提高糖蛋白唾液酸化作用的组合物与方法

专利名称：提高糖蛋白唾液酸化作用的组合物与方法
技术领域：
本发明一般涉及唾液酸酶。特别地，本发明涉及提高糖蛋白唾液酸化作用的组合 物与方法。
背景技术：
采用DNA重组技术培养哺乳动物细胞而生产的糖蛋白，代表了人类保健治疗药品 中的一个重要的种类。糖蛋白的生物学功能往往高度依赖于其碳水化合物结构。在糖蛋白 中发现的众多糖中，末端唾液酸被认为是特别重要的。已发现，唾液酸影响各种糖蛋白的溶 解度、热稳定性、抗蛋白酶的攻击、抗原性以及比活性。糖蛋白中唾液酸的量是两个相反过 程的结果，即通过唾液酸转移酶活性胞内增加唾液酸以及通过唾液酸酶切割胞外去除唾液 酸。当从血清糖蛋白除去末端唾液酸时，与唾液酸化的对应物(counterpart)相比， 去唾液酸化的蛋白具有显著降低的循环半衰期。其他糖蛋白中唾液酸的去除与降低的生物 活性和增加的血清清除率有关。此外，在分批培养的细胞生产糖蛋白的过程中，营养物质的 消耗和产物的积累可能会改变细胞环境，使得蛋白质糖基化随着时间变化而降低。再者，由 此产生的糖蛋白往往有糖形异质性，并且，生产过程中有显著的批次变化。这些变化在用于 蛋白质治疗药物大规模生产的生物加工过程中是不可接受的。因此，在哺乳动物细胞培养 系统中，我们往往需要使糖蛋白产物中最终唾液酸含量最大化，以确保其作为有效药物的 质量和一致性。因此，存在对具有增强的糖蛋白唾液酸化作用的哺乳动物细胞培养系统的 需求。这一系统将提高充分唾液酸化的重组糖蛋白的生产。发明概述在本发明的各个方面中，提供了一种细胞系，该细胞系包括至少一种编码非细胞 质唾液酸酶的染色体整合的核酸序列的受破坏的表达。表达受到破坏的非细胞质唾液酸酶 的氨基酸序列选自由以下组成的组(a)与SEQ IDNO :2至少约95%同一的序列，和(b)与 SEQ ID NO :4至少约80%同一的序列。本发明的另一个方面包括一种生产糖蛋白的方法。该方法包括在细胞中表达编码 糖蛋白的核酸序列，所述细胞包括至少一种编码非细胞质唾液酸酶的染色体整合的核酸序 列的受破坏的表达，其中糖蛋白相对于适当对照，具有增强的唾液酸化作用。在细胞中表达 受到破坏的非细胞质唾液酸酶的氨基酸序列选自由以下组成的组(a)与SEQ ID N0:2至 少约95%同一的序列，和(b)与SEQ ID NO :4至少约80%同一的序列。本发明的另一个方面提供了一种分离的核酸，该核酸编码氨基酸序列由SEQ ID NO 2组成的多肽。本发明的另一个方面还包括一种分离的核酸，该核酸编码氨基酸序列由SEQ ID NO 4组成的多肽。本发明的另一个可选方面提供了一种纯化的多肽，该多肽的氨基酸序列由SEQ ID NO 2组成。本发明的另一个方面包括一种纯化的多肽，该多肽的氨基酸序列由SEQID NO 4组成。本发明的其他方面和特征在下面更为详细地描述。彩色附图的引用本申请文件包含至少一副彩色照片。具有彩色照片的这一专利申请公布文本的拷 贝在经过请求和偿付必要的费用后由专利局提供。


图1示出由CHO NeuU Neu2和Neu3基因编码的蛋白质的唾液酸酶活性。所呈现 的是，使用含有所示各种基因的编码区的表达构建体(或任何空表达构建体)转染的细胞 溶胞产物中的酶活性。图2示出由CHO NeuU Neu2和Neu3基因编码的蛋白质的唾液酸酶活性的抑制。 所呈现的是，在不存在或存在两种浓度的两种不同的唾液酸酶抑制剂的情况下，在用含有 各种基因编码区的表达构建体转染的细胞的溶胞产物中所测量的酶活性。图3示出Neul、Neu2和Neu3蛋白质的亚细胞位置。所呈现的是共焦荧光显微图 像，其中带FLAG标签的Neu蛋白质以绿色显示，溶酶体(Lys)标志物以红色显示，而质膜 (PM)标志物以蓝色显示。图4示出采用小干扰RNA(siRNA)技术对Neul、Neu2和Neu3mRNA表达的敲低。所 呈现的是，在使用基因特异性siRNA (S1-S5)或者靶向不相关GFP核酸序列的对照siRNA (C) 敲低各种基因后，采用基因特异性引物通过RT-PCR扩增的产物。对照基因(β_2微球蛋白 (microglubulin), β 2Μ)的表达不受 siRNA 影响。图 5 示出采用小干扰 RNA(siRNA)技术对(A)Neul、(B)Neu2 和(C)Neu3mRNA的敲低表达。所呈现的是Q-RT PCR结果，其显示当使用对每种Neu基因特异 的siRNA或者靶向不相关核酸序列(GFP)的对照siRNA时，各种基因的相对表达。图6示出CHO-hlFNY细胞中的唾液酸酶活性，其中在CH0_hIFN γ细胞中Neu 基因的表达使用siRNA敲低。所呈现的是CHO-hlFNY细胞中的唾液酸酶活性，其中在 CHO-hlFN γ细胞中每种Neu基因被沉默，两种Neu基因被沉默，或者全部Neu基因被沉默。 还显示的是缺乏siRNA构建体(CHO)或者包括靶向不相关核酸序列(GFP)的对照siRNA的 CHO-hlFN γ细胞中唾液酸酶的活性。图 7 示出采用短发夹 RNA (shRNA)技术对(A) Neul、(B) Neu2 和(C) Neu3mRNA 表达 的稳定的敲低。所呈现的是Q-RT PCR结果，其显示相应敲低的CH0-hIFNY细胞或者对照 CHO-hlFN γ细胞(非靶向)中每种唾液酸酶基因的相对表达，所述对照CH0-hIFNY细胞包 括靶向不相关核酸序列的对照siRNA。图8示出使用shRNA对CHO-hlFN γ细胞中唾液酸酶活性的稳定的敲低。所呈现 的是CHO-hlFNy细胞中唾液酸酶的活性，其中在CHO-hlFNy细胞中，唾液酸酶基因(Neul、 Neu2或Neu3)中的每一种被沉默。还显示了对照CHO-hlFN γ细胞(非靶向)中的唾液酸 酶活性，所述对照CH0-hIFNY细胞包括靶向不相关核酸序列的对照shRNA。*p < 0. 005， **p < 0. 0001。图9示出细胞生长不受唾液酸酶基因沉默影响。所呈现的是作为培养天数函数的 细胞生长(即，活细胞密度(V⑶)和生存力百分比)。对CH0-hIFNY细胞(其中每种唾液
6酸酶基因(Neul、Neu2或Neu3)被敲低)或者对照(非靶向)CH0_hIFN γ细胞(其包括靶 向不相关核酸序列的对照shRNA)绘制生长数据的图。图10示出人干扰素γ (hIFNy)的产生不受唾液酸酶基因沉默影响。所绘制的是 由CHO-hlFNy细胞或者对照(非靶向)CHO-hlFNy细胞产生的hIFNy蛋白的水平，在所 述CHO-hlFNy细胞中，每种唾液酸酶基因(Neul、Neu2或Neu3)被敲低。图11示出唾液酸酶敲低细胞产生了具有增加的唾液酸水平的糖蛋白。所绘制的 是由CHO-hlFNY细胞(其中每种唾液酸酶基因(Neul、Neu2或Neu3)被敲低)或者对照 (非靶向)CHO-hlFNY细胞(其包括靶向不相关核酸序列的对照shRNA)产生的人干扰素 Y (hIFN γ )中的唾液酸的浓度。NS，不显著，*p < 0. 01，**p < 0. 05。发明详述唾液酸酶是从糖蛋白和糖脂中去除末端唾液酸残基的酶。已知中国仓鼠卵巢 (CHO)细胞含有细胞质唾液酸酶。本发明的发明人已经分离并表征了 CHO细胞中另外两种 唾液酸酶，即溶酶体唾液酸酶和质膜相关唾液酸酶。因此，本发明提供了包括两种新鉴定 的唾液酸酶基因的受破坏的表达的细胞系，其中所述基因单独，相互组合，或者与细胞质唾 液酸酶组合。本发明还提供了使用包括受破坏的唾液酸酶表达的细胞生产感兴趣的糖蛋白 的方法。一般而言，相对于具有正常唾液酸酶活性的亲代细胞所生产的糖蛋白，由本发明的 方法所生产的糖蛋白具有增加的唾液酸含量。(I)非细胞质唾液酸酶本发明的一个方面包括一种分离的核酸序列，该核酸序列编码氨基酸序列由SEQ ID NO :2组成的多肽。