通过微小rna装置进行细菌介导的基因调节的利记博彩app

专利名称：通过微小rna装置进行细菌介导的基因调节的利记博彩app
通过微小RNA装置进行细菌介导的基因调节相关申请的交叉参考该申请要求2007年6月四日提交的美国临时专利申请系列号60/947，311的优 先权和权益，所述临时专利申请的内容完整引入作为参考。
背景技术：
尽管首先在秀丽新小杆线虫(Caenorhabditis elegans)中发现，但已经在植物和 包括人的动物中发现了微小RNA(miRNA)。miRNA由从DNA转录但不翻译成蛋白质的基因 (非蛋白质编码RNA)编码，已经发现其调节高于30%的哺乳动物基因。成熟的miRNA分子 与一个或多个信使RNA(mRNA)分子部分互补，并且相信其主要功能是调节基因表达。miRNA具有许多潜在的应用用于治疗目的，然而关键的障碍在于向靶细胞中递送 miRNA或其前体。需要新的方法向动物靶标施用安全并可预测的miRNA。发明概述本发明提供细菌介导的系统，用于通过细菌感染向靶细胞内引入miRNA。在一个实 施方案中，所述细菌含有编码miRNA的DNA，并在所述细菌中通过原核启动子，或在靶细胞 中使用真核启动子表达所述miRNA。在可选的实施方案中，所述细菌含有编码miRNA前体的 DNA，并在所述细菌中通过原核启动子，或在靶细胞中使用真核启动子表达所述前体。如果 前体在细菌中进行表达，其可在细菌中或在靶细胞中加工为成熟的miRNA。一方面，本发明提供至少编码微小RNA(miRNA)或miRNA前体的DNA载体。所述 miRNA能够调节，即上调或下调真核、原核或病毒靶基因中至少一个表达。所述miRNA前体 可以是初级-miRNA(pri-miRNA)、miRNA前体(pre_miRNA)或miRNA双链体。在一个实施方 案中，所述载体编码具有基本互补区的两个miRNA，当表达时，所述两个miRNA形成双链体。 在一个实施方案中，所述miRNA是成熟miRNA或弓|导miRNA。所述载体还包括原核或真核启 动子，并还可编码Hly基因。在一个实施方案中，由miRNA靶向的至少一个基因是与癌相关 的。一方面，本发明提供含有微小RNA(miRNA)、miRNA前体或编码所述miRNA或所述前 体的DNA分子的细菌，所述miRNA能够调节真核、原核或病毒靶基因中至少一个表达。所述 细菌可以是活的侵入性细菌或其衍生物。在一个实施方案中，所述细菌还包含能够将所述 miRNA前体加工成近于成熟miRNA的酶或核酶，如内切核酸酶。在一个实施方案中，所述细 菌还含有细菌核糖核酸酶III、切酶、切酶样酶、Drosha和I^sha中的至少一种。所述细菌 还包括在遗传物质释放到靶真核细胞的细胞质中后帮组转运其遗传物质的酶。在一个实施 方案中，所述酶是由Hly A基因编码的利斯特氏菌溶素0。所述真核靶基因可以是动物，例 如哺乳动物或鸟类基因。在一个实施方案中，由miRNA靶向的至少一个基因是与癌相关的。一方面，本发明提供通过用本发明的细菌感染动物，向动物细胞递送miRNA或 miRNA前体的方法。在一个实施方案中，所述动物细胞是人细胞。所述方法还包括在细菌感 染动物细胞后，裂解细菌的步骤。一方面，本发明提供制备miRNA的方法。在一个实施方案中，所述方法包括用具有 至少编码miRNA的原核载体的细菌感染的步骤。或者，所述方法包括具有用至少编码miRNA前体的第一个原核载体和编码用于将所述miRNA前体加工成miRNA的至少一种酶的第二个 原核载体的细菌感染的步骤。所述方法还包括在细菌中分别表达miRNA或miRNA前体和所 述酶，并从所述细菌中收集miRNA的步骤。一方面，本发明提供在动物细胞中调节至少一个靶基因表达的方法。所述方法包 括步骤用本发明的细菌感染动物细胞；并裂解所述细菌以释放其内容物，由此允许来自 所述内容物的或从所述内容物产生的miRNA与靶基因的mRNA相互作用，并由此调节所述基 因的表达。在一个特征中，调节的机制是翻译阻抑、mRNA降解，或翻译阻抑和mRNA降解。一方面，本发明提供在动物中治疗或预防病征的方法。所述方法包括包括通过用 包含微小RNA(miRNA)、miRNA前体或至少编码所述miRNA或所述前体的DNA分子的细菌感 染动物细胞，来调节已知参与病征的至少一个靶基因的表达，所述miRNA能够调节至少所 述基因的表达。所述动物可以是哺乳动物或鸟类。一方面，本发明提供在动物中治疗或预防癌或细胞增殖病征的方法。所述方法包 括用包含微小RNA(miRNA)、miRNA前体或至少编码所述miRNA或所述前体的DNA分子的细 菌感染动物细胞，来调节已知参与细胞增殖或癌的至少一个靶基因的表达，所述miRNA能 够调节至少所述基因的表达。一方面，本发明提供在动物中治疗或预防由动物中至少一个缺陷型miRNA引起的 病征的方法。所述方法包括用包含所述miRNA的功能版本(version)、所述功能性miRNA的 RNA前体或至少编码所述功能性miRNA或所述前体的DNA分子的细菌感染动物细胞。一方面，本发明提供在动物中治疗或预防由动物中至少一个上调miRNA引起的病 征的方法。所述方法包括用包含所述miRNA的反义版本、miRNA所述反义版本的RNA前体， 或至少编码所述反义版本或所述前体的DNA分子的细菌感染动物细胞。另一方面，本发明提供发现或确认治疗靶标的方法。所述方法包括下述步骤用本 发明的细菌感染哺乳动物细胞；裂解所述细菌以释放其内容物；并研究底物与来自所述内 容物的或从所述内容物产生的miRNA之间的相互作用。所述底物可调节miRNA的活性或所 述miRNA可调节所述底物的活性。本发明的其他特征和优势可显而易见于本文提供的，包括于不同实施例中的额外 描述。提供的实施例阐明了用于实践本发明的不同成分和方法。所述实施例不限于要求本 发明。基于本公开内容，技术人员可鉴定并使用用于实践本发明的其他成分和方法。附图简述

图1是显示miRNA如何从其多种前体加工得到的示意图。图2是显示质粒pTiOR构建的载体图。图3是显示质粒pTPIV构建的载体图。图4显示溴化乙锭染色的RT-PCR反应(左)和化学发光western印迹(右)。发明详述如本文所用，“调节”指升高或降低(例如沉默)，换言之，上调或下调。如本文所 用，向靶细胞“引入”或“递送”微生物指用所述微生物(例如细菌)感染所述靶细胞的过 程，并且在某些情况下可能通过裂解所述微生物向靶细胞期望位置(例如细胞质)释放该 微生物内的遗传物质。微小RNA(miRNA)是一类内源的、单链或双链的约22个核苷酸长的RNA分子，其调节约 30 % 的哺乳动物基因(Czech，NEJM 354 :1194-1195(2006) ；Mack, Nature Biotech. 25 :631-638(2007) ；Eulalio，等，Cell 132 :9-14 Q008))。miRNA通过阻断翻译或 引起转录物降解来抑制蛋白质产生。miRNA可靶向250-500个不同的mRNA。miRNA是miRNA 前体进行切酶消化的产物，而所述miRNA前体是初级miRNA (primary miRNA)的产物。切酶是核糖核酸酶III核糖核酸酶家族的成员。切酶将长的双链RNA(dsRNA)和短 发夹RNA (shRNA)切割成约20-25个核苷酸长的称为小干扰RNA (siRNA)的短双链RNA片段， 其通常在3'末端具有两个碱基的突出端。切酶也将pre-微小RNA(miRNA)切割成miRNA 双链体。切酶催化RNA干扰途径中的第一步并起始RNA诱导沉默复合体(RISC)的形成，所 述RNA诱导沉默复合体的催化组分argonaute是能够降解信使RNA(mRNA)的内切核酸酶， 所述信使RNA的序列与siRNA引导链的序列互补。参考图1，编码miRNA的基因比加工过的成熟miRNA分子长的多；miRNA首先转录 成具有帽子和poly-Α尾的初级转录物或初级-miRNA，并在细胞核中加工成更短的70个核 苷酸的茎环结构，称为miRNA前体。在动物中通过称为微处理机复合体的蛋白质复合体进 行该加工，所述微处理机复合体由核酸酶Drosha和双链RNA结合蛋白质Pasha组成。然后 通过与内切核酸酶切酶相互作用将这些miRNA前体在细胞质中加工成成熟的miRNA，所述 内切核酸酶切酶也起始RNA诱导沉默复合体(RISC)的形成。该复合体负责因miRNA表达 和RNA干扰而观察到的基因沉默。该途径也不同于来自基因内茎环的miRNA;这些是通过 切酶加工而非Drosha。DNA的正义链或反义链可作为模板起功能，产生miRNA。如图1显示，成熟miRNA具有至少三种形式的中间RNA前体(a)初级-miRNA，(b) miRNA前体和(c)由miRNA前体茎环结构进行切酶切割产生的miRNA双链体。因此，一方面，本发明提供使用细菌向靶细胞递送miRNA，或miRNA前体，或编码 miRNA或miRNA前体的DNA，或任何上述的混合物的系统，以通过翻译阻抑、mRNA降解或两 者引起基因调控。所述细菌优选为非致病性或治疗性菌株，其具有进入细胞的能力。所述 靶细胞可以是真核细胞。本发明的miRNA调节，例如下调靶细胞中的目的基因。所述真核 细胞可以是哺乳动物细胞或鸟类细胞。所述目的基因可以是哺乳动物、鸟类、真核、细菌或 病毒基因。如果递送的分子是miRNA前体，其可在细菌内或在靶细胞中使用细胞的现有加 工装置加工成成熟的miRNA。在动物细胞中，酶或核酶，如Drosha、Pasha和切酶是该装置 的一部分，其将miRNA前体加工成可引导多酶复合体RNA诱导沉默复合体(RISC)靶向mRNA 的成熟形式。在一个实施方案中，本发明提供至少编码miRNA或miRNA前体的原核载体。所 述miRNA可调节真核、原核或病毒靶基因中至少一个表达。所述miRNA前体可以是(a)初 级-miRNA，(b)miRNA前体和(c)miRNA双链体。对于miRNA双链体，可以是双链环形质粒的 载体编码具有互补区以形成双链体的两个miRNA。所述质粒可具有一个或两个启动子。根 据载体是否表达，所述启动子可以是原核启动子或真核启动子。在一个实施方案中，因为载 体旨在载体细菌内表达，所以在所述载体上提供至少一个原核启动子，如T7。在另一实施方 案中，因为载体旨在靶真核细胞内表达，所以在所述载体上提供至少一个真核启动子。在一个实施方案中，向真核细胞中递送细菌携带的编码miRNA前体的一个或多个 DNA分子，其在所述真核细胞中转录，然后在所述真核细胞中加工以产生成熟的miRNA。所 述DNA分子可处于通常指导小核RNA(snRNA)转录的RNA聚合酶II相容启动子或RNA聚合酶 III 相容启动子(例如 U6、Hl)的控制下(P. J. Paddison, A. A. Caudiy, G. J. Hannon, PNAS 99，1443(2002)，T. R. Brummelkamp, R. Bernards,R. Agami，Science 296，550 (2002))。 