明在被水解和/或发酵之前经预处理。在一 个优选实施方案中，将经预处理的材料在发酵之前和/或过程中水解，优选酶催化的。预处 理的目标为分离和/或释放纤维素、半纤维素和/或木质素，且该方法改善了酶水解的速率。根据本发明，预处理步骤(a)可为本领域技术人员已知的常规预处理步骤。预 处理可在含水浆料中进行。含木质纤维素的材料可在预处理期间以10-80wt%，优选 20-50wt%的量存在。化学、机械和/或生物预处理所述含木质纤维素的材料可根据本发明在水解和/或发酵前经化学、机械和/或 生物预处理。机械处理(常常称作物理预处理)可单独使用或和后续或同时的水解，特别 是酶水解组合使用，从而促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。优选的，所述化学、机械和/或生物预处理在水解和/或发酵之前进行。或者，所 述化学、机械和/或生物预处理可与水解，如与添加一种或多种纤维素分解酶，或下面提及
11的其它酶同时进行，以释放可发酵的糖类，例如葡萄糖和/或麦芽糖。在本发明的一个实施方案中，所述预处理的含木质纤维素的材料在水解步骤(b) 前经洗涤和/或解毒。这可能改善，例如，稀酸水解的含木质纤维素的材料，例如，玉米秸杆 (corn stover)的可发酵性。解毒可以任何合适的方式进行，例如，通过蒸汽气提、蒸发、离 子交换、树脂或木炭处理液体级分或洗涤所述经预处理的材料。化学预处理根据本发明“化学预处理”指促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/ 或释放的任何化学处理。合适的化学预处理步骤的实例包括用，例如稀酸、石灰、碱、 有机溶剂、氨、二氧化硫、二氧化碳进行处理。进一步，湿法氧化和控制PH的水热解 (hydrothermolysis)也是期望的化学预处理。优选的，所述化学预处理为酸处理，更优选，为连续的稀酸和/或弱酸(mild acid)处理，例如，用硫酸，或其它有机酸，如乙酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸或其混合物处理。 也可使用其它酸。弱酸处理在本发明的上下文中意为处理的PH在1-5，优选1-3的范围内。 在一个特定实施方案中，所述酸浓度在0. 1到2. 酸，优选硫酸的范围内。该酸可经混 合或与根据本发明方法待发酵的材料相接触，且混合物可保持在160-220°C，如165-195 范围内的温度，处理时间为数分钟到数秒，例如，1-60分钟，如2-30分钟或3-12分钟。可添 加强酸，如硫酸，来移除半纤维素。这增强了纤维素的可消化性。根据本发明也涵盖纤维素溶剂处理，显示其可将约90%的纤维素转化为葡萄糖。 也显示当木质纤维素结构被破坏时，极大增强了酶水解。碱、H2O2、臭氧、有机溶剂(使用水 性醇中的路易斯酸，FeCl3, (Al)2SO4)、甘油、二噁烷，苯酚或乙二醇属于已知破坏纤维素结 构并促进水解的溶剂(Mosier 等，2005，Bioresource Technology 96:673-686)。使用碱，例如NaOH，Na2CO3和/或氨等的碱性化学预处理也在本发明的范围 内。使用氨的预处理方法描述于 WO 2006/110891、WO 2006/110899、W02006/110900、WO 2006/110901，其通过提述并入本文。湿法氧化技术涉及使用氧化剂，例如，基于亚硫酸盐的氧化剂等。溶剂预处理的实 例包括用DMSO (二甲亚砜)等的处理。化学预处理通常进行1到60分钟，如5到30分钟， 但可依赖于待进行预处理的材料进行较短或较长的时间。其它合适的预处理方法的实例描述于Schell等，2003，Appl. Biochem andBiotechn. 105—108 :69_85 禾口 Mosier 等，2005，Bioresource Technology 96 :673_686， 以及美国
发明者刘继银, 吉勒莫·科沃德-凯利, 宋子良 申请人:诺维信公司