一般而言，分离的核酸序列与SEQ ID NO :1至少约80%同一。在一 些实施方案中，分离的核酸序列可与SEQ ID NO 1约80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或99. 5%同一。在其他实施方案中，分离的核酸序列可 主要由SEQ ID N0:1组成。在这些实施方案中，可能有侧翼于分离的核酸序列的5’端、3’ 端或者两端的其他外源核苷酸序列。外源核苷酸序列可以是包括用于克隆的限制性内切核 酸酶切割位点的连接体，与用于扩增和/或其他检测方法的引物互补的连接体，及类似物。 在另外一些实施方案中，分离的核酸序列可由SEQ ID N0:1组成。本发明的另一个方面提供了一种分离的核酸序列，该核酸序列编码氨基酸序列由 SEQ ID NO :4组成的多肽。一般而言，分离的核酸序列与SEQ IDNO :3至少约80%同一。在 一些实施方案中，分离的核酸序列可与SEQ IDNO 3约80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或99. 5%同一。在其他的实施方案中，分离的核酸序列 可主要由SEQ ID NO :3组成。在这些实施方案中，可能有侧翼于分离的核酸序列的5’端、3’ 端或者两端的其他外源核苷酸序列。外源核苷酸序列可以是包括用于克隆的限制性内切核 酸酶切割位点的连接体，与用于扩增和/或其他检测方法的引物互补的连接体，及类似物。 在另外一些实施方案中，分离的核酸序列可由SEQ ID N0:3组成。本发明的另一个方面包括了一种纯化的多肽，所述纯化的多肽的氨基酸序列可与 SEQ ID NO :2的氨基酸序列至少约95%同一，其中纯化的多肽具有唾液酸酶的活性。在一 些实施方案中，纯化的多肽的氨基酸序列可与SEQ IDNO 2的氨基酸序列约95、96、97、98、 99或99. 5%同一。在其他的实施方案中，纯化的多肽的氨基酸序列可主要由SEQ ID NO 2 组成。在这些实施方案中，可能有侧翼于纯化的多肽的氨基末端、羧基末端或者两端的外源
7氨基酸序列，其中纯化的多肽的生物活性没有改变。这些外源氨基酸序列可包括，但不限于 抗体表位标签，如FLAG标签、myc标签、6xHis标签、HA标签、GST标签、HSV标签，及类似物。 在进一步的实施方案中，纯化的多肽的氨基酸序列可由SEQ ID NO :2组成。通常，由SEQ ID NO 2编码的多肽(或相关多肽)位于真核细胞的溶酶体。本发明的另一个方面还提供了一种纯化的多肽，所述纯化的多肽的氨基酸序列可 与SEQ ID NO :4的氨基酸序列至少80%同一，其中纯化的多肽具有唾液酸酶的活性。在一 些实施方案中，纯化的多肽的氨基酸序列可与SEQ IDNO 4的氨基酸序列约80、81、82、83、 84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 99. 5% 同一。在其他的实施方案 中，纯化的多肽的氨基酸序列可主要由SEQ ID N0:4组成。在这些实施方案中，可能有侧 翼于纯化的多肽的氨基末端、羧基末端或者两端的外源氨基酸序列，其中纯化的多肽的生 物活性没有改变。这些外源氨基酸序列可包括，但不限于抗体表位标签，如FLAG标签、myc 标签、6xHis标签、HA标签、GST标签、HSV标签，及类似物。在进一步的实施方案中，纯化的 多肽的氨基酸序列可由SEQ ID NO 4组成。通常，由SEQ ID NO 2编码的多肽(或相关多 肽)位于真核细胞的质膜。(II)包括受破坏的唾液酸酶表达的细胞系本发明的另一个方面提供了细胞系，在该细胞系中至少一种编码非细胞质唾液酸 酶的内源性、染色体整合的核酸序列的表达被破坏，使得细胞系具有降低的唾液酸酶活性。 该细胞系还可包括编码细胞质唾液酸酶的内源性、染色体整合的核酸序列的受破坏的表 达。在一些实施方案中，该细胞系包括至少一种编码非细胞质唾液酸酶的染色体整合 的核酸序列的受破坏的表达，其中唾液酸酶的氨基酸序列选自由以下组成的组(a)与SEQ ID NO :2至少约95%同一的序列，和(b)与SEQ IDNO :4至少约80%同一的序列。在一些 实施方案中，表达受到破坏的非细胞质唾液酸酶可与SEQ ID NO :2约95、96、97、98、99或者 99，5%同一。在另一个实施方案中，表达受到破坏的非细胞质唾液酸酶可主要由SEQ IDNO 2组成。在另一个实施方案中，表达受到破坏的非细胞质唾液酸酶可由SEQ ID N0:2组成。 在其他的实施方案中，表达受到破坏的非细胞质唾液酸酶可与SEQ ID NO :4的氨基酸序列 约 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或者 99. 5% 同一。 在可选的实施方案中，表达受到破坏的非细胞质唾液酸酶可主要由SEQ ID N0:4组成。在 另一个实施方案中，表达受到破坏的非细胞质唾液酸酶可由SEQ ID N0:4组成。在一些迭代中，细胞系可具有一种非细胞质唾液酸酶的受破坏的表达。例如，溶酶 体唾液酸酶(即关于SEQ ID NO 2)的表达可能被破坏。另外，质膜相关唾液酸酶(即关于 SEQ ID NO 4)的表达可能被破坏。在其他迭代中，细胞系可具有两种非细胞质唾液酸酶的 受破坏的表达。也就是说，溶酶体唾液酸酶(即关于SEQ ID NO :2)和质膜相关唾液酸酶 (即关于SEQ ID NO 4)的表达可能都被破坏。在可选的实施方案中，细胞系还可包括编码细胞质唾液酸酶的染色体整合的核酸 序列的受破坏的表达，所述细胞质唾液酸酶的氨基酸序列可与SEQID NO 5至少约85%同 一。在一些实施方案中，表达受到破坏的细胞质唾液酸酶可与SEQ ID NO :5的氨基酸序列 约 85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或 99. 5% 同一。在另一个实施方案 中，表达受到破坏的细胞质唾液酸酶可主要由SEQ ID NO :5组成。在另一个实施方案中，表达受到破坏的细胞质唾液酸酶可由SEQ ID NO 5组成。在某些迭代中，细胞系可具有一种非细胞质唾液酸酶和细胞质唾液酸酶的受破坏 的表达。例如，溶酶体唾液酸酶(即关于SEQ ID NO 2)和细胞质唾液酸酶(即关于SEQ ID NO 5)的表达可能被破坏。可选地，质膜相关唾液酸酶(即关于SEQ ID NO 4)和细胞质唾 液酸酶(即关于SEQ ID NO 5)的表达可能被破坏。在某些其他迭代中，细胞系可具有非细 胞质唾液酸酶和细胞质唾液酸酶两者的受破坏的表达。也就是说，溶酶体唾液酸酶(即关 于SEQ ID NO :2)，质膜相关唾液酸酶(即关于SEQ ID NO :4)，和细胞质唾液酸酶(即关于 SEQ ID NO 5)的表达可能都被破坏。(a)细胞类型 一般而言，真核细胞将会用于本发明的实施中。适当的宿主细胞包括真菌或酵 母，如巴斯德毕氏酵母(Pichia pastoris)或者酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)； 昆虫细胞，如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)的SF9细胞或者黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的S2细胞；植物细胞；和动物细胞，如小鼠、大鼠、仓鼠、非人灵长类动物或 者人类细胞。