用于调控t细胞的方法和组合物的利记博彩app

专利名称：用于调控t细胞的方法和组合物的利记博彩app
技术领域：
一般而言，本发明涉及免疫相关疾病和其它病理状况的治疗领域。更具体的说，本 发明关注用于调控与已活化T细胞中的CRTAM表达有关的分子事件的方法和组合物。
背景技术：
T细胞与APC之间的协调相互作用是有效的TCR活化和它们的效应器功能形成 所需要的(Dustin 和 Cooper, 2000 ；Friedl 等，2005 ；Huppa 和 Davis, 2003 ；Krummel 和 Macara, 2006 ；Vicente—Manzanares 禾口 Sanchez—Madrid，2004)。表面共同受体(包括 CD2、 CD4、CD8和CD28)在T细胞APC接触区协调初始信号传导平台以诱导细胞因子生成和效应 器功能所需要的膜动力学、细胞极性和细胞形状变化。许多TCR激活的基因控制后续细胞 命运和全集决策(Cantrell，1996)。转录因子(诸如 Tbx21/T_bet、Gata3、Rorc ( y t)、和 Foxp3)的上调调节分别变成Th1、Th2、Th17和Treg细胞的T细胞子集分化(Lee等，2006 ； Tato等，2006)。细胞表面蛋白(诸如CD25)的上调赋予IL2响应性并使得细胞能够进行细 胞因子介导的细胞分裂(Ma等，2006)。相反，CTLA4的上调调控T细胞应答并促进TCR全 集的成型(Teft等，2006)。因此，TCR活化后受到调节的分子表达可在决定T细胞应答中 发挥重要作用。CRTAM(—种含有V和C1样Ig结构域的I型跨膜蛋白质)(Du Pasquier, 2004) 是一种细胞毒性或调节性T细胞相关分子，被鉴定为在结构上与免疫球蛋白超家族有关 且在某些T细胞上表达的细胞表面标志物蛋白质(Kennedy等；美国专利No. 5，686，257 ； 和TO2006/098887)。已经报告了在已活化CD8+T细胞、NK和NKT细胞中瞬时检测到人 CRTAM转录物，而且CRTAM与其配体Necl2(也叫作CADM1)之间的相互作用可能在抗肿 瘤免疫应答中发挥作用(Fuchs和Colonna，2006 ;Kennedy等，2000)。已经披露了小鼠 Crtam是双阴性(DN)胸腺细胞中一种激活诱导的基因(Kennedy等，2000)。由Abbas等 (Geneslmmun(2005)，6 :319_331 ；US2007/0184444 ；US2007/0185017 ；US2006/0263774)进 行的微阵列分析指示CRTAM是在人CD4+和CD8+T细胞上上调的候选基因，尽管T细胞活化 期间CRTAM表达的精确的T细胞亚群、性质、程度、和生理学意义尚不清楚。Crtam的细胞 质C00H-末端序列含有高度保守的I类PSD-95/盘-大/Z0-1 (PDZ)-域蛋白质相互作用基 序，其促进涉及多种信号传导途径(包括细胞粘附、极性和增殖)的大型蛋白质复合物的装 配。在T细胞中，含PDZ的蛋白质的网络(包括Scrib和Dlgl)在T细胞尾足形成、迁移中 发挥关键作用，且促进T细胞APC偶联物形成(Ludford-Menting等，2005)。已经证明了 Scrib和Dlgl在TCR参与后受到动态调节，并影响NFAT和细胞因子转录活化(Round等， 2007 ；Round等，2005 ；Xavier等，2004)。Scrib充当支架来装配在上皮和神经元细胞中调 节细胞极性的信号传导复合物(Humbert等，2006)。果蝇中scribble (scrib)的突变或上皮细胞中Scrib的敲除导致极性丧失、G1至S期的细胞周期延长和细胞增殖加快(Bilder 等，2000 ；Nagasaka等，2006)。然而，不清楚CRTAM在已活化T细胞失调构成众多病理学病 症原因的该已活化T细胞(诸如CD4+细胞)中发挥什么作用(如果有的话)。因为T细胞 在正常生理学背景中发挥关键作用，所以对T细胞活性的治疗性调控会受益于对T细胞病 理性子集的精细靶向，同时放过正常免疫功能所需要的旁观T细胞。已经完全确立了 T细胞是免疫系统的重要参与者，而且T细胞在其各种阶段和形 式中的精致平衡的不当扰动可导致严重的病理学疾患，包括其中有不受检查的和/或升高 的免疫应答的自身免疫性疾病，或其中有不足的免疫防御的持续感染和癌症。因此，已经使 用多种治疗剂来治疗此类疾患。但是，临床经验证明了这些药剂达不到理想的功效和安全 性特征，而且常常与短期和长期不良副作用有关。例如，显然不是所有的药剂在所有患者中 都是有效的和/或安全的，因此需要开发靶向限制性地与根本病理学原因有关的新分子的 新型药剂，例如通过采取聚焦于靶向特定T细胞子集的更加细调的办法。这样的办法需要 鉴定只在如下的T细胞子集中存在的和/或只对如下的T细胞子集负责的靶物，该T细胞 子集被引发和/或在生理学上注定引起构成感兴趣疾病原因的效应。适合于治疗性靶向的分子包括那些在限制性T细胞亚群上表达的，它们标记和/ 或负责自宽的T细胞全集划分出涉及特定免疫相关病症的病因或病理的最小亚群。事实 上，理想的是，在限制性的T细胞标志物之外，此类分子还可以是与可以为了治疗性干预而 被靶向的细胞活性有关的。不幸的是，迄今为止，缺少关于此类分子的信息。信息的短缺妨 碍了开发会容许细调T细胞治疗性调节的治疗策略的努力。确实需要鉴定此类分子靶物和 途径，它们会成为上文所述新型治疗性干预的焦点。本文所述发明满足了这种需要并提供 了其它好处。通过述及完整收录本文中所引用的所有参考文献，包括专利申请和出版物。发明概述本发明(至少部分)基于如下发现，即Crtam在特定T细胞子集(特别是特定 CD4+T细胞子集)上上调，而且它与以Scrib为中心的信号传导复合物配合来控制先前未认 识的T细胞极性晚期和选择性调节某些细胞因子(包括IFN Y、IL22、和IL17)的生成。细胞蛋白质的空间组构在细胞极性的建立中发挥重要作用，而且是细胞分裂、分 化、细胞迁移和器官发生的本质特征。抗原呈递细胞(APC)对T细胞的活化导致免疫学突触 (immunological synapse, IS)的形成(即TCR接触区处信号传导支架的配合装配)、肌动 蛋白与微管的重新组构及细胞间接触后头几个小时里第二信使的生成。如本文所述，CRTAM 在⑶4+和⑶8+T细胞二者上上调，而且更具体的说和出乎意料的是，它在已活化T细胞的特 定子集中在T细胞活化独特(早)期之后上调，而且它与由Scrib极性蛋白锚定的信号传 导分子独特集合配合来在T细胞活化晚期期间调节细胞极性以影响适应性免疫应答的细 胞分裂、增殖和选择性细胞因子生成。本文中显示了 CRTAM表达来标记T细胞全集的特定 子集。CRTAM生物学功能在本文中显示出与在T细胞中在活化晚期期间实现某些活性有联 系，而且对CRTAM功能的干预在本文中展示出导致已活化T细胞活性的改变。如此，本文中 所公开的数据揭示了一种重要的分子靶物/途径，它专门与重要的已活化T细胞子集有关 且在干预时导致对与该已活化T细胞子集有关的关键活性的调控。本发明提供了对于调节 此类细胞的存在和/或活性有用的方法、组合物、试剂盒和制品，这通过调控CRTAM相关T细胞活性，例如通过对某些表达CRTAM的T细胞的存在和/或活性的选择性靶向和/或消 除(ablation)实现。一方面，本发明提供了在T细胞(例如已活化T细胞，诸如CD4+T细胞)中调控 CRTAM活性的CRTAM调控物。在一个实施方案中，所述CRTAM调控物调控与相关配体(例如 Necl2)结合CRTAM有关的CRTAM活性。在一个实施方案中，所述CRTAM调控物调控由CRTAM 与Scrib之间的复合物形成诱导的CRTAM活性。本发明的CRTAM调控物可调控CRTAM_Scrib 途径的一个或多个方面。例如，在一个实施方案中，本发明的CRTAM调控物调控一种或多种 与CRTAM和/或Scrib活性有关的细胞事件，包括例如免疫学突触的形成和/或维持、T细 胞极化、T细胞活化的维持、等。例如，在一个实施方案中，本发明的CRTAM调控物能够在已 活化T细胞(诸如CD4+T细胞)中拮抗和/或抑制CRTAM活性。在一个实施方案中，本发 明的CRTAM调控物能够在体外或在体内调控已极化的已活化T细胞(诸如CD4+T细胞)的 量。例如，在一个实施方案中，本发明的CRTAM调控物能够在已活化T细胞(诸如CD4+T细 胞)中拮抗和/或抑制CRTAM活性，使得已极化的T细胞的量减少。在一个实施方案中，本 发明的CRTAM调控物能够在已活化T细胞(诸如CD4+T细胞中增强CRTAM活性。如此，例 如，在一个实施方案中，本发明的CRTAM调控物能够在已活化T细胞(诸如CD4+T细胞)中 增强CRTAM活性，使得已极化的T细胞的量增多。可以以任何适合于临床使用的形式来提供本发明的CRTAM调控物。例如，可以以 核酸或多肽的形式来提供和/或施用本发明的调控物。因而，在一个实施方案中，所述核酸 编码能够调控CRTAM(例如通过调控CRTAM的表达)的抑制性/干扰性RNA(诸如siRNA) 或反义RNA。在一个实施方案中，所述核酸编码或包含能够调控CRTAM表达和/或活性的微 RNA(microRNA)序列。在一个实施方案中，本发明的调控物是能够在细胞中干扰微RNA使得 CRTAM表达和/或活性受到调控的分子。在一个实施方案中，本发明的CRTAM调控物包含编 码能够拮抗CRTAM活性的多肽的核酸。例如，所述多肽可以包含至少包含CRTAM —部分的 肽，其中所述肽能够与CRTAM的相互作用配偶(例如它的细胞外或细胞内结合配偶)相互 作用。在一个实施方案中，所述调控物多肽是包含与免疫球蛋白序列至少一部分(例如Ig Fc)融合的CRTAM至少一部分(例如CRTAM的细胞外结构域中能够与CRTAM配体诸如Necl2 结合的一部分)的融合多肽。在一个实施方案中，所述调控物多肽包含截短的CRTAM，其包 含Scrib结合序列。在一个实施方案中，所述调控物多肽是包含与免疫球蛋白序列至少一 部分(例如Ig Fc)融合的CRTAM结合配偶至少一部分(例如Necl2中能够与CRTAM结合 的一部分)的融合多肽。在一个实施方案中，所述调控物多肽是与Ig Fc融合的Necl2细 胞外结构域。在一个实施方案中，所述调控物多肽是抗体。在一个实施方案中，所述调控物 多肽是抗CRTAM抗体。在一个实施方案中，所述调控物多肽是抗Necl2抗体。在一个实施 方案中，本发明的调控物包含适体(aptamer)。因而，在一个实施方案中，本发明的CRTAM调控物包含在细胞(例如已活化⑶4+T 细胞)中存在时抑制该细胞中CRTAM活性(包括但不限于基因表达)的核酸。在一个实施 方案中，所述核酸包含反义寡核苷酸。在另一个实施方案中，所述核酸包含抑制性/干扰性 RNA。在一个实施方案中，所述抑制性/干扰性RNA是抑制性/干扰性小RNA (siRNA)。在 一个实施方案中，本发明的CRTAM调控物包含抗体。在一个实施方案中，抗CRTAM抗体可以 是单克隆抗体，包括其片段。在一个实施方案中，抗CRTAM抗体可以是多克隆抗体。在一个实施方案中，抗体是阻断性的或非阻断性的，其在每种情况中还可以是消减性的抗体。在一 个实施方案中，所述抗体是消减性的抗体。在一个实施方案中，抗体片段可以是例如Fab、 Fab'、F(ab' )2、scFv、(scFv)2、dAb、互补决定区(CDR)片段、线性抗体、单链抗体分子、微 型抗体、双抗体、和多特异性抗体(例如自抗体片段形成的多特异性抗体)。在一个实施方 案中，本发明的抗体具有改变的效应器功能，例如通过Fc序列突变、Fc糖基化改变(例如 未岩藻糖基化)。用于改变抗体效应器功能的方法是可变的和本领域公知的。在一个实施方案中，CRTAM抗体是消减性的抗体。在一个实施方案中，所述消减性 的抗体是包含毒素的抗体偶联物。在一个实施方案中，所述毒素是放射性同位素、酶、小分 子毒素、和/或细胞毒剂。在一个实施方案中，本发明的CRTAM调控物包含干扰CRTAM与其 细胞内结合配偶(例如Scrib)相互作用的分子。例如，此类分子可以包含核酸、肽、小分子、 或抗体，施用它，使得它进入靶T细胞以抑制该细胞中的CRTAM活性，即该分子被内化。在 一个实施方案中，肽或抗体是由导入(例如转染)靶T细胞中的核酸编码的。一方面，本发明提供了能够与CRTAM结合的结合剂。在一个实施方案中，此类结合 剂包含任何能够检测样品中存在的或与细胞或组织结合的CRTAM的分子。在一个实施方案 中，此类结合剂对于使感兴趣分子(例如治疗剂、毒素、等)靶向CRTAM+T细胞亚群是有用 的。在一个这样的实施方案中，CRTAM+T细胞亚群是⑶4+。在一个实施方案中，结合剂包含 本文所述CRTAM调控物中的一种或多种。一方面，本发明提供了一种鉴定CRTAM调控物(诸如对于调控已活化T细胞中的 CRTAM活性有用的分子)的方法，该方法包括使候选物质接触CRTAM(或其功能性变体，如 下文中所定义的)，并在存在和不存在所述候选物质的情况中测量一种或多种如本文所述 CRTAM相关活性的量，其中在存在和不存在所述候选物质时的所述CRTAM相关活性的量不 同指示所述候选物质是CRTAM调控物。CRTAM相关活性可以通过本领域已知的任何合适的 定性或定量测量方法来测定。CRTAM相关活性包括例如对例如⑶4+Thl、Thl7和/或⑶8+ 细胞中的细胞因子水平(诸如IFN Y、白介素IL22、和/或IL17)的调节。例如，活性的量可 以通过其活性受CRTAM调节的下游分子的活性量来指示。在另一个例子中，活性的量通过 细胞表型(例如T细胞极性)的检测和/或测量来指示。本发明的方法可用于鉴定CRTAM 拮抗剂或激动剂。例如，在一个实施方案中，CRTAM相关活性在存在候选物质的情况中较低。 在另一个实施方案中，CRTAM相关活性在存在候选物质的情况中较高。通过本发明方法鉴 定的调控物可具有在本发明方法中使用所需要的任何特征。例如，可选择能够调控T细胞 活化和/或维持此类活化的候选物。在另一个例子中，可选择能够调控特定细胞因子表达 (包括例如抑制IFN y、IL22、和/或IL17表达)的CRTAM拮抗剂调控物。一方面，本发明 的CRTAM调控物是如本文所述通过本发明的鉴定方法获得的。如本文所述，本发明的抗体可以处于任何适合于在本发明方法中使用的形 式。例如，本发明的抗体可以是人的、人源化的或嵌合的。在一个实施方案中，本发明的 抗体是称作 17B2. 7. 12. 9. 2. 2 (ATCC 保藏物 no. PTA-8463) ；32D6. 4. 1. 1. 1 (ATCC 保藏物 no. PTA-8461) ； 34G4. 6. 2. 1. 1. 3 (ATCC 保藏物 no. PTA-8460) ；6E2. 27. 8. 2. 1 (ATCC 保藏 物 no. PTA-8462)；或 20F4. 1. 1. 1. 2. 1 (ATCC 保藏物 no. PTA-8464)的抗体的人源化形式 或嵌合形式。在一个实施方案中，本发明的抗体是与称作17B2. 7. 12. 9. 2. 2 (ATCC保藏物 no. PTA-8463) ；32D6. 4. 1. 1. 1 (ATCC 保藏物 no. PTA-8461) ；34G4. 6. 2. 1. 1. 3 (ATCC 保藏物no. PTA-8460) ；6E2. 27. 8. 2. 1 (ATCC 保藏物 no. PTA-8462)；或 20F4. 1. 1. 1. 2. 1 (ATCC 保 藏物no. PTA-8464)的抗体结合CRTAM上相同表位的人源化抗体、嵌合抗体或人抗体。在 一个实施方案中，本发明的抗体是与称作17B2. 7. 12.9.2.2仏10保藏物11。.？1六-8463)； 32D6. 4. 1. 1. 1 (ATCC 保藏物 no. PTA-8461) ；34G4. 6. 2. 1. 1. 3 (ATCC 保藏物 no. PTA-8460)； 6E2. 27. 8. 2. 1 (ATCC 保藏物 no. PTA-8462)；或 20F4. 1. 1. 1. 2. 1 (ATCC 保藏物 no. PTA-8464) 的抗体竞争对CRTAM的结合的人源化抗体、嵌合抗体或人抗体(例如在CRTAM位于无细 胞环境中或者在细胞上(在体外或在体内)的情况中)。在一个实施方案中，本发明的 抗体包含称作 17B2. 7. 12. 9. 2. 2 (ATCC 保藏物 no. PTA-8463) ；32D6. 4. 1. 1. 1 (ATCC 保藏物 no. PTA-8461) ；34G4. 6. 2. 1. 1. 3 (ATCC 保藏物 no. PTA-8460) ；6E2. 27. 8. 2. 1 (ATCC 保藏物 no. PTA-8462)；或 20F4. 1. 1. 1. 2. 1 (ATCC 保藏物 no. PTA-8464)的抗体的一个、两个、三个、 四个、五个或所有高变区、高变环和/或互补决定区(CDR)序列。在一个实施方案中，本发 明的抗体包含称作 17B2. 7. 12. 9. 2. 2 (ATCC 保藏物 no. PTA-8463) ；32D6. 4. 1. 1. 1 (ATCC 保 藏物 no. PTA-8461) ；34G4. 6. 2. 1. 1. 3 (ATCC 保藏物 no. PTA-8460) ；6E2. 27. 8. 2. 1 (ATCC 保 藏物 no. PTA-8462)；或 20F4. 1. 1. 1. 2. 1 (ATCC 保藏物 no. PTA-8464)的抗体的一个或所有 (两个)可变域或其功能性部分。在一个实施方案中，本发明的抗体包含称作17B2的抗体 的轻链(SEQ ID N0:31)。在一个实施方案中，本发明的抗体包含称作17B2的抗体的轻链 可变区(SEQ IDN0 35)。在一个实施方案中，本发明的抗体包含称作17B2的抗体的轻链可 变区 CDR1(SEQ ID NO :37)、CDR2(SEQ ID NO :38)、或 CDR3 (SEQ ID NO 39)中至少一项。在 一个实施方案中，本发明的抗体包含称作17B2的抗体的轻链可变区⑶R1 (SEQ ID NO 37)、 CDR2 (SEQ ID NO :38)、和CDR3 (SEQID NO :39)。在一个实施方案中，本发明的抗体包含称作 17B2的抗体的重链(SEQ ID NO 32)。在一个实施方案中，本发明的抗体包含称作17B2的 抗体的重链可变区(SEQ ID N0:36)。在一个实施方案中，本发明的抗体包含称作17B2的 抗体的重链可变区 CDR1(SEQ ID NO :40)、CDR2(SEQ ID NO :41)、或CDR3 (SEQ ID NO :42)中 至少一项。在一个实施方案中，本发明的抗体包含称作17B2的抗体的重链可变区CDR1 (SEQ ID NO :40)、CDR2(SEQ ID NO :41)、和 CDR3 (SEQ ID NO :42)。在一个实施方案中，本发明的 抗体是称作 17B2 的抗体 7. 12. 9. 2. 2 (ATCC 保藏物 no. PTA-8463) ；32D6. 4. 1. 1. 1 (ATCC 保 藏物 no. PTA-8461) ；34G4. 6. 2. 1. 1. 3 (ATCC 保藏物 no. PTA-8460) ；6E2. 27. 8. 2. 1 (ATCC 保 藏物no. PTA-8462)；或20F4. 1. 1. 1. 2. 1 (ATCC保藏物no. PTA-8464)的亲和力成熟衍生物 的人源化形式、嵌合形式或人形式。一方面，本发明提供了用于预防或治疗疾病(例如自身免疫性疾病)的方法，包括 对受试者施用有效量的本发明CRTAM调控物。在一个实施方案中，所述受试者是哺乳动物 受试者，例如，人类受试者。在一个实施方案中，所述CRTAM调控物是CRTAM拮抗剂。在一个实施方案中，通过本发明的方法治疗和/或预防的疾病的特征为存在已活 化CD4+CRTAM+T细胞。在一个实施方案中，所述T细胞的进一步特征为细胞因子表达水平在 与CD4+CRTAM—T细胞中的表达相比时升高。在又一个实施方案中，所述T细胞的特征为细胞 因子分泌水平在与CD4+CRTAMT细胞中的细胞因子分泌水平相比时升高。在一个实施方案 中，所述细胞因子是IFN y、IL22、和/或IL17。在一个实施方案中，所述T细胞是自身反应 性的。在一个实施方案中，治疗或预防疾病的方法的特征为在施用本发明的CRTAM调控物后受试者中的细胞因子表达与不施用所述CRTAM调控物的受试者相比降低。在另一个实 施方案中，所述治疗或预防的进一步特征为在施用本发明的CRTAM调控物后受试者中的细 胞因子分泌水平与不施用所述CRTAM调控物的受试者相比降低。在一个实施方案中，所述 细胞因子是IFN Y、IL22、和/或IL17。在一个实施方案中，所述T细胞是自身反应性的。在另一方面，本发明提供了一种抑制T细胞增殖或T细胞效应器功能的方法。在 一个实施方案中，T细胞是已活化T细胞，诸如CD4+T细胞。在一个实施方案中，本发明提 供了一种抑制T细胞增殖或T细胞效应器功能的方法，包含使CRTAM调控物接触T细胞，其 中所述调控物抑制T细胞中的CRTAM活性，例如通过在所述T细胞中抑制配体结合CRTAM 来实现。在一个实施方案中，所述调控物包含如本文所述抗体，包括阻断性的或非阻断性的 抗体，其在每种情况中还可以是消减性的抗体。在一个实施方案中，所述抗体是消减性的抗 体。在一个实施方案中，所述抗体是抗体片段。在一个实施方案中，所述抗体是包含毒素的 抗体偶联物。在一个实施方案中，所述毒素包括放射性同位素、酶、小分子毒素、和/或具有 细胞毒活性的药剂。本发明提供了使用如本文所述能够调控CRTAM生物学活性的本发明CRTAM调控物 治疗或预防疾病的方法。在一个实施方案中，所述调控涉及一种或多种细胞事件，包括但不 限于下述一项或多项细胞增殖、周期和/或分裂；细胞粘附；T细胞效应器功能的形成；细 胞因子生成；某些分子自细胞内募集至膜，所述分子包括但不限于Scrib、PKC (、和Cdc42 中的一项或多项；T细胞前缘处含Cdc42的复合物的装配的细胞内协调；晚期细胞骨架改 造；和T细胞极性(polarity)。在一个实施方案中，CRTAM调控物的调控作用可影响某些 CRTAM+细胞类型，包括但不限于下述一项或多项⑶4+T细胞(例如Thl和Thl7细胞)、⑶8+T 细胞、NK细胞、和NKT细胞。在另一个实施方案中，CRTAM调控物的调控作用涉及对细胞因 子生成的影响，包括但不限于下述一项或多项IFNy、IL22、和/或IL17。在一个实施方案中，本发明的治疗或预防疾病的方法包括消减T细胞亚群，这与 对受试者施用如本文中所提供的CRTAM调控物有关。在一个实施方案中，所消减的T细胞 群体是CRTAM+⑶4+T细胞亚群，例如Thl和/或Thl7T细胞亚群。一方面，本发明提供了一种在受试者中检测或诊断疾病的方法，包括(a)使CRTAM 调控物(例如CRTAM结合剂)接触自所述受试者获得的第一细胞(例如T细胞)样品，(b) 比较所述样品与对照样品中CRTAM+细胞的量，其中所述第一样品中的量较高指示所述受试 者中存在所述疾病。在一个实施方案中，所述检测疾病的方法进一步包括下述步骤(c)自 所述受试者获得含有T细胞的第二样品；(d)使CRTAM调控物(例如CRTAM结合剂)接触 所述第二样品；并(e)比较所述第一和第二样品中CRTAif细胞的量，其中所述第二样品中 的量较高指示所述受试者中疾病(例如自身免疫性疾病)发作(flare-up)。在一个实施方案中，来自受试者的样品可含有T细胞，包括但不限于下述一种或 多种CRTAM+T细胞，诸如CD4+细胞(例如Thl或Th 17)，和/或CD8+细胞。在一个实施方 案中，通过本发明方法检测/诊断的免疫学病症是活动性自身免疫性疾病。在一个实施方 案中，所述活动性自身免疫性疾病的特征为存在已活化T细胞，其中所述T细胞是CRTAM+。 在一个实施方案中，所述T细胞是⑶4+和/或⑶8+。在一个实施方案中，所述⑶4+细胞 是Thl或Thl7。在一个实施方案中，所述已活化T细胞的进一步特征可以为细胞因子表达 水平与CRTAM—T细胞中的所述细胞因子表达相比升高，而在一个实施方案中，所述细胞的进一步特征为细胞因子分泌水平与CRTAM—T细胞中的所述细胞因子分泌水平相比升高。在一 个实施方案中，所述T细胞是⑶8+或⑶4+ (例如Thl或Thl7)。