双"Trojan horse"技术可与携带真核转录质粒的侵入性和营养缺陷型细菌一起使用。该 质粒依次通过靶细胞转录，形成进一步加工成成熟miRNA的miRNA前体，所述成熟miRNA引 发RNAi的细胞内过程。在一个有利方面，本发明提供通过用细菌，优选细菌的非病原性或治疗性菌株感 染真核细胞，向该真核细胞中递送miRNA、miRNA前体或编码所述miRNA或前体的DNA的方 法，以在真核细胞中引起基因调节。所述细菌包含(a)miRNA，(b)miRNA前体，或(c)编码所 述miRNA或所述前体的DNA。在一个实施方案中，细菌本身能够合成并将miRNA前体加工为成熟的miRNA。在一 个实施方案中，所述细菌具有加工或消化所述前体的酶或核酶。所述酶可以是内切核酸酶。 所述内切核酸酶可以是核糖核酸酶III家族的成员，如细菌核糖核酸酶III、切酶或切酶样 酶。所述酶可以是Drosha或I^asha。在一个实施方案中，所述酶对载体细菌是内源的。在 另一实施方案中，所述酶对载体细菌是外源的并通过表达此类酶(例如切酶样酶或Drosha 样酶)的载体引入。所得miRNA可以调节(例如敲减或沉默)一个或多个靶基因的表达，所述方法能 够降低基因表达的至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，或高于90%。细菌递送比病毒递送更具吸引力，因为可通过抗生素和不能复制的减毒细菌菌株 控制所述细菌递送。同样，细菌更易于进行遗传操作，其允许产生特异用于某些应用的载体 菌株。在本发明的一个实施方案中，本发明的方法用于产生细菌，其以组织特异性方式引起 基因调节。本发明的无毒菌可通过多种机制进入哺乳动物宿主细胞。专门的吞噬细胞活性 吞入菌、侵入性细菌菌株具有侵入非吞噬宿主细胞的能力。此类细菌的天然实例是细胞 内病原体如利斯特氏菌(Listeria)、志贺氏菌(Shigella)和沙门氏菌(Salmonella), 但该性质也可通过转移侵入相关基因转移到其他细菌如大肠杆菌(E. coli)和双歧杆 菌(Bifidobacteriae),包括益生菌(P. Courvalin, S. Goussard, C. Grillot-Courvalin, C. R. Acad. Sci. Paris 318,1207(1995))。在本发明的其他实施方案中，用于向宿主细胞递 送小 RNA 的细菌包括弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri) (D. R. Sizemore,A. A. Branstrom, J. C. Sadoff，Science 270，299 (1995))、侵入性大肠杆菌(P. Courvalin, S. Goussard, C. Grillot-Courvalin, C. R. Acad. Sci.Paris 318,1207 (1995), C. Grillot-Courvalin, S. Goussard, F. Huetz, D. Μ. Ojcius, P. Courvalin, Nat Biotechnol 16,862(1998))、 小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)(A. Al-Mariri A, A. Tibor, P. Lestrate, P. Mertens, X. De Bolle, J. J. Letesson Infect Immim 70,1915(2002))禾口
tl Ifi±1 ^^1J T# K S‘ (Listeria monocytogenes) (M. Hense, E. Domann, S. Krusch, P. Wachholz, K. E. Dittmar, M. Rohde, J. ffehland, T. Chakraborty, S. Weiss, Cell Microbiol 3, 599 (2001), S. Pilgrim, J. Stritzker, C. Schoen, A. KoIb-Maurer, G. Geginat, M. J. Loessner, I. Gentschev, W. Goebel, Gene Therapy 10，2036 (2003))。任何侵入性细 菌用于 DNA 向真核细胞中转移(S.Weiss，Τ. Chakraborty, Curr Opinion Biotechnol 12， 467(2001))。
在一个实施方案中，构建至少编码微小RNA (miRNA)或miRNA前体的原核载体。所 述miRNA可调节真核、原核或病毒靶基因中至少一个表达。然后用载体转化侵入性细菌。所 述细菌可以是活的细菌，或其衍生物，例如来自细菌的半失活细菌或功能颗粒。在一个实施 方案中，所述细菌能够表达和/或加工所述miRNA或其前体。在可选实施方案中，所述细菌 不能够表达和/或加工所述miRNA或其前体，而仅作为载体在靶真核细胞中用于进一步的 表达和加工。所述miRNA前体可以是(a)初级-miRNA，(b)miRNA前体，(c)miRNA双链体或 其混合物。此时，转化的细菌包含以下一个或多个微小RNA(miRNA)、miRNA前体、编码所述 miRNA或所述前体的DNA分子，或任何上述的混合物。细菌的内容物经过细菌侵入(“细菌感染(bactofection) ”)向靶细胞中递送，并 在通过营养缺陷型、内含体或通过定时添加抗生素引发细菌裂解后在哺乳动物靶细胞内释 放，导致对所述靶基因的调节。细菌DNA和RNA从细胞内细菌中的释放通过活性机制发生。所述细菌DNA和RNA 可包含miRNA、miRNA前体和/或其编码质粒的混合物。一种机制涉及鼠伤寒沙门氏菌 (S. typhimurium)中的III类输出系统，其为横跨细菌细胞膜的专门化多蛋白复合体，其功 能包括向细胞外分泌毒力因子，以允许向靶细胞发放信号，但其也可用于向靶细胞中递送 抗原(Russmann H. Int J Med Microbiol, 293 :107-12(2003))或通过细菌裂解并向细胞 质中释放细菌内容物。通过加入细胞内活性抗生素(四环素)引发细胞内细菌的裂解，或 通过细菌代谢减毒(营养缺陷型)或通过细胞内体或溶酶体自然发生。释放真核转录质粒 后，在靶细胞内产生miRNA、miRNA前体，依次引发靶基因的基于miRNA的调节。可使用天然侵入性病原体鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)进行 本发明。在该实施方案的一方面，鼠伤寒沙门氏菌的菌株包括SL 7207和VNP20009 (S. K. Hoiseth, B.A.D.Stacker, Nature 291,238(1981) ；Pawelek JM，Low KB, Bermudes D. Cancer Res. 57(20) :4537-44(1997 年 10 月 15 日))。在本发明的另一实施方案中，使用减毒大肠杆菌进行本发明。在该实施方案的 一个实例中，大肠杆菌的菌株是 BM 2710 (C. Grillot-Courvalin, S. Goussard, F. Huetz, D. M. Ojcius, P. Courvalin, Nat Biotechnol 16,862(1998))。在该实施方案的一个特征 中，通过侵入性质粒例如编码Inv基因的一个质粒来改造所述BM 2710菌株，以具有细胞侵 入性质。根据本发明的另一特征，本发明的细菌含有具有Hly (利斯特氏菌溶素(listeria lysine)0)基因的载体，因为认为Hly蛋白质对遗传物质从输入小泡中逃逸是重要的。显 然，所述载体可以是相同的侵入质粒。因此，在一个实施方案中，所述细菌具有编码Inv和 Hly基因的质粒。在一个实例中，用于本发明的大肠杆菌菌株是BL21 (DE3) pLysE。在一个实施方案中，miRNA前体，例如miRNA前体在细菌中表达并加工成miRNA前 体，然后递送至真核细胞中。在另一实施方案中，miRNA前体，例如miRNA前体在细菌中表 达，然后递送至真核细胞中并在所述真核细胞中加工成miRNA。在可选实施方案中，编码 miRNA前体，例如初级-miRNA的DNA分子递送至真核细胞中，并且所述miRNA前体在所述真 核细胞中表达，然后加工成miRNA。在一个实施方案中，miRNA在细菌中表达，然后递送至真核细胞中。在另一实施方 案中，编码miRNA的DNA分子递送至真核细胞中，并且所述miRNA在所述真核细胞中表达。
在一个实施方案中，至少一个基因是一个基因，或多于2、4、8、16、32、64、100、200 或400个基因。本发明也提供通过用在适当启动子控制下表达miRNA或前体的载体转化细菌或 其他宿主细胞制备微小RNA的方法。在细菌的情况下，在载体中提供原核启动子，例如T7。 如果所述载体编码miRNA前体，例如miRNA前体，表达上文讨论的所需加工酶的载体也转化 到细菌中。1.应用1. 1研究和药物开发工具野生型miRNA在细胞中行使基因调节功能；一些已经与多种类型的人类疾病， 包括癌相关。因此，miRNA可用于研究其调节的靶基因和它们本身怎样被其他分子，例如 miRNA抑制剂靶向。本发明的方法可用于在体外和体内研究基因功能。本发明的载体可用于转染培养 的动物细胞，作为药物靶向/途径鉴定和确认中的研究工具。例如，在用本发明的细菌感染 宿主细胞并释放细菌内容物提供某些miRNA或可加工成miRNA的前体后，可观察细胞的表 型或形态改变，其揭示了一些目的途径已经受到影响。此类表型改变可包括多种细胞核、细 胞核形态、细胞死亡、细胞增殖、DNA片段化、细胞表面标记和有丝分裂指数等。在另一实例 中，可分离或鉴定宿主细胞中分子/底物与转染到细胞中的miRNA之间的相互作用，以发现 潜在的治疗靶标。该靶标可以处于上游并调节所述miRNA的活性，或者所述靶标可以处于 下游，并且其活性受所述miRNA调节。在体内应用方面，因为miRNA可通过本发明的方法引入宿主体内，在研究某些 miRNA对不同细胞类型和不同组织的影响中可采用系统生物学手段。这些体内和体外方法使用具有期望性质(侵入力、减毒、steerability)的细菌。 例如双歧杆菌和利斯特氏菌用于进行本发明细菌介导的RNAi方法。使用质粒赋予细菌侵 入力以及一个或几个miRNA或miRNA前体的真核或原核转录。1. 2治疗用途本发明细菌介导的miRNA组合物可用于治疗和或预防多种疾病，包括总结 T Dykxhoorn, Novina&Sharp· Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4 :457-467(2003) ；Kim&Rossi， Nature Rev. Genet. 8 :173-184(2007) ；de Fougerolles,等 Nature Rev. Drug Discov. 6 443-453(2007)中的疾病。