适当细胞系的例子包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、SV40转化的猴肾CVI系 (C0S7)；人胚胎肾系293;幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(TM4)；猴肾细胞(CVI-76)； 非洲绿猴肾细胞(VER0-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；布法罗大鼠肝细胞 (buffalo rat liver cell,BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤 细胞(MMT)；大鼠肝细胞瘤细胞(HTC) ；HIH/3T3细胞和TRI细胞。对于一份全面的哺乳动 物细胞系清单，本领域的普通技术人员可参考美国典型培养物保藏中心目录(ATGC Mamassas, VA)。一般而言，细胞可以是多种细胞类型，如成纤维细胞、成肌细胞、T细胞或B 细胞、巨噬细胞、上皮细胞，等等。在优选的实施方案中，细胞是一种广泛用于生产糖蛋白的 类型。在一个示例的实施方案中，细胞可以是CHO细胞。其中一些产生感兴趣的糖蛋白的 众多CHO细胞系可从ATCC获得。稳定表达感兴趣的糖蛋白的CHO细胞的例子，包括产生细 胞内细胞粘附分子-1的CH0-ICAM-1细胞和产生人干扰素γ的CHO-hlFNY细胞。(b)受破坏的表达一般而言，本发明中的细胞系具有降低的唾液酸酶表达。该表达可能会在基因表 达过程的几个不同阶段受到破坏。例如，编码唾液酸酶多肽的DNA序列可能会被改变，使得 功能信使RNA(mRNA)(和，因此，功能多肽)不能合成。可选地，该mRNA可能会被改变(或 降解)，使得多肽不能合成或合成较低水平的多肽。(i) RNA 干扰使用抑制靶mRNA或者转录产物表达的RNA干扰(RNAi)剂可破坏唾液酸酶的表 达。RNAi剂可导致靶转录产物的裂解。可选地，RNAi剂可阻止或者破坏靶转录产物翻译为 蛋白质。在一些实施方案中，RNAi剂可以是短干扰RNA (SiRNA)。一般而言，siRNA包括双链 RNA分子，长度范围为约15至约29个核苷酸。siRNA的长度可以为约16-18，17-19，21-23， 24-27，或者27-29个核苷酸。在优选的实施方案中，siRNA的长度可为约21个核苷酸。 siRNA还可任选地包括一个或两个单链突出端，例如，在一端或两端的3’突出端。siRNA可 由杂交在一起的两个RNA分子形成，或者可选地，可由短发夹RNA(shRNA)生成(见下文)。 在一些实施方案中，siRNA的两条链可能完全互补，使得在两条序列之间形成的双链体中不
9存在错配或者凸起。在其他的实施方案中，SiRNA的两条链可能大体上互补，使得在两条序 列之间形成的双链体中可存在一个或多个错配和/或凸起。在某些实施方案中，SiRNA的 5’端中的一个或两个可能具有磷酸基，而在其他的实施方案中，5’端中的一个或两个可能 没有磷酸基。在其他的实施方案中，siRNA的3’端中的一个或两个可能具有羟基，而在其 他的实施方案中，5’端中的一个或两个可能没有羟基。siRNA的一条链被称为“反义链”或“指导链”，包括与靶转录产物杂交的部分。在 优选的实施方案中，siRNA的反义链，可能与靶转录产物的区域完全互补，即其在长度为约 15和约29个核苷酸，长度优选为至少16个核苷酸，以及长度更优选为约18-20个核苷酸的 靶区域内，与靶转录产物杂交而没有一个错配或凸起。在其他的实施方案中，反义链可能与 靶区域大体上互补，即由反义链和靶转录产物形成的双链体中可能存在一个或多个错配和 /或凸起。通常情况下，siRNA靶向于靶转录产物的外显子序列。本领域的技术人员熟悉设 计靶转录产物的siRNA的程序、算法和/或商业服务。示例的例子是Rosetta siRNA设计 算法(Rosetta Inpharmatics,North Seattle, WA)和]MISSION siRNA(Sigma—Aldrich， St. Louis,MO) 0 siRNA可在体外用本领域技术人员熟知的方法酶促合成。可选地，siRNA可 以用本领域熟知的寡核苷酸合成技术化学合成。在其他的实施方案中，RNAi剂可以是短发夹RNA(shRNA)。一般而言，shRNA是一 种RNA分子，包括至少两个杂交或者能够杂交形成足够长以介导RNA干扰的双链结构的互 补部分(如上所述)，和至少一个与形成双链体的shRNA区连接而形成环的单链部分。该结 构也可以称为茎-环结构，以茎作为双链体部分。在一些实施方案中，该结构的双链体部分 可能完全互补，使得shRNA的双链体区域中不存在错配或凸起。在其他的实施方案中，该结 构的双链体部分可能大体上互补，使得shRNA的双链体部分中可存在一个或多个错配和/ 或凸起。该结构的环长度可能为约1至约20个核苷酸，优选长度为约4至约10个核苷酸， 以及更优选长度为约6至约9个核苷酸。该环可能位于与靶转录产物互补的区域的5’或 3’端(即shRNA的反义部分)。该shRNA在5’或3’端还可包括突出端。任选的突出端长度可能为约1至约20 个核苷酸，以及更优选长度为约2至约15个核苷酸。在一些实施方案中，突出端可包括一 个或者多个U残基，如约1和约5个U残基之间。在一些实施方案中，shRNA的5’端可具有 磷酸基，而在其他的实施方案中可能没有。在其他的实施方案中，shRNA的3’端可具有羟 基，而在其他的实施方案中可能没有。一般而言，通过保守的细胞RNAi机制，将shRNA加工 成siRNA。因此，shRNA是siRNA的前体并且类似地，能够抑制与shRNA的一部分(即shRNA 的反义部分)互补的靶转录产物的表达。本领域的技术人员熟悉设计和合成shRNA的可用 的资源(如上面提到的细节)。示例的例子是MISSION ShRNA(Sigma-Aldrich)。在其他的实施方案中，RNAi剂可以是RNAi表达载体。通常地，RNAi表达载体可用 于在细胞内(体内)合成RNAi剂，如siRNA或shRNA。在一个实施方案中，两条独立的互补 siRNA链可使用包含两个启动子的单一载体转录，两个启动子中的每一个指导单一 siRNA 链的转录(即每个启动子可操作地与siRNA的模板连接，使得转录可以发生)。两个启动子 可以在相同的方向上，在这种情况下，每个启动子可操作地与互补siRNA链之一的模板连 接。可选地，两个启动子可以在相反的方向上，其侧翼于单一模板，使得启动子的转录导致 两个互补siRNA链的合成。在另一个实施方案中，RNAi表达载体可包括一个启动子，该启动子驱动包括两个互补区域的单一 RNA分子的转录，使得转录物形成shRNA。本领域的技术人员将了解，在体内通过多于一个的转录单元的转录来产生siRNA 和shRNA剂是优选的。一般而言，用来指导一个或多个siRNA或者shRNA转录单元在体内 表达的启动子可以是RNA聚合酶III (Pol III)启动子。某些Pol III启动子，如TO或者 Hl启动子，不需要转录区域内的顺式作用调控元件(cis-acting regulatory element)，因 此，在某些实施方案中是优选的。在其他的实施方案中，Pol II启动子可用于驱动一个或 多个siRNA或shRNA转录单元的表达。在一些实施方案中，可以使用组织特异性的、细胞特 异性的或者可诱导的Pol II启动子。可使用标准重组DNA方法生产提供合成siRNA或shRNA模板的构建体，并插入 适于在真核细胞中表达的多种不同载体中的任一种。