在一个实施方案中，所述已 活化T细胞是自身反应性的。这些自身反应性T细胞可以是已活化⑶4+T细胞或⑶8+T细 胞。在一个实施方案中，极化的T细胞的量(例如作为相对于其它细胞的比率)与无病参 照相比升高。在一个实施方案中，这些细胞与自身免疫性疾病的病因和/或病理有关。一方面，本发明提供了用于制备、分离、和/或纯化基本上纯的已活化T细胞群体 的方法。在一个实施方案中，所述群体包含特征为表达CRTAM的已活化⑶4+T细胞。在一个 实施方案中，所述T细胞展现出相对于不表达CRTAM的CD4+已活化T细胞而言水平升高的 细胞因子表达和/或分泌。在一个实施方案中，所述细胞因子是IFN y、IL22、和/或IL17。 在一个实施方案中，所述制备、分离、和/或纯化方法包括使已知或怀疑包含混合T细胞群 体的样品接触CRTAM结合剂(例如抗CRTAM抗体)，并自所述混合群体分出基本上不结合 CRTAM结合剂(例如CRTAM抗体)的任何细胞，由此受到所述CRTAM结合剂(例如CRTAM抗 体)结合的已活化CD4+T细胞群体得到分离。所述方法可进一步包括将结合的CRTAM结合 剂与结合至所述CRTAM结合剂的已活化CD4+细胞群体分开。一方面，本发明提供了一种组合物，其包含基本上纯的已活化T细胞群体。在一个 实施方案中，所述群体包含特征为表达CRTAM的已活化CD4+T细胞。在一个实施方案中，所 述T细胞展现出相对于不表达CRTAM的CD4+已活化T细胞而言水平升高的细胞因子表达 和/或分泌。在一个实施方案中，所述细胞因子是IFN Y、IL22、和/或IL17。另一方面，本发明提供了 CRTAM调控物在制备用于治疗疾病(例如自身免疫性疾 病)的药物中的用途。一方面，本发明提供了 CRTAM调控物，其用于治疗疾病，例如自身免疫性疾病。一 方面，本发明提供了用于治疗各种与T细胞活化和/或功能失调有关的病症的方法。例如， 一方面，本发明提供了一种治疗与异常T细胞活化和/或功能有关的病症的方法，所述方法 包括对受试者施用有效量的本发明CRTAM调控物，由此治疗所述病症。在一个实施方案中， 所述调控物降低T细胞活化。在一个实施方案中，所述调控物降低T细胞活性，其在一个实 施方案中是自身反应性活性。在一个实施方案中，所述调控物抑制与T细胞活化失调有关 的炎症。一方面，本发明提供了一种通过增强T细胞活性(特别是CD4+T细胞活性)治疗 病症的方法，所述方法包括对患有病症的受试者施用有效量的增强CRTAM活性的CRTAM调 控物，由此所述病症得到治疗。在一个实施方案中，所述CRTAM调控物包括激动性分子，例 如激动性抗体或包含CRTAM结合配体的融合多肽(例如Necl2的CRTAM结合域的至少一部 分融合至免疫球蛋白序列诸如免疫球蛋白Fc)。本发明的此类方法对于治疗会受益于增强 已活化CD4+T细胞活性的病症(例如癌症、免疫缺陷、和感染)是有用的。在其中本发明的CRTAM调控物与另一治疗剂联合施用的本发明方法中，施用 CRTAM调控物的时机相对于施用所述另一治疗剂的时机会是凭经验和/或在临床上认为在 治疗上有益的任何时机。例如，在一个实施方案中，在施用所述另一治疗剂之前施用CRTAM 调控物。在一个实施方案中，在施用所述另一治疗剂之后施用CRTAM调控物。在另一个实 施方案中，在施用所述另一治疗剂的同时施用CRTAM调控物。在一个实施方案中，所述另一 治疗剂具有抗炎活性。在一个实施方案中，所述另一治疗剂具有免疫遏制活性。在一个实施方案中，所述另一治疗剂具有细胞毒活性。在一个实施方案中，所述另一治疗剂具有抗感 染活性。在一个实施方案中，作为分开的组合物施用所述两药剂。在一个实施方案中，作为 单一组合物施用所述两药剂。在临床上适宜或想要的情况中，本发明的方法可进一步包括别的治疗步骤。例如， 在一个实施方案中，一种方法进一步包括其中将靶细胞和/或组织暴露于其它标准护理治 疗方案(例如类固醇、或其它多肽或小分子抗炎药)的步骤。如上所述，本发明的CRTAM调控物和方法在治疗怀疑或已知与T细胞活性的不当 调节有关的各种病症中是有用的。例如，这些病症包括但不限于那些属于免疫学(诸如自 身免疫)、癌症或感染相关病症范畴的。在一个实施方案中，所述病症与组织炎症(急性的 或慢性的)有关，例如自身免疫性病症。还应当注意，有些疾病可具有在两个或更多个病症 范畴间交叠的特征。在一个实施方案中，自身免疫性疾病可以是例如类风湿性关节炎(RA)；多发性硬 化(MS)；系统性红斑狼疮(SLE)；狼疮肾炎；皮肤红斑狼疮(CLE)；自身免疫性肝炎；幼年型 类风湿性关节炎；传染性肝炎；原发性胆汁性肝硬化；银屑病；皮炎；特应性皮炎；系统性 硬皮病；系统性硬化病；克罗恩氏病，溃疡性结肠炎；呼吸窘迫综合征；成人呼吸窘迫综合 征；ARDS ；脑脊膜炎；脑炎；葡萄膜炎；肾小球肾炎；天疱疮；巨噬细胞活化综合征；湿疹；哮 喘；动脉粥样硬化；白细胞粘附缺陷；糖尿病；I型糖尿病；胰岛素依赖性糖尿病；变应性鼻 炎；与器官移植有关的自身免疫性反应；雷诺氏综合征；自身免疫性甲状腺炎；桥本氏甲状 腺炎；变应性脑脊髓炎；斯耶格伦氏综合征；幼发型糖尿病；与由细胞因子和T-淋巴细胞 介导的急性和迟发性超敏反应有关的免疫应答；结核病，结节病，多肌炎，肉芽肿病；血管 炎；恶性贫血(阿狄森氏病)；牵涉白细胞渗出的疾病冲枢神经系统(CNS)炎性病症；多器 官损伤综合征；溶血性贫血；冷球蛋白血症；库姆斯阳性贫血；重症肌无力；抗原_抗体复 合物介导的疾病；抗肾小球基底膜病；抗磷脂综合征；变应性神经炎；格雷夫斯氏病；朗伊 二氏肌无力综合征；大疱性类天疱疮；天疱疮；自身免疫性多内分泌病；莱特氏病；僵人综 合征；贝切特病；巨细胞动脉炎；免疫复合物肾炎；IgA肾病；IgM多神经病；免疫性血小板 减少性紫癜(ITP)和自身免疫性血小板减少症。在一个实施方案中，更具体地，自身免疫性疾病可以是类风湿性关节炎(RA)，多发 性硬化(MS)，系统性红斑狼疮(SLE)，皮肤红斑狼疮(CLE)，银屑病，克罗恩氏病，溃疡性结 肠炎，葡萄膜炎，特应性皮炎，哮喘，与器官移植有关的自身免疫性反应，自身免疫性肝炎， 幼年型类风湿性关节炎，传染性肝炎，肾小球肾炎，原发性胆汁性肝硬化，血管炎，天疱疫， 巨噬细胞活化综合征，变应性鼻炎，1型糖尿病，和2型糖尿病。一方面，本发明提供了包含一种或多种本发明CRTAM调控物和载体的组合物。在 一个实施方案中，所述载体是药学可接受的。一方面，本发明提供了编码本发明CRTAM调控物的核酸。在一个实施方案中，本发 明的核酸编码CRTAM调控物，其是或包含多肽(例如寡肽)。在一个实施方案中，本发明的核 酸编码CRTAM调控物，其是或包含抗体或其片段。在一个实施方案中，本发明的核酸编码抑 制CRTAM表达/活性(例如CRTAM基因转录或CRTAM蛋白翻译)的核酸序列，例如siRNA、 反义寡核苷酸、等。一方面，本发明提供了包含本发明核酸的载体。
一方面，本发明提供了包含本发明核酸或载体的宿主细胞。载体可以是任何类型 的，例如重组载体，诸如表达载体。可使用多种宿主细胞之任一种。在一个实施方案中，宿 主细胞是原核细胞，例如大肠杆菌。在一个实施方案中，宿主是真核细胞，例如哺乳动物细 胞，诸如中国仓鼠卵巢(CH0)细胞。在一个实施方案中，宿主细胞被遗传工程改造以生成具 有改变的效应器功能的抗体，例如在由细胞生成的抗体包含与想要的效应器功能改变有关 的糖基化序型的情况中(例如如在未岩藻糖基化抗体中观察到的)。在一个实施方案中，本 发明的核酸或载体在已活化T细胞中表达。一方面，本发明提供了用于本发明CRTAM调控物的方法。例如，本发明提供了一种 制备是抗体(或其片段)的CRTAM调控物或包含抗体(或其片段)的CRTAM调控物的方法， 所述方法包括在合适的宿主细胞中表达编码所述抗体(或其片段)的本发明重组载体，并 回收所述抗体(或其片段)。在另一个例子中，本发明提供了一种制备是多肽(诸如寡肽) 的CRTAM调控物或包含多肽(诸如寡肽)的CRTAM调控物的方法，所述方法包括在合适的 宿主细胞中表达编码所述多肽(诸如寡肽)的本发明重组载体，并回收所述多肽(诸如寡 肽)。一方面，本发明提供了一种制品，其包含容器；和装在该容器内的组合物，其中所 述组合物包含一种或多种本发明的CRTAM调控物。在一个实施方案中，所述组合物包含本 发明的核酸。在一个实施方案中，包含CRTAM调控物的组合物进一步包含载体，其在有些实 施方案中是药学可接受的。在一个实施方案中，本发明的制品进一步包含关于施用所述组 合物(例如CRTAM调控物)来治疗本文所述病症的指令(说明)。—方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含第一容器，其中装有包含一种或多种本 发明CRTAM调控物的组合物；和第二容器，其中装有缓冲液。在一个实施方案中，所述缓冲 液是药学可接受的。在一个实施方案中，包含CRTAM调控物的组合物进一步包含载体，其在 有些实施方案中是药学可接受的。在一个实施方案中，所述试剂盒进一步包含关于施用所 述组合物(例如CRTAM调控物)来治疗本文所述病症的指令(说明)。附图简述

图1。Crtam在TCR活化后在生成更多IFNy、IL22和IL17的CD4+T细胞亚群 上表达。(A)用抗⑶3(10 iig/ml)和抗CD28(2iig/ml)mAb活化后脾CD4+CD62L+T细胞的 Crtam表达的流式细胞术分析。(B)用抗CD3 (2 u g/ml)和抗CD28 (2 u g/ml)mAb活化来自 C57BL/6小鼠的脾幼稚⑶4+ (⑶4+⑶62L+) T细胞。14小时后，通过FACS分选来纯化Crtam+* CrtanTT细胞。让分选出的Crtam+和CrtanTT细胞静息3天，并以5X 105细胞/ml的浓度用 抗⑶3/28mAb用再刺激。然后通过流式细胞术检查再刺激的T细胞上的Crtam表达。(C) 将脾幼稚⑶4+T细胞用抗⑶3/28mAb活化14小时。自分选出的Crtam+和CrtanTT细胞提 取mRNA，并进行定量TaqMan分析(上部小图)。如(b)中所述让分选出的细胞静息并再刺 激，在48小时时收获上清液并通过ELISA来分析(下部小图)。(D，F，G)如所描述的那样 在Th分化条件下用抗⑶3/28mAb刺激来自C57BL/6小鼠的脾幼稚⑶4+ (⑶4+⑶62L+) T细胞。 TCR活化后14小时，通过FACS分选来纯化Crtam+和CrtanTT细胞。让分选出的Crtam+和 CrtanTT细胞静息3天，并以5X105细胞/ml的浓度用抗⑶3 (10 y g/ml)和抗⑶28(2 yg/ ml)mAb再刺激。在48小时时自再刺激的T细胞收获上清液并通过ELISA来分析。(E)在 Th1条件下活化⑶4+T细胞。14小时后，通过FACS分选来纯化CrtanT和Crtam+⑶4+T细胞，此后在TH1条件性培养基中培养4天。然后在存在GolgiPlug(BD Pharmingen)的情况中将 已分化的T细胞用PMA和伊屋诺霉素(ionomycin)再刺激4小时。然后为了细胞内IFN Y 的免疫荧光染色，使用BD Cytofix/Cytoperm Plus试剂盒固定和透化细胞。所示FACS分 析代表五个(A和B)和三个(E)独立实验。所示ELISA数据代表五个独立实验，其中细胞 是自30只小鼠纯化的。误差条指示标准偏差(SD)。统计学分析是使用Durmett氏方法带 对照实施的。图2。Crtam+CD4+和⑶8+T细胞在细胞因子生成中有缺陷。(A和B)通过流式细 胞术(A)禾P Western印迹分析⑶来分析活化了 12小时的Crtam+A和Crtam+T细胞的 Crtam表达。(C和D)自Crtam+A和Crtam+小鼠纯化幼稚CD4+T细胞，并在TH0或TH1条 件下活化。6天后，清洗T细胞，再活化并在普通培养基中再培养三天。在第10天，将已 分化T细胞用PMA/伊屋诺霉素刺激4小时供TaqMan分析用(C)和用PMA/伊屋诺霉素加 GolgiPlug刺激供IFNy细胞内染色用(D)。所示数据代表两个独立实验。(E)活化幼稚 Crtam+/+和Crtam+CD4+T细胞，并在TH分化培养基中培养。六天后，清洗细胞，计数并在普 通培养基中以5 X 105细胞/ml的浓度用抗⑶3 (10 u g/ml)和抗⑶28 (2 u g/ml)mAb再刺激。 刺激后48小时收集上清液，并通过ELISA来分析。(F)纯化幼稚(⑶8+⑶62L+)和效应/记忆 (CD8+CD62L-)CD8+T 细胞，并以 1X106 细胞/ml 的浓度用抗 CD3 (10 y g/ml)和抗 CD28 (2 y g/ ml) mAb刺激幼稚T细胞，而以5X105细胞/ml的浓度用抗CD3 (5 u g/ml)和抗CD28 (2 u g/ ml)mAb刺激效应/记忆T细胞。活化后40小时通过ELISA来分析细胞因子生成。(E)和 (F)中所示数据代表三个独立实验，其中细胞是自Crtamv+(n = 3)和Crtam^fc = 3)小 鼠独立纯化和刺激的。(G)通过Speedy同基因策略将Crtam+小鼠回交至C57/BL-6遗传 背景。给来自N4代的10-13周龄小鼠(Crtam+/+, n = 5 ；Crtam+，n = 6) 口服接种200 u 1 PBS中的2X109CFU的鼠柠檬酸杆菌(C. rodentium)。感染后7和14天在MacConkey琼脂 上测定远端结肠和脾中可存活细菌的数目。在此图中，误差条指示标准偏差(SD)。统计学 分析是使用Durmett氏方法带对照实施的。图3。Crtam+幼稚T细胞响应APC-肽刺激而发生的过度增殖。(A)用经照射的 加载了 0VA肽的APC活化来自Crtam."(空心柱)和Crtam+(实心柱)小鼠的幼稚0T-II TCR+CD4+T细胞，并通过[3H]_胸苷掺入来评估细胞增殖。(B)通过羧基荧光素双乙酸酯琥珀 酰亚氨基酯(CFSE)标记的0T-II TCR+⑶4+T细胞(5 y M OVA肽)的流式细胞术分析来监测 细胞分裂。在每幅柱形图上方呈现了每次分裂内的％细胞。(C)用经照射的加载了 0VA肽 的APC活化来自Crtamv+和Crtam+小鼠的幼稚0T_I TCR+CD8+T细胞，并通过[3H]-胸苷掺 入来评估细胞分裂。(D)刺激(10 y M 0VA肽)后3天检查CFSE标记的0T_I TCR+CD8+T细 胞的稀释。A-D中所示数据代表三个独立实验。(E)OT-II TCR+Crtam+CD4+T细胞的增强的 体内表达。将CFSE标记的、来自Crtam+/+和Crtam+小鼠的0T-II TCR+CD4+T细胞(8X106 细胞/小鼠)转移入B6129SF2/J小鼠，并在T细胞转移后12小时通过脚垫注射用20 y g OVA蛋白质攻击。抗原攻击后三天对受体小鼠的引流淋巴结分析细胞周期。此数据代表四 个独立实验。(F)对Crtamv+(空心柱)和Crtam+(实心柱)小鼠(6周龄，n = 16 ;10月 龄，n = 10)定量来自颈淋巴结(LN)、脾和血液的总⑶4+和⑶8+T细胞及B220+B细胞。误 差条指示标准偏差(SD)。统计学分析是使用Durmett氏方法带对照实施的。图4。已活化Crtam+CD4+T细胞中对晚期T细胞极性的破坏。a_c，(A-C)将幼稚Crtamv+(上部小图)或Crtam+(下部小图)CD4+T细胞(或是未刺激的或是用抗 CD3 (10 u g/ml)和 CD28 (2 u g/ml)mAb 刺激 14 小时的)对 Crtam 和 Talin (A)、CD3 e (B)、 Crtam和CD44(C)染色，并通过解卷积显微术来分析。(D)使用解卷积显微术(DeltaVision) 通过细胞计数(n > 200)对Talin、CD44、和CD3极化的定量。(E)使用Imaris 5. 5自> 35 幅2D平板3D重建14小时抗CD3/28活化T细胞的Crtam、Talin、和CD44染色。(F)将幼 稚OT-II TCR+Crtam+/+或Crtam+⑶4+T细胞(或是未刺激的或是用经OVA肽脉冲的DC刺激 14小时的)对Talin、⑶44和⑶3染色，并通过解卷积显微术来分析。(G)对已活化0T-II TCR+Crtam+/+ 和 Crtam+CDfT 细胞(n > 200)中 Talin、CD44、和 CD3 极化(polarization) 的定量。(H)对初始T细胞接触形成的分析。将CMRA标记的且经OVA肽脉冲的DC与0T-II TCR+Crtam+/+和Crtam+⑶4+T细胞一起温育30分钟，并对F-肌动蛋白染色(鬼笔毒环肽)。 ⑴如(H)中所述活化细胞，并通过流式细胞术来分析Crtamv+或Crtam+OT-II TCR+⑶4+T 细胞与经0VA肽脉冲的DC形成细胞偶联物的能力。所示数据代表四个独立实验。误差条 指示标准偏差(SD)。图5。Crtam经由PDZ蛋白质网络控制细胞极性、增殖、和细胞因子生成。(A)将来 自Crtamv+和Crtam+小鼠的幼稚⑶4+T细胞活化所示时间，并用针对Scrib (上部小图) 或Dlgl (下部小图)的Ab免疫沉淀细胞提取物。然后通过针对Crtam的免疫印迹来分析 免疫复合物。所示数据代表五个独立实验。(B-D)将幼稚⑶4+T细胞用抗⑶3(10i!g/ml) 和抗CD28(2ii g/ml)mAb活化14小时。然后将已活化细胞对Crtam、Scrib、Cdc42或PKC € 染色，并通过解卷积显微术来分析。图像代表每项染色> 300个细胞。(E)将幼稚0T-II TCR+CD4+T细胞与经0VA肽脉冲的DC —起温育，在规定时间点固定，粘附到8孔腔式载玻片 上，并用每幅小图上方所示特异性抗体染色。图像代表每个时间点每项染色> 50个细胞。图6。Crtam与Scrib的相互作用是控制细胞极性、增殖和细胞因子生成所必需 的。(A) Crtam和Crtam突变体的结构示意图。(B和C) Crtam+CD4+T细胞中逆转录病毒重 建的Crtam、(汁3111(八1^)、或(汁3111(八￡51乂)的细胞增殖和细胞因子生成。用GFP重建 的Crtamv+和Crtam+CD4+T细胞充当对照。数据代表五个独立实验。(D)TCR再刺激后14 小时检查 Crtam、Crtam( A ICD)、或 Crtam( A ESIV)重建的 Crtam+CDAT 细胞的极性。(E 和F)用GFP对照、Crtam、或Crtam (A ESIV)经逆转录病毒转导自C57BL/6小鼠FACS分选 出的Crtam+和Crtam_CD4T细胞。让所有经转染细胞静息3天，并以2X105细胞/ml用抗 CD3 (10 u g/ml)和抗CD28 (2 u g/ml)mAb再刺激。TCR重建后48小时通过ELISA来分析细 胞因子生成(E)。ELISA数据代表四个独立实验。误差条指示标准偏差(SD)，而统计学分析 是使用Durmett氏方法带对照实施的。用抗⑶3/28mAb再刺激后14小时分析Crtam+⑶4+T 细胞(小图1)或经逆转录病毒重建的Crtam_CD4+T细胞(小图2_4)中的Talin极性(F)。 图像代表每项染色检查的> 100个细胞。图7。Crtam功能是经由Scrib来传送的。(A和B)通过FACS分选自活化了 14小 时的T细胞纯化来自C57/BL6小鼠的Crtam+⑶4T细胞。将分选出的Crtam+CD4T细胞扩增 4天，并通过Amaxa Nucleofector用对照或Scrib siRNA (QIAGEN)电穿孔。转染后12小 时，通过Western印迹来分析Scrib表达(A)。(A)中的箭头指示内源Scrib。将T细胞用 抗CD3和CD28mAb再刺激8小时，并对Talin染色(B)。(C)再刺激后48小时通过ELISA 分析经对照或Scrib siRNA转染的细胞的细胞因子生成。所示数据代表两个独立实验。(D和E)纯化幼稚Crtam+⑶4+T细胞，并用板结合的抗⑶3和抗⑶28mAb活化。刺激后四天， 使用 Amaxa Nucleofector 用 pIRES-GFP 或 pIRES_Crtam( A ICD) :Scrib 电穿孔 T 细胞。通 过Western印迹分析(D)和流式细胞术(E)来验证Crtam( A ICD) :Scrib表达。箭头指示 Crtam(AI⑶)Scrib嵌合物及其各种差异糖基化形式。⑶中的箭头指示内源Scrib。(F) 转染后12小时，将T细胞用抗CD3和CD28mAb再刺激8小时，并为了染色而固定细胞。(G) TCR刺激后48小时收集细胞培养物的上清液，供ELISA分析用。所示数据代表三个独立实 验。图8。Crtam在TCR活化后在T细胞上表达。用抗CD3 (10 y g/ml)和抗CD28(2iig/ ml)mAb活化后脾⑶8+CD62L+T细胞的Crtam表达的流式细胞术分析。数据表达三个独立实验。图9。Crtam+小鼠的生成。(A)基因打靶策略。描绘了 Crtam外显子1周围的 基因组结构(顶部)、寻靶载体(中部)和靶定等位基因(底部)。通过同源重组用新霉 素抗性基因替换Crtam的外显子1。箭头指示用于PCR基因分型的引物。以灰色条显示了 用于Southern印迹的探针的位置。(B)使用PCR扩增(左边)和Southern印迹分析(右 边)对靶定等位基因的基因分型(+/+ :328bp和-/" :191bp)。5’探针与+/+小鼠的10. 5kB 和-/"小鼠的7. 6kB EcoRI片段杂交。3，探针与+/+小鼠的10. 5kB和-/-小鼠的2. 8kB EcoRI片段杂交。(C) Crtam+小鼠中缺失Crtam mRNA表达。自Crtam+/+和Crtam+小鼠提 取脾的总RNA，逆转录成cDNA并用对Crtam(外显子4_8)或肌动蛋白特异性的引物扩增。图10。Crtam+小鼠中的正常T细胞发育。(A)对来自Crtamv+ (空心柱)和 Crtam+(实心柱)小鼠(6周龄，n = 16)的各种胸腺细胞子集定量，CD4_CD8_(DN)，CD4+， CD8+，和 CD4+CD8+(DP)。(B)对来自 0T-II TCR+Crtam+/+(空心柱)和 Crtam+(实心柱) 小鼠(6周龄，n = 10)的各种胸腺细胞子集定量。(C和D)对来自Crtamv+(空心柱)和 Crtam+(实心柱)小鼠(6周龄，n = 16)脾和血液的总CD4+和CD8+T细胞、B220+B细胞、 CD4+幼稚(CD62Lhi)、CD4+效应(aMfiQMSRBhiCDeZL1。)、CD4+记忆(aMfiaMSRB^CDeZL1。)、 ⑶8+幼稚(⑶62Lhi)、和⑶8+效应(⑶43-1811*^0621；°)T细胞定量。在顶部显示了代表性 流式细胞术分析。误差条指示标准偏差(SD)。T =总细胞；N =幼稚细胞；E =效应细胞；M =记忆细胞。图11。Crtam+⑶4+T细胞响应TCR刺激而发生的降低的IFNy分泌。纯化幼稚 野生型和Crtam+⑶4T细胞，并在TH1分化培养基中用板结合的抗⑶3 (1_10 y g/ml)和抗 CD28(2iig/ml)mAb刺激。六天后，清洗细胞，计数并在普通培养基中以5X 105细胞/ml的 浓度用抗CD3 (1-10 u g/ml)和抗CD28 (2 u g/ml)mAb再刺激。刺激后48小时收集上清液， 并通过ELISA来分析。此实验代表两个独立实验。误差条指示标准偏差(SD)。统计学分析 是使用Durmett氏方法带对照实施的。图12。IL23处理时的IL22降低。活化幼稚Crtam+/+和Crtam+OM+T细胞，并在 含有重组小鼠 IL23(10ng/ml, eBioscience)、抗 IFN y mAb (5 ii g/ml，BDPharmingen)禾口抗 IL4mAb(5ug/ml,BD Pharmingen)的TH17分化培养基中培养。六天后，清洗细胞，计数并在 普通培养基中再刺激。刺激后48小时收集上清液，并通过ELISA来分析。所示数据代表三 个独立实验，其中细胞是自Crtamv+(n = 3)和Crtam+(n = 3)小鼠独立纯化和刺激的。误 差条指示标准偏差(SD)。统计学分析是使用Durmett氏方法带对照实施的。