在一个实施方案中，本发明可通过靶向一个或多个癌相关基因作为癌治疗 方法或用于预防癌。该方法受参与细胞增殖或其他癌表型的基因的沉默或敲减影 响。用于癌治疗的本发明的细菌优选为改造以安全搜出并杀死肿瘤的细菌(Forbes， Nature Biotechnology 24:1484-1485(2006)。所述细菌可以是专性厌氧菌，如梭菌 (Clostridium) novyi-NT，或兼性厌氧菌，如鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌(如上)。这些基因的实例是多种癌基因，例如k-Ras。例如，k_Ras已经显示受miRNA Let_7 的调节。这些癌基因是活化的并涉及大多数临床病例。例如，k-Ras在大多数人结肠癌、胰 腺癌和非小细胞非癌中中异常活化。k-Ras突变赋予对化学治疗和目前靶向治疗的抗性。 本发明细菌介导的和基于miRNA的基因寻靶方法可应用于达到肠道用于结肠癌治疗和预 防。这些方法也用于治疗携带异种移植肿瘤的动物，以在肠的肿瘤发生的k-RasV12模型中治疗并预防癌，并在腺瘤性结肠息肉病(APC-min模型)中预防和治疗肿瘤。本发明的方法也可用于产生用于待使用的癌预防性“益生菌”，其尤其具有GI道 或肝的靶标。本发明的方法用作针对炎症疾病，例如炎性肠病(IBD)，包括局限性肠炎、溃疡 性结肠炎的治疗。这些方法用于沉默或敲减非癌基因靶标(病毒基因，用于治疗和预防乙 肝、丙肝；炎性基因，用于治疗和预防炎性肠病)和其他基因靶标。本发明的方法可用于向消化道和结肠中递送基因沉默(称为结肠癌治疗和预 防)，并在多种疾病的治疗中用于经口应用。在该实施方案的另一方面，基因沉默的递送是 经肠外的，如局部的、静脉内的。细菌产生和/或递送的dsRNA也可用于沉默或敲减非癌基因靶标。本发明的RNA 分子也可用于治疗或预防眼疾(例如年龄相关性黄斑变性(AMD)和糖尿病性视网膜病变 (DR))；感染性疾病(例如HIV/AIDS、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人乳头瘤 病毒(HPV)、单纯疱疹病毒(HSV)、RCV、巨细胞病毒(CMV)、登革热、西尼罗病毒)；呼吸道疾 病(例如呼吸道合胞病毒、哮喘、囊性纤维化)；神经疾病(例如亨廷顿舞蹈病(HD)、肌萎缩 性脊髓侧索硬化(ALS)、脊索损伤、帕金森疾病、阿尔茨海默氏疾病、疼痛)；心血管疾病；代 谢疾病(例如糖尿病)；遗传病；和炎性疾病(例如炎性肠病(IBD)、关节炎、风湿病、自身免 疫性疾病)，皮肤病。因为miRNA是动物细胞许多细胞途径调节装置的一部分，缺陷型miRNA本身可在 动物中引起病征或疾病。因此，本发明的一个治疗用途是简单地产生并向动物中递送miRNA 的功能拷贝或遗传改造拷贝，以治疗或预防此类病征或疾病。2.细菌递送根据本发明，能够如通过穿过细胞膜并进入细胞的细胞质，而向靶细胞的细胞质 中递送分子，例如miRNA分子的任何微生物可用于向此类细胞中递送miRNA和其前体。在 优选的实施方案中，所述微生物是原核生物。在甚至更优选的实施方案中，所述原核生物 是细菌。也处于本发明范围内的是除可用于向细胞递送RNA的细菌以外的微生物。例 如，所诉微生物可以是真菌，例如Cryptococciis neoformans,原生动物，例如克鲁兹锥 虫(Trypanosoma cruzi)、鼠弓菜虫(Toxoplasma gondii)、多氏禾丨」什曼虫(Leishmania donovani)禾口疱虫(Plasmodia)。如本文所用，当指微生物，例如细菌时，术语“侵入性的”指能够向靶细胞递送至少 一种分子，例如RNA或编码RNA的DNA分子的微生物。侵入性微生物可以是能够穿过细胞 膜，由此进入所述细胞的细胞质，并向靶细胞递送至少一些其内容物，例如RNA或编码RNA 的DNA的微生物。向靶细胞递送至少一种分子的过程优选不显著修饰侵入装置。在优选的 实施方案中，所述微生物是细菌。优选的侵入性细菌是能够如通过进入真核细胞的细胞质 向靶细胞递送至少一种分子，例如RNA或编码RNA的DNA分子的细菌。优选的侵入性细菌 是或的细菌，例如活的侵入性细菌。侵入性微生物包括天然能够如通过穿过细胞膜，例如真 核细胞膜并进入细胞质，而向靶细胞递送至少一种分子的微生物，以及非天然侵入性的但 已经被修饰，例如遗传修饰而变得具侵入性的微生物。在另一优选实施方案中，可通过将细 菌连接到“侵入因子”，也称为“进入因子”或“细胞质靶向因子”上来修饰非天然侵入性的 微生物，使其变得有侵入性。如本文所用，“侵入因子”是当非侵入性细胞表达时致使细菌 具有侵入性的因子，例如蛋白质或一组蛋白质。如本文所用，“侵入因子”由“细胞质靶向基因”编码。天然侵入性微生物，例如细菌可具有某些向性，即趋向优选的靶细胞。或者，可修 饰，例如遗传修饰微生物，例如细菌，以模拟第二种微生物的向性。可根据本领域已知的方法测定至少一种分子向靶细胞的递送。例如，可通过杂交 或PCR方法，或通过包括使用抗体的免疫方法检测分子的存在，由此沉默的RNA或蛋白质的 表达降低。测定微生物是否具有用于本发明的足够的侵入性可包括测定相对于与宿主细胞 接触的微生物数量，是否有足够的RNAOniRNA或miRNA前体)或其编码DNA向宿主细胞递 送。如果RNA的量相对于所用微生物的数量较低，可期望进一步修饰微生物以提高其侵入 性潜力。可通过多种方法测定细菌进入细胞。细胞内细菌在氨基糖苷类抗生素处理下 存活，而细胞外细菌被快速杀死。可通过用抗生素庆大霉素处理单层细胞来灭活细胞 外细菌，然后在用温和去污剂释放存活的细胞内生物并在标准细菌学培养基上测定有 活力的数量前除去该抗生素，来完成对细菌吸收的定量评估。此外，例如通过细胞层的 thin-section-transmission电子显微镜或通过免疫荧光技术直接观察细菌进入细胞 O^alkow等(1992)Annual Rev. Cell Biol. 8 :333)。因此，多种技术可用于测定特定细菌是 够能够侵入特定类型的细胞，或用于如修饰细菌的向性以模拟第二种细菌的向性的细菌修 饰后，验证细菌的侵入。根据本发明方法递送RNA的细菌优选为非致病性的。然而，只要它 们的致病性已经减毒，由此致使所述细菌对向其施用的受试者无害，也可使用病原菌。如本 文所用，术语“减毒的细菌”指已经被修饰来显著减少或消除其对受试者的损害的细菌。可 通过下文所述的多种方法减毒病原菌。不想受限于作用的特定机理，根据细菌类型，向真核细胞中递送RNA或DNA的细菌 可进入细胞的多个区室。例如，所述细菌可以在小泡中，例如吞噬小泡中。一旦进入细胞， 细菌可被破坏或裂解，并且其内容物可递送到真核细胞中。也可改造细菌表达吞噬体降解 酶，以允许RNA从所述吞噬体中泄漏。在一些实施方案中，所述细菌在真核细胞中可保持活 力不同时间，并可继续产生RNAOniRNA或miRNA前体)。RNA或编码RNA的DNA然后可从细 菌中例如通过泄漏释放到细胞中。在本发明的某些实施方案中，所述细菌也可以在真核细 胞中复制。在优选的实施方案中，细菌复制不杀死宿主细胞没有明显的毒性。本发明不限 于通过特定装置递送RNA或编码RNA的DNA并且旨在包括允许通过不依赖的细菌递送装置 递送RNA或编码RNA的DNA的方法和组合物。下文所述的是在文献中已经描述为天然侵入性的细菌(部分2. 1)，以及在文献中 已经描述为天然非侵入性的细菌(部分2. 2)，以及天然非致病性的或减毒的细菌的实例。 尽管已经将一些细菌描述为非侵入性的(部分2.幻，这些根据本发明仍然是侵入性足够使 用的。无论是否常规描述为天然侵入性的或非侵入性的，可修饰任何的细菌菌株以进行调 节，尤其是增加其侵入性特征(例如在部分2. 3中所述)。2. 1天然侵入性细菌本发明使用的特定天然侵入性细菌并不是至关重要的。此类天然发生的侵入性细 菌的实例包括，但不限于志贺氏菌属物种，沙门氏菌属物种，利斯特氏菌属物种，立克次氏 体属物种(Rickettsia spp.)，和肠侵染性大肠杆菌。所用的特定志贺氏菌菌株对本发明并 非是至关重要的。可用于本发明的志贺氏菌株的实例包括弗氏志贺氏菌^(ATCC No. 29903),Shigella sonnet (ATCC No. 29930)，和 Shigella disenteriae (ATCCNo. 13313)。减毒志贺 氏菌株,如弗氏志贺氏菌2a 2457T aroA virG突变体CVD 1203 (Noriega等，上文)、弗氏志 贺氏菌 M90T icsA 突变体(Goldberg 等 Infect Immun.，62 :5664-5668 (1994))、弗氏志贺 氏菌 Y SFLl 14 aroD 突变体(Karnell 等 Vacc，10 167-174 (1992))和弗氏志贺氏菌 aroA aroD突变体(Verma等Vacc，9 :6-9(1991))优选用于本发明。或者，可通过单独引入减毒 突变或与其他一种或更多种额外减毒突变结合构建新的减毒志贺氏菌属物种菌株。志贺氏菌RNA疫苗载体的至少一个优势是其对结肠黏膜表面中淋巴组织的向 性。此外，认为志贺氏菌复制的初始位点位于树状突细胞和巨噬细胞内，其通常见于黏膜
E^liRΦ M 白勺—/^ (McGhee, J. R.等 Reproduction, Fertility, &Development 6 :369(1994) ；Pascual, D. W.等 Immunomethods 5:56(1994)综述)。像这样，志贺氏菌 载体可提供手段以在这些专门抗原呈递细胞中表达抗原的工具。志贺氏菌载体的另一优 势是减毒的志贺氏菌菌株在体外和体内递送核酸报告基因(Sizemore，D. R.等kience 270:299(1995) ；Courvalin, P.等 Comptes Rendus de 1 Academiedes Sciences Serie Ill-Sciences de Ia Vie-Life Sciences 318 :1207(1995) ；Powell,R. J.等在Molecular approaches to the control of infectiousdiseases(1996) ψ . , F. Brown, E. Norrby, D. Burton 禾口 J. Mekalanos,编著 Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. 183 ； Anderson,R. J.等Abstracts for the 97th General Meeting of the American Society forMicrobiology :E. (1997))。在实践方面，志贺氏菌的严格限制的宿主特异性支持通 过中间宿主防止志贺氏菌载体扩散到食物链中。此外，已经在啮齿类、灵长类和自生自长 型(植物)中开发了高度减毒的减毒菌株(Anderson等(1997)上文；Li，A.