指导可参阅最新分子生物学实验方 法汇编(Current Protocols in Molecular Biology ；Ausubel 等，John Wiley & Sons， New York, 2003)或分子克隆实验室手册(Molecular Cloning :A Laboratory Manual ； Sambrook & Russell,Cold SpringHarbor PressiCold Spring Harbor，NY，第3片反，2001)。 本领域的技术人员还了解，载体可包括附加的调控序列(例如，终止序列、翻译控制序列 等)，以及选择性标记序列。本领域已知DNA质粒，包括基于pBR322、PUC的那些，等等。由 于许多表达载体已经包含了适当的一个或多个启动子，可能只需要在相对于启动子的适当 位置插入编码感兴趣的RNAi剂的核酸序列。病毒载体也可用于提供RNAi剂的细胞内表 达。适当的病毒载体包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹 病毒载体，等等。在优选的实施方案中，RNAi表达载体是shRNA的基于慢病毒的载体或慢 病毒粒子，例如，MISSION TRC shRNA产品(Sigma-Aldrich)中所提供的。RNAi剂或RNAi表达载体可用本领域技术人员熟知的方法引入细胞。指导可参阅， 例如Ausubel等，见上或Sambrook & Russell，见上。在一些实施方案中，RNAi表达载体， 例如，病毒载体，可稳定地整合到细胞的基因组中，使得后续的细胞后代中的唾液酸酶表达 被破坏。(ii)基因靶向在其他的实施方案中，可使用同源重组技术来破坏基因组DNA水平上的唾液酸酶 表达。因此，这些技术可以用来删除核酸序列，删除核酸序列的一部分，或在核酸序列中引 入点突变，使得没有功能产品可以被合成。在一个实施方案中，可通过使用Capecchi (Cell 22:4779-488,1980)和 Smithies ((Proc Natl Acad Sci USA 91:3612-3615,1994))的技 术的同源重组来靶向核酸序列。在其他的实施方案中，可使用Cre-IoxP位点特异性重组系 统，FIp-FRT位点特异性重组系统，或其变型来靶向核酸序列。这种重组系统是商业可得的， 并且更多的指导可参阅Ausubel等，见上。在另一个实施方案中，可使用锌指核酸酶(ZFN) 介导的基因靶向(Sangamo Biosciences, Richmond, CA)来靶向基因。简单地说，ZFN是合 成的蛋白质，其包括与FokI限制性内切核酸酶的切割结构域融合的设计的锌指DNA结合结 构域。ZFN可用于诱导特定DNA序列中的双链断裂，从而促进基因组序列的位点特异性同源 重组和靶向操控。ZFN可经过设计以便靶向任何感兴趣的DNA序列。(iii)测量受破坏的表达上述RNAi和基因靶向方法，通常将导致唾液酸酶基因的降低的表达，因而导致降 低的唾液酸酶活性。因此，所述细胞通常将具有降低水平的唾液酸酶mRNA和/或唾液酸酶蛋白。可使用本领域已知的多种方法来测量mRNA水平、蛋白质水平或酶活性。RNA检测方 法的非限制性例子包括逆转录酶PCR、逆转录酶定量PCR、核酸微阵列、基于杂交的方法、支 链DNA检测技术、Northern印迹和核酸酶保护测定。蛋白质检测方法的非限制性例子包括 蛋白质印迹法、ELISA测定和其他免疫测定。每种唾液酸酶可逐一检测或者全部三个可同 时检测，这取决于这些检测测定中所用探针的特异性。然而，与特异性无关，可通过将具有 受破坏的唾液酸酶表达的细胞中的(mRNA和/或蛋白质的)水平与未处理细胞中的水平进 行比较而确定表达水平的降低。优选地，唾液酸酶表达的降低导致细胞中(例如，在从细胞 获得的溶胞产物中)，培养所述细胞的培养基中或两者中的唾液酸酶活性的降低。唾液酸酶 的活性，可使用本领域中各种已知的唾液酸酶测定来测量。例如，唾液酸酶的活性可使用实 施例2中所述的测定来测量。在一些实施方案中，相对于未处理细胞，唾液酸酶mRNA的水平可能降低至少2倍、 至少5倍、至少10倍、至少100倍、至少1000倍或至少10，000倍。在其他的实施方案中， 相对于未处理的细胞，唾液酸酶蛋白的量可能降低至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少100 倍、至少1000倍或至少10，000倍。此外，唾液酸酶活性可降低未处理细胞值的20% -50%, 50% -60%,60% -70%,70% -80%,80% -90%，或 90% -100%。(c)优选的实施方案优选地，包括受破坏的唾液酸酶表达的细胞系，来源于CHO细胞系。在一个实施方 案中，CHO细胞系包括由SEQ ID NO :2组成的唾液酸酶的受破坏的表达。在另一个实施方 案中，CHO细胞系包括由SEQ ID NO :4组成的唾液酸酶的受破坏的表达。还有另一个实施 方案中，CHO细胞系包括由SEQ) ID NO :2和SEQ ID NO :4组成的唾液酸酶的受破坏的表达。 在进一步的实施方案中，CHO细胞系包括由SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 5组成的唾液酸酶 的受破坏的表达。在另一个实施方案中，CHO细胞系包括由SEQ IDNO :4和SEQ ID NO :5组 成的唾液酸酶的受破坏的表达。在另一个可选的实施方案中，CHO细胞系包括由SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5组成的唾液酸酶的受破坏的表达。优选地，唾液酸酶的表 达通过RNAi破坏。(III)生产具有增强的唾液酸化作用的糖蛋白的方法本发明的另一个方面提供了一种生产包括增强的唾液酸化作用的糖蛋白的方法。 一般而言，该方法包括在细胞中表达编码感兴趣的糖蛋白的核酸序列，所述细胞包括至少 一种编码非细胞质唾液酸酶的核酸序列的受破坏的表达，其中细胞产生的糖蛋白具有增加 的唾液酸化作用。在其他的实施方案中，该细胞还包括编码细胞质唾液酸酶的核酸的受破 坏的表达。本发明方法中适用的唾液酸酶受到破坏的细胞在上文第(II)部分中描述。相比于唾液酸酶表达未改变的对照细胞(例如，唾液酸酶被破坏的细胞所源自的 亲代细胞)所产生的糖蛋白，具有受破坏的唾液酸酶表达的细胞所产生的糖蛋白通常将具 有更高水平的唾液酸化作用。具有受破坏的唾液酸酶表达的细胞所产生的糖蛋白的唾液 酸化作用，可能比对照细胞所产生的糖蛋白的唾液酸化作用高至少约10%。在一些实施方 案中，具有受破坏的唾液酸酶表达的细胞所产生的糖蛋白的唾液酸化作用，可能比对照细 胞所产生的糖蛋白的唾液酸化作用高约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、 300、350、400、450或500 %。在其他的实施方案中，具有受破坏的唾液酸酶表达的细胞所产 生的糖蛋白的唾液酸化作用，可能比对照细胞所产生的糖蛋白的唾液酸化作用高约500%以上。在一些实施方案中，用于生产糖蛋白的唾液酸酶受到破坏的细胞可能已经表达了 感兴趣的糖蛋白。例如，糖蛋白对细胞而言可能是内源性的；据此编码糖蛋白的核酸存在细 胞的基因组中。可选地，糖蛋白对细胞而言可能是外源性的，并且编码糖蛋白的核酸序列可 能已稳定地整合到细胞的染色体上。如上第(II) (a)部分所述，具有商业上可得的表达外 源糖蛋白的细胞系。例如，CHO细胞系，即CHO-hlFN γ，稳定地表达了人干扰素γ。在其他的实施方案中，用于生产糖蛋白的唾液酸酶受到破坏的细胞可能不表达感 兴趣的糖蛋白。在这种情况下，唾液酸酶受到破坏的细胞中可引入编码感兴趣的糖蛋白的 核酸序列。编码感兴趣的糖蛋白的核酸序列，可稳定地整合到唾液酸酶受到破坏的细胞的 基因组中。