图13。TCR活化后Crtam+幼稚⑶4+T细胞的过度增殖。(A)用板结合的抗⑶3/ CD28mAb活化来自Crtamv+ (黑色)和Crtam+ (灰色)小鼠的幼稚CD4+T细胞。通过[3H]-胸 苷掺入来分析细胞增殖。(B)活化后3天通过流式细胞术用CFSE标记的CD4+T细胞监测细 胞分裂。(C和D)用来自Crtam+A(黑色)和Crtam+(灰色)小鼠的幼稚CD8+T细胞实施 相同的实验。此处所示数据代表四个独立实验。(E)用板结合的抗CD3和抗CD28mAb活化 来自C57BL/6小鼠的幼稚⑶4+T细胞。通过FACS分选来纯化Crtamhi和Crtam_CD4T细胞。 四天后，用板结合的mAb再刺激细胞，并通过[3H]_胸苷掺入来分析细胞增殖。此处所示数 据代表两个独立实验。此图中的误差条指示标准偏差(SD)。统计学分析是使用Durmett氏 方法带对照实施的。(F)用板结合的抗⑶3和抗⑶28mAb刺激自C57BL/6 (⑶45. 2+)和同基 因B6. SJL(CD45. 1+)小鼠纯化的CD62L+CD4+幼稚脾T细胞。14小时后，通过限制的FACS分 选自C57BL/6 (CD45. 2+)小鼠纯化CrtamhiCD4T细胞和自同基因B6. SJL (CD45. 1+)小鼠纯化 CrtamXD4T 细胞。静息 4 天后，用 CFSE 标记 CrtamhiCD45. 2+ 和 CrtanTCD45. 1+T 细胞，并作 为单一或混合群体用板结合的mAb再刺激另外三天。将细胞对⑶45. 2染色，并通过FACS 分析来检查CFSE稀释。此处所示数据代表两个独立实验。(G)在TH1条件性培养基中用板 结合的抗CD3和抗CD28mAb刺激自C57BL/6 (CD45. 2+)和同基因B6. SJL (CD45. 1+)小鼠纯 化的CD62L+CD4+幼稚脾T细胞。14小时后，通过限制的FACS分选自C57BL/6 (CD45. 2+)小 鼠纯化Crtamhira4T细胞和自同基因B6. SJL(⑶45. 1+)小鼠纯化CrtamTD4T细胞。为了增 强细胞存活力，使用BD FACSVantage细胞分选仪以20psi套管压力(sheath pressure)和 2000例每秒分选细胞，并在所有时间保存于4°C。让分选出的细胞静息，并在Th1条件性培 养基中培养。72小时后，在存在GolgiPlug(BD Biosciences)的情况中将细胞用PMA加伊 屋诺霉素再刺激4小时。将刺激后的细胞用抗CD45.2mAb染色，并为细胞内IFNy染色而 透化。此处所示数据代表两个独立实验。图14。Crtam与Scrib PDZ3相互作用及逆转录病毒重建的Crtam+CDfT细 胞中相当的Crtam表面表达。(A)将p⑶NA4-Crtam_Flag转染入293细胞，并将细胞 提取物与 GST-Scrib-PDZl、GST-Scrib-PDZ2、GST-Scrib-PDZ3、GST-Scrib-PDZ4 或 GST-Erbb2ip(Erbin)-PDZl 一起温育。用抗GST (上部小图)或抗Crtam(下部小图)抗体 通过免疫印迹分析使用抗Flag M2-琼脂糖珠得到的免疫复合物。(B)用eGFP-IRES-Crtam、 eGFP-IRES-Crtam( A ICD)或 eGFP-IRES_Crtam( A ESIV)经逆转录病毒重建 Crtam+OM+T 细胞。通过流式细胞术检查Crtam、Crtam (A ICD)和eGFP-IRES_Crtam( A ESIV)的表面表 达。图15。Crtam的PDZ结合基序是控制细胞增殖所需要的。OT-II TCR+Crtam+CD4+T 细胞中逆转录病毒重建的Crtam、Crtam ( A ICD)、或Crtam ( A ESIV)响应OVA肽/APC刺激 而发生的细胞增殖。用GFP重建的0T-IITCR+Crtamv+和Crtam+CD4+T细胞充当对照。数 据代表五个独立实验。误差条指示标准偏差(SD)。统计学分析是使用Durmett氏方法带对 照实施的。图16。Crtam的胞内结构域控制T细胞极性和增殖，而且Cadml与Crtam的相互 作用能进一步增强CD4T细胞的细胞因子生成。(A)将幼稚CD4+T细胞(或是未刺激的或是 用抗⑶3和抗⑶28 (10 2mg/ml)mAb刺激14小时的)用抗Cadml家兔多克隆Ab (GNE)加 Talin或Crtam染色，并通过解卷积显微术来分析。(B) Crtam和Crtam( A EOT)突变体的结构。(C)纯化幼稚Crtam+CD4+T细胞，并用板结合的抗CD3和抗CD28mAb活化。刺激后四天， 用编码GFP或Flag-Crtam( A EOT)的逆转录病毒载体重建T细胞。TCR再刺激后8小时检 查GFP或Crtam ( A EOT)重建的Crtam+⑶4T细胞的极性。(D)通过[3H]-胸苷掺入来评估 Crtam或Flag-Crtam( A ECD)转染的Crtam+CDfT细胞的细胞增殖。用GFP转染的Crtam+/+ 和Crtam+⑶4+T细胞充当对照。(E)在TCR刺激后48小时通过ELISA来分析细胞因子。(F) 纯化幼稚Crtamv+和Crtam+CD4+T细胞，用板结合的mAb加板结合的Cadml (ECD) -Fc(lu g/ ml)或人IgGl (1 u g/ml)活化，并在48小时时测量细胞因子。N = 2个独立实验。图17。Crtam在TCR活化后在CD8+T细胞上快速上调，而且是最佳IFN y , TNF a 和IL22生成而非溶胞活性所需要的。(A)自Crtamv+和Crtam+小鼠纯化幼稚⑶8+T细胞， 用板结合的抗CD3/28mAb活化并在所示时间点通过流式细胞术来分析。所示数据代表两个 独立实验。(B)通过左脚垫注射用30 ill PBS中的20iig OVA蛋白质攻击OT-I TCR+小鼠。 对来自经免疫小鼠的左脚引流淋巴结和右脚对照淋巴结分析Crtam表达。数据代表每个 时间点的三只小鼠。(C)自Crtamv+和Crtam+小鼠纯化幼稚(CD8+CD62L+)和效应/记忆 (⑶8+CD62L—)⑶8+T细胞，并用板结合的抗⑶3/28mAb刺激。刺激后40小时通过ELISA来分 析细胞因子生成。数据代表五个独立实验。⑶将来自0T-ITCR+Crtam+和OT-I TCR+Crtam+/+ 小鼠的⑶8+T细胞用板结合的抗⑶3/28mAb活化5天。将⑶8+T细胞母细胞(T cell blast) 与经10 u M0VA257_264脉冲的靶细胞(EL4) —起温育4小时，并通过ELISpot来分析粒酶B生 成。图像代表两个独立实验，其中有一式三份的反应。右边显示了使用Leica M655手术显 微镜对粒酶B染色细胞的定量。(E)将来自OT-I TCR+Crtam+和0T-ITCR+Crtamv+小鼠的第 5天⑶8+T细胞母细胞在存在GolgiStop和抗⑶107mAb的情况中用经肽脉冲的EL4再活化 4小时，或者在普通培养基中活化16小时。通过流式细胞术来分析已活化CD8+T细胞表面上 4小时时的⑶107表达和16小时时的FasL表达。所示数据代表两个独立实验。统计学分 析是使用Dunnett氏方法带对照实施的。(F)将来自0T_I TCR+Crtam+和0T-ITCR+Crtamv+ 小鼠的第5天⑶8+T细胞母细胞用51Cr标记的、经10 u M0VA257_264脉冲的EL4细胞再活化。 温育后4小时实施51Cr释放测定法。数据代表两个独立实验，其中有一式三份的反应。图18。⑶8+T细胞中的Crtam表达在活化后上调。通过脚垫注射入左脚用30 u 1 PBS中的20iig OVA蛋白质攻击OT-I TCR+小鼠。对来自经免疫小鼠的左脚引流淋巴结和 右脚对照淋巴结分析CD69表达。数据代表每个时间点三只小鼠。图 19。Crtam 是最佳 IFN y , TNF a 禾口 IL22 生成所需要的。自 0T-I TCR+Crtam+/+ 和Crtam+小鼠纯化幼稚和效应/记忆⑶8+T细胞，并用经照射的经10 y M 0VA257_264脉冲的 APC刺激40小时。通过ELISA来分析细胞因子生成。数据代表两个独立实验。图20。第5天OT-I TCR+Crtam+⑶8+T细胞母细胞上的正常TCR/⑶3表达。将来 自OT-I TCR+Crtam+和0T-I TCR+Crtam+/+小鼠的CD8+T细胞用板结合的抗CD3/28mAb活化 5天。通过抗CD3和I类iTAg MHC四聚物(0VA肽，Beckman Coulter)染色来检查表面CD3 和TCR表达。数据代表四个独立实验。图21。Crtam经由Scrib来维持晚期T细胞极性和选择性细胞因子生成。(A)自 Crtam+/+和Crtam+小鼠纯化幼稚⑶8+T细胞，并用板结合的抗⑶3/28mAb刺激16小时。用 抗 Scrib mAb (H-300，Santa Cruz Biotechnology, [SCB])免疫沉淀细胞提取物。通过免疫 印迹用针对 Crtam(17B2, GNE)、Cdc42 (B_8，SCB)、PKC I (H_l，SCB)、和 Scrib (H-300)的抗体来分析免疫复合物。⑶将OT-I TCR+Crtamv+和Crtam+CD8+T细胞在37°C温箱中用肽/ APC活化14小时。于RT使已活化T细胞粘附到聚-D-赖氨酸包被的盖玻片(BD BioCoat ) 上达 10-20 分钟并固定，用抗 Crtam mAb (17B2, Genentech)或抗 CD3mAb (BDPharmingen)染 色，用 0.2% Triton X-100 透化，并用抗 Scrib (H-300)、抗 Cdc42 (B_8)、或抗 PKC € (H_l)抗 体(Santa Cruz Biotechnology)染色。(C)对 OT-I TCR+Crtam+/+和 Crtam+CDS+T 细胞(n
>200)中CD3极化的定量。(D)再刺激后14小时检查GFP对照、Crtam或Crtam( A ESIV) 重建的Crtam+⑶8+T细胞的极性。(E)在TCR刺激后48小时分析Crtam (蓝色)或 Crtam(AESIV)(红色)重建的Crtam+CD8+T细胞的细胞因子生成。GFP重建的Crtamv+(白 色)或Crtam+(绿色)T细胞充当D和E中的对照。数据代表三个独立实验。通过解卷积 显微术(Delta Vision)来分析载玻片。图22。Crtam+CD8+T细胞中晚期T细胞极性的维持遭到破坏。㈧将⑶8+T细胞 在37°C温箱中用板结合的抗⑶3/28mAb活化16小时。通过用培养基温和吹打使已活化T 细胞从板上洗下。于RT使洗脱的细胞粘附到聚-D-赖氨酸包被的盖玻片(BD BioCoat ) 上达10-20分钟，并实施固定和染色规程。(B)对Crtamv+和Crtam+⑶8+T细胞(n > 200) 中⑶3极化的定量。通过解卷积显微术(Delta Vision)来分析载玻片。图23。TCR活化后30分钟Crtam+⑶8+T细胞中的细胞极性和初始活化是正常的。 (A)将 10 ii 1 抗 CD3/CD28Ab 包被的 Dynabead 与 1 X 106 个来自 Crtam+/+ 和 Crtami 小鼠 的幼稚⑶8+T细胞一起在37°C温箱中温育30分钟，并于RT使细胞粘附到聚_D_赖氨酸包 被的盖玻片(BD BioCoat )上达10-20分钟。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗掉非粘附细胞， 并用PBS中的4%低聚甲醛固定细胞，用抗Crtam mAb(17B2, Genentech)或抗CD3mAb (BD Pharmingen)染色，用 0. 2% Triton X-100 透化，并用抗粒周蛋白(anti-pericentrin) (BD Pharmingen)、抗 PKC e (细胞信号传导)、抗 Scrib (H-300)、或抗 PKC I (H_l)抗体(Santa CruzBiotechnology)染色。最后清洗后，用ProLong Gold不褪色试剂(Invitrogen)封固 染色细胞。图像代表每种实验条件>50个细胞。用Leica SP5共焦显微镜分析载玻片。 ⑶用板结合的抗⑶3/28mAb活化来自Crtam+和Crtam+A小鼠的幼稚⑶8+T细胞。活化 后6小时检查表面⑶25和⑶69表达。数据代表五个独立实验。图24。Scrib和PKC I是维持晚期T细胞极性所需要的，其继而是IFN y , TNF a 和IL22调节所需要的。(A-G)如先前所述(Yeh等，Cell 132(5) :846_859 (2008))用对照、 Scrib (A、B、C 小图 2、禾口 D)、或 PKC€ (C，小图 3、E_G) siRNA(QIAGEN)电穿孔来自 Crtam+/+ 小鼠的第5天⑶8+T细胞母细胞。转染后12小时通过Western印迹来分析Scrib和PKC I 表达(A和E)，并且将T细胞用抗⑶3/⑶28mAb再刺激8小时，固定细胞并在Scrib和/ 或PKCI之外对Crtam和Talin染色，如图中所示。再刺激后48小时通过ELISA来分析 对照、Scrib或PKCz siRNA转染的细胞的细胞因子生成(D和G)。(H-J)将pIRES_GFP或 pIRES-Crtam(AICD) :Scrib电穿孔入来自Crtam+小鼠的第5天CD8+T细胞母细胞。通过 Western印迹(H)和流式细胞术(图27)确定了 Crtam(AICD) :Scrib表达。此图中的灰 色箭头指示内源Scrib蛋白质，而星号指示Crtam( A I⑶)Scrib嵌合物。在再刺激后8小 时检查Crtam ( A I⑶)Scrib表达细胞中的细胞极性(I)，并在再刺激后48小时通过ELISA 来分析这些细胞的细胞因子生成(J)。数据代表两个独立实验。图像代表每项染色检查的
>50个细胞。
图25。Talin极化在Scrib和PKCz敲低⑶8+T细胞中没有得到维持。对再活化 后 8 小时对照、Scrib (A)、或 PKC I (B) siRNA 转染的 Crtam+/+CD8+T 细胞(图 24B 和 24F 所 示)(n > 50)中Talin极化的定量。图26。Scrib和PKC I敲低⑶8+T细胞中正常的早期T细胞极性和活化。(A)将对 照、Scrib、或 PKC I siRNA 转染的 Crtam+/+CD8+T 细胞用抗 CD3/CD28Ab 包被的 Dynabead 再活 化30分钟并固定，供抗CD3和抗PKC0染色用(n>50)。(B)将对照、Scrib、或PKC € siRNA 转染的Crtamv+CD8+T细胞用板结合的抗⑶3/⑶28Ab活化8小时，并通过流式细胞术来检查 表面CD25和CD69表达。图27。细胞表面Crtam(DICD) :Scrib嵌合物的表达。将pIRES-GFP或 pIRES-Crtam(AICD) :Scrib电穿孔入来自Crtam+小鼠的第5天CD8+T细胞母细胞。通过 流式细胞术来评估Crtam(AICD) :Scrib表达。图28。Crtam介导的⑶8T细胞应答是单核细胞增生利斯特氏菌感染期间宿主抵抗 力所必需的。(A)在单核细胞增生利斯特氏菌(L. monocytogenes)感染前一天给Rag2+小 鼠静脉内注射1X107个CD8+Crtam+或Crtam+AT细胞。持续两周每天跟踪小鼠的存活力。 (B)在第14天对存活小鼠处以安乐死，并显示了它们的脾的总体形态。(C)通过脑心浸液 (BHI)琼脂板上的菌落计数来测定来自存活小鼠的脾的细菌负荷并定量。(D)自第5天受 感染小鼠收集血清，并通过ELISA来分析。(E)将lX107ml来自第5天受感染小鼠的脾细 胞在有或无lX108CFU/ml热杀死的单核细胞增生利斯特氏菌(HKLM)的情况中温育。48小 时后，通过ELISA来分析细胞因子生成。(F)将自第5天受感染小鼠纯化的CD8+T细胞与单 核细胞增生利斯特氏菌感染的IC-21靶细胞一起温育3小时，并用Leica M655显微镜对特 异性粒酶B斑点计数。数据代表三个独立实验。统计学分析是使用Durmett氏方法带对照 实施的。图29。单核细胞增生利斯特氏菌感染后重建的Rag2+小鼠中的⑶8+T细胞 检查。(A)单核细胞增生利斯特氏菌感染前一天给Rag2+小鼠静脉内注射1X107个 ⑶8+Crtam+或Crtamv+T细胞。在感染当天(第0天)和第14天检查血液中重建的⑶8+T 细胞。(B)第5天通过流式细胞术检查脾中的CD8+T细胞。右边小图中显示了每只小鼠中 ⑶8+T细胞的百分比。统计学分析是使用Durmett氏方法带对照实施的。图30。人CRTAM氨基酸序列。㈧显示了带信号序列的人CRTAM的氨基酸序列 (SEQ ID N0:1)。(B)显示了缺信号序列的人CRTAM的氨基酸序列(SEQ ID NO :2)。图31。小鼠CRTAM氨基酸序列。(A)显示了带信号序列的小鼠CRTAM(NM_019465) 的氨基酸序列(SEQ ID NO 3) 0 (B)显示了缺信号序列的小鼠CRTAM(NM_019465)的氨基酸 序列(SEQ ID NO :4)。图32。人NeC12(Cadml)氨基酸序列。(A)显示了带信号序列的人Necl2 (Cadml) (NM_014333)的氨基酸序列(SEQ ID NO :5)。(B)显示了缺信号序列的人Necl2 (Cadml) (NM_014333)的氨基酸序列(SEQ ID NO 6)。图33。小鼠Necl2 (Cadml)氨基酸序列。(A)显示了带信号序列的小鼠Necl2 (Cadm 1) (NM_207675)的氨基酸序列(SEQ ID NO 7)。(B)显示了缺信号序列的小鼠Necl2 (Cadml) (NM_207675)的氨基酸序列(SEQ ID NO :8)。图34。抗CRTAM抗体氨基酸序列。㈧显示了仓鼠-小鼠嵌合抗CRTAM抗体(17B2)的轻链的氨基酸序列(SEQ ID N0:31)。可变域标有下划线(SEQID NO 35) ；CDR1 (SEQ ID NO :37)、CDR2(SEQ ID NO 38)、和 CDR3 (SEQ ID NO 39)中每一项以方框标示。(B)显示了 仓鼠-小鼠嵌合抗CRTAM抗体(17B2)的重链的氨基酸序列(SEQ ID NO :32)。可变域标有 下划线(SEQID NO 36) ；CDR1 (SEQ ID NO 40)、CDR2 (SEQ ID NO 41)、禾口 CDR3 (SEQ ID NO 42)中每一项以方框标示。图35。抗CRTAM抗体轻链核酸序列。显示了仓鼠-小鼠嵌合抗CRTAM抗体(17B2) 的轻链的核酸序列(SEQ ID NO 33)。起始和终止密码子标有下划线；成熟轻链的第一个密 码子以方框标示。图36。抗CRTAM抗体重链核酸序列。显示了仓鼠-小鼠嵌合抗CRTAM抗体(17B2) 的重链的核酸序列(SEQ ID NO :34)。起始和终止密码子标有下划线；成熟轻链的第一个密 码子以方框标示。发明详述本发明提供了通过调控已活化T细胞中的CRTAM来诊断和治疗各种病症的方法、 组合物、试剂盒和制品。本文中提供了这些方法、组合物、试剂盒和制品的详情。通用技术除非另有说明，本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物 学、细胞生物学、生物化学、和免疫学的常规技术，这些都在本领域的技术范围内。文 献中充分阐述了这些技术，诸如“Molecular Cloning :ALaboratory Manual”，第二版 (Sambrook 等，1989) ；"Oligonucleotide Synthesis”(M. J. Gait，编，1984) ；"Animal Cell Culture，，(R. I. Freshney,编，1987) ；"Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.)； "Current Protocols inMolecular Biology”(F. M. Ausubel 等，编，1987，及定期更新)； "PCR :ThePolymerase Chain Reaction”，(Mullis 等，编，1994) ；"A Practical Guide toMolecular Cloning，，(Perbal Bernard V. , 1988)。I.定义如本文中在CRTAM调控的语境中所使用的，“病症”或“疾病”指任何会受益于本发 明的CRTAM调控物和/或方法的治疗的疾患。这包括慢性和急性病症或疾病，包括那些使 哺乳动物倾向于所讨论病症或疾病的病理状况。本文中待治疗的病症或疾病的非限制性例 子包括炎性(例如自身免疫性)和其它免疫学病症/疾病。“自身免疫性疾病”在本文中指源于且针对个体自身组织的非恶性疾病或病症。 自身免疫性疾病在本文中明确排除恶性或癌性疾病或疾患，尤其排除B细胞淋巴瘤、急性 成淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病和慢性成髓细胞白血 病。自身免疫性疾病或病症的例子包括但不限于炎症应答，诸如炎性皮肤病，包括银屑病 和皮炎(例如特应性皮炎)；系统性硬皮病和硬化；与炎性肠病有关的应答(诸如克罗恩 氏(Crohn)病和溃疡性结肠炎)；呼吸窘迫综合征(包括成人呼吸窘迫综合症(ARDS))；皮 炎；脑膜炎；脑炎；葡萄膜炎；结肠炎；肾小球肾炎；过敏状况，诸如湿疹和哮喘及牵涉T细 胞浸润和慢性炎性应答的其它状况；动脉粥样硬化；白细胞粘着缺陷；类风湿性关节炎；系 统性红斑狼疮(SLE)；糖尿病(例如I型糖尿病或胰岛素依赖性糖尿病)；多发性硬化；雷 诺氏(Reynaud)综合征；自身免疫性甲状腺炎；变应性脑脊髓炎；斯耶格伦氏(Sjogren)综 合征；幼发型糖尿病；通常在结核病、结节病、多肌炎、肉芽肿病和血管炎中发现的与细胞因子和T_淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏感性有关的免疫应答；恶性贫血(阿狄森氏 (Addison)病)；牵涉白细胞渗出的疾病；中枢神经系统(CNS)炎性病症；多器官损伤综合 征；溶血性贫血(包括但不限于冷球蛋白血症或库姆斯氏(Coombs)阳性贫血)；重症肌无 力；抗原-抗体复合物介导的疾病；抗肾小球基膜病；抗磷脂综合症；过敏性神经炎；格雷 夫斯氏(Graves)病；朗-伊二氏(Lambert-Eaton)肌无力综合症；大疱性类天疱疮；天疱 疮；自身免疫性多种内分泌腺病；莱特氏(Reiter)病；僵人综合症；贝切特氏(Behcet)病； 巨细胞动脉炎；免疫复合物肾炎；IgA肾病；IgM多神经病；免疫性血小板减少性紫癜(ITP) 或自身免疫性血小板减少症等。本发明还关注活动性自身免疫性疾病。活动性的自身免疫性疾病指其中受试者 的免疫系统处于自身反应性状态(也就是受试者自身免疫系统的细胞被动员来攻击受试 者自身组织和/或器官)的自身免疫性疾病。患有活动性自身免疫性疾病的受试者一般 会展现出疾病的相应症状。患有活动性自身免疫性疾病的哺乳动物受试者可发生发作 (flare-up)，即一段时间的升高的疾病活动或相应症状的复发。发作可响应重度感染、变应 性反应、机体应激、情绪创伤、手术、或环境因素而发生。如上所述，在治疗本文所述炎性疾病(例如自身免疫性疾病或自身免疫相关疾 患)时，可以用本发明的CRTAM调控物与第二治疗剂(诸如免疫抑制剂(即抗炎药))联合 来处理受试者，诸如在多药物方案中。所述CRTAM调控物可以与所述免疫抑制剂同时、序贯 或交替施用。所述免疫抑制剂可以以与本领域提出的剂量相同或较小的剂量施用。适宜的 辅助免疫抑制剂会取决于许多因素，包括所治疗病症的类型以及患者的历史。“免疫抑制剂”在用于本文时指作用于抑制或掩盖患者的免疫系统和/或炎性应 答的物质。此类药剂将包括抑制细胞因子生成、下调或抑制自身抗原表达、或掩盖MHC抗 原的物质。此类药剂的例子包括类固醇，诸如糖皮质类固醇，例如泼尼松(prednisone)、 甲泼尼龙(methylprednisolone)和地塞米松(dexamethasone) ；2-氨基-6-芳基-5-取 代的嘧啶(参见美国专利第4，665，077号)；硫唑嘌呤(azathioprine)(或环磷酰胺 (cyclophosphamide)，如果对硫唑嘌呤有不良反应的话)；溴隐亭(bromocryptine)；戊二 醛(它掩盖MHC抗原，如美国专利第4，120，649号中所记载的)；针对MHC抗原和MHC片 段的抗独特型抗体；环孢菌素A ；细胞因子或细胞因子受体拮抗剂，包括抗干扰素、