等Vaccine 10 :395(1992) ；Li，Α.等 Vaccine 11:180(1993) ；Karnel 1, A.等 Vaccine 13:88(1995)； Sansonetti, P. J.禾口 J. ArondelVaccine 7:443(1989) ；Fontaine, Α.等 Research in Microbiology 141 :907(1990) ；Sansonetti, P.J.等(1991)Vaccine 9 416 ；Noriega, F. R.等 Infection&Immunity 62:5168(1994) ；Noriega, F. R.等 Infection&Immunity 64 :3055(1996) ；Noriega, F. R.等 Infection&Immunity 64:23(1996) ；Noriega, F. R.等 Infection&Immunity 64:3055(1996) ；Kotloff, K. L.等 Infection&Immunity 64: 4542(1996))。该近来的认识将允许开发用于人的良好耐受的志贺氏菌载体。可使用化学性非特异性诱变，如使用试剂如N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍；或 使用重组DNA技术、经典的遗传技术(如TnlO诱变、P22-介导的转导、λ噬菌体介导的交 换和接合转移)的非特异性诱变；或使用定点诱变的重组DNA技术，将减毒突变引入细菌 性病原菌中。因为对重组DNA技术构建的菌株进行了更明确的定义，所以优选重组DNA技 术。此类减毒突变的实例包括，但不限于(i)营养缺陷性突变，如aroOtoiseth等Nature， 291 :238-239 (1981))、gua (McFarland 等 Microbiol. Path.，3 :129-141 (1987))、nad (Park 等 J. Bact, 170 :3725-3730(1988)、thy (Nnalue 等 Infect. Immun. ,55 :955-962(1987))和 asd(Curtiss，上文)突变；(ii)灭活球形调节功能的突变，如cya(Curtiss等Infect. Immun. ,55 3035-3043 (1987))、crp (Curtiss 等(1987)，上文)、phoP/phoQ (Groisman 等 Proc. Natl. Acad. Sci.，USA,86 :7077-7081 (1989)；禾口 Miller 等 Proc.Natl. Acad. Sci.，USA,86 5054-5058(1989))、phop (Miller 等 J. Bact, 172 :2485-2490 (1990))或 ompR(Dorman 等Infect. Immun. ,57 :2136-2140(1989))突变；(iii)修饰应激应答的突变，如 recA(Buchmeier 等 MoI. Micro.，7 933-936(1993))、htrA (Johnson 等 Mol. Micro.，5 :401-407 (1991) )、htpR(Neidhardt 等 Biochem.Biophys. Res. Com. ，100 :894-900(1981))、hsp (Neidhardt 等 Ann. Rev. Genet, 18 295-329(1984))和 groEL (Buchmeier 等 ki.，248 :730-732(1990))突变；(iv)特定毒力因子中的突变，如 IsyA (Libby 等 Proc. Natl. Acad. ki.，USA, 91 :489-493(1994))、pag 或 prg(Miller 等(1990)，上文；和 Miller 等(1989)，上文)、 iscA 或 virG(d ‘ Hauteville 等 Mol. Micro.，6 :833-841 (1992))、plcA(Mengaud 等 Mol Microbiol.，5 :367-72(1991) ；Camilli 等 J. Exp. MecU 173 :751-754 (1991))，和 act (Brundage 等 Proc. Natl. Acad. Sci.，USA, 90 11890-11894 (1993))突变；(ν)影响 DNA 拓扑结构的突变，如 top A(Galan 等 hfect. Immun.，58 1879-1885 (1990))；(vi)阻断或修饰细胞周期的突变，如 min(de Boer 等 Cell，56 :641-649 (1989))。(vii)引入编码自杀系统的基因，如 sacB(Recorbet 等 App. Environ. Micro. ,59 1361-1366(1993) ；Quandt 等 Gene，127 :15-21 (1993) )、nuc (Ahrenholtz 等 App. Environ. Micro. ,60 :3746-3751(1994))、hok、gef、kil 或 phlA (Molin 等 Ann. Rev. Microbiol. ,47 139-166(1993))；(viii)改变脂多糖和/或脂类A的生物起源的突变，如rfMRaetz inEsherishia coli and Salmonella typhimurium, Neidhardt 等编著，ASMPress, Washington D. C.第 1035-1063 页(1996))、galE(Hone 等 J. Infect. Dis.，156 :164-167(1987))和 htrB(Raetz， 上文)、msbB (Reatz，上文)(ix)引入噬菌体裂解系统，如P22编码的溶源体(Rermell等Virol，143 280-289(1985))、λ 胞壁质转糖基酶(Bienkowskalzewczyk 等 Mol. Gen. Genet.，184 111-114(1981))或 S 基因(Reader 等 Virol，43 :623-6 (1971))；禾口减毒突变可组成型表达或处于诱导性启动子控制下，如启动子的温度敏感型 热激家族(Neidhardt等上文)，或厌氧诱导的nirB启动子(Harbome等Mol Micro.， 6 :2805-2813(1992))或抑制型启动子，如 uapA (Gorfinkiel 等 J. Biol. Chem.，268 23376-23381 (1993))或 gcv(Stauffer 等 J. Bact, 176 :6159-6164 (1994))。所用的特定利斯特氏菌株对本发明并非是至关重要的。可用于本发明的利斯特 氏菌菌株的实例包括单核细胞增生利斯特氏菌(ATCC No. 15313)。减毒的利斯特氏菌株， 如单核细胞增生利斯特氏菌actA突变体(Brundage等上文)或单核细胞增生利斯特氏菌 ρ IcA (Camilli等J.Exp. Med.，173 :751-754(1991))优选用于本发明。或者，可通过引入上 文描述志贺氏菌属物种的(i)到(vii)组中的一个或多个减毒突变构建新的减毒利斯特氏 菌株。所用的特定沙门氏菌菌株对本发明并非是至关重要的。可用于本发明的沙门氏菌菌株的实例包括伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi) (ATCC No. 7251)和鼠伤寒沙门氏菌(ATCC No. 13311)。减毒的沙门氏菌株优选用于本发明 并包括伤寒沙门氏菌(S. typhi) -aroC-aroD (Hone等Vacc. 9 :810 (1991)和鼠伤寒沙门氏 菌-axoA突变体(Mastroeni等Micro. Pathol. 13 :477 (1992))。或者，可通过引入上文描 述志贺氏菌属物种的一个或多个减毒突变构建新的减毒沙门氏菌菌株。
所用的特定立克次氏体菌株对本发明并非是至关重要的。可用于本发明的立 克次氏体菌株的实例包括立氏立克次氏体(Rickettsia Rickettsiae) (ATCC No. VR149 和 VR891)、普氏立克次氏体(Ricketsia prowaseckii) (ATCC No. VR233)、恙虫热立克次 氏体(Rickettsia tsutsugamuchi) (ATCCNo. VR312, VRl 50 和 VR609)、摩氏立克次氏体 (Rickettsia mooseri) (ATCCNo. VR144)、西伯利亚立克次氏体(Rickettsia s'ibirica ) (ATCC No. VR151)和五日热立克次氏体(Rochalimaea qui tana) (ATCC No. VR358)。减毒的 立克次体菌株优选用于本发明，并可通过引入上文描述志贺氏菌属物种的(i)到(vii)组 中的一个或多个减毒突变构建。所用的特定肠侵染性大肠杆菌菌株对本发明并非是至关重要的。可用于本发明 的肠侵染性大肠杆菌的实例包括大肠杆菌菌株4608-58、1184-68、53638-C-17、13-80和 6-81 (Sansonetti 等 Ann. Microbiol. (Inst. Pasteur)，132A :351-355 (1982))。减毒的肠侵染性大肠杆菌菌株优选用于本发明并可通过引入上文描述志贺氏菌 属物种的(i)到(vii)组中的一个或多个减毒突变构建。此外，因为除细菌之外的某些微生物也可与整联蛋白分子(其为某些侵入因子 的受体)相互作用用于细胞吸收，此类微生物也可用于向靶细胞中引入RNA。例如，病毒， 例如口蹄病病毒、艾柯病毒和腺病毒，和真菌病原体，例如荚膜组织孢浆菌(Histoplasma capsulatum)和硕大利什曼原虫(Leishmania major)与整联蛋白分子相互作用。2. 2较低侵入性的细菌可用于本发明并已经在文献中描述为非侵入性的或至少比前文部分(2. 1)中列 出的细菌侵入性弱的细菌的实例包括，但不限于耶尔森菌属物种(Yersinia spp.)、大肠杆 菌属物种(Escherichia spp.)、克雷伯氏菌属物种(Klebsiella spp.)、博德特氏菌属物种 (Bordetella spp.)、奈瑟氏球菌属物种(Neisseria spp.)、气单胞菌属物种(Aeromonas spp.)、ft禾中(Franciesella spp.)、_ 木干胃 M 禾中(Corynebacterium spp.)、柠檬酸细菌属物种(CitrcAacter spp.)、衣原体属物种(Chlamydia spp.)、嗜 血菌属物种(Hemophilus spp.)、布鲁氏菌属物种(Brucella spp.)、分枝杆菌属物种 (Mycobacterium spp.)、军团杆菌属物种(Legionella spp.)、红球菌属物种(Rhodococcus spp.)