可选地，编码感兴趣的糖蛋白的核酸序列，可瞬时引入唾液酸酶受到破坏的细胞 中。换一种说法，编码感兴趣的糖蛋白的核酸序列可能是染色体外的。本领域的技术人员 熟悉将核酸引入细胞的合适载体和方法。此外，指导可参阅Ausubel等，见上或Sambrook & Russell，见上。可由唾液酸酶受到破坏的细胞产生的糖蛋白的例子包括生长因子、生长因子受 体、细胞因子、白细胞介素和其他免疫系统蛋白、干扰素、红细胞生成素、整合蛋白、地址素、 选择蛋白、归巢受体、T细胞受体、免疫球蛋白、单克隆抗体、可溶性主要组织相容性复合体 抗原、酶(例如，组织纤溶酶原激活物、链激酶、胆固醇生物合成或降解酶、促类固醇生成 酶、激酶、磷酸二酯酶、磷酸酶、甲基化酶、去甲基化酶、脱氢酶、纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶、 磷脂酶、芳香酶、细胞色素等)、激素或肽受体、结合蛋白、转录因子、翻译因子、癌蛋白质或 原癌蛋白质、肌蛋白、脊髓蛋白(myeloprotein)、神经活性蛋白、肿瘤生长抑制蛋白、抗败血 症蛋白、结构蛋白和血液蛋白(例如，凝血酶、血清白蛋白、因子VII、因子VIII、因子IX、因 子X、蛋白C、血管假性血友病因子(von Willebrand factor)等)。在一些实施方案中，糖 蛋白可包括肽标签，如抗体表位标签(例如，FLAG标签、HA标签、myc标签、6xHis标签等)， 在其他实施方案中，糖蛋白可以是包括来自感兴趣的糖蛋白的第一结构域和来自另一种感 兴趣的蛋白质的第二结构域的融合蛋白，其中两个结构域或融合在一起，或由一个或多个 另外的结构域隔离。例如，第一结构域可包括免疫球蛋白结构域或其一部分，而第二结构域 可包括非免疫球蛋白多肽。多肽或其一部分可以是天然存在的多肽，可以是天然存在的多 肽的改造或改变的形式，或者可以是人工或人造的多肽。该方法还包括，在糖蛋白产生条件下培养唾液酸酶受到破坏的细胞。本领域的技 术人员将会了解，培养特定类型细胞的适当条件。在一些实施方案中，所述细胞可在生产少 量糖蛋白(例如，毫克-克)的小型容器中生长。在其他的实施方案中，所述细胞可在生产 大量糖蛋白(如，千克数量)的大型生物反应器中维持。一般而言，相对于唾液酸酶表达未 被破坏的相同类型的细胞所产生的相同的糖蛋白，由唾液酸酶受到破坏的细胞所产生的糖 蛋白将具有增强的唾液酸化作用。与感兴趣的糖蛋白轭合的唾液酸的量，可通过本领域已 知的几个测定之一或使用商用试剂盒测量。经过一段时间后，通常将收集细胞和/或培养基，并可以从中纯化感兴趣的 糖蛋白。适当的纯化方法包括亲和色谱、免疫亲和色谱、疏水相互作用色谱、离子交换 色谱、尺寸排阻色谱、沉淀、透析，以及它们的组合。参见，例如，Roe(编辑)，Protein Purification Techniques :A Practical Approach(蛋白质纯化技术一种实用方法)，Oxford University Press，第二版，2001。熟练的技术人员将能够选择适用于感兴趣的特 定糖蛋白的方法。(IV)试剂盒本发明还有一个方面包括试剂盒，该试剂盒用于产生包括增强的唾液酸化作用的 糖蛋白。通常地，试剂盒包括本发明的细胞系，其中细胞系包括至少一种非细胞质唾液酸酶 的受破坏的表达。在一些实施方案中，该细胞系还可包括细胞质唾液酸酶的受破坏的表达。 适用于本发明试剂盒的唾液酸酶受到破坏的细胞在上文第(II)部分中描述。该试剂盒还 可包括使用说明书。在一个实施方案中，该试剂盒还可包括培养唾液酸酶受到破坏的细胞的适当的培 养基。在另一个实施方案中，该试剂盒还可包括将编码感兴趣的糖蛋白的核酸序列引入唾 液酸酶受到破坏的细胞的构建体(例如，质粒、病毒等)。在另一个实施方案中，该试剂盒也 还可包括用于检测和/或纯化本发明中细胞所产生的糖蛋白的试剂。合适试剂的非限制性 例子包括PCR引物、多克隆抗体、单克隆抗体、亲和色谱介质、免疫亲和色谱介质，及类似试 剂。在优选的实施方案中，该试剂盒包括CHO细胞系，所述细胞系包括受破坏的唾液 酸酶表达。在一个实施方案中，CHO细胞系包括由SEQ ID NO :2组成的唾液酸酶的受破坏 的表达。在另一个实施方案中，CHO细胞系包括由SEQ ID NO :4组成的唾液酸酶的受破坏 的表达。在另一个实施方案中，CHO细胞系包括由SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :4组成的唾 液酸酶的受破坏的表达。在进一步的实施方案中，CHO细胞系包括由SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :5组成的唾液酸酶的受破坏的表达。在另一个实施方案中，CHO细胞系包括由SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5组成的唾液酸酶的受破坏的表达。在另一个可选的实施方案中， CHO细胞系包括由SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 4和SEQ IDNO 5组成的唾液酸酶的受破坏的 表达。优选地，唾液酸酶的表达通过RNAi破坏。^X为方便理解本发明，下面定义了 一些术语。本文中所使用的术语“互补”是指双链核酸通过特定的氢键进行碱基配对(即 5’ -AGTC-3’与互补序列3’ -TCAG-5’配对)的缔合。两个单链分子可能完全互补，即所有 的碱基对是互补的，并且没有错配。可选地，两个单链分子可能大体互补，即至少一个错配 存在于两条链之间。本文中所使用的短语“受破坏的表达”，是指编码多肽的核酸序列的操控使得没有 合成多肽(即敲除)或以降低的水平合成多肽(即敲低)。表达可能会在几个水平受到破 坏。例如，编码多肽的DNA可能会被改变，使得没有功能信使RNA，和因此，没有功能蛋白被 合成。可选地，信使RNA可能受到影响，使得不能合成多肽或者以降低的水平合成多肽。本文中所使用的术语“杂交”，指的是在包括两个互补的单链核酸分子的碱基之间 进行氢键合或碱基配对以形成双链杂合体或双链体的过程。“杂交”的严格性通常由温度和 离子强度条件确定。核酸杂合体稳定性一般以解链温度或Tm表示，这是杂合体在确定条件 下有50%变性的温度。对方程式进行推导以便估算给定杂合体的Tm ；该方程式考虑了核酸 中的G+C含量、杂合体的性质(如DNA:DNA，DNA:RNA等)、核酸探针的长度等(参见，例如， Sambrook和Russell，见上)。本领域技术人员应了解，在基于杂交的反应过程中操控哪一个参数来优化杂交。然而，在一些基于杂交的反应中，如聚合酶反应、扩增反应等，反应温度 通常决定了杂交的严格性。此外，温度通常还决定体内反应过程中的杂交严格性。本文中所使用的术语“同一性”或“同一的”，是指当比对最大一致性时，两个核苷 酸序列或两个氨基酸序列相同的程度。核苷酸序列之间的最优比对和百分比同一性可采 用 Altschul 等人的 BLASTN 算法(J. Mol. Biol. 215 =403-410,1990)确定；而两个氨基酸 序列之间的最优比对和百分比同一性可采用Karlin和Altschul的BLASTP算法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA87 =2264-2268,1993)确定。在 NCBI 网站上，这些算法被纳入 BLAST 程 序(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)。