或-a抗体；抗肿瘤坏死因子-a抗体；抗肿瘤坏死因子抗体；抗白介素_2抗体和 抗IL-2受体抗体；抗L3T4抗体；异源抗淋巴细胞球蛋白；泛(pan) T抗体，优选抗CD3或 抗⑶4/⑶4a抗体；含有LFA-3结合域的可溶性肽(W0 90/08187，公布于90年7月26 日)；链激酶；TGF-0 ；链道酶；来自宿主的RNA或DNA;H(506;RS-61443;脱氧精胍菌素 (deoxyspergualin)；雷帕霉素(rapamycin) ；T细胞受体(美国专利第5，114，721号)；T细 胞受体片段(Offner 等，Science251 430-432 (1991) ；W0 90/11294 ；W0 91/01133)；及 T 细 胞受体抗体(EP340, 109)，诸如T10B9。术语“细胞毒性或调节性T细胞相关分子”、“I类MHC限制性T细胞相关分子” 和“CRTAM”(大写或小写字母，或其任意组合)在本文中可互换使用，涵盖能够以与野生 型CRTAM相似的方式调控已活化T活性的天然序列多肽、多肽变体及天然序列多肽和多肽 变体的片段(在本文中有进一步定义)。本文中所描述的CRTAM多肽可以从多种来源分 离，诸如人组织类型或其它来源，或者通过重组或合成方法制备。术语“CRTAM”、“CRTAM多肽”、“CRTAM蛋白质”、和“CRTAM分子”还包括本文中所公开的CRTAM多肽的变体。本发明 的“CRTAM调控物”指调控CRTAM的正常生物学功能/活性的分子。“天然序列CRTAM多肽”包括与衍生自自然界的相应CRTAM多肽具有相同氨基酸序 列的多肽。在一个实施方案中，天然序列CRTAM多肽包含SEQID NO 1 (见图30A)或SEQ ID N0:2(见图30B)的氨基酸序列。此类天然序列CRTAM多肽可以从自然界分离，或者可以通 过重组或合成手段生成。术语“CRTAM多肽”和“CRTAM蛋白质”在用于本文时明确涵盖天 然存在的截短或其它翻译后修饰形式的特定CRTAM多肽、该多肽的天然存在变体形式(例 如可变剪接形式)和天然存在等位变体。在用于本文时，术语“肽”和“多肽”可互换使用， 只是术语“肽”一般指包含少于200个连续氨基酸的多肽。术语“载体”在用于本文时意指能够运输与其连接的其它核酸的核酸分子。一类 载体是“质粒”，指其中可连接另外的DNA区段的环状双链DNA环。另一类载体是噬菌体载 体。另一类载体是病毒载体，其中可将另外的DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能 够在其所导入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳 动物载体)。其它载体(例如非附加型哺乳动物载体)可在导入宿主细胞后整合到宿主细 胞的基因组中，由此随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作连接的 基因表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“重组载体”)。通常，在重 组DNA技术中有用的表达载体常常是质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使 用，因为质粒是载体的最常用形式。“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换使用，指任何长度的核苷酸聚合物，包括DNA 和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经过修饰的核苷酸或碱基、和/或其 类似物，或者是可通过DNA或RNA聚合酶或者通过合成反应掺入聚合物的任何底物。多核 苷酸可包含经过修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及其类似物。如果有的话，对核苷酸结 构的修饰可以在装配聚合物之前或之后进行。核苷酸序列可以由非核苷酸组分中断。多核 苷酸可以在合成后进一步修饰，诸如通过与标记物偶联。其它类型的修饰包括例如“帽”， 将一个或多个天然存在的核苷酸用类似物替代，核苷酸间修饰诸如例如具有不带电荷连接 (例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等)和具有带电荷连 接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修饰，含有悬垂模块(pendant moiety)，诸如例 如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)的修饰、具有嵌入剂(例如 吖啶、补骨脂素等)的修饰、含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的修 饰、含有烷化剂的修饰、具有经修饰连接(例如a端基异构核酸(anomeric nucleic acid) 等)的修饰、以及未修饰形式的多核苷酸。另外，通常存在于糖类中的任何羟基可以用例 如膦酸(phosphonate)基团、磷酸(phosphate)基团替换，用标准保护基团保护，或活化以 制备与另外的核苷酸的另外的连接，或者可偶联至固相或半固相支持物。5'和3'末端 0H可磷酸化或者用胺或1-20个碳原子的有机加帽基团模块取代。其它羟基也可衍生成标 准保护基团。多核苷酸还可含有本领域普遍知道的核糖或脱氧核糖糖类的类似物形式，包 括例如2'-氧-甲基、2'-氧-烯丙基、2'-氟-或2'-叠氮-核糖，碳环糖类似物， a-端基异构糖，差向异构糖诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，无 环类似物及脱碱基核苷类似物诸如甲基核糖核苷。可用备选连接基团替换一个或多个磷酸 二酯连接。这些备选连接基团包括但不限于如下实施方案，其中磷酸酯用P(0)S( “硫代酸酯，，(thioate)),P(S)S( “二硫代酸酯” (dithioate)),(0)NR2( “酰胺酯”(amidate))、P (0) R、P(0)0R'、C0或CH2 (“甲缩醛”(formacetal))替代，其中R或R'各自独立为H或者取 代或未取代的烷基(1-20个C)，任选含有醚(-0-)连接、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷 基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有连接都必需是相同的。上述描述适用于本文中提及 的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。“寡核苷酸”在用于本文时通常指短多核苷酸，通常是单链，通常是合成的，长度通 常但不是必需小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”并不互相排斥。上文 关于多核苷酸的描述同样且完全适用于寡核苷酸。术语“宿主细胞”(或“重组宿主细胞”)在用于本文时意图指通过导入外源多核 苷酸诸如重组质粒或载体，遗传上已经改变或者能够在遗传上改变的细胞。应当理解，此类 术语意图不仅指特定的受试细胞，还指此类细胞的后代。因为在后代中可能由于突变或环 境影响而存在某些改变，所以此类后代可能事实上与亲本细胞不同，但是在用于本文时仍 然包括在术语“宿主细胞”的范围内。CRTAM “胞外结构域”或“ECD”指基本上不含相应全长分子的跨膜和胞质结构域的 CRTAM多肽形式。术语“CRTAM配体”指结合CRTAM的物质，包括但不限于天然CRTAM配体(无论是 分离的和/或纯化的、合成的、和/或重组的)，天然CRTAM配体的同系物(例如来自另一种 哺乳动物)、抗体、此类分子的一部分、和其它物质。术语CRTAM配体涵盖作为CRTAM活性抑 制剂或促进剂的物质，以及结合但缺乏抑制剂或促进剂活性的物质。CRTAM配体的例子包括 但不限于柄蛋白样蛋白2(Necl2)，也称作Cadml。如本文中涉及CRTAM功能/活性所使用的术语“拮抗剂”和术语“CRTAM拮抗剂” 以最广义使用，包括阻断天然序列CRTAM多肽结合CRTAM配体，和/或部分或完全阻断或中 和(统称“抑制”)或以其它方式降低天然序列CRTAM多肽的定量生物学活性(如本文中 所定义的)的任何分子。合适的CRTAM拮抗剂分子具体包括但不限于如本文所述的CRTAM 调控物，例如包含阻断性抗CRTAM抗体(包括抗体片段)、其它多肽(诸如本文中天然序列 CRTAM多肽的变体和融合物)、肽和非肽(有机)小分子、抑制性和反义多核苷酸分子的调 控物。在一个实施方案中，CRTAM拮抗剂包括特异性结合天然CRTAM多肽且能够阻断其结 合CRTAM配体的抗CRTAM抗体，包括抗体片段。"CRTAM阻断性抗体”或涉及CRTAM活性/功能使用的“阻断性抗体”指能够阻断 天然序列CRTAM多肽结合CRTAM配体，和/或部分或完全阻断或中和(统称“抑制”)或以 其它方式降低天然序列CRTAM多肽的生物学活性(如本文中所定义的)的抗体。阻断性抗 体可以是如本文中所定义的消减性抗体。如本文中所使用的，术语“CRTAM结合剂”指能够结合CRTAM的分子，诸如蛋白质。 在一个实施方案中，结合剂结合CRTAM但不干扰CRTAM结合CRTAM配体的能力。在一个实 施方案中，CRTAM结合剂是CRTAM非阻断性抗体。"CRTAM非阻断性抗体”或涉及CRTAM功能/活性使用的“非阻断性抗体”指能结合 天然序列CRTAM多肽但不干扰或阻断CRTAM配体结合天然序列CRTAM多肽的抗体。然而， 在结合后，CRTAM非阻断性抗体能够介导表达CRTAM分子的细胞的消减或删除。在一个实 施方案中，非阻断性抗体结合CRTAM胞外结构域。如此，在一个实施方案中，CRTAM非阻断性抗体不干扰CRTAM配体结合但能够诱导表达CRTAM的T细胞的消减。非阻断性抗体可以 是如本文中所定义的消减性抗体。如本文中所使用的，“消减”指细胞的清除、消减、或删除。在一个实施方案中，被消 减的细胞是特定T细胞群体的一部分，例如，已活化的CD4+或CD8+T细胞群体。一般而言， 被消减的细胞表达特定细胞表面标志物。所述标志物可以是CD4或CD8，单独的或与CRTAM 组合的。在一个实施方案中，所述表面标志物是CRTAM。如本文中所定义的，“消减性抗体”指对包含其抗原靶的细胞的结合导致对抗原 或细胞功能的抑制或导致细胞死亡的抗体。在一个实施方案中，本发明的消减性抗体结合 CRTAM,且可以阻断或不阻断CRTAM配体结合CRTAM。如此，消减性抗体具体包括如上文所 定义的阻断性的和非阻断性的抗体。在某些实施方案中，消减性抗体可诱导凋亡或程序性 细胞死亡，例如T细胞的，如通过标准凋亡测定法所测定的，诸如膜联蛋白V结合、DNA断 裂、细胞收缩、内质网膨胀、细胞破裂、和/或膜囊(称作凋亡小体)形成。“诱导细胞死 亡”的消减性抗体指引起可存活细胞变得不能存活的消减性抗体。在一个实施方案中，所 述细胞是CRTAM+细胞。体外细胞死亡可在不存在补体和免疫效应细胞时测定，以区分由抗 体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)诱导的细胞死亡。如 此，用于细胞死亡的测定法可使用热灭活血清(即不含补体)在不存在免疫效应细胞时进 行。为了确定抗体、寡肽或其它有机分子是否能够诱导细胞死亡，可相对于未处理细胞评 估膜完整性的丧失，它是通过碘化丙啶(propidium iodide) (PI)、锥虫蓝(参见Moore等， Cytotechnology 17:1-11(1995))或7AAD的摄取来评估的。在一个实施方案中，诱导细胞 死亡的抗体是消减CRTAM+细胞的抗体。在一个实施方案中，本发明的消减性抗体结合CRTAM且包含毒素偶联物，其中所 述毒素诱导结合所述抗体偶联物的细胞消减。本发明的消减性抗体还可经由偶联的毒素或 细胞毒剂诱导细胞死亡。术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞破坏的 物质。该术语意图包括放射性同位素，例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32 和Lu的放射性同位素；化疗剂，例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、长春 花生物碱类(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊 昔(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法仓(melphalan)、丝裂霄素(mitomycin)C、 苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂；酶及其片段，诸如 溶核酶；抗生素；和毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素，包 括其片段和/或变体。下文记载了其它细胞毒剂。“抗体” (Ab)和“免疫球蛋白”(Ig)指具有相似结构特征的糖蛋白。虽然抗体展现 出对特定抗原的结合特异性，但是免疫球蛋白包括抗体及通常缺乏抗原特异性的其它抗体 样分子二者。后一类多肽例如由淋巴系统以低水平生成而由骨髓瘤以升高的水平生成。术语“抗体”和“免疫球蛋白”以最广义互换使用，包括单克隆抗体(例如全长或 完整单克隆抗体)、多克隆抗体、单价抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体， 只要它们展现出期望的生物学活性)，而且还可以包括某些抗体片段(如本文中更为详细 描述的)。抗体可以是嵌合的、人的、人源化的和/或亲和力成熟的。术语“抗CRTAM抗体”或“能结合CRTAM的抗体”指能够以足够亲和力结合CRTAM，使得该抗体可用作靶向CRTAM的治疗剂和/或诊断剂的抗体。在一个实施方案中，抗CRTAM抗 体结合无关、非CRTAM蛋白的程度小于抗体对CRTAM结合的约10 %，所述程度例如根据放射 免疫测定法(RIA)测量的。在某些实施方案中，能结合CRTAM的抗体具有彡1 P M、彡lOOnM、 彡lOnM、彡InM、或彡0. InM的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗CRTAM抗体能结合在 来自不同物种的CRTAM多肽间保守的CRTAM表位。术语“全长抗体”和“完整抗体”在本文中可互换使用，指基本上完整形式的抗体 而非如下文所定义的抗体片段。该术语具体指重链包含Fc区的抗体。“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段的例子包 括Fab、Fab'、F(ab' )2和Fv片段；双抗体(diabody)；线性抗体；单链抗体分子；及由抗 体片段形成的多特异性抗体。用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，各自具有 一个抗原结合位点，及一个剩余的“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶 处理产生一个F(ab' )2片段，它具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C-端区域，其可以通过用木瓜蛋白酶消 化完整抗体而产生。Fc区可以是天然序列Fc区或变异Fc区。虽然免疫球蛋白重链Fc区的 边界可以变化，但是人IgG重链Fc区通常定义为自Fc区的大约Cys226位置或大约Pro230 位置的氨基酸残基至羧基末端的区段。免疫球蛋白的Fc区一般包含两个恒定域，即CH2结 构域和CH3结构域，而且任选包含CH4结构域。“Fc区链”在本文中指Fc区的两条多肽链 之一。“Fv”是包含完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施方案中，双链Fv种 类由紧密、非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。六个CDR —起 赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或是只包含对抗原特异性的三个 CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合位点。Fab片段包含重链可变域和轻链可变域，而且还包含轻链的恒定域和重链的第一 恒定域(CHI)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于重链CHI结构域的羧基末端增加了少 数残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab' _SH是本文中对其中恒定域半 胱氨酸残基携带游离硫醇基的Fab'的称谓。F(ab' )2抗体片段最初是作为在成对Fab' 片段之间有铰链半胱氨酸的成对Fab'片段生成的。还知道抗体片段的其它化学偶联形式。“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和\结构域，其中这些结构域存在于 一条多肽链上。一般而言，scFv多肽在VH与\结构域之间还包含多肽接头，使得scFv能够 形成结合抗原所需的结构。关于scFv的综述参见Pluckthun，在Rosenburg和Moore编的 《The Pharmacology of MonoclonalAntibodies》第 113卷中，Springer_Verlag,New York, pp.269-315(1994)。术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段在同一条多肽链 (VH-VL)中包含相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(\)。通过使用过短的接头使得同一 条链上的两个结构域之间不能配对，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对，从而 产生两个抗原结合位点。双抗体可以是二价的或双特异性的。双抗体更完整的记载于例 如 EP 404，097 ；W093/1161 ；Hudson 等(2003)Nat. Med. 9 :129_134 ；及 Hollinger 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448(1993)。三抗体(Triabody)和四抗体(tetrabody)也记载于 Hudson 等(2003) Nat. Med. 9 129-134。术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成 群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的突变，例如天然存在的突变。如此， 修饰语“单克隆”表明抗体不是不同的抗体的混合物的特征。在某些实施方案中，此类单克 隆抗体典型地包括包含结合靶物的多肽序列的抗体，其中靶物结合多肽序列是通过包括从 众多多肽序列中选择单一靶物结合多肽序列在内的过程得到的。例如，选择过程可以是从 众多克隆诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的集合中选择独特克隆。应当理解， 所选择的靶物结合序列可进一步改变，例如为了提高对靶物的亲和力、将靶物结合序列人 源化、提高其在细胞培养物中的产量、降低其在体内的免疫原性、创建多特异性抗体等，而 且包含改变后的靶物结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型的包含针对不同决 定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体 针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性外，单克隆抗体制备物的优势在于它们通常未 受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通 过任何特定方法来生产抗体。例如，将依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生 成，包括例如杂交瘤法(例如 Kohler 等，Nature256 495(1975) ；Harlow 等，Antibodies A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory Press,2nd ed. 1988 ；Hammerling 等，于:MonoclonalAntibodies and T—Cell Hybridomas, 563-681，Elsevier,N. Y.，1981)、 重组DNA法(参见例如美国专利No. 4,816, 567)、噬菌体展示技术(参见例如Clackson 等，Nature 352 :624_628 (1991) ；Marks 等，J. Mol. Biol. 222 :581_597 (1992) ；Sidhu 等， J. Mol. Biol. 338(2) :299_310 (2004) ；Lee 等，J. Mol. Biol. 340(5) 1073-1093 (2004)； Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34) 12467-12472 (2004) ；Lee 等，J. Immunol. Methods 284(1-2) : 119-132 (2004))、及用于在具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编 码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生成人或人样抗体的技术(参见例如W0 98/24893 ； W0 96/34096 ；W0 96/33735 ；W0 91/10741 Jakobovits 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 2551 (1993) Jakobovits 等，Nature362 255-258 (1993) ；Bruggemann 等，Year in Immuno. 7 33(1993)；美国专利 No. 5，545，807 ;5，545，806 ;5，569，825 ;5，625，126 ； 5, 633, 425 ；5, 661, 016 ；Marks 等，Bio/Technology 10:779-783(1992) ；Lonberg 等， Nature 368 856-859(1994) ；Morrison,Nature 368 812-813(1994) ；Fishwild Nature Biotechnol. 14 845-851(1996) ；Neuberger, Nature Biotechnol. 14 826(1996) ；Lonberg andHuszar,Intern. Rev. Immunol. 13 :65_93(1995))。单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍 生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部 分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此 类抗体的片段，只要它们展现出期望生物学活性(美国专利第4，816，567号；Morrison等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :6851_6855 (1984))。