、假单胞菌属物种(Pseudomonas spp.)、缠绕杆菌属物种(Helicobacter spp·)、 弧菌属物种(Vibrio spp.)、芽孢杆菌属物种(Bacillus spp.)和丹毒丝菌属物种 (Erysipelothrix spp.)。修饰这些细菌以增加它们的侵入潜力是必需的。所用的特定耶 尔森菌菌株对本发明并非是至关重要的。可用于本发明的耶尔森菌菌株的实例包括小肠结肠炎耶尔森氏菌 (Y. enterocolitica) (ATCC No. 9610)或鼠疫耶尔森氏菌(Y. pestis) (ATCC No. 19428)。 减毒的耶尔森菌菌株如小肠结肠炎耶尔森氏菌k03-R2(al-Hendy等hfect. Immun.， 60 :870-875 (1992))或小肠结肠炎耶尔森氏菌 aroA (0 ‘ Gaora 等 Micro. Path.，9 105-116(1990))优选用于本发明。或者，可通过引入上文所述用于志贺氏菌属物种的(i) 到(vii)组中的一个或多个减毒突变构建新的减毒耶尔森菌菌株。所用的特定大肠杆菌菌株对本发明并非是至关重要的。可用于本发明的大肠杆 菌菌株的实例包括大肠杆菌 H10407 (Elinghorst 等 hfect. Immun. ,60 :2409-2417(1992)) 和大肠杆菌 EFC4、CFT325 和 CPZ005 (Donnenberg 等 J. Infect. Dis.，169 :831-838 (1994))。减毒的大肠杆菌菌株，如减毒的火鸡病原体大肠杆菌02 carAB突变体(Kwaga等Infect. Immun. ,62 :3766-3772(1994))优选用于本发明。或者，可通过引入上文所述用于志贺氏菌 属物种的(i)到(vii)组中的一个或多个减毒突变构建新的减毒大肠杆菌菌株。所用的特定克雷伯氏菌菌株对本发明并非是至关重要的。可用于本发明的克雷伯氏菌菌株的实例包括肺炎雷伯氏菌(K. pneumoniae) (ATCC No. 13884)。减毒的克雷伯氏菌菌株优选用于本发明，并可通过引入上文所述用于志贺氏菌 属物种的(i)到(vii)组中的一个或多个减毒突变构建。所用的特定博德特氏菌菌株对本发明并非是至关重要的。可用于本发明的博德特氏菌菌株的实例包括气管炎博德特氏菌 (B. bronchiseptica) (ATCC No. 19395)。减毒的博德特氏菌菌株优选用于本发明，并可通过 引入上文所述用于志贺氏菌属物种的(i)到(vii)组中的一个或多个减毒突变构建。所用的特定奈瑟氏球菌菌株对本发明并非是至关重要的。可用于本发明的奈瑟氏 球菌菌菌株的实例包括脑膜炎奈瑟氏球菌(N. meningitidis) (ATCC No. 13077)和淋病奈 瑟氏球菌(N. gonorrhoeae) (ATCC No. 19424)。减毒的奈瑟氏球菌菌株，如淋病奈瑟氏球菌 MSll aro 突变体(Chamberlain 等Micro. Path. , 15 :51-63(1993))优选用于本发明。或者， 可通过引入上文所述用于志贺氏菌属物种的(i)到(vii)组中的一个或多个减毒突变构建 新的减毒奈瑟氏球菌菌株。所用的特定气单胞菌菌株对本发明并非是至关重要的。可用于 本发明的气单胞菌菌株的实例包括A. euCren0phila(ATCC No. 23309)。或者可通过引入上 文所述用于志贺氏菌属物种的(i)到(vii)组中的一个或多个减毒突变构建新的减毒气单 胞菌菌株。所用的特定弗朗西丝氏菌菌株对本发明并非是至关重要的。可用于本发明的弗朗 西丝氏菌菌株的实例包括土拉热弗朗西丝氏菌(F. tularensis) (ATCC No. 15482)。减毒的 弗朗西丝氏菌菌株优选用于本发明，并可通过引入上文所述用于志贺氏菌属物种的(i)到 (vii)组中的一个或多个减毒突变构建。所用的特定棒杆菌菌株对本发明并非是至关重要的。可用于本发明的棒杆菌菌株 的实例包括假结核病棒杆菌(C. pseudotuberculosis) (ATCC No. 19410)。减毒的棒杆菌菌 株优选用于本发明，并可通过引入上文所述用于志贺氏菌属物种的(i)到(vii)组中的一 个或多个减毒突变构建。所用的特定柠檬酸细菌菌株对本发明并非是至关重要的。可用于本发明的柠檬酸 细菌菌株的实例包括弗氏柠檬酸细菌(C. freundii) (ATCC No. 8090)。减毒的柠檬酸细菌菌 株优选用于本发明，并可通过引入上文所述用于志贺氏菌属物种的(i)到(vii)组中的一 个或多个减毒突变构建。所用的特定衣原体菌株对本发明并非是至关重要的。可用于本发明的衣原体菌株 的实例包括C. pneumoniae (ATCC No. VRl 310)。减毒的衣原体菌株优选用于本发明，并可通 过引入上文所述用于志贺氏菌属物种的(i)到(vii)组中的一个或多个减毒突变构建。所用的特定嗜血杆菌菌株对本发明并非是至关重要的。可用于本发明的嗜血杆菌 菌株的实例包括H. sornmis (ATCC No. 43625)。减毒的嗜血杆菌菌株优选用于本发明，并可 通过引入上文所述用于志贺氏菌属物种的(i)到(vii)组中的一个或多个减毒突变构建。所用的特定布鲁氏菌菌株对本发明并非是至关重要的。可用于本发明的布鲁氏菌菌株的实例包括流产布鲁氏菌(B. abortus) (ATCC No. 23448)。减毒的布鲁氏菌菌株优选用 于本发明，并可通过引入上文所述用于志贺氏菌属物种的(i)到(vii)组中的一个或多个
减毒突变构建。所用的特定分枝杆菌菌株对本发明并非是至关重要的。可用于本发明的分枝杆 菌菌株的实例包括胞内分枝杆菌(M. intracelhilare) (ATCC No. 13950)和结核分枝杆菌 (M. tuberculosis) (ATCC No. 27294)。减毒的分枝杆菌菌株优选用于本发明，并可通过引入 上文所述用于志贺氏菌属物种的(i)到(vii)组中的一个或多个减毒突变构建。所用的特定军团杆菌菌株对本发明并非是至关重要的。可用于本发明的军团杆菌 菌株的实例包括L. pneumophila (ATCC No. 33156)。减毒的军团杆菌菌株，如L. pneumophila mip突变体(0tt，FEMS Micro. Rev. ,14 :161-176(1994))优选用于本发明。或者，可通过引 入上文所述用于志贺氏菌属物种的(i)到(vii)组中的一个或多个减毒突变构建新的减毒 军团杆菌菌株。所用的特定红球菌菌株对本发明并非是至关重要的。可用于本发明的红球菌菌株 的实例包括R.equi(ATCC No. 6939)。减毒的红球菌菌株优选用于本发明，并可通过引入上 文所述用于志贺氏菌属物种的(i)到(vii)组中的一个或多个减毒突变构建。所用的特定假单胞菌菌株对本发明并非是至关重要的。可用于本发明的假单胞菌 菌株的实例包括铜绿假单胞菌(P. aeruginosa) (ATCC No. 23267)。减毒的假单胞菌菌株优 选用于本发明，并可通过引入上文所述用于志贺氏菌属物种的(i)到(vii)组中的一个或 多个减毒突变构建。所用的特定缠绕杆菌菌株对本发明并非是至关重要的。可用于本发明的缠绕杆菌 菌株的实例包括H. mustelae (ATCC No. 43772)。减毒的缠绕杆菌菌株优选用于本发明，并可 通过引入上文所述用于志贺氏菌属物种的(i)到(vii)组中的一个或多个减毒突变构建。所用的特定沙门氏菌菌株对本发明并非是至关重要的。可用于本发明的沙门氏 菌菌株的实例包括伤寒沙门氏菌(ATCC No. 7251)和鼠伤寒沙门氏菌(ATCC No. 13311)。 减毒的沙门氏菌菌株优选用于本发明并包括伤寒沙门氏菌aroC aroD (Hone等Vacc， 9 :810-816(1991))和鼠伤寒沙门氏菌 aroA 突变体(Mastroeni 等 Micro. Pathol，13 477-491(1992)))。或者，可通过引入上文所述用于志贺氏菌属物种的(i)到(vii)组中的 一个或多个减毒突变构建新的减毒沙门氏菌菌株。所用的特定弧菌菌株对本发明并非是至 关重要的。可用于本发明的弧菌菌株的实例包括霍乱弧菌(Vibrio cholerae) (ATCC No. 14035)和辛辛那提弧菌(Vibrio cincinnatiensis) (ATCC No. 35912)。减毒的弧菌 菌株优选用于本发明并包括霍乱弧菌RSI毒力突变体(Taylor等J. hfect. Dis.，170 1518-1523(1994))和霍乱弧菌 ctxA、ace、zot、c印突变体(Waldor 等 J. Infect. Dis.，170 278483(1994))。或者，可通过引入上文所述用于志贺氏菌属物种的(i)到(vii)组中的 一个或多个减毒突变构建新的减毒弧菌菌株。所用的特定杆菌菌株对本发明并非是至关重要的。可用于本发明的杆菌菌株的实 例包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) (ATCC No. 6051)。减毒的杆菌菌株优选用于本 发明并包括 B. anthracis 突变体 pXOl (WeIkos 等 Micro. Pathol, 14 :381-388 (1993))和减 毒的BCG菌株(Mover等Nat，351 :456-460 (1991))。或者，可通过引入上文所述用于志贺氏菌属物种的(i)到(Vii)组中的一个或多个减毒突变构建新的减毒杆菌菌株。所用的特定丹毒丝菌菌株对本发明并非是至关重要的。可用于本发明的丹毒丝 菌菌株的实例包括猪丹毒丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae) (ATCC No. 19414) 和扁桃体丹毒丝菌(Erysipelothrix tonsillarum) (ATCCNo. 43339) 减毒的沙门氏菌菌 株优选用于本发明并包括猪丹毒丹毒丝菌Kg-Ia和Kg-2 (ffatarai等J. Vet. Med. Sci.， 55 :595-600(1993))和猪丹毒丹毒丝菌 ORVAC 突变体(Markowska-Daniel 等 ht. J.Med. Microb. Virol. Parisit. Infect. Dis.，277 :547-553 (1992))。或者，可通过引入上文所述 用于志贺氏菌属物种的(i)到(vii)组中的一个或多个减毒突变构建新的减毒丹毒丝菌菌 株。2. 3用于增加菌株侵入性性质的方法无论已经将生物常规描述为侵入性的还是非侵入性的，可改造这些生物以增加它 们的侵入性性质，例如通过模拟志贺氏菌属物种、利斯特氏菌属物种、立克次体属物种、伤 寒沙门氏菌属物种或肠侵染性大肠杆菌属物种的侵入性质。例如，可向微生物中引入使微 生物能够进入细胞(例如所述非侵入性细菌的天然宿主中的细胞)的细胞质中的一个或多 个基因。