为了获得用于比较目的的缺口比对，可以如 Altschul 等人(Nucleic Acids Res. 25 :3389_3402，1997)描述的使用缺口 BLAST。当使用 BLAST和缺口 BLAST程序时，使用各自程序的默认参数。序列同一性的百分比通过在比较窗 口内比较两个优化比对的序列而确定，其中比较窗口中的序列部分与用于两个序列最优比 对的参考序列(其不包括添加或缺失)相比，可包括添加或缺失(即缺口)。所述百分比通 过以下来计算确定两个序列中相同核苷酸出现的位置数以获得匹配位置数，将匹配位置 数除以在比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100以得到序列同一性的百分比。术语“核酸”是指包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子。该核苷酸可以是标 准核苷酸(即腺苷、鸟苷、胞苷、胸苷和尿苷)或核苷酸类似物。核苷酸类似物是指具有修 饰的嘌呤或嘧啶碱基或修饰的核糖部分的核苷酸。核苷酸类似物可以是天然存在的核苷 酸(如肌苷)或非天然存在的核苷酸。对核苷酸的糖或碱基部分修饰的非限制性例子包 括添加(或去除)乙酰基、氨基、羧基、羧甲基、羟基、甲基、磷酰基和硫醇基，以及使用其他 原子取代碱基的碳原子和氮原子(例如，7-脱氮嘌呤)。核苷酸类似物还包括二脱氧核 苷酸、2’ -0-甲基核苷酸、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)和吗啉代核苷酸(morpholinos)。 核苷酸可通过磷酸二酯键、硫代磷酸酯(phosphothioate)键、亚磷酰胺键或磷酰二胺 (phosphorodiamidate)键相连接。“唾液酸酶”是催化末端唾液酸残基从糖轭合物如糖蛋白水解的一组酶。唾液酸酶 也被称为外_ α -唾液酸酶(exo- α -sialidase)、神经氨酸酶或乙酰神经氨酸酶。当引用本发明或其优选实施方案中的元素时，冠词〃 一(a) “、〃一 (an)“、“该 (the)“和〃所述(said)“旨在说明有一种或多种元素。术语〃包括(comprising)“、“ 包括(including)"和"具有(having)"预期为包容性的，说明除了列出的元素还有其他 元素。已详细描述了本发明，明显的是修饰和改变是可能的，而不背离所附权利要求中 定义的本发明的范围。
实施例包括以下实施例以证明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应该了解，下面 实施例中所公开的技术代表了本发明人所发现的在本发明的实施中良好运作的技术。但 是，根据本公开内容，本领域技术人员应该意识到，所公开的具体实施方案中可以进行很多 变化，且仍得到相似或类似结果，而不背离本发明的精神和范围，因此，所有提到的内容将 被解释为说明性的，而不是限制性的含义。实施例1. CHO细胞中另外的唾液酸酶基因的分离。
已在人、小鼠和大鼠中鉴定出四种唾液酸酶基因(Neul、Neu2、Neu3和Neu4)，并已 良好表征。这些唾液酸酶表现出不同的酶活性、底物偏好和亚细胞位置。然而，到目前为 止，只有一种唾液酸酶基因已在CHO细胞中表征。这种基因编码细胞质唾液酸酶(即Neu2) (Gramer MJ, Goochee CF. (1993) Biotechnol Prog，9 :366)。本研究的目的是确定 CHO 细胞 是否包含其他唾液酸酶基因。采用RT_PCR、5，/3，RACE (cDNA末端的快速扩增)和其他标准方法，从CHO细胞中 分离和克隆了其他三种唾液酸酶基因。CHO Neul编码具有410个氨基酸残基的蛋白质，而 CHO Neu3编码具有417个氨基酸残基的蛋白质(表1)。另一方面，CHO Neu4似乎是CHO细 胞中的假基因。Neul和Neu3两者与其他物种中的其对应物享有高度相似性(表2)。表1. CHO细胞中新唾液酸酶的特性
cDNASEQ ID NO 蛋白质SEQ ID NO Neul1463bp1410aa2Neu31833bp3417aa4表2.唾液酸酶蛋白之间的百分比相似性
CHO唾液酸酶人 唾液酸酶小鼠 唾液酸酶大鼠唾液酸酶Neul (SEQ ID NO 2)86. 5%95. 4%95. 6%Neu277. 1 %86. 5%87. 1%(SEQ ID NO 5)Neu3 (SEQ ID NO 4)76. 8%81. 1%83. 3%实施例2. CHO Neul和CHO Neu3是唾液酸酶进行酶促唾液酸酶活性研究，以证实由CHO细胞中有预期功能的这两种新基因编 码的蛋白质。简言之，Neul基因(SEQ ID NO 1)的编码区和Neu3基因(SEQ ID NO 3)的 编码区，以及以前报道的 Neu2 基因(Ferrari 等.(1994)Glycobiology 4(3) :367_373)的 编码区被克隆入pcDNA3. 1哺乳动物表达载体。然后，该表达构建体转染入C0S7细胞，以过 表达唾液酸酶蛋白。单独的pcDNA3. 1载体也转染入C0S7细胞作为模拟转染。含绿色荧光 蛋白(GFP)的表达构建体共转染入C0S7细胞，以标准化转染效率。转染24小时后，通过超声溶解细胞。细胞碎片在4°C，1000 X g下离心IOmin除去， 收集上清液部分用于酶活性。如前所述(Gramer等.(1993)Biotechnol Prog 9:366-373)，
16使用ImM的4-甲基伞形酮-Neu5Ac作为底物，进行唾液酸酶测定。对于每个溶胞产物， IOOyg蛋白质被用于测定。该测定进行三次。在使用GFP读数标准化后，CHO Neul和Neu3 蛋白质相比于阴性对照(模拟转染)和阳性对照(Neu2)，有显著的唾液酸酶活性(图1)。 事实上，Neu3蛋白质具有Neu2活性约6_15倍以上的活性。为了进一步考察这些唾液酸酶蛋白的活性，在两种浓度的两种不同唾液酸酶抑制 剂(Neu5Ac和Neu5AC2en)存在下，进行了唾液酸酶测定。如图2所示，Neu5Ac2en对所有 唾液酸酶具有比Neu5Ac强的抑制作用。使用CH0Neu3为例，0. ImM Neu3Ac2en降低活性约 30%，而0. 5mM Neu3Ac2en降低活性约60%。这些数据表明，新鉴定的CHO基因(Neul和 Neu3)编码唾液酸酶。实施例3. CHO唾液酸酶的亚细胞定位为鉴定这两个新CHO唾液酸酶的亚细胞位置，进行了使用共聚焦扫描显微镜技术 的免疫细胞化学。概括地讲，编码8个氨基酸残基(DYKDDDDK)的Flag标签被克隆到Neu 表达构建体的3’ -末端，以表达带有Flag标签的融合蛋白。带有Flag标签的构建体转染 入C0S7细胞。转染24小时后，使用标准程序进行细胞免疫染色。结果示于图3。唾液酸酶的亚细胞位置由FITC轭合的抗FLAG抗体产生的绿色 荧光表示。转染的细胞也用细胞器标志物进行免疫染色在图3中，溶酶体标志物(Lyso Tracker DND-99)由红色荧光表示，和质膜标志物(麦胚凝集素647)由蓝色信号表示。本 研究显示，Neul位于溶酶体；其染色模式几乎与溶酶体标志物的染色模式一样。Neu3位于 质膜，以与质膜标志物染色模式相似的方式。此外，阳性对照Neu2显示了所预期的细胞质 染色。实施例4.采用SiRNA技术的基因沉默采用小干扰RNA(SiRNA)技术，敲低三种CHO唾液酸酶基因的每一种的表达。根 据cDNA序列，设计并合成了几个针对CHO唾液酸酶基因(Neul、Neu2和Neu3)的每种 基因的siRNA。序列示于表3。这些siRNA转染入稳定表达人干扰素、的CHO细胞系 (CHO-hlFN y ) 0该转染重复操作两次。转染48小时后，收获细胞。