非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的 序列的嵌合抗体。在一个实施方案上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变 区残基用具有期望特异性、亲和力和/或能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的框架区 (FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没 有找到的残基。可以进行这些修饰以进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包 含至少一个、通常两个基本上整个如下可变区，其中整个或基本上整个高变环对应于非人 免疫球蛋白的高变环，且整个或基本上整个FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任 选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节 参见 Jones 等，Nature 321 :522_525 (1986) ；Riechmann 等，Nature 332 :323_329 (1988)； Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593_596 (1992)。还可参见以下综述及其引用的参 考文献Vaswani andHamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1 :105-115 (1998)； Harris, Biochem. Soc. Transactions 23 1035-1038(1995) ；Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5 :428_433(1994)。“人抗体”指包含与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使 用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。此类技术包括筛选人衍生的组 合文库，诸如噬菌体展示文库(参见例如Marks等，J. Mol. Biol. , 222 581-597 (1991)和 Hoogenboom 等，Nucl. Acids Res.，19 :4133_4137 (1991))；使用人骨髓瘤和小鼠-人异源 骨髓瘤(heteromyeloma)细胞系来生成人单克隆抗体(参见例如Kozbor J. Immunol., 133:3001 (1984) ；Brodeur 等，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,第 51 页-第 63 页(Marcel Dekker, Inc. , New York, 1987)；禾口 Boerner 等，J. Immunol. ,147 86(1991))；和在转基因动物(例如小鼠)中生成单克隆抗体，所述 转基因动物能够在没有内源免疫球蛋白生成的情况中生成人抗体的完全全集(参见例如 Jakobovits 等，Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90 2551 (1993) Jakobovits 等，Nature, 362 255(1993) ；Bruggermann 等，Year in Immunol.，7 :33 (1993))。人抗体的这种定义明确排 除包含来自非人动物的抗原结合残基的人源化抗体。“亲和力成熟的”抗体指在其一个或多个CDR中具有导致抗体对抗原的亲和力与 没有这些改变的亲本抗体相比有所改进的一处或多处改变的抗体。在一个实施方案中，亲 和力成熟的抗体具有纳摩尔或甚至皮摩尔水平的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体可 通过本领域已知流程生成。Marks等，Bio/Technology 10:779-783(1992)记载了通过VH 和VL结构域改组的亲和力成熟。下列文献记载了 HVR和/或框架残基的随机诱变BarbaS 等，Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813(1994) ；Schier 等，Gene 169:147-155(1995)； Yelton 等，J. Immunol. 155 :1994-2004 (1995) ；Jackson 等，J. Immunol. 154(7) 3310-9 (1995) ；Hawkins 等，J. Mol. Biol. 226 :889_896 (1992)。“小分子”或“有机小分子”在本文中定义为分子量小于约500道尔顿的有机分子。“CRTAM结合寡肽”或“结合CRTAM的寡肽”指能够以足够的亲和力结合CRTAM以 使得该寡肽作为靶向CRTAM中的诊断剂和/或治疗剂是有用的寡肽。在某些实施方案中， CRTAM结合寡肽对无关的、非CRTAM的蛋白质的结合程度小于约10%的该CRTAM结合寡 肽对CRTAM的结合，如通过例如表面等离振子共振测定法所测量的。在某些实施方案中， CRTAM结合寡肽具有小于等于1 P M、小于等于100nM、小于等于10nM、小于等于InM、或小于 等于0. InM的解离常数(Kd)。"CRTAM结合有机分子”或“结合CRTAM的有机分子”指与如本文中所定义的寡肽或抗体不同的、能够以足够的亲和力结合CRTAM以使得该有机分子作为靶向CRTAM中的诊 断剂和/或治疗剂是有用的有机分子。在某些实施方案中，CRTAM结合有机分子对无关的、 非CRTAM的蛋白质的结合程度小于约10%的该CRTAM结合有机分子对CRTAM的结合，如通 过例如表面等离振子共振测定法所测量的。在某些实施方案中，CRTAM结合有机分子具有 小于等于1 P M、小于等于100nM、小于等于10nM、小于等于InM、或小于等于0. InM的解离常 数(Kd)。可以使用表面等离振子共振测定法来方便地测量任何分子结合靶多肽的解离常 数(Kd)。此类测定法可以采用于 25°C 的 BIAcore -2000 或 BIAcore -3000(BIAcore，Inc.， PiSCataWay，NJ)，其中固定化靶多肽CM5芯片在约10个响应单位(RU)。简言之，依照供应 商的说明书用盐酸N-乙基-N’ _(3_ 二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰 亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，BIAcore Inc.)。用10mM乙酸钠 pH 4. 8将靶多肽稀释至5 u g/ml (约0. 2 y M)，然后以5 yl/分钟的流速注入至获得约10 个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入靶多肽后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了 进行动力学测量，于25°C以约25 u 1/分钟的流速注入在含0. 05% Tween-20的PBS(PBST) 中两倍连续稀释的结合分子(0. 78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结 合模型(BIAcore Evaluation Softwareversion 3.2)通过同时拟合结合和解离传感图来 计算结合速率(k。n)和解离速率(k。ff)。平衡解离常数(Kd)以比率k。ff/k。n计算。参见例 如Chen，Y.，等，(1999)J. Mol. Biol. 293 :865-881。如果根据上文表面等离振子共振测定 法，抗体的结合速率超过lO^-is-1，那么结合速率可以使用荧光淬灭技术来测定，即根据分 光计诸如配备了断流装置的分光光度计(a stop-flow equippedspectrophometer) (Aviv Instruments)或8000系列SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯 的测量，在存在浓度渐增的抗原的条件下，测量PBS，pH 7. 2中的20nM抗体(Fab形式)于 25°C的荧光发射强度(激发=295nm ；发射=340nm, 16nm带通)的升高或降低。涉及CRTAM功能/活性使用的“调控”或如本文中所使用的“对CRTAM生物学活 性的调控”指例如对如下细胞事件的调控(i)其是涉及CRTAM+细胞的免疫应答的一部分， 和(ii)其受到CRTAM调控物的调控，所述CRTAM调控物包括CRTAM抗体(例如拮抗性抗 体)。此调控发生在T细胞活化的初始阶段之后，一般包括细胞活化的第一个小时期间对T 细胞骨架的改造。在此初始改造期间，细胞骨架调节物(诸如Was/WaSp、Vavl/Vav、WaSf2/ WAVE2和Hclsl/HSl)在早期T细胞微管和肌动蛋白改造中发挥作用。其它早期事件包括但 不限于下述一项或多项抗原呈递细胞(APC)对T细胞的活化；免疫学突触的形成；T细胞 抗原受体(TCR)接触区处信号传导支架的协同装配；Scrib和Dlgl被募集至免疫学突触和 脂筏；Scrib和Dlgl远离CD3的极化；肌动蛋白聚合的初始阶段；和细胞骨架改造以在细胞 间接触后产生第二信使。T细胞活化晚期在初始T细胞活化后发生，期间CRTAM表达上调。 CRTAM调控物对此晚期的调控可影响各种T细胞活化事件，包括但不限于下述一项或多项 细胞增殖、周期或分裂；细胞粘附；T细胞效应器功能的形成；细胞因子生成；某些分子自细 胞内募集至膜，所述分子包括但不限于Scrib肿瘤阻抑物、PKC (、和Cdc42中的一项或多 项；T细胞前缘处含Cdc42的复合物的装配的细胞内协调；晚期细胞骨架改造；和T细胞极 性。CRTAM调控还可影响某些CRTAM"细胞类型，包括但不限于下述一项或多项⑶4+T细胞， ⑶8+T细胞，NK细胞，和NKT细胞。由CRTAM调控物进行的调控包括例如对细胞因子生成的影响，包括但不限于下述细胞因子中的一项或多项IFNy，IL22和/或IL17。如本文中所使用的，“CRTAM+细胞”指在其表面上具有或表达天然序列CRTAM的细 胞。在某些实施方案中，CRTAM+细胞是处于T细胞活化晚期的T细胞。CRTAM+细胞包括但 不限于⑶8+T细胞、⑶4+T细胞、NK细胞、或NKT细胞。在某些实施方案中，CRTAM+细胞是细 胞因子生成细胞，所述细胞因子包括但不限于IFNy、IL22、和/或IL17。在一个实施方案 中，CRTAM+细胞还是⑶4+的。在一个实施方案中，CRTAM+细胞还是⑶8+的。在一个实施方 案中，CRTAM+细胞是已活化的CD4+T细胞。“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”指由细胞介导的反应，其中表达Fc 受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细 胞)识别靶细胞上结合的抗体，随后引起靶细胞溶解。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只 表达 FcyRIII，而单核细胞表达 FcyRI、FcyRII 禾口 FcyRIII。Ravetch and Kinet,Annu. Rev. Immunol. 9 =457-492 (1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估目 的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸如美国专利No. 5，500, 362或5，821，337中 所记载的。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK) 细胞。或者/另外，可在体内评估目的分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes 等，PNAS(USA)95 =652-656(1998)中所披露的。术语“Fc受体”和“FcR”用于描述能结合抗体Fc区的受体。在一个实施方案中，FcR 是天然序列人FcR。在一个实施方案中，FcR是结合IgG抗体的FcR(Y受体)，包括FcyRI、 Fc y RII和Fc Y RIII亚类的受体，包括这些受体的各等位变体和各可变剪接形式。FcyRII 受体包括FcyRIIA( “活化受体”)和FCYRIIB( “抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序 列，区别主要在于其胞质结构域。活化受体FcyRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于 酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcyRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨 酸的抑制基序(ITIM)(参见DaSron，Annu. Rev. Immunol. 15 :203_234 (1997))。FcR 的综述 参见 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9 :457_492 (1991) ；Cape 1 等，Immunomethods 4:25-34(1994)；及 de Haas 等，J. Lab. Clin. Med. 126 :330_341 (1995)。术语“FcR” 在本 文中涵盖其它FcR，包括那些未来将会鉴定的。该术语还包括新生儿受体，FcRn，其负责 将母体 IgG 转移给胎儿(Guyer 等，J. Immunol. 117 587(1976)及 Kim 等，J. Immunol. 24 249(1994))。“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指在存在补体时分子溶解靶物的能力。补体激活 途径是由补体系统第一组分(Clq)结合与关联抗原复合的分子(例如抗体)起始的。为了 评估补体激活，可进行⑶C测定法，例如如Gazzano-Santoro等，J. Immunol. Methods 202 163(1996)中所记载的。“免疫效应细胞”指能够结合抗原并介导免疫应答的细胞。这些细胞包括但不限 于T细胞(例如⑶4+、⑶8+)、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、NK细胞和细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)。在一个实施方案中，免疫效应细胞包含已活化的细胞。在一个实施方案中，CRTAM+ 细胞是免疫效应细胞。“幼稚(naiVe)”免疫效应细胞指从未暴露于能够活化T细胞的抗原的免疫效应细 胞。幼稚免疫效应细胞的活化需要对肽:MHC复合物的识别及同时专职APC对共刺激信号 的传递二者以增殖和分化成抗原特异性的、经武装的效应T细胞。
病症(诸如自身免疫性疾病)的“病理”或“病理学”包括所有危及患者康乐的现 象。这包括但不限于异常的或不可控的细胞生长(嗜中性细胞、嗜酸性细胞、单核细胞、淋 巴细胞)、抗体生成、自身抗体生成、补体生成、对邻近细胞正常机能的干扰、细胞因子或其 它分泌产物的异常水平释放、任何炎性应答或免疫学应答的抑制或恶化(aggration)、炎症 细胞(嗜中性细胞、嗜酸性细胞、单核细胞、淋巴细胞)浸润入细胞间隙(cellular spaces)寸。如本文中所使用的，术语“自身反应性的”指具有自身免疫性疾病的哺乳动物的免 疫系统中的细胞的状况。免疫系统的自身反应性T淋巴细胞一般牵涉如本文所述的自身免 疫性疾病的病理。自身反应性T细胞可推动各种促成自身免疫性应答启动和持续的事件， 包括但不限于下述一项或多项对B细胞自身抗体生成的诱导，对巨噬细胞的活化，细胞因 子mRNA表达的升高，和分泌的细胞因子水平的升高。术语“细胞因子”是由一种细胞群释放，作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白 质的通称。此类细胞因子的例子有淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子中包 括生长激素，诸如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺 素；胰岛素；胰岛素原；松驰素；松驰素原；糖蛋白激素类，诸如促卵泡激素(FSH)、促甲状 腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；促乳素；胎盘催乳激 素；肿瘤坏死因子-a和；穆勒氏(Mullerian)抑制性物质；小鼠促性腺激素相关肽； 抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TP0)；神经生长因子，诸如 NGF-0 ；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-a和TGF-0 ；胰岛素样生长因 子-I和-II ；红细胞生成素(EP0)；骨诱导因子(osteoinductive factor)；干扰素，诸如 干扰素-a、干扰素和干扰素；集落刺激因子(CSF)，诸如巨噬细胞CSF(M-CSF)、粒 细胞-巨噬细胞CSF(GM-CSF)和粒细胞CSF(G-CSF)；白介素(IL)，诸如IL1、IL1 a、IL2、 IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12、IL13、IL17、IL22 ；肿瘤坏死因子，诸如 TNF-a或TNF-0 ；及其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。在用于本文时，术语细胞 因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质及天然序列细胞因子的生物学活 性等效物。“分离的”核酸分子指已经鉴定且与核酸的天然来源中通常与之关联的至少一种 污染性核酸分子分开的核酸分子。分离的核酸分子不同于在自然界中发现它时的形式或背 景。分离的核酸分子因此与存在于天然细胞中时的核酸分子有区别。然而，分离的核酸分 子包括通常表达所编码多肽的细胞中所包含的核酸分子，例如当所述核酸分子在所述细胞 中的染色体定位不同于它在天然细胞中的染色体定位时。“分离的”多肽(包括分离的抗体)指已经鉴定且与/由其天然环境的一种成分 分开和/或回收的多肽。抗体的天然环境的污染性成分指将会干扰其诊断或治疗用途的物 质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将多 肽纯化至(1)根据Lowry法的测定，多肽重量超过95%且最优选重量超过99%，(2)足以通 过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据 使用考马斯蓝或优选的银染色的还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE，达到同质。既然化 合物的天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的化合物(例如抗体或其它多肽)包 括重组细胞内的原位化合物。然而，分离的化合物通常通过至少一个纯化步骤来制备。
在用于本文时，术语“免疫粘附素”指将异源蛋白质(“粘附素”)的结合特异性与 免疫球蛋白恒定域的效应器功能联合起来的抗体样分子。在结构上，免疫粘附素包括不同 于抗体的抗原识别和结合位点(即是“异源”的)、具有期望结合特异性的氨基酸序列和免 疫球蛋白恒定域序列的融合物。免疫粘附素分子的粘附素部分典型的是至少包含受体或配 体的结合位点的连续氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定域序列可以从任何免疫 球蛋白获得，诸如 IgG-l、IgG-2、IgG-3 或 IgG-4 亚型、IgA (包括 IgA_l 和 IgA_2)、IgE、IgD 或1#。短语“基本上相似”或“基本上相当”在用于本文时表示两个数值之间足够高的相 似程度，以致本领域技术人员将认为在用所述数值所测量的生物学特性背景内两个数值之 间的差异具有很小的或没有生物学显著性。所述两个数值之间的差异优选小于约50%，优 选小于约40%，优选小于约30%，优选小于约20%，优选小于约10%。术语“激动剂”以最广义使用，包括部分或完全模拟或增强多肽(包括但不限于 CRTAM和Necl2 (Cadml))的生物学活性，或者提高编码该多肽的核酸的转录或翻译的任何 分子。例示性的激动剂分子包括但不限于激动性抗体、多肽片段、寡肽、有机分子(包括小 分子)、和包含CRTAM结合序列的融合多肽。术语“诊断”在用于本文时指分子或病理状态、疾病或状况的鉴定或分类。例如， “诊断”可以指自身免疫性疾病(诸如特定类型的狼疮疾患，例如SLE)存在、阶段和/或程 度，或者类型/亚型的鉴定。“诊断”还可以指特定亚型的狼疮的分类，例如通过组织/器官 累及(例如狼疮肾炎)、通过分子特征(例如以特定基因或核酸区域中的遗传变异为特征的 患者亚群)。在用于本文时，“治疗”指试图改变所治疗个体或细胞的自然进程的临床干预，可 以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括预防疾病的发生或复 发、缓解症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、减缓疾病进展的速率、改善或减轻 疾病状态、及免除或改善预后。在有些实施方案中，本发明的方法和组合物在试图延迟疾病 或病症的发生/发展中是有用的。如本发明的语境中所使用的，术语“预防”、“抑制”、和“防止”包括其中病理状态、 疾病或状况的发生得到完全或部分阻断，病理状态、疾病或状况的发作得到部分或完全延 迟，或者对现有病理状态、疾病或状况的刺激得到部分或完全逆转的情形。虽然预见到现有 病理状态、疾病或状况可得到完全或部分逆转，但是这不是此定义的必要条件。如本文中所使用的，“改善”在本文中定义为使之变得更好或改进。“有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的治疗或预防效果的量。治疗剂 的“治疗有效量”可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重及该抗体在个体中引发期 望应答的能力等因素而变化。治疗有效量还指该治疗剂的治疗有益效果胜过任何有毒或有 害后果的量。“预防有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的预防效果的量。通常 而非必然，由于预防剂量是在疾病发作之前或在疾病的早期用于受试者的，因此预防有效 量将低于治疗有效量。“个体”、“受试者”或“患者”指脊椎动物。在某些实施方案中，脊椎动物指哺乳动 物。哺乳动物包括但不限于牲畜(诸如牛)、运动用动物、宠物(诸如猫、犬、和马)、灵长类 动物(包括人和非人灵长类)、和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，哺乳动物指人。术语“测试样品，，指来自怀疑具有病理状态、疾病或状况(诸如自身免疫性疾病) 的受试者的样品。测试样品可源自受试者中的各种来源，包括但不限于血液、血清、骨髓、寸。术语“对照”指预期其中的阴性结果有助于关联测试样品中的阳性结果的阴性对 照。