本文称为“细胞质靶向基因”的此类基因的实例包括编码能够通过志贺氏菌，或肠 侵染性大肠杆菌的类似侵入基因，或利斯特氏菌的利斯特氏菌溶素0侵入的蛋白质的基因， 像已知此类技术产生广泛的能够侵袭并进入动物细胞的细胞质中的侵入细菌一样(Formal 等 Infect. Immun. ,46 :465(1984) ；Bielecke 等 Nature，345 175-176 (1990) ；Small 等 Microbiology-1986,第 121-124页，Levine等编著，American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1986) ；Zychlinsky 等 Molec. Micro.，11 :619-627(1994) ；Gentschev 等 (1995) Infection&Immunity 63 4202 ；Isberg, R. R.禾口 S. Falkow (1985) Nature 317:262; 和Isberg，R.R.等(1987)Cell 50:769)。用于向细菌菌株中转移上述细胞质靶向基因的 方法为本领域所熟知。可向细菌引入另一优选基因以增加其侵入特征，该基因编码来自假 结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)的侵染素蛋白质，(Leong等EMBO J. ,9 1979(1990))。侵染素也可与listeriolysin组合引入，由此，相对于引入任一这些基因，进 一步增加细菌的侵入特征。为说明性目的，已经对上述基因做了描述；然而，对于本领域技 术人员显而易见的是来自一种或更多种来源的任何基因或基因组合将足够，所述基因或基 因组合参与将分子，尤其是RNA或编码RNA的DNA分子从微生物递送到细胞，例如动物细胞 的细胞质中。因此，此类基因不限于细菌基因，并包括病毒基因，如流感病毒血凝素HA-2，其 促进胞内体裂解作用(endosmolysis) (Plank 等 J. Biol. Chem.，269 12918-12924 (1994))。 也可通过例如PCR扩增从DNA获得上述靶向细胞质的基因，从携带期望的靶向细胞质的基 因的侵入性细菌中分离所述DNA。可从本领域，例如上文列出的参考文献和/或在因特网 (www. ncbi. nlm. nih. gov/)上可公开获得的GenBank中获得的核苷酸序列设计PCR的引物。 可设计PCR引物以扩增细胞质靶向基因、细胞质靶向操纵子、细胞质靶向基因簇或细胞质 靶向基因调节子。所用的PCR策略将依赖于细胞质靶向基因或靶侵入性细菌中基因的遗传 结构。设计PCR引物，使其含有与靶DNA序列开始和末端的DNA序列同源的序列。然后可以 例如通过使用 Hfr 转移或质粒活动(Miller，A Short Course in BacterialGenetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1992) ；Bothwell 等上文；和Ausubel等上文)、噬菌体介导转导(de Boer，上文；Miller，上文；和Ausubel等上文)、 化学转化(Bottiwell等上文；Ausubel等上文)、电穿孔(Bottiwel等上文；Ausubel等上文； 禾口Sambrook,MolecularCloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.)和物理转化技术(Johnston 等上文；和 Bothwell，上 文)将细胞质靶向基因引入靶细菌菌株中。细胞质靶向基因可整合到可溶性噬菌体中(de Boer等Cell，56 :641-649 (1989))，质粒载体s (Curtiss等上文)或剪接到靶菌株的染色体 中(Hone等上文)。如上所述，除了遗传改造细菌提高其侵入性性质外，也可通过将侵入因子与细胞 连接，以修饰细菌。因此，在一个实施方案中，通过用侵入因子，例如具有足够侵入力的蛋白 质侵染素、侵染素衍生物或其片段共价或非共价包被细菌致使细菌更具侵入性。事实上，已 经显示用来自假结核耶尔森氏菌的纯化侵染素包被非侵入性细菌细胞或侵染素的羧基末 端192个氨基酸能够进入哺乳动物细胞(Leong等EMBO J. 9 :1979(1990))。此外，侵染素 的羧基末端区包被的乳胶球被哺乳动物细胞有效内化，如用抗体固定的侵染素包被的金黄 色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)菌株(综述见于 Isberg 禾口 Trail van Nhieu Ann. Rev. Genet. 27 :395(1994))。或者，也可用特异性结合细菌进入因子识别的表面分子的抗 体、其变体或其片段包被细菌。例如，已经显示如果用针对整联蛋白分子，例如α5β1(称 作与细菌侵染素蛋白质相互作用的表面分子)的单克隆抗体包被细菌，那么它们则被内化 (Isberg和Tran van Nhieu，上文)。可根据本领域已知的方法制备此类抗体。通过例如用 抗体包被细菌，使细菌与具有抗体识别的表面受体的真核细胞接触，并根据上述方法监测 细胞内细菌的存在来检测抗体在调节细菌侵入力中的功效。用于连接侵入因子与细菌表面 的方法为本领域所知，包括交联。3.靶细胞本发明提供用于向任何类型的靶细胞递送RNA(或RNA编码DNA)的方法，其中所 述RNA是miRNA或miRNA前体。如本文所用，术语“靶细胞”指细菌侵入的细胞，即具有用 于细菌识别必需的表面受体的细胞。优选地，靶细胞是真核细胞。甚至更优选地，靶细胞是动物细胞。将“动物细胞” 定义为来自或存在于多细胞生物中的有核的，不含叶绿体细胞，所述多细胞生物的分类 (taxanomic)位置位于动物国界。该细胞可以存在于完整动物、原代细胞培养物、外植体培 养物或转化的细胞系中。该细胞的特定组织来源并非对本发明至关重要。用于本发明的受 体动物细胞对其并非至关重要，并包括出现在动物国界内的所有生物中的或来自动物国界 内的所有生物，如哺乳类、鱼类、鸟类、爬行类的那些生物。优选的动物细胞是哺乳动物细胞，如人、牛、绵羊、猪、猫、犬、山羊、马和灵长类细 胞。最优选的动物细胞是人细胞。在优选的实施方案中，靶细胞是黏膜表面。某些肠病原体，例如大肠杆菌、志贺氏 菌、利斯特氏菌和沙门氏菌自然适合用于该应用，因为这些生物具有粘着并侵入宿主黏膜 表面的能力(Kreig等上文)。因此，在本发明中，此类细菌可向宿主黏膜区室中的细胞递送 RNA分子(miRNA或前体)或编码RNA的DNA。尽管某些类型的细菌具有某一向性，即趋向优选的靶细胞，可通过选择对期望的 细胞类型具有向性的细菌或被修饰以能够侵入期望细胞类型的细菌完成RNA或编码RNA的DNA向某一类型细胞的递送。因此，如上讨论，例如可遗传改造细菌以模拟黏膜组织向性和 侵入性性质，由此允许所述细胞侵入黏膜组织，并向这些位点中的细胞递送RNA或编码RNA 的 DNA。细菌也可靶向其他类型的细胞。例如，可通过修饰细菌以在其表面上表达间 日疟虫(Plasmodium vivax)网织红细胞结合蛋白质_1或_2，或-1和-2 (其特异性 结合人和灵长类中的红细胞)，而使细菌靶向人和灵长类的红细胞(felinski等Cell， 69 :1213-1226(1992)).在另一实施方案中，修饰细菌以在其表面上具有脱唾液酸血 清类黏蛋白，其为肝细胞上脱唾液酸糖蛋白受体的配体OVu等J. Biol. Chem.，263 14621-14624(1988))。在另一实施方案中，用已经显示靶向质粒吸收到具有胰岛素 受体的细胞的胰岛素多聚L赖氨酸包被细菌(Rosenkranz等Expt. Cell Res.，199 323-329 (1992))。还在本发明范围内的是被修饰以在其表面上具有允许肝细胞具有向 性的单核细胞增生利斯特氏菌的p60 (Hess等Infect. Immun. ,63 :2047-2053(1995))或 来自通过结合肝素、硫酸肝素和胶原引起特异性结合哺乳动物细胞外基质的克鲁兹锥虫 (Trypanosoma cruzi)的 60kD 表面蛋白(Ortega-Barria 等 Cell,67 :411-421 (1991))的 细菌。在另一实施方案中，细胞可被修饰以变成递送RNA的细菌的靶细胞。因此，可修饰 细胞以表达细菌识别的表面抗原(即侵入因子的受体)，用于其靶向进入细胞。可通过向细 胞中引入编码侵入因子的受体的核酸修饰细胞，使得表面抗原在期望条件下表达。或者，可 用侵入因子的受体包被细胞。侵入因子的受体包括属于整联蛋白受体超家族的蛋白质。多 种细菌和其他微生物识别的整联蛋白受体类型的列表可见于例如Isberg和TranVan Nhieu Ann. Rev. Genet. 27 :395 (1994)。用于整联蛋白亚基的核苷酸序列可见于例如在因特网上可 公共获得的GenBank。如上所述，其他靶细胞包括鱼类、鸟类和爬行类动物细胞。下文中描述了对鱼类、 鸟类和爬行类动物细胞具有天然侵入性的细菌的实例。可天然进入鱼类细胞细胞质的细菌的实例包括，但不限于气单胞菌(Aeromonas salminocida) (ATCC No. 33658)和杀鲑气单胞菌(Aeromonasschuberii) (ATCC No. 43700)。 减毒的细菌优选用于本发明，并包括A. salmonicidia vapA (Gustafson等J. MoI. Biol.， 237 :452-463(1994))或 A. salmonicidia 芳香族依赖性突变体(Vaughan 等 hfect. Immun. ,61 :2172-2181 (1993))。可天然进入鸟类细胞细胞质的细菌的实例包括，但不限于鸡沙门氏菌 (Salmonella galinarum) (ATCC No. 9184)、肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteriditis) (ATCC No. 4931)和鼠伤寒沙门氏菌(ATCC No. 6994)。减毒的细菌优选于本发明并包括减毒的沙 门氏菌菌株如鸡沙门氏菌(S. galinarum) cya crp突变体(Curtiss等(1987)上文)或肠 炎沙门氏菌(S. enteritidis)aroA芳香族依赖性突变体CVL30 (Cooper等hfect. Immun.， 62 :4739-4746(1994))。可天然进入爬行类动物细胞细胞质的细菌的实例包括，但不限于鼠伤寒沙门氏菌 (ATCC No. 6994)。减毒的细菌优选用于本发明并包括减毒的菌株如鼠伤寒沙门氏菌芳香族 依赖性突变体(Hormaeche等上文)。本发明还提供向其他真核细胞例如植物细胞递送RNAOniRNA或其前体)，只要具有天然或已被修饰变得具有侵入性后能够侵入此类细胞的微生物。