RNA和蛋白质从转染细 胞中分离。使用标准程序，进行了利用基因特异性引物的逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和 定量 RT-PCR(O-RT-PCR)。 *大写字母表示19 nt siRNA序列，小写字母表示3’突出端。如图4所示，RT-PCR分析表明，每组siRNA中的至少两种能够降低每个基因的 mRNA 表达。Neul-S2、Neul-S3 和 Neul_S4 降低了 Neul mRNA 的表达，Neu2_S2 和 Neu2_S3 降 低了 Neu2 mRNA的表达，而Neu3-Sl和Neu3-S2降低了 Neu3 mRNA的表达。定量逆转录酶 (Q-RT)PCR分析表明，与靶向不相关核酸序列(GFP核酸序列)的对照siRNA相比，针对CHO 唾液酸酶基因的siRNA显著地降低了 mRNA的表达水平(即 70% -95% )(图5)。Neul mRNA 表达降低了约 90% (图 5A) ；Neu2 mRNA 表达降低了约 70-85% (图 5B)禾Π Nue3 mRNA 表达降低了约95% (图5C)。为了进一步证实蛋白质水平上的基因沉默效应，进行了唾液酸酶活性测定。粘附 CHO-hlFNy细胞悬浮在化学成份确定且不合动物组分的培养基中。上述鉴定的阳性siRNA 通过电穿孔转染入CHO-hlFNY细胞的悬浮液，重复两次。为了研究潜在的协同基因沉默效 应，每种Neu基因单独和组合(即两种或三种基因沉默)沉默。转染72小时后，收获细胞， 并用预冷的IX PBS缓冲液洗涤。总RNA和蛋白质，从siRNA转染的细胞中分别分离。如 上所述，总RNA用于逆转录(和Q-RT PCR)。蛋白质用于体外唾液酸酶活性测定，如实施例 2中详述。与对照(亲代CHO-hlFN γ细胞和GFP siRNA转染的细胞)相比，单个siRNA和 siRNA组合都显著降低了唾液酸酶的活性(图6)。最有趣的是，针对Neul和Neu3的siRNA 的组合显著降低唾液酸酶活性至不可检测的水平。
实施例5.利用shRNA技术的稳定的基因沉默根据实施例4显示的Neu mRNA和唾液酸酶的活性可使用siRNA敲低的结果，用 shRNA 技术平台(Mission :RNAi , Sigma Aldrich, St. Louis, MO)稳定地敲低 CHO hIFNy 细胞中Neu基因的表达。将编码每种唾液酸酶基因(Neul_S4、Neu2_S3、Neu3_S2)的有效siRNA的DNA片 段克隆到pLKO. 1-puro shRNA表达载体。DNA测序确认后，质粒DNA转染入HEK293细胞， 以产生包装有shRNA盒的慢病毒。使用含shRNA盒的慢病毒感染CH0_hIFN γ细胞悬浮液 和进行嘌呤霉素选择后，获得了携带Neul、Neu2和Neu3基因shRNA盒的CH0_hIFN γ细 胞。进行Q-RTPCR来证实在mRNA水平上的基因沉默效应(图7)。在Neul-shRNA细胞中， Neul (Neul-S4)的 mRNA 表达敲低超过 95 % (图 7A)，在 Neu2_shRNA 细胞中，Neu2 (Neu2_S3) 的敲低为约50% (图7b)，而在Neu3-shRNA细胞中，Neu3 (Neu3_S2)的敲低超过70% (图 7 C)。如上所详述的，通过测量唾液酸酶活性，还在蛋白质水平证实了基因敲低效应。与 对照(非靶向shRNA)相比，针对所有三种唾液酸酶基因的shRNA显著降低了 CHO-hlFNy 细胞中唾液酸酶的活性(见图8)。携带Neu3-S2shRNA的细胞具有最显著的唾液酸酶活性 的降低。为了评估shRNA是否影响细胞生长和/或蛋白质的生产，分析了这些CHO-ShRNA 细胞的生长及其对人干扰素Y蛋白的生产。简言之，以 200，000细胞/毫升活细胞密度 将细胞接种于补充有4mM谷氨酰胺的培养基(化学成分确定且不含动物组分)中。细胞生 长测定重复进行两次。细胞在37°C，含5%C02&5L生物反应器中培养。在适当的时间点， 收集培养基样品用于进行蛋白质分析。5L生物反应器细胞生长数据表明，相比于非靶向shRNA对照细胞，无shRNA负面影 响细胞生长(图9)。人IFN γ的生产使用人IFN γ ELISA试剂盒(eBioscience，San Diego, CA)测量。如图10所示，相比于非靶向对照细胞，无shRNA负面影响蛋白质生产。事实上， 通过一些唾液酸酶shRNA靶向细胞生产高水平的人类IFN γ蛋白。采用250毫升摇瓶得到 了相似的结果(数据未显示)。实施例6. CHO Neu基因的沉默产生了具有增加的唾液酸含量的糖蛋白通过HPLC，分析了唾液酸酶shRNA靶向细胞和非靶向shRNA对照细胞所产生的人 IFNy蛋白中的唾液酸水平。废培养基样品收集自5L生物反应器培养物的稳定期(第6 天，细胞生存力约95% )和死亡期(第13天，细胞生存力约20% )。通过免疫亲和纯化从 细胞培养上清液纯化人干扰素Y蛋白。简言之，经离心和过滤除去细胞碎片后，将30毫升 蛋白质样品负载到与hIFNy抗体轭合的亲和柱上。洗涤柱后，hIFNy蛋白用洗脱缓冲液 洗脱。在AKTA Explorer 100色谱系统(Amersham Biosciences)上进行纯化。纯化的蛋 白通过ELISA定量，如前所述。通过HPLC对纯化的hIFN γ蛋白的唾液酸化作用进行分析。简言之，将50 μ g纯 KWhIFNY蛋白样品冷冻干燥，并重新悬浮于含有2N乙酸的100 μ 1超纯水中。该样品在 80°C水解3小时。之后，过滤样品，并快速真空干燥(speed-vac dried)。释放的唾液酸残 基用荧光化合物1，2_ 二氨基-4，5-(亚甲二氧基)苯(DMB)衍生化，然后用C18反相柱进 行 HPLC。
数据示于图11。在第6天，由Neul和Neu2shRNA CHO细胞产生的hIFN γ蛋白质 中的唾液酸水平，与非靶向shRNA对照无显著差异(图11Α)。虽然Neu2shRNA细胞中的 唾液酸水平似乎略高，但不显著(Neu2 1.945士0. Illpmol唾液酸/pmol hIFNy vs.非靶 向1.600士0. 090pmol 唾液酸/pmol hIFN γ，ρ = 0. 0528，η = 4)。然而，与来自对照细 胞的蛋白相比，来自Neu3 shRNA CHO细胞的hIFN γ蛋白的唾液酸含量显著提高(Neu3 2. 133 士 0. IOlpmol 唾液酸 /pmol hIFNy vs.非革巴向:1. 600 士 0. 090pmol 唾液酸 /pmol hIFNy , ρ < 0. 01，η = 4)。在第13天，由NeulshRNA CHO细胞产生的hIFN γ的唾液酸化作用没有明 显改善。然而，Neu2 细胞(Neu2 4. 948士0. 150pmol 唾液酸 /pmol hIFNy , vs.非靶 向4· 113士0. 113pmol 唾液酸 /pmol hIFNy , ρ < 0. 01，η = 4)禾口 Neu3 细胞(Neu3 5. 175士0. 414pmol 唾液酸 /pmol hIFNy , vs.非靶向4. 113士0. 113pmol 唾液酸 /pmol hIFNy , ρ <0.05，η = 4)产生的hIFNy蛋白中的唾液酸水平提高了(图11B)。由Neu3 和Neu2 shRNA CHO细胞产生的人干扰素γ蛋白的唾液酸化作用的提高表明，唾液酸酶基 因(Neu3和Neu2)的下调降低了总唾液酸酶的活性，因而降低了 CHO细胞产生的重组蛋白 中的唾液酸水平。这些实施例表明，采用RNA干扰平台的靶向基因沉默，是一种提高蛋白质 糖基化的有效途径。