适合于本发明的对照包括但不限于已知不含表达CRTAM的已活化T细胞的样品、已知 不含表达CRTAm的已活化CD4+T细胞的样品、和自已知没有有关病理状态、疾病或状况的受 试者获得的样品。另外，对照可以是含有与测试样品中所含细胞具有相同起源的正常细胞 的样品。本领域技术人员会领会适合于在本发明中使用的其它对照。“药物”或“药剂”指用于治疗病理状态、疾病、和/或状况的活性药物。在一个实施 方案中，所述病理状态、病症、和/或状况是本文所列自身免疫性病症或其症状或副作用。II.本发明的组合物和方法本发明的CRTAM调控物(包括抗CRTAM抗体及其片段)可用于调控涉及CRTAM+ 细胞的生物学活性。在一个实施方案中，所述方法可用于通过给有需要的受试者施用有效 量的CRTAM调控物来治疗或预防疾病，诸如自身免疫性疾病。如此，本文中的CRTAM调控物 (例如CRTAM拮抗剂)可用于治疗或预防与涉及受CRTAM调控物调控的CRTAM"细胞的生物 学活性有关的疾病。在一个实施方案中，CRTAM调控物包含拮抗性抗CRTAM抗体或其片段， 其可以起阻断性抗体的作用。在另一个实施方案中，CRTAM调控物包含阻断性抗体或其片段，其可诱导CRTAM+细 胞的消减。针对细胞表面分子的抗体已经显示出有效消减或清除特定淋巴细胞子集或抑 制细胞功能。例如，认为针对细胞表面受体CD45RB的单克隆抗体的使用导致表达具有相 应CD45RB抗原的受体的T细胞克隆的功能和/或实际消减(Lazarovits，等U. S. Patent No. 7，160，987)。此类抗体表现出能够选择性抑制炎性和细胞毒性T细胞介导的免疫应答 而不破坏记忆T细胞集合。这些类型的抗体具有作用于特定T细胞群体(而非具有全面免 疫抑制效应)和赋予针对特定抗原的长期耐受(当在暴露于抗原的同时施用它们时，诸如 恰好在组织或器官移植之前和之后，或者在自身免疫性疾病急性期期间)的潜力。在一个 实施方案中，本发明的抗体能够作用于特定T细胞亚群，而非具有全面免疫抑制效应。在一 个实施方案中，所述T细胞亚群包含CRTAM+T细胞亚群，例如已活化CD4+CRTAM+T细胞亚 群。本发明的CRTAM调控物(包括抗CRTAM抗体及其片段)可用于消减受此类CRTAM 调控物消减的CRTAM+细胞。在一个实施方案中，所述CRTAM+细胞是细胞毒性T细胞或免疫 效应细胞。在一个实施方案中，通过给有需要的受试者施用有效量的CRTAM调控物，所述方 法可用于治疗或预防疾病(诸如自身免疫性疾病)。如此，本文中的CRTAM调控物可用于治 疗或预防可通过消减CRTAM+细胞来改善的疾病。CRTAM调控物可包含抗CRTAM抗体或其片 段，其可以起非阻断性抗体的作用。在本文中方法的一个实施方案中，不给受试者施用CRTAM调控物(诸如抗CRTAM 抗体)以外的药物来治疗或预防疾病。在一个实施方案中，可以与CRTAM调控物一起给受 试者施用有效量的第二药物，其中CRTAM调控物(例如抗CRTAM抗体)是第一药物。所述 第二药物可以是一种或多种药物，包括例如免疫抑制剂、细胞因子拮抗剂(诸如细胞因子抗体)、生长因子、激素、整联蛋白、整联蛋白拮抗剂或抗体、或其任意组合。所述第二药物的 类型取决于多种因素，包括免疫性疾病的类型、免疫性疾病的严重程度、受试者的状况和年 龄、所采用的第一药物的类型和剂量、等。本发明的CRTAM调控物在自身免疫性疾病诊断和预后测定法及成像方法中特别 有用。在一个实施方案中，使用抗CRTAM抗体或其片段实施所述测定法。本发明还提供了对 于CRTAM蛋白的检测和定量有用的多种免疫学测定法。这些测定法是在本领域公知的各种 免疫学测定形式内实施的，包括但不限于各种类型的放射免疫测定法、酶联免疫吸附测定 法(ELISA)、酶联免疫荧光测定法(ELIFA)、等等。另外，本发明还提供了能够检测以CRTAM 表达为特征的自身免疫性疾病的免疫学成像方法，包括但不限于使用例如经标记CRTAM抗 体进行的放射闪烁成像法。此类测定法在临床上可用于以CRTAM表达为特征的自身免疫性 疾病的检测、监测、和预后。本发明的另一个方面涉及用于鉴定表达CRTAM的细胞的方法。CRTAM的表达序型 使之成为病症(诸如自身免疫性疾病)的诊断标志物。因而，CRTAM表达的状态提供了对 于预测下述多种因素有用的信息，包括对疾病晚期的易感性、进展速率、和/或活动性疾病 (例如活动性自身免疫性疾病)中症状的突然和严重发作，即发作(flare-up)。在一个实施方案中，本发明提供了检测病症(诸如自身免疫性疾病)的方法。例 如，使来自受试者和对照的测试样品各自接触例如抗CRTAM抗体或其片段。在一个实施方 案中，所述测试样品含有具有某些细胞表面标志物的T细胞(例如已活化T细胞)，所述细 胞表面标志物包括但不限于下述一项或多项CRTAM+，⑶4+，和⑶8+。在一个实施方案中，所 述测试样品含有作为已活化CRTAM+、⑶4+T细胞的T细胞。测量CRTAM+细胞的量，而且与对 照相比测试样品中较高相对量的细胞指示获取所述测试样品的受试者中的疾病(诸如自 身免疫性疾病)。所述检测方法可进一步包括以下步骤，自所述受试者获得含有T细胞的第 二测试样品，使所述第二测试样品和初始测试样品接触抗CRTAM抗体，与初始测试样品相 比在第二测试样品中检测到较高相对量的CRTAM+细胞指示获取测试样品的受试者中疾病 (诸如自身免疫性疾病)的发作。在另一个实施方案中，通过本发明方法检测的自身免疫性疾病是活动性自身免疫 性疾病。在有些实施方案中，采用所述方法来检测活动性自身免疫性疾病的发作。在初步检 测到自身免疫性疾病后，可以自发现具有自身免疫性疾病的受试者获得另外的测试样品。 可以在采集初始样品后几小时、几天、几周、或几个月获得另外的样品。本领域技术人员会 领会用于获得所述另外的样品(可以包括第二、第三、第四、第五、第六、等测试样品)的适 宜时间表。使初始测试样品和另外的样品(或者如本文所述的对照)接触例如抗CRTAM抗 体。测量CRTAM+细胞的量，而且与初始测试样品相比另外的测试样品中较高相对量的细胞 指示获取测试样品的受试者中活动性自身免疫性疾病的发作。本发明提供了用于检测组织或其它生物学样品(诸如血清、精液、骨、前列腺、尿 液、细胞制备物、等等)中CRTAM的存在的测定法。用于检测CRTAM的方法也是公知的，包 括例如免疫沉淀、免疫组织化学分析、Western印迹分析、分子结合测定法、ELISA、ELIFA 等等。例如，检测生物学样品中CRTAM蛋白的存在的一种方法包括首先使样品接触例如抗 CRTAM抗体、其CRTAM反应性片段、或含有抗CRTAM抗体之抗原结合区的重组蛋白；然后检 测样品中CRTAM蛋白的结合。
在另一方面，本发明提供了提供分离的已活化CD4+T细胞群体的方法。分离已活 化CD4+T细胞的方法包括使含有来自受试者的混合T细胞群体的生物学样品接触CRTAM结 合分子(例如如本文所述的CRTAM调控物，诸如抗CRTAM抗体)的步骤。可以通过本领域已 知方法自受试者获得样品。使含有T细胞混合物的样品接触特异性结合CRTAM的分子。在 一个实施方案中，所述分子是抗CRTAM抗体或其片段。任何表达CRTAM的细胞会结合CRTAM 结合分子，由此将它们与不表达CRTAM的细胞区分开并容许分开和分离。将结合分子与它 们所结合的细胞分开的方法是本领域公知的例如，可以通过短时间暴露于低PH溶液或用 蛋白酶(诸如糜蛋白酶)将抗体与细胞分开。或者，可以经由加速鉴定和分离的偶联标记 物来实现CRTAM+细胞群体的分离。此类标记物的例子包括磁珠；生物素，其可以借助其对 亲合素或链霉亲合素的亲和力来鉴定或分离；荧光染料，其可以借助荧光活化细胞分选仪 (FACS，见下文)来鉴定或分离；等等。可以使用任何技术来进行分离，只要该技术不过度伤 害CRTAM+细胞。许多此类方法是本领域已知的。在一个实施方案中，将CRTAM结合分子附着至固体支持物。一些合适的固体支持 物包括硝酸纤维素、琼脂糖珠、聚苯乙烯珠、中空纤维膜、磁珠、和塑料皮氏皿。例如，可以将 结合分子共价连接至Pharmacia Sepharose 6MBmacro珠。固相连接的结合分子与粗制细 胞混合物温育的精确条件和持续时间会取决于所采用的系统特异的数项因素，正如本领域 公知的。通过将固体支持物与剩余细胞悬浮液物理分离，自细胞悬浮液取出结合至结合分 子的细胞。例如，在容许固体支持物结合CRTAM+细胞足够时间之后，用生理缓冲液系统洗 脱或洗掉未结合的细胞。通过任何适宜的方法(主要取决于固相和结合分子的性质)，将结合的细胞与固 相分开。例如，可以通过剧烈搅动自塑料皮氏皿洗脱结合的细胞。或者，可以通过酶促“切 割”或消化固相与抗体之间的酶敏感性“间隔物”序列来洗脱结合的细胞。合适的结合至琼 脂糖珠的间隔物序列可购自例如Pharmacia。然后可以通过离心用缓冲液清洗洗脱的、富集的细胞级分，并以可存活状态低温 保存，供稍后依照本领域已知方法使用。III.已活化⑶4+T细胞群体在另一方面，本发明涉及分离的已活化CD4+T细胞群体，其中例如所述分离的群 体中的大多数或基本上所有T细胞处于晚期活化。在一个实施方案中，所述分离的群体的 特征为(1)表达CRTAM，和(2)细胞因子mRNA表达水平相对于不表达CRTAM的CD4+已活 化T细胞升高。另外，过表达细胞因子mRNA的细胞可展现出升高的细胞因子分泌水平。在 其它实施方案中，所述细胞因子优选是IFN Y、IL22、和/或IL17。在另一个实施方案中，纯化所述分离的群体，使得它比用于分离已活化CD4+T细 胞的粗制细胞群体含有更高比例的已活化CD4+T细胞。纯化的已活化CD4+T细胞群体可以 如下分离，即使含有表达已活化T细胞特征性抗原的T细胞群体的粗制细胞混合物接触特 异性结合该抗原细胞外部分的分子。此类技术称作正选择。已活化T细胞对该分子的结合 容许将T细胞与不表达该抗原的污染性细胞充分区分，以容许自污染性细胞分离T细胞。一 般而言且优选的是，所述抗原包含CRTAM。用于将已活化CD4+T细胞与污染性细胞分开的CRTAM结合分子可以是特异性结合在要分离的已活化CD4+细胞上表达的CRTAM的任何分子。所述分子可以是例如如本文所 述的抗体或其片段。在一个实施方案中，所述分子是CRTAM阻断性抗体或CRTAM非阻断性 抗体。在一个实施方案中，由本发明提供的分离的已活化CD4+T细胞群体含有一种或多 种如本文中所定义的CRTAM+细胞。IV.调控物抗体在一个实施方案中，本发明提供了可在本文中用作治疗剂和/或诊断剂的CRTAM 调控物抗体。例示性的抗体包括多克隆的、单克隆的、人源化的、多特异性的、和异源偶联的 抗体。下文列出了抗体的生成、鉴定、表征、修饰和生产方面，而且它们是本领域已经建立 的技术，例如记载于美国专利申请公布号2005/0042216，第522-563段、第604-608段和第 617-688 段。⑴抗原制备可溶性抗原或其片段(任选偶联有其它分子的)可作为免疫原用于生成抗体。对 于跨膜分子，诸如受体，它们的片段(例如受体的胞外结构域)可用作免疫原。或者，表达 跨膜分子的细胞可用作免疫原。此类细胞可衍生自天然来源(例如癌细胞系)，或者可以是 经重组技术转化而表达跨膜分子的细胞。对于制备抗体有用的其它抗原及其形式对于本领 域技术人员会是显而易见的。(ii)多克隆抗体多克隆抗体优选在动物中生成，通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原 和佐剂。使用双功能或衍生化试剂，例如马来酰亚氨基苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过 半胱氨酸残基偶联)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、S0C12或 RiN = C = NR(其中R和队是不同的烃基)，将相关抗原与在待免疫物种中有免疫原性的蛋 白质偶联可能是有用的，所述免疫原性的蛋白质例如匙孔1威血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状 腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。通过将例如100 y g或5 y g蛋白质或偶联物(分别用于兔或小鼠)与3倍体积的 弗氏完全佐剂混和并将该溶液皮内注射于多个部位，将动物针对抗原、免疫原性偶联物或 衍生物进行免疫。1个月后，通过多个部位的皮下注射，用弗氏完全佐剂中初始量1/5-1/10 的肽或偶联物对动物进行加强免疫。7-14天后，采集动物的血液并测定血清的抗体滴度。 对动物进行加强免疫直到滴度达到平台(Plateau)。优选的是，将动物用相同抗原但与不同 蛋白质和/或通过不同交联剂偶联得到的偶联物进行加强免疫。偶联物还可在重组细胞培 养中作为蛋白质融合物来制备。同样，适当使用凝聚剂诸如明矾来增强免疫应答。(iii)单克隆抗体单克隆抗体可以使用最初由Kohler等，Nature, 256 =495(1975)记载的杂交瘤方 法来生成，或者可以通过重组DNA方法(美国专利No. 4，816，567)来生成。在杂交瘤方法 中，如上所述免疫小鼠或其它适宜的宿主动物，诸如仓鼠或猕猴，以引发生成或能够生成如 下抗体的淋巴细胞，所述抗体将特异性结合用于免疫的蛋白质。或者，可以在体外免疫淋巴 细胞。然后使用合适的融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤 细胞(Goding, Monoclonal Antibodies Principles and Practice, pp. 59-103, Academic Press,1986)。
将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，所述培养基优选含有抑 制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质。例如，若亲本骨髓瘤细胞缺少 次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基典型的将含有 次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。优选的骨髓瘤细胞是那些高效融合、支持所选择的抗体生产细胞稳定且高水平 的生成抗体、且对培养基诸如HAT培养基敏感的骨髓瘤细胞。其中，优选的骨髓瘤细胞 系是鼠骨髓瘤系，诸如那些自可从索尔克研究所细胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USA)获得的 M0PC-21 和 MPC-11 小鼠肿瘤和可 从美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection, Rockville, Md. USA)获 得的SP-2或X63-Ag8-653衍生的。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也有用于生 成人单克隆抗体的记载(Kozbor, J. Immunol.，133 3001(1984) ；Brodeur 等，Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications, pp. 51—63, Marcel Dekker, Inc., NewYork,1987)。可对杂交瘤细胞正在其中生长的培养基测定针对抗原的单克隆抗体的生成。优选 的是，通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射性免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸 附测定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。在鉴定出生成具有期望特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，所述 克隆就可通过有限稀释规程进行亚克隆，并通过标准方法进行培养(Goding，Monoclonal Antibodies :Principles and Practice, pp. 59-103, AcademicPress, 1986)。适于这一目 的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可在动物中作为腹水 瘤进行体内培养。可通过常规免疫球蛋白纯化规程，诸如例如蛋白A-S印harose、羟磷灰石层析、凝 胶电泳、透析、或亲和层析，将由亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水或血清适当分开。编码单克隆抗体的DNA易于使用常规规程分离和测序(例如通过使用能够特异性 结合编码单克隆抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞是此类DNA的优选 来源。一旦分离，就可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染到不另外生成免疫球 蛋白蛋白质的宿主细胞中，诸如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CH0)细胞或 骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。抗体的重组生产在下文中有更 详细描述。在另一个实施方案中，可从使用McCafferty等，Nature，348 :552_554 (1990)中记 载的技术构建的噬菌体抗体库中分离抗体或抗体片段。Clackson 等，Nature，352 :624_628 (1991)及 Marks 等，J. Mol. Biol.，222 581-597(1991)分别记载了使用噬菌体文库进行的鼠和人抗体的分离。后续出版物记 载了通过链改组生成高亲和力(nM范围)的人抗体(Marks等，Bio/Technology 10: 779-783(1992))，以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略 (Waterhouse 等，Nucl. Acids Res. 21 :2265_2266 (1993))。如此，这些技术是用于分离单克 隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方法。也可以修饰DNA，例如通过用人重链和轻链恒定域的编码序列替代同源鼠序列 (美国专利 No. 4，816，567 ；Morrison 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 6851 (1984))，或通
39过将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列共价连接。典型地，用此类非免疫球蛋白多肽替代抗体的恒定域，或者用它们替代抗体的一 个抗原结合位点的可变域，以产生嵌合二价抗体，它包含对一种抗原具有特异性的一个抗 原结合位点和对不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点。在一个实施方案中，本发明提供了制备用于抑制T细胞活化的针对CRTAM的单克 隆抗体的方法。(iv)人源化和人抗体人源化抗体具有一个或多个导入其中的来自非人来源的氨基酸残基。这些非人氨 基酸残基常常称作“输入”残基，它们通常取自“输入”可变域。人源化可基本上遵循Winter 及其同事的方法进行(Jones 等，Nature，321 :522_525 (1986) ；Riechmann 等，Nature，332 323-327(1988) ；Verhoeyen 等，Science，239 :1534_1536 (1988))，即用啮齿类 CDR 或 CDR 序 列替代人抗体的相应序列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4，816，567)， 其中本质上少于整个人可变域用来自非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通 常是其中一些CDR残基和可能的一些FR残基用来自啮齿类抗体中类似位点的残基替代的 人抗体。用于制备人源化抗体的人可变域的选择，包括轻链和重链，对于降低抗原性非常 重要。依照所谓的“最适”(best-fit)法，用啮齿类抗体的可变域序列对已知的人可变域序 列的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类序列最接近的人序列作为人源化抗体的人框架 (FR) (Sims 等，J. Immunol.，151 2296 (1993) ；Chothia 等，J. Mol. Biol.，196 901 (1987))。 另一种方法使用由特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架。同一框 架可用于数种不同的人源化抗体(Carter等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 4285 (1992)； Presta 等，J. Immunol.，151 2623 (1993))。更为重要的是，抗体在人源化后保持对抗原的高亲和力及其它有利的生物学特 性。为了实现这一目的，依照一种优选的方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析 亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是 可获得的，且为本领域技术人员所熟悉。还可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的 可能三维构象结构的计算机程序。检查这些显示图像能够分析残基在候选免疫球蛋白序列 行使功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可从 受体和输入序列中选出FR残基并进行组合，从而获得期望抗体特征，诸如对靶抗原的亲和 力提高。通常，CDR残基直接且最实质的涉及对抗原结合的影响。或者，现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫时生成人 抗体完整全集的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重 链连接区(JH)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转 移大量人种系免疫球蛋白基因将导致在抗原攻击时生成人抗体。参见例如Jakobovits等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 2551 (1993) Jakobovits 等，Nature，362 :255_258 (1993)； Bruggermann 等，Yearin Immunol.，7 :33 (1993)；及 Duchosal 等，Nature, 355 258 (1992)。 还可从噬菌体展示库衍生人抗体(Hoogenboom等，J.Mol.Biol.，227 =381 (1991) ；Marks等， J. Mol. Biol.，222 :581_597 (1991) ；Vaughan 等，Nature Biotech.，14 309 (1996))。下文进 一步描述了自抗体噬菌体展示文库生成人抗体。