可侵入植物细胞的微生 物的实例包括根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumerfacium)，其使用通过特异受体结合植物细 胞的菌毛样结构，然后通过与细菌结合类似的过程向植物细胞中递送至少一些其内容物。下文说明的是根据本发明方法可向其中递送RNA的细胞系。人类细胞系的实例包括但不限于ATCC No. CCL 62, CCL 159、HTB151、HTB 22, CCL 2、CRL 1634、CRL 8155、HTB 61 和 HTBl04 牛细胞系的实例包括 ATCC No. CRL 6021、CRL 1733,CRL 6033,CRL 6023,CCL 44 和 CRL 1390。绵羊细胞系的实例包括 ATCC No. CRL6540、 CRL 6538、CRL 6548 和 CRL 6546。猪细胞系的实例包括ATCC No. CL 184、CRL 6492 和 CRL 1746。猫细胞系的实例包括CRL 6077,CRL 6113,CRL 6140,CRL 6164,CCL 94,CCL 150、 CRL 6075 和 CRL 6123。水牛细胞系的实例包括CCL 40和CRL 6072。犬细胞系的实例包括ATCC No. CRL 6213, CCL 34, CRL 6202、CRL6225、CRL 6215、 CRL 6203 和 CRL 6575。山羊来源细胞系的实例包括ATCC No. CCL 73和ATCC No. CRL6270。马来源细胞系的实例包括ATCC No. CCL 57和CRL 6583。鹿细胞系的实例包括ATCC No. CRL 6193-6196。灵长类来源细胞系的实例包括来自黑猩猩的那些细胞系，如ATCC No. CRL 6312、CRL 6304 和 CRL 1868 ；猴细胞系如 ATCC No. CRL 1576、CCL 26 禾口 CCL 161 ；猩猩 (orangautan)细胞系 ATCC No. CRL 1850 ；和大猩猩细胞系 ATCC No. CRL 1854。4.药物组合物在本发明优选的实施方案中，含有miRNA或其前体分子，和/或编码此类分子的 DNA的侵入性细菌通过静脉、肌内、皮内、腹膜内、经口、鼻内、眼内、直肠内、阴道内、骨内、口 腔、浸入和尿道内灌输途径弓I入动物内。本发明的细菌可冻干或加工成其孢子形式。待向受试者施用的本发明的活的侵入性细菌的量根据受试者的类别，以及待治疗 的疾病或病征不同而不同。通常，所用的剂量将是每个受试者约IO3到IO15活菌，优选约IO4 到IO12活菌。本发明的侵入性细菌通常与可药用载体和/或稀释剂一起施用。所用的特定可 药用载体和/或稀释剂对本发明并非至关重要。稀释剂的实例包括磷酸缓冲盐水、缓冲 胃中胃酸的缓冲液，如含有蔗糖的柠檬酸盐缓冲液(PH7. 0)、单独的碳酸氢盐缓冲液(pH 7.0) (Levine 等 J. Clin. Invest, 79 :888-902(1987)；和 Black 等 J. Infect. Dis.，155 1260-1^5(1987))，或含抗坏血酸、乳糖和任选地天冬苯丙二肽酯的碳酸氢盐缓冲液(pH 7. 0) (Levine等Lancet，11 :467-470 (1988))。载体的实例包括例如在脱脂牛奶中发现的蛋 白质、糖(例如蔗糖)或聚乙烯吡咯烷酮。通常将以约0. 1-30% (w/v)，但优选1-10% (w/ ν)范围内的浓度内使用这些载体。下文所示是可用于递送特异途径的其他可药用载体或稀释剂。任何此类载体或 稀释剂可用于施用本发明的细菌，只要所述细菌仍然能够侵入靶细胞。可进行体外或体内 测试侵入力来确定适当的稀释剂和载体。可配制本发明的组合物用于多种类型的施用，包括全身和局部施用或定域施用。也可包括冻干形式，只要细菌在接触靶细胞或向受试者施 用后具有侵入性。技术禾口配制通常可见于Remmington' s Pharmaceutical Sciences, MeadePublishing Co.，Easton, Pa。对于全身施用，优选注射，包括肌内、静脉、腹膜内和 皮下施用。对于注射，可在液体溶液中，优选在生理学相容的缓冲液如Hank' s溶液或 Ringer' s溶液中配制本发明的组合物，例如细菌。对于口服给药，药物组合物可以采取例如通过利用可药用赋形剂，如结合剂(例 如预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如，乳糖、微晶纤维素 或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或淀粉 羟乙酸钠)；或湿润剂(例如十二烷基硫酸钠)的常规手段制备的片剂或胶囊剂形式。可通 过本领域所熟知的方法包被所述片剂。用于口服给药的液体制剂可采取例如溶液、糖浆剂 或悬浮液的形式，或者它们可呈现为干产品，在使用前用水或其他合适的载体构建。可通过 利用可药用添加剂如悬浮剂(例如山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂)；乳化剂(例 如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性载体(例如杏仁油、油酯类(oily esters)、乙醇或分馏的植 物油)；和防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)，用常规方法制 备此类液体制剂。所述制剂也含有缓冲盐、增味剂、着色剂，适当时还含有甜味剂。可适当地配制用于口服施用的制剂，以给出活性化合物的可控释放。对于口腔施 用，所述组合物可采取常规方式配制的片剂或锭剂形式。对于吸入施用，使用合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙 烷、二氧化碳或其他合适气体，以呈现自加压包装或喷雾器的喷雾剂形式常规递送根据本 发明使用的药物组合物。在加压气雾剂的情况下，可通过提供阀门递送测定量来确定剂量 单元。可配制用于吸入器或吹出器中例如明胶的胶囊和药筒，所述吸入器或吹出器含有组 合物的粉剂混合物，例如细菌和合适的粉剂基质，如乳糖或淀粉。可配制药物组合物用于通过注射，例如通过快速浓注或连续输注来进行肠胃外施 用。可以单位剂量形式，例如在安瓿或含有添加防腐剂的多剂量容器中提供用于注射的制 剂。所述组合物可采取这样的形式，如油载体或水载体中的悬浮液、溶液或乳剂，并可含有 配制剂(formulatory agent)，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以是在使 用前用合适载体，例如灭菌注射用水构建的粉剂形式。也可在直肠、阴道内或尿道内组合物中配制药物组合物，例如含有常规栓剂基质 如可可脂或其他甘油酯类的栓剂或保留灌肠剂。全身施用也可通过经黏膜或经皮途径。对 于经黏膜或经皮施用，在制剂中使用适合于待渗透屏障的渗透剂。此类渗透剂通常为本领 域所知，并包括例如用于经黏膜施用胆汁盐和夫西地酸衍生物。此外，去污剂也用于促进渗 透。经黏膜施用可通过鼻腔喷雾或使用栓剂。对于局部施用，本发明细菌可配制成本领域 通常已知的软膏剂、药膏、凝胶或膏状物，只要所述细菌在接触靶细胞后仍然具有侵入性。如果需要，可在含有一个或多个单位剂量形式的包装或分配装置和/或药盒中提 供组合物，所述单位剂量形式含有活性成分。所述包装例如包含金属或塑料薄片，如泡罩包 装。所述包装或分配装置可具有用于施用的说明书。含有待引入的miRNA/前体或编码RNA的DNA的侵入性细菌可用于感染在体外培 养的动物细胞，如从受试者获得的细胞。然后可将这些体外感染的细胞经过静脉内、肌内、 皮内或腹膜内，或通过允许细胞进入宿主组织的任何灌输途径引入动物，例如所述细胞最初来源的受试者。当向个体细胞中递送RNA时，所施用的活生物的剂量是每个细胞约0. 1 到106，优选约IO1到IO4细菌的多重性感染。在本发明的另一实施方案中，细菌也可向细胞，例如然后可从中收集或纯化蛋白 质的动物细胞中递送编码蛋白质的RNA分子。例如，可在组织培养细胞中产生蛋白质。通过以下不应以任何形式解释为限制的实施例来进一步说明本发明。包括该 申请全文中引用的文献、授权的专利、公开的专利申请的所有引用参考文献的内容因此 明确地引入作为参考，但不认为它们是本发明之前的现有技术。除非另行说明，本发明 的实践将使用本领域技术中的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生 物学、重组DNA和免疫学的常规技术。在参考文献中详细解释了此类技术。参阅，例如 由 Sambrook, Fritsch 禾口 Maniatis 编著的 Molecular Cloning A LaboratoryManual, 第 2 版(Cold Spring Harbor Laboratory Press :1989) ；DNACloning,第 I 卷和第 II 卷(D. N. Glover 编著，1985) ；OligonucleotideSynthesis (Μ· J. Gait 编著，1984) ；Mullis 等美国专利号4，683，195 ；NucleicAcid Hybridization (B. D. Hames&S. J. Higgins 编著 1984) ；TranscriptionAnd Translation(B. D. Hames&S. J. Higgins 编 著 1984) ；Culture OfAnimal Cells(R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc. ,1987) ；Immobilized CellsAnd Enzymes(IRL Press,1986) ；B. Perbal, A Practical Guide To MolecularCloning(1984)； the treatise, Methods In Enzymology(Academic Press, Inc., N. Y. ) ；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos 编著，1987，Cold Spring Harbor Laboratory) ；Methods InEnzymology,第 154 卷禾口第 155 卷(Wu 等编著)， ImmunochemicalMethods In Cell And Molecular Biology (Mayer 禾口 Walker,编 著， Academic Press, London,1987) ；Handbook Of Experimental Immunology,第 I-IV 卷 (D.M.Weir禾口C.C.Blackwell，编著，1986) ；Manipulating theMouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, N.Y. ,1986)。