权利要求
一种细胞系，所述细胞系包括至少一种编码非细胞质唾液酸酶的染色体整合的核酸序列的受破坏的表达，所述唾液酸酶的氨基酸序列选自由以下组成的组(a)与SEQ ID NO2至少约95％同一的序列，和(b)与SEQ ID NO4至少约80％同一的序列。
2.如权利要求1所述的细胞系，其中所述氨基酸序列选自由以下组成的组(a)与SEQ ID NO :2至少约97%同一的序列，和(b)与SEQ IDNO :4至少约90%同一的序列。
3.如权利要求1所述的细胞系，其中所述氨基酸序列主要由选自SEQIDNO :2和SEQ ID NO :4组成的组的序列组成。
4.如权利要求1所述的细胞系，其中所述氨基酸序列由选自SEQIDNO :2和SEQ ID NO 4组成的组的序列组成。
5.如权利要求1所述的细胞系，其中所述核酸序列的表达通过选自以下组成的组的技 术破坏RNA干扰、同源重组和位点特异性重组。
6.如权利要求5所述的细胞系，其中RNA干扰(RNAi)通过选自以下组成的组的RNAi 剂介导短干扰RNA、短发夹RNA和RNAi表达载体。
7.如权利要求1所述的细胞系，其中所述细胞系选自由昆虫细胞系、哺乳动物细胞系、 啮齿动物细胞系、非人灵长类动物细胞系和人类细胞系组成的组。
8.如权利要求1所述的细胞系，其中所述细胞系是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。
9.如权利要求8所述的细胞系，其中所述唾液酸酶由SEQID N0:2组成。
10.如权利要求8所述的细胞系，其中所述唾液酸酶由SEQID N0:4组成。
11.如权利要求8所述的细胞系，其中所述唾液酸酶由SEQID NO :2和SEQ ID NO 4 组成。
12.如权利要求1所述的细胞系，所述细胞系还包括编码细胞质唾液酸酶的染色体整 合的核酸序列的受破坏的表达，所述细胞质唾液酸酶的氨基酸序列与SEQ ID N0:5至少约 85% 同一。
13.如权利要求12所述的细胞系，其中氨基酸序列主要由SEQIDNO :5组成。
14.如权利要求12所述的细胞系，其中氨基酸序列由SEQID NO :5组成。
15.如权利要求12所述的细胞系，其中所述核酸序列的表达通过选自以下组成的组的 技术破坏RNA干扰、同源重组和位点特异性重组。
16.如权利要求16所述的细胞系，其中RNA干扰(RNAi)通过选自以下组成的组的RNAi 剂介导短干扰RNA、短发夹RNA和RNAi表达载体。
17.如权利要求12所述的细胞系，其中所述细胞系选自由昆虫细胞系、哺乳动物细胞 系、啮齿动物细胞系、非人灵长类动物细胞系和人类细胞系组成的组。
18.如权利要求12所述的细胞系，其中所述细胞系是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。
19.如权利要求18所述的细胞系，其中所述非细胞质唾液酸酶由SEQIDNO :2组成。
20.如权利要求18所述的细胞系，其中所述非细胞质唾液酸酶由SEQIDN0:4组成。
21.如权利要求18所述的细胞系，其中所述非细胞质唾液酸酶由SEQIDNO :2和SEQ ID NO 4 组成。
22.—种生产糖蛋白的方法，所述方法包括在细胞中表达编码所述糖蛋白的核酸序列， 所述细胞包括至少一种编码非细胞质唾液酸酶的染色体整合的核酸序列的受破坏的表达， 所述唾液酸酶的氨基酸序列选自以下组成的组(a)与SEQ ID NO 2至少约95%同一的序列，和(b)与SEQ IDNO 4至少约80%同一的序列，其中所述糖蛋白相对于适当对照，具有 增加的唾液酸化作用。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述唾液酸酶的氨基酸序列选自由以下组成的 组(a)与SEQ ID NO 2至少约97%同一的序列，和(b)与SEQ ID NO 4至少约90%同一 的序列。
24.如权利要求22所述的方法，其中所述唾液酸酶的氨基酸序列主要由选自SEQID NO 2和SEQ ID NO 4组成的组的序列组成。
25.如权利要求22所述的方法，其中所述唾液酸酶的氨基酸序列由选自SEQID NO 2 和SEQ ID NO 4组成的组的序列组成。
26.如权利要求22所述的方法，其中编码所述唾液酸酶的所述核酸序列的表达通过选 自以下组成的组的技术破坏RNA干扰、同源重组和位点特异性重组。
27.如权利要求26所述的方法，其中RNA干扰(RNAi)通过选自以下组成的组的RNAi 剂介导短干扰RNA、短发夹RNA和RNAi表达载体。
28.如权利要求22所述的方法，其中编码所述糖蛋白的所述核酸序列选自由染色体整 合的核酸序列和染色体外核酸序列组成的组。
29.如权利要求22所述的方法，其中所述细胞选自由昆虫细胞、哺乳动物细胞、啮齿动 物细胞、非人灵长类动物细胞和人类细胞组成的组。
30.如权利要求22所述的方法，其中所述细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述非细胞质唾液酸酶由SEQIDNO :2组成。
32.如权利要求30所述的方法，其中所述非细胞质唾液酸酶由SEQIDNO :4组成。
33.如权利要求30所述的方法，其中所述非细胞质唾液酸酶由SEQIDNO 2和SEQ ID N0:4组成。
34.如权利要求22所述的方法，其中所述细胞还包括编码细胞质唾液酸酶的染色体整 合的核酸序列的受破坏的表达，所述细胞质唾液酸酶的氨基酸序列与SEQ ID N0:5至少约 85% 同一。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述细胞质唾液酸酶的氨基酸序列主要由SEQID NO 5组成。
36.如权利要求34所述的方法，其中所述细胞质唾液酸酶的氨基酸序列由SEQID NO 5组成。
37.如权利要求34所述的方法，其中编码所述细胞质唾液酸酶的所述核酸序列的表达 通过选自以下组成的组的技术破坏RNA干扰、同源重组以及位点特异性重组。
38.如权利要求37所述的方法，其中RNA干扰(RNAi)通过选自以下组成的组的RNAi 剂介导短干扰RNA、短发夹RNA和RNAi表达载体。
39.如权利要求34所述的方法，其中所述细胞选自由昆虫细胞、哺乳动物细胞、啮齿动 物细胞、非人灵长类动物细胞和人类细胞组成的组。
40.如权利要求34所述的方法，其中所述细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述非细胞质唾液酸酶由SEQIDNO :2组成。
42.如权利要求40所述的方法，其中所述非细胞质唾液酸酶由SEQIDNO :4组成。
43.如权利要求40所述的方法，其中所述非细胞质唾液酸酶由SEQIDNO :2和SEQ IDN0:4组成。
44.一种分离的核酸，该核酸编码氨基酸序列由SEQ ID NO :2组成的多肽。
45.一种分离的核酸，该核酸编码氨基酸序列由SEQ ID NO :4组成的多肽。
46.一种纯化的多肽，该多肽的氨基酸序列由SEQ ID N0:2组成。
47.一种纯化的多肽，该多肽的氨基酸序列由SEQ ID N0:4组成。
全文摘要
本发明提供了用于生产具有增强的唾液酸化作用的糖蛋白的组合物和方法。特别地，本发明提供了包括受破坏的唾液酸酶表达的细胞系和使用该细胞系来生产具有增强的唾液酸化作用的糖蛋白的方法。
文档编号C12N15/113GK101896616SQ200880111449
公开日2010年11月24日 申请日期2008年10月13日 优先权日2007年10月12日
发明者J·S·罗斯, 张民 申请人:西格马-奥利奇有限公司