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(v)抗体片段已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗 体来衍生这些片段(参见例如 Morimoto 等，Journal of Biochemical andBiophysical Methods 24:107—117(1992)；及 Brennan 等，Science，229 :81 (1985))。然而，现在可直接 由重组宿主细胞生成这些片段。例如，可以从上文讨论的噬菌体抗体库分离抗体片段。或 者，可直接从大肠杆菌回收Fab' _SH片段并化学偶联以形成F(ab' )2片段(Carter等， Bio/Technology 10 163-167 (1992))。在另一个实施方案中，如下文实施例所述，使用亮氨 酸拉链GCN4促进F(ab' )2分子的装配来形成F(ab‘ )2。依照另一种方法，可直接从重组 宿主细胞培养物分离F(ab' )2片段。用于生成抗体片段的其它技术对熟练从业人员将是 显而易见的。在其它实施方案中，所选抗体是单链Fv片段(scFv)。参见W0 93/16185。(vi)多特异性抗体多特异性抗体具有对至少两种不同表位的结合特异性，其中所述表位通常来自不 同抗原。尽管此类分子通常只结合两种不同表位(即双特异性抗体，BsAb)，但是此表述在 用于本文时涵盖具有额外特异性的抗体，诸如三特异性抗体。BsAb的例子包括那些一个臂 针对CRTAM而另一个臂针对另一种在免疫复合物清除中发挥作用的蛋白质，诸如选自CR1、 CR2、CR3、和CR4的巨噬细胞受体。用于构建双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统生产 基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达，其中两种链具有不同的特异性(Millstein等， Nature, 305 :537_539 (1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源 杂交瘤(quadroma))生成10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特 异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦且产物产量低。类似的 规程披露于 W093/08829 及 Traunecker 等，EMB0 J.，10 :3655_3659 (1991)。依照一种不同 的方法，将具有期望结合特异性(抗体_抗原结合位点)的抗体可变域与免疫球蛋白恒定 域序列融合。优选的是，与包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定域进行 融合。优选在至少一种融合物中存在包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。 将编码免疫球蛋白重链融合物和，在需要时，免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体 中，并共转染到合适的宿主生物体中。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供所期望的 最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了很大的灵活性。然而，在 至少两种多肽链以相同比例表达导致高产量时或在该比例没有特别意义时，有可能将两种 或所有三种多肽链的编码序列插入一个表达载体。在该方法的一个实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂 合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异 性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了便利的分离途径， 因此发现这种不对称结构便于将期望的双特异性复合物与不想要的免疫球蛋白链组合分 开。该方法披露于W094/04690。关于生成双特异性抗体的进一步详情参见例如Suresh等， Methodsin Enzymology,121 :210(1986)。依照W096/27011中记载的另一种方法，可改造一对抗体分子间的界面，以将从重 组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大化。优选的界面包含抗体恒定域的至少部分 CH3结构域。在该方法中，将第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换。通过将大氨基酸侧链用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨 酸)替换，在第二抗体分子的界面上产生与大侧链相同或相似大小的补偿性“空腔”。这提 供了较之其它不想要的终产物诸如同二聚体提高异二聚体产量的机制。双特异性抗体包括交联的或“异源偶联的”抗体。例如，可以将异源偶联物中 的一种抗体与亲合素偶联，而将另一种抗体与生物素偶联。此类抗体已经建议用于例如 将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利No. 4，676，980)和用于治疗HIV感染(W0 91/00360,W0 92/200373)。异源偶联抗体可以使用任何方便的交联方法来制备。合适的交 联剂连同许多交联技术是本领域众所周知的，而且披露于美国专利No. 4，676，980。文献中还记载了由抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接来 制备双特异性抗体。Brerman等，Science，229 81(1985)记载了通过蛋白水解切割完整抗 体以生成F(ab' )2片段的规程。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠的情况下还原， 以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫键的形成。然后将产生的Fab'片段转变为硫代硝 基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab' -TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成 Fab'-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab' _TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生 的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。也可以从大肠杆菌直接回收Fab' -SH片段，而且可以将这些片段化学偶联以形 成双特异性抗体。Shalaby等，J. Exp. Med.，175 :217_225 (1992)记载了完全人源化的双特 异性抗体F(ab' )2分子的生成。由大肠杆菌分开分泌每种Fab'片段，并在体外进行定向 化学偶联以形成双特异性抗体。还记载了从重组细胞培养物直接生成和分离双特异性抗体片段的多种技 术。例如，已使用亮氨酸拉链生成双特异性抗体。Kostelny等，J. Immunol. , 148 (5) 1547-1553(1992)。将来自Fos和Jim蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体 的Fab'部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原以形成单体，然后重新氧化以形成抗体异二 聚体。这种方法也可用于生成抗体同二聚体。Hollinger等，Proc. Natl. Acad. Sci.USA，90 6444-6448(1993)记载的“双抗体”技术提供了构建双特异性抗体片段的替代机制。该片段 包含通过接头相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)，所述接头太短使得同一条链上 的两个结构域之间不能配对。因此，迫使一个片段上的VH和VL结构域与另一个片段上的互 补VL和VH结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv) 二 聚体构建双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber等，J. Immunol.，152 =5368(1994)。设想了具有超过两种特异性的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt等， J. Immunol.，147 60(1991)。另外，具有超过一种针对同一抗原的结合特异性的多价(例如 二价)抗体也在本发明的范围内。(vii)效应器功能工程改造可能希望在效应器功能方面修饰本发明的抗体，从而增强抗体的效力。例如，可向 Fc区中引入半胱氨酸残基，从而使得在该区中形成链间二硫键。如此生成的同二聚体抗体 可具有改善的内在化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞的细胞毒 性(ADCC)。参见 Caron 等，J.Exp. Med.，176 1191-1195 (1992)和 Shopes，B.，J. Immunol.， 148 :2918-2922(1992)。具有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体还可使用如Wolff等， Cancer Research, 53 =2560-2565(1993)中记载的异双功能交联剂来制备。或者，抗体可改造成具有双重Fc区，由此可具有增强的补体溶解和ADCC能力。参见Stevenson等， Anti-Cancer Drug Design, 3 :219_230(1989)。(viii)抗体-补救受体结合表位融合物在本发明的某些实施方案中，可能希望使用抗体片段，而非完整抗体，来例如提高 肿瘤穿透。在这种情况中，可能希望修饰抗体片段以延长其血清半衰期。这可通过例如将补 救受体结合表位掺入抗体片段中来实现(例如通过抗体片段中适宜区域的突变或通过将 表位掺入肽标签中然后将该肽标签融合至抗体片段的任一末端或中部，后者通过例如DNA 或肽合成来实现)。补救受体结合表位优选构成这样一个区域，其中将来自Fc结构域的一个或两个 环的任何一个或多个氨基酸残基转移至抗体片段的类似位置。甚至更优选的是，转移来自 Fc结构域的一个或两个环的三个或更多残基。仍更优选的是，表位取自Fc区(例如IgG 的)的CH2结构域并转移至抗体的011、013、或￥11区，或超过一个此类区域。或者，表位取 自Fc区的CH2结构域并转移至抗体片段的CL区或VL区或二者。(ix)抗体的其它共价修饰抗体的共价修饰包括在本发明的范围内。如果适用，它们可通过化学合成或者通 过酶促或化学切割抗体来生成。抗体的其它类型共价修饰如下引入分子，即通过使抗体的 目标氨基酸残基与能够与选定侧链或N-或C-末端残基反应的有机衍生化试剂起反应。共 价修饰的例子记载于美国专利No. 5，534，615，明确收入本文作为参考。一类优选的抗体 共价修饰包括将抗体连接至多种非蛋白质性质聚合物之一，例如聚乙二醇、聚丙二醇、或 聚氧化烯，以美国专利 No. 4，640,835 ；4，496，689 ；4，301，144 ；4，670，417 ；4，791，192 ；或 4，179，337所列方式。(x)从合成的抗体噬菌体文库中产生抗体在一个实施方案中，本发明提供利用独特的噬菌体展示法来产生和挑选新的抗体 的方法。该方法包括产生基于单个框架模板的合成抗体噬菌体文库，设计可变域内的足够 的多样性，展示具有多样化可变域的多肽，选择对靶抗原具有高亲和力的候选抗体，和分离 所选的抗体。噬菌体展示方法的详情可在例如2003年12月11日公开的W003/102157中找到， 将其完整公开内容明确收入本文作为参考。在一个方面，本发明中所用的抗体文库可通过在抗体可变域的至少一个⑶R中突 变溶剂可及的和/或高度多变的位置来产生。一些或全部CDR可用本文提供的方法来突 变。在一些实施方案中，优选突变⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3中的位置以形成单个文库或突变 ⑶RL3和⑶RH3中的位置以形成单个文库或突变⑶RL3和⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3中的位置 以形成单个文库，由此产生多样的抗体文库。例如，可产生这样的抗体可变域文库，其在⑶RH1、⑶RH2和/或⑶RH3中溶剂可及 的和/或高度多变的位置上有突变。产生的另一种文库在⑶RL1、⑶RL2和/或⑶RL3中有 突变。这些文库也可互相结合使用以产生具有期望亲和力的结合物。例如，在一轮或多轮 选择对靶抗原结合的重链文库后，在其它轮次的选择中可将轻链文库替换入重链结合物群 中以提高结合物的亲和力。文库优选通过用重链序列可变区⑶RH3区中的变异氨基酸替代原始氨基酸来产生。所得文库可包含多种抗体序列，其中所述序列多样性主要位于重链序列的CDRH3区中。在一个方面，所述文库在人源化抗体4D5序列、或人源化抗体4D5序列的框架氨基 酸序列的背景中产生。所述文库优选通过用DVK密码子集编码的氨基酸至少替代重链残 基95-lOOa来产生，其中DVK密码子集用于编码这些位置中每个位置的变异氨基酸集。可 用于产生这些替代的寡核苷酸集的例子包括序列(DVK)7。在一些实施方案中，文库通过用 DVK和NNK两个密码子集编码的氨基酸替代残基95-lOOa来产生。可用于产生这些替代的 寡核苷酸集的例子包括序列(DVK) 6 (NNK)。在另一个实施方案中，文库通过用DVK和NNK两 个密码子集编码的氨基酸至少替代残基95-lOOa来产生。可用于产生这些替代的寡核苷酸 集的例子包括序列(DVK)5(NNK)。可用于产生这些替代的寡核苷酸集的另一个例子包括序 列(NNK)6。根据本文所述标准，本领域技术人员可确定合适寡核苷酸序列的其它例子。在另一个实施方案中，利用不同的CDRH3设计来分离高亲和力结合物和分离针对 各种表位的结合物。该文库中产生的CDRH3的长度范围是11至13个氨基酸，尽管也可产 生不同于此的长度。通过用NNK、DVK和NVK密码子集也可拓展H3多样性，以及在N和/或 C-末端处的较有限的多样性。⑶RH1和⑶RH2中也可产生多样性。⑶R-H1和H2多样性的设计遵循目标为模拟 所述带有如下修饰的天然抗体全集的策略，所述修饰使多样性较前述设计更紧密地与天然 多样性相匹配。对于CDRH3中的多样性，可分开构建多个文库，它们具有不同长度的H3，然后组合 起来以选择针对靶抗原的结合物。可合并多个文库并用前述和本文下述的固体支持物选择 和溶液分选法来选择。可采用多种选择策略。例如，一种变化涉及在结合至固相的靶物上 选择，然后分选可能在融合多肽上存在的标签(例如抗gD标签)，然后再一次在结合至固相 的靶物上分选。或者，文库可首先在结合至固体表面的靶物上选择，然后用靶抗原浓度逐渐 减低的溶液相结合来分选所洗脱的结合物。利用不同分选方法的组合来最低限度地只选择 高度表达的序列并选择许多不同的高亲和力克隆。针对靶抗原的高亲和力结合物可由文库分离。H1/H2区中的有限多样性可降低简 并性约104至105倍并允许为更多高亲和力结合物提供更大的H3多样性。利用在CDRH3中 具有不同类型多样性的文库(例如利用DVK或NVT)可分离能与靶抗原的不同表位结合的 结合物。对于如上所述合并的文库中分离的结合物，已经发现亲和力可通过提供轻链中的 有限多样性来进一步提高。在该实施方案中，轻链多样性如下产生，在CDRL1中氨基酸第 28位由RDT编码；氨基酸第29位由RKT编码；氨基酸第30位由RVW编码；氨基酸第31位 由ANW编码；氨基酸第32位由THT编码；任选的，氨基酸第33位由CTG编码；在CDRL2中 氨基酸第50位由KBG编码；氨基酸第53位由AVC编码；任选的，氨基酸第55位由GMA编 码；在CDRL3中氨基酸第91位由TMT或SRT或这两者编码；氨基酸第92位由DMC编码； 氨基酸第93位由RVT编码；氨基酸第94位由NHT编码；和氨基酸第96位由TWT或YKG或 这两者编码。在另一个实施方案中，产生在⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3区中具有多样性的一个或多 个文库。在该实施方案中，用各种长度的H3区并主要用密码子集XYZ和NNK或NNS来产生 CDRH3中的多样性。可用各寡核苷酸形成文库并合并，或者可合并寡核苷酸来形成文库子集。该实施方案的文库可针对结合至固体的靶物进行分选。分离自多次分选的克隆可利用 ELISA测定法来筛选特异性和亲和力。对于特异性，克隆可以针对期望靶抗原以及其它非靶 抗原进行筛选。然后，在溶液结合竞争ELISA测定法或点竞争测定法中对那些针对靶抗原 的结合物筛选亲和力。可以用如上所述制备的XYZ密码子集由文库分离高亲和力结合物。 可方便地在细胞培养中以高产率将这些结合物制备成抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，可能希望产生在⑶RH3区长度方面具有更大多样性的文库。 例如，可能希望产生⑶RH3区的长度范围为约7至19个氨基酸的文库。由这些实施方案中的文库分离的高亲和力结合物可方便地在细菌和真核细胞培 养中以高产率产生。可设计载体以方便地去除如下序列诸如gD标签、病毒外壳蛋白成分序 列，和/或增加恒定区序列来高产率地产生全长抗体或抗原结合片段。可以将⑶RH3中有突变的文库与包含不同型式的其它⑶R(例如⑶RL1、⑶RL2、 ⑶RL3、⑶RH1和/或⑶RH2)的文库组合。因此，例如，在一个实施方案中，将⑶RH3文库与 ⑶RL3文库组合，所述⑶RL3文库用预先确定的密码子集在第28、29、30、31、和/或32位有 变异氨基酸的人源化4D5抗体序列的背景中产生。在另一个实施方案中，可将CDRH3有突变 的文库与包含变异CDRH1和/或CDRH2重链可变域的文库组合。在一个实施方案中，所述 ⑶RH1文库用第28、30、31、32和33位有变异氨基酸的人源化抗体4D5序列产生。⑶RH2文 库可用预先确定的密码子集用第50、52、53、54、56和58位有变异氨基酸的人源化抗体4D5 序列产生。(xi)抗体突变体可进一步修饰噬菌体文库产生的新抗体以产生抗体突变体，所述抗体突变体具有 比亲本抗体改善了的物理、化学和/或生物学性质。当所用的测定法是生物学活性测定法 时，优选抗体突变体在所选测定法中的生物学活性比亲本抗体在该测定法中的生物学活性 好至少约10倍，优选好至少约20倍，更优选好至少约50倍，有时好至少约100倍或200倍。 例如，优选抗CRTAM抗体突变体针对CRTAM的结合亲和力比亲本抗体的结合亲和力强至少 约10倍，优选强至少约20倍，更优选强至少约50倍，有时强至少约100倍或200倍。为了产生抗体突变体，将一处或多处氨基酸改变(例如替代)导入亲本抗体的一 个或多个高变区。或者/另外，可将框架区残基的一处或多处改变(例如替代)导入亲本 抗体，这些改变导致抗体突变体针对来自第二哺乳动物物种的抗原的结合亲和力有所改 善。要修饰的框架区残基的实例包括那些直接非共价结合抗原的(Amit等(1986)Science 233 747-753)；相互作用于 / 影响 CDR 构象的(Chothia 等(1987) J. Mol. Biol. 196 901-917)；和/或参与VfVH界面的(EP 239 400B1)残基。在某些实施方案中，一个或多个 这类框架区残基的修饰导致抗体针对来自第二哺乳动物物种的抗原的结合亲和力有所增 强。例如，在本发明的该实施方案中，可改变约1个至约5个框架残基。有时，这可足以产 生适用于临床前试验中的抗体突变体，甚至其中没有高变区残基被改变。可是通常，抗体突 变体将包含别的高变区改变。改变的高变区残基可以是随机改变的，尤其是在其中亲本抗体的起始结合亲和力 使得这类随机产生的抗体突变体可方便地被筛选出来。可用于生成此类抗体突变体的一种方法称作“丙氨酸扫描诱变”(Cunningham和 Wells (1989) Science 244 1081-1085)。这里，一个或多个高变区残基用丙氨酸或多丙氨酸残基替代，以影响氨基酸与来自第二哺乳动物物种的抗原的相互作用。然后通过在或对替 代位点引入更多或其它突变，推敲那些对替代展现出功能敏感性的高变区残基。如此，虽然 引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，但是突变本身的性质不需要预先决定。如本文 所述对如此生成的丙氨酸突变体筛选它们的生物学活性。通常，从保守替代诸如下文显示在标题“优选替代”下的那些开始。如果此类替代 导致生物学活性(例如结合亲和力)的改变，那么引入下表中称为“例示替代”的更实质性 改变，或如下文中关于氨基酸种类的进一步描述，并筛选产物。例示/优选替代 对抗体生物学特性的甚至更实质性修饰通过选择在保持以下方面的效果上显著 不同的替代来完成(a)替代区域的多肽主链的结构，例如作为折叠片或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。基于共同的侧链特性，将天然存在残基如 下分组(1)疏水性的正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile ；(2)中性、亲水性的cys、ser、thr、asn、gin ；(3)酸性的asp、glu ；(4)碱性的his、lys、arg ；(5)影响链取向的残基gly、pro ’及(6)芳香族的trp、tyr、phe。非保守替代将需要用这些类别之一的一个成员替换另一个类别的。在另一个实施方案中，利用噬菌体展示(见上)，对为修饰而选择的位点进行亲和 力成熟。编码氨基酸序列突变体的核酸分子由本领域已知的多种方法制备。这些方法包括 但不限于，寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变、和盒式诱变早先制备的突变或非突变 型式的亲本抗体。制备突变体的优选方法是定点诱变(参见例如Kimkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 488)。在某些实施方案中，抗体突变体仅有单个高变区残基被替代。在其它实施方案中， 有亲本抗体的两个或更多个高变区残基被替代，例如约2个至约10个高变区替代。通常，生物学特性得到改善的抗体突变体所具有的氨基酸序列与亲本抗体重链 或轻链可变域的氨基酸序列有至少75%，更优选至少80%，更优选至少85%，更优选至少 90%，和最优选至少95%的氨基酸序列同一性或相似性。关于此序列的同一性或相似性在 本文中定义为在比对序列并在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性后，候选序列 中与亲本抗体残基相同(即相同残基)或相似(即根据共同侧链特性来自同一组的氨基酸 残基，见上文)的氨基酸残基的百分比。N-末端、C-末端、或内部的延伸、删除、或插入可变 域以外的抗体序列都不应视为影响序列同一性或相似性。产生抗体突变体后，测定该分子相对于亲本抗体的生物学活性。如上所示，这可包 括测定抗体的结合亲和力和/或其它生物学活性。在本发明的一个优选实施方案中，制备 一组抗体突变体并筛选针对抗原或其片段的结合亲和力。任选将该初始筛选中选出的一个 或多个抗体突变体进行一种或多种其它生物学活性测定法以确证结合亲和力增强的抗体 突变体是真正有用的，例如可用于临床前研究。这样选出的抗体突变体可进一步修饰，修饰时常取决于抗体的预期用途。此类修 饰可包括进一步改变氨基酸序列，融合异源多肽和/或共价修饰，诸如下文所详述的那些。 对于氨基酸序列改变，示例性的修饰上文有详述。例如，也可替代任何不涉及保持抗体突变 体正确构象的半胱氨酸残基，一般替代为丝氨酸，用以改善分子的氧化稳定性并防止异常 交联。相反地，可向抗体中加入半胱氨酸键以改善其稳定性(特别是在抗体是抗体片段，诸 如Fv片段时)。另一类氨基酸突变体具有改变的糖基化模式。这可通过删除抗体中发现的 一个或多个碳水化合物模块和/或增加不存在于抗体中的一个或多个糖基化位点来实现。 抗体糖基化通常是N-连接的或0-连接的。N-连接的指碳水化合物模块附着于天冬酰胺残 基侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X是除了脯氨酸之外 的任何氨基酸，是碳水化合物模块酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中存在这些三肽序列之任一产生潜在的糖基化位点。0-连接的糖基化指糖类N-乙酰半乳糖胺、半 乳糖、或木糖之一附着于羟基氨基酸(最常见的是丝氨酸或苏氨酸，尽管也可用5-羟脯氨 酸或5-羟赖氨酸)。在抗体上增加糖基化位点可通过改变氨基酸序列使之包含一个或多个 上述的三肽序列来方便地实现(用于N-连接的糖基化位点)。也可在原始抗体序列中通过 添加、或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来产生改变(用于0-连接的糖基化位点)。(xii)抗体的重组生产为了重组生产抗体，分离编码抗体的核酸，并插入可复制载体中，用于进一步克隆 (DNA扩增)或表达。编码单克隆抗体的DNA易于使用常规规程分离和测序(例如通过使用 能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。可以获得许多载体。载 体构件通常包括但不限于下列一种或多种信号序列、复制起点、一种或多种标志基因、增 强子元件、启动子、和转录终止序列(例如如美国专利No. 5，534，615中所记载的，明确收入 本文作为参考)。适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞是上文描述的原核生物、酵母 或高等真核细胞。适于此目的的原核生物包括真细菌，诸如革兰氏阴性生物体或革兰 氏阳性生物体，例如肠杆菌科，诸如埃希氏菌属(Escherichia)例如大肠埃希氏菌或 大肠杆菌(E. coli)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌 属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏 菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、和志贺氏菌属(Shigella)、以及芽孢杆菌属(Bacilli)诸如枯草芽孢杆 菌(B. subtilis)和地衣芽孢杆菌(B. licheniformis)(例如1989年4月12日公布的 DD 266，710中披露的地衣芽孢杆菌41P)、假单胞菌属(Pseudomonas)诸如铜绿假单胞菌 (P. aeruginosa)、和链霉菌属(Str印tomyces)。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌 294仏了031，446)，尽管其它菌株诸如大肠杆菌8、大肠杆菌乂1776仏10 31,537)和大肠杆 菌W3110(ATCC 27，325)也是合适的。这些例子是例示性的，而不是限制性的。在原核生物以外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是编码抗体的载体的合 适克隆或表达宿主。酿酒糖酵母或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常用 的面包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。然而，通常可获得许多其它属、种和菌 株且可用于本发明，诸如粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵 母属(Kluyveromyces)宿主，诸如例如乳酸克鲁维酵母(K. lactis)、脆壁克鲁维酵母 (K. fragilis) (ATCC 12，424)、保加利亚克鲁维酵母(K. bulgaricus) (ATCC 16，045)、威克 克鲁维酵母(K. wickeramii) (ATCC 24，178)、K. waltii (ATCC 56，500)、果蝇克鲁维酵母 (K. drosophilarum) (ATCC 36，906)、耐热克鲁维酵母(K. thermotolerans)和马克思克鲁 维酵母(K. marxianus)；亚罗酵母属(Yarrowia) (EP 402, 226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris) (EP 183, 070)；假丝酵母属(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia) (EP 244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，诸如西方许 旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；禾口丝状真菌，诸如例如脉抱菌属(Neurospora)、 青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)、和曲霉属(Aspergillus)宿主诸如构 巢曲霉(A. nidulans)和黑曲霉(A. niger)。适于表达糖基化抗体的宿主细胞衍生自多细胞生物体。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株和变体及相应的允许昆虫宿主细胞，它们 来自诸如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、 白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和 家蚕(Bombyx mori)等宿主。公众可获得多种病毒株用于转染，例如苜蓿尺蠖(Autographa californica)NPV的L_1变体和家蚕(Bombyx mori)NPV的Bm_5株，而且此类病毒可依照本 发明用作本文中的病毒，特别是用于转染草地夜蛾细胞。还可利用棉、玉米、马铃薯、大豆、 矮牵牛、番茄和烟草的植物细胞培养物作为宿主。然而，脊椎动物细胞得到最多关注，而且培养(组织培养)中脊椎动物细胞的 繁殖已经成为常规流程。有用哺乳动物宿主细胞系的例子是用SV40转化的猴肾CV1系 (C0S-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾系(293或为了在悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞， Graham 等，J. Gen Virol. ,36 59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK, ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵 巢细胞/-DHFR(CH0，Urlaub 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 4216(1980))；小鼠塞托利 (sertoli)细胞(TM4，Mather, Biol. R印rod. ,23 :243_251 (1980))；猴肾细胞(CV1, ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VER0-76, ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCCCCL 2)； 犬肾细胞(MDCK, ATCC CCL 34)；牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A, ATCC CRL 1442)； 人肺细胞(ff 138, ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB8065)；小鼠乳瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51) ；TRI 细胞(Mather 等，Annals N. Y. Acad. Sci.，383 44-68 (1982) ；MRC5 细胞；FS4 细胞；和人肝瘤系(Hep G2)。用上文所述用于生产抗体的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动 子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当更改的常规营养培养基中进行培养。可以在多种培养基中培养用于生产本发明抗体的宿主细胞。商品化培养基诸如 Ham 氏 F10 (Sigma)、极限必需培养基(MEM, Sigma)、RPMI-1640 (Sigma)、禾口 Dulbecco 氏改 良的Eagle氏培养基(DMEM，Sigma)适于培养宿主细胞。另外，可以使用下列文献中记载 的任何培养基作为宿主细胞的培养基:Ham等，Meth. Enz. 58 44(1979) ；Barnes等，Anal. Biochem. 102 255(1980)；美国专利 No. 4，767，704 ；4，657，866 ；4，927，762 ；4，560，655 ；或 5，122，469 ；W090/03430 ；W0 87/00195 ；或美国专利复审30，985。任何这些培养基可以根据 需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯 化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如 GENTAMYCIN )、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、和葡萄 糖或等效能源。还可以以本领域技术人员知道的适宜浓度包含任何其它必需补充物。培养 条件，诸如温度、PH等，就是先前为表达而选择用于宿主细胞的，这对于普通技术人员而言 是显而易见的。在使用重组技术时，可以在细胞内、在周质空间中生成抗体，或者直接分泌到培养 基中。如果在细胞内生成抗体，那么作为第一步，通过例如离心或超滤除去宿主细胞或裂解 细胞的微粒碎片。如果将抗体分泌到培养基中，那么通常首先使用商品化蛋白质浓缩滤器， 例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元浓缩来自此类表达系统的上清液。在任何上 述步骤中，可以包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF来抑制蛋白水解，而且可以包括抗生素来防止 外来污染物的生长。可以使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析来纯化由细胞制备的抗体组合物，优选的纯化技术是亲和层析。蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于抗体中存在 的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人Yl、Y2或 重链的抗体(Lindmark等，J. Immunol. Meth. 62 1-13 (1983)) 蛋白G推荐用于所有小鼠同 种型和人Y3(Guss等，EMBO J.5 :1567-1575(1986))。亲和配体所附着的基质最常用的是 琼脂糖，但是可以使用其它基质。物理稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯) 苯容许获得比琼脂糖所能获得的更快的流速和更短的加工时间。若抗体包含Ch3结构域， 则可使用Bakerbond ABX 树脂(J. T. Baker，Phi 11 ipsburg，NJ)进行纯化。根据待回收的 抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术，诸如离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土 上的层析、肝素SEPHAR0SE 上的层析、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上 的层析、层析聚焦、SDS-PAGE、和硫酸铵沉淀。(xiii)抗体偶联物在另一个方面，本发明涉及包含偶联有细胞毒剂的抗体的抗体偶联物或免疫偶联 物，所述胞毒剂诸如化疗剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素，或其片 段)或放射性同位素(即放射偶联物)。上文已经描述了可用于生成此类免疫偶联物的化疗剂。可使用的酶活毒素 及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假 单孢菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒 素(modeccin)A链、a-帚曲毒素(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)毒蛋白、香石竹 (dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca Americana)毒蛋白(PAPI、PAPII 和 PAP-S)、苦 瓜(momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂 草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒素(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局 限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌毒素 (tricothecenes)。有多种放射性核素可用于生成放射偶联抗体。例子包括212Bi、mI、mIn、 90Y 和 186Re。使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和细胞毒剂的偶联物，诸如3_(2_吡啶 基二巯基)丙酸N-琥珀酰亚氨基酯(SPDP)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰 亚胺二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化 合物(诸如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对重氮苯甲酰基)乙 二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2， 4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitetta等，Science 238 =1098(1987)中所述 制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙 酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见W094/11026。本领 域技术人员会领会别的适合于本发明偶联物的偶联剂。在另一个实施方案中，可将抗体与“受体”(诸如链霉亲合素)偶联，用于组织的预 定位，其中对患者施用抗体_受体偶联物，随后使用清除剂从循环中除去未结合的偶联物， 然后施用与胞毒剂(如放射性核苷酸)偶联的“配体”(例如亲合素)。CRTAMV. CRTAM调控物多肽—方面，本发明的CRTAM调控物包括多肽。在一个实施方案中，调控物多肽拮抗已活化T细胞中的CRTAM活性。在一个实施方案中，调控物多肽拮抗已活化T细胞中的 Scrib活性。在一个实施方案中，所述多肽结合，优选特异性结合CRTAM或与CRTAM相互作 用的胞内分子，使得与CRTAM-Scrib相互作用有关的生物学活性得到抑制。在一个实施方 案中，调控物多肽激动已活化T细胞中的CRTAM活性。在一个实施方案中，所述多肽结合， 优选特异性结合CRTAM，使得与CRTAM有关的生物学活性得到模拟或增强。在一个实施方 案中，所述多肽结合，优选特异性结合与CRTAM相互作用的胞外分子，使得与CRTAM-胞外 分子有关的生物学活性得到模拟或增强。多肽可以使用已知的肽合成方法学化学合成，或 者可以使用重组技术制备和纯化。在一个实施方案中，CRTAM调控物多肽的长度是至少约 5 个氨基酸，或者长度为至少约 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、 49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、 74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、 99或100个氨基酸或更长，其中此类多肽能够调控CRTAM活性。这些多肽无需过多试验就 可使用公知技术来鉴定。在这点上，注意到用于对寡肽文库筛选能够特异性结合多肽靶物 的寡肽的技术是本领域公知的(参见例如美国专利号5，556，762，5，750，373，4，708，871， 4，833，092，5，223，409，5，403，484，5，571，689，5，663，143 ;PCT 公布号 TO 84/03506 和 W0 84/03564 ；Geysen 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81 =3998-4002 (1984) ；Geysen 等， Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82 178-182 (1985) ；Geysen in Synthetic Peptides as Antigens，130-149(1986) ；Geysen 等，J. Immunol. Meth. 102 :259_274 (1987) ；Schoofs 等， J. Immunol. 140 611-616 (1988) ；Cwirla, S. E.等，(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378 ；Lowman, H. B.等，(1991)Biochemistry 30 10832 ；Clackson, T.等，(1991)Nature 352 624 ；Marks, J. D.等，(1991), J. Mol. Biol. 222 581 ；Kang，A. S.等，(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 8363 ；Smith, G. P. ， (1991)Current Opin. Biotechnol. 2 668)。在这点上，噬菌体展示是一种可以筛选大型寡肽文库来鉴定那些文库中能够特 异性结合多肽靶物的成员的公知技术。噬菌体展示是将变体多肽作为与外壳蛋白的融合 蛋白展示在噬菌体颗粒表面的一种技术(Scott, J. K. andSmith, G. P. (1990) Science 249 386)。噬菌体展示的效用在于，可以对选择性随机化蛋白质变体(或随机克隆cDNA)的大 型文库迅速且有效的分选那些以高亲和力结合靶分子的序列。在噬菌体上展示肽(Cwirla， S.E.等，(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378)或蛋白质(Lowman, H. B.等，(1991) Biochemistry 30 10832 ；Clackson, T.等，(1991)Nature 352 624 ；Marks, J. D.等， (1991) J. Mol. Biol. 222 581 ；Kang, A. S.等，(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA88 8363) 文库已经用于对数百万多肽或寡肽筛选具有特异结合特性的那些(Smith，G.P. (1991) Current Opin. Biotechnol. 2 668)。分选随机突变体的噬菌体文库需要构建和扩增大量变 体的策略，使用靶受体进行亲和纯化的流程，及评估结合富集的结果的手段。参见美国专利 5，223，409，5，403，484，5，571，689 和 5，663，143。尽管大多数噬菌体展示方法已经使用丝状噬菌体，入类(lambdoid)噬菌体展示 系统(TO 95/34683 ；US 5，627，024)、T4 噬菌体展示系统(Ren 等，Gene, 215 439(1998)； Zhu 等，Cancer Research, 58 (15) :3209_3214 (1998) Jiang 等，Infection & Immunity, 65(11) 4770-4777(1997) ； Ren 等，Gene, 195(2) :303_311 (1997) ； Ren, Protein Sci.，5 1833(1996) ；Efimov 等，Virus Genes，10 173 (1995))和 T7 噬菌体展示系统(Smith and Scott, Methods in Enzymology, 217 228-257 (1993) ；U. S. 5, 766, 905)也是已知的。现在已经对基础噬菌体展示概念开发了很多其它改进和变异。这些改进增强了展 示系统对肽文库筛选与选定靶分子的结合及展示功能性蛋白质的能力，所述功能性蛋白质 具有对这些蛋白质筛选期望特性的潜力。已经开发了用于噬菌体展示反应的组合反应装置(W0 98/14277)，而且噬菌体展 示文库已经用于分析和控制生物分子相互作用(W0 98/20169 ；W098/20159)和受约束螺 旋肽的特性(W0 98/20036)。W0 97/35196描述了分离亲和配体的方法，其中使噬菌体展 示文库接触第一种溶液和第二种溶液以选择性分离结合的配体，在第一种溶液中配体将 结合靶分子，而在第二种溶液中亲和配体将不会结合靶分子。W0 97/46251描述了这样一 种方法，即用亲和纯化的抗体生物淘选随机噬菌体展示库，然后分离结合的噬菌体，随后 使用微量板的孔进行淘选过程以分离高亲和力结合的噬菌体。已经报道了金黄色葡萄球 菌(Staphylococcus aureus)蛋白 A 作为亲和标签的使用(Li 等，(1998)Mol. Biotech. 9 187)。W0 97/47314描述了底物扣除文库用于区别酶特异性的用途，其中使用可以是噬菌体 展示库的组合文库。W0 97/09446描述了使用噬菌体展示选择适用于洗涤剂的酶的方法。 美国专利5，498，538，5，432，018和W0 98/15833中描述了选择特异性结合的蛋白质的其它 方法。产生肽文库和筛选这些文库的方法还公开于美国专利5，723，286,5, 432，018， 5，580，717，5，427，908，5，498，530，5，770，434，5，734，018，5，698，426，5，763，192，和 5，723，323。用于生成、鉴定、表征、修饰和生产调控物多肽的方法是本领域已经建立的，例如 记载于美国专利申请公布号2005/0042216第606-608段和第614-688段。VI. CRTAM调控物小分子在一个实施方案中，CRTAM调控物小分子指本文所定义的寡肽或抗体以外，调 控CRTAM活性的有机分子。CRTAM调控物小分子可以使用已知方法学来鉴定和化学合成 (参见例如PCT
发明者叶江华, 安德鲁·陈 申请人:健泰科生物技术公司