实施例材料和方法质粒对于单个启动子质粒，如下(图2)构建transkingdom miRNA(TMIR)质粒。简 言之，含有多克隆位点(MCQ的退火寡核苷酸、T7启动子和增强子(Qiagen合成)连接到 KSIK+)的平端BssHII位点中。编码人Let-7miRNA(Let-7a)或其一个前体的DNA序列插 入MCS的BamHI和Mil位点中，以产生质粒pT7miRNA。已经发现Let_7miRNA家族调节fcis 基因(Johnson, S.等，Cell，第 120 卷，635-64792005))。利用以下引物通过PCR (Pfx DNA 聚合酶，Invitrogen Inc.)从 pGB2Winv_hly (C. Grillot-Courvalin提供)扩增Hly A基因并将其克隆到KSII (+)的EcoRV位点中hly-Ι :5，-CCCTCCTTTGATTAGTATATTCCTATCTTA-3' (SEQ IDNO :1)，和hly-2 :5，-AAGCTTTTAAATCAGCAGGGGTCTTTTTGG-3，(SEQID NO :2)。含有pGB2 Ω inv-hly 的 inv 基因座的 PstI 片段插入 KSII (+)/Hly ^ PstI 位点。 用BamHI和Mil切割Hly-Inv片段。补平后，将其连接到pT7miRNA的T7终止子中整合的 EcoRV位点中。所得编码Let-7a miRNA或一个其前体的TiOR转化到大肠杆菌(BL21(DE3)PLysE)细胞中。过夜培养细胞以允许表达和miRNA加工。对于两个启动子的质粒，构建 T7-Therapeutic Pathway Identificationand ValidationCTPIV )质粒，以包括具有两个T7启动子的RNAi，盒(图3)。使用标准的分 子克隆技术通过两个)(bal位点将所获DNA分子克隆至质粒中。所述质粒还包括与TiOR质 粒类似的Inv基因座和Hly基因座。对于载体构建，按照标准分子生物学技术将T7终止子复性，并用BamHIAbaI或 Xbal/Sall消化。随后使用以下引物将终止子克隆至TPIV 载体的BamHlAbaI或)(baI/ Sail位点BamHI 正向5 ‘ ACGGATCCTCCTTTCAGCAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGTTATTGCTCAGCGGTGGTCTAGAGGATCCAC 3，(SEQ ID NO 3)BamHI 反向5’ GTGGATCCTCTAGACCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGATCCGT 3，(SEQ ID NO 4)SalI 正向5 ’ GCGTCGACTCTAGACCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGTCGACCG 3，(SEQ ID NO 5)SalI 反向:5 ’ CGGTCGACTCCTTTCAGCAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGTTATTGCTCAGCGGTGGTCTAGAGTCGACGC 3，(SEQ ID NO 6)miRNA 测定在37°C，MOI为1000时用大肠杆菌(BL21 (DE3)pLysE)细胞感染Hela细胞2小 时。感染M小时后，用TRIZOL(Invitrogen)收获细胞RNA并在裂解缓冲液中提取蛋白质。 使用OneSt印RT-PCR kit (Invitrogen)并用以下引物通过RT-PCR进行k_Ras mRNA的扩 增，以扩增k-Ras mRNA的278碱基对片段5，-AGTACAGTGCAATGAGGGACCAGT(SEQ ID NO 7)禾口5' -AGCATCCTCCACTCTCTGTCTTGT(SEQ ID NO :8)。对所得PCR产物进行染色并在琼脂糖凝胶上电泳，根据标准的分子生物学方法 (包括RT-PCR、western印记和/或northern印记分析)观察(图4，左)。具体地，使用在12% SDS-PAGE凝胶上分离的50ug细胞提取物进行western印记 分析以测定k-Ras蛋白质水平。通过与单克隆k-Ras抗体(SantaCruz)孵育测定k-Ras蛋 白质水平并通过增强的化学发光(GEBiosciences)进行观察(图4，右)。针对k-Ras的细菌介导的基于miRNA的基因调节实施例1 :miRNA前体的细菌表达如上述，将购自 Integrated DNA Technologies, Inc.的人 Let_7miRNA (Let_7a) 的片段克隆至TiOR质粒中。侧接限制性酶切位点(BamHI/Sall)的Let_7a DNA具有以下序列(SEQID NO 9)5’ -GCGGATCCTGGGATGAGGTAGTAGGTTGTATAGTTTTAGGGTCACACCC
ACCACTGGGAGATAACTATACAATCTACTGTCTTTCCTAGTCGACCG-3，mRNA测定的结果示于图4中。当与对照(左)相比，k_Ras mRNA水平在用Let_7a miRNA处理的细胞中显示仅稍微降低时，k-Ras蛋白质水平中的降低不相称地增加(右)，提 示了当可能已经发生了一些mRNA降解时，Let-7a miRNA引起的大多数基因调节很可能通 过翻译阻抑(其为miRNA装置的标志)。这些数据清楚地显示细菌可通过合成和加工miRNA 前体的miRNA装置介导基因调节。实施例2 初级-miRNA的细菌表达将编码人miR-155miRNA的初级-miRNA序列的DNA序列克隆至TiOR质粒中。利用 质粒进行细菌转化。在一个实例中，初级-miRNA加工成miRNA前体在细胞中发生，伴随在 与初级-miRNA序列相同的TMIR质粒中或在不同的细菌表达载体上人Drosha的表达。在 另一实例中，初级-miRNA加工在感染的真核细胞中发生，而不需要细菌Drosha的表达。然后用转化的细菌感染Hela细胞并使用所述测定分析Bachl mRNA和蛋白质的水 平。miR-155 初级-miRNA 序列如下5’ -GTGGCACAAACCAGGAAGGGGAAATCTGTGGTTTAAATTCTTTATGCCTCATCCTCTGAGTGCTGAAGGCTTGCTGTAGGCTGTATGCTGTTAATGCTAATCGTGATAGGGGTTTTTGCCTCCAACTGACTCCTACATATTAGCATTACAGTGTATGATGCCTGTTACTAGCATTCACATGGAACAAATTGCTGCCGTGGGAGGATGACAAAGAAGCATGAGTCACCCTGCTGGATAAACTTAGACTTCAGGCTTTATCATTTTTCAATCTGTTAATCATAATCTGGTCACTGGGATGTTCAACCTTAAACTAAGTTTTGAAAGTAAGG-3 ‘ (SEQ ID NO 10)实施例3 =HiiRNA双链体的细菌表达将编码人miR_155miRNA双链体的两条链的DNA序列克隆至TPIV 质粒中。利 用质粒进行细菌转化。然后用转化的细菌感染Hela细胞并使用所述测定分析k-Ras mRNA 水平。所述miR_155miRNA双链体序列如下FOR 5，-TTAATGCTAATCGTGATAGGGG-3，(SEQ ID NO :11)REV 5，-CCCCTATCACGATTAGCATTAA-3，(SEQ ID NO :12)实施例4 :miRNA的细菌表达将编码人miR-155miRNA序列的DNA序列克隆至TiOR质粒中。利用质粒进行细菌 转化。然后用转化的细菌感染Hela细胞并使用所述测定分析BachlmRNA和蛋白质水平。所述miR_155miRNA 序列如下5，-TTAATGCTAATCGTGATAGGGG-3，(SEQ ID NO :11)其他实施方案在以下的权利要求中。尽管已显示并描述了若干实施方案，在不背 离本发明精神和范围的情况下可进行不同的修饰。
权利要求
1.至少编码微小RNA(miRNA)或miRNA前体的DNA载体，其中所述miRNA能够调节真 核、原核或病毒靶基因中至少一个的表达。
2.权利要求1的载体，其中所述miRNA前体是初级-miRNA。
3.权利要求1的载体，其中所述miRNA前体是miRNA前体。
4.权利要求1的载体，其中所述载体编码双链体miRNA，其中所述两条miRNA链包含基 本互补的区域。
5.权利要求1的载体，其中所述miRNA是成熟的miRNA。
6.权利要求1的载体，其还包含原核启动子。
7.权利要求1的载体，其还包含真核启动子。
8.权利要求1的载体，其中所述至少一个靶基因是癌相关基因。
9.权利要求1的载体，其还编码Hly基因。
10.细菌，其包含微小RNA(miRNA)、miRNA前体或至少编码所述miRNA或所述前体的 DNA分子，其中所述miRNA能够调节真核、原核或病毒靶基因中至少一个的表达。
11.权利要求10的细菌，其中所述前体是miRNA前体。
12.权利要求10的细菌，其中所述前体是初级-miRNA。
13.权利要求10的细菌，其中所述细菌是活的侵入性细菌。
14.权利要求10的细菌，其中所述细菌是活的侵入性细菌的衍生物。
15.权利要求10的细菌，其中所述细菌是非致病性且无毒性的。
16.权利要求10的细菌，其中所述细菌是选自利斯特氏菌、志贺氏菌、沙门氏菌、大肠 杆菌和双歧杆菌的减毒菌株。
17.权利要求10的细菌，其中所述细菌选自耶尔森菌属物种、大肠杆菌属物种、克雷伯 氏菌属物种、博德特氏菌属物种、奈瑟氏球菌属物种、气单胞菌属物种、弗朗西丝氏菌属物 种、棒杆菌属物种、柠檬酸细菌属物种、衣原体属物种、嗜血菌属物种、布鲁氏菌属物种、分 枝杆菌属物种、军团杆菌属物种、红球菌属物种、假单胞菌属物种、缠绕杆菌属物种、沙门氏 菌属物种、弧菌属物种、芽孢杆菌属物种、利什曼虫属物种和丹毒丝菌属物种，所述细菌已 经经过遗传改造，以模拟志贺氏菌属物种、利斯特氏菌属物种、立克次体属物种和肠侵染性 大肠杆菌属物种的侵入性质。
18.权利要求10的细菌，其还包含能够将所述前体加工成接近成熟miRNA的酶或核酶。
19.权利要求18的细菌，其中所述酶是内切核酸酶。
20.权利要求10的细菌，其还包含细菌核糖核酸酶III、切酶、切酶样酶、Drosha和 Pasha中的至少一种。
21.权利要求10的细菌，其还包含酶，所述酶从所述细菌中释放到靶真核细胞的细胞 质后帮助转运遗传物质。
22.权利要求21的细菌，其中所述酶是Hly蛋白质。
23.权利要求10的细菌，其还包含控制所述DNA分子表达的原核启动子。
24.权利要求23的细菌，其中所述启动子是T7启动子。
25.权利要求10的细菌，其还包含控制所述DNA分子表达的真核启动子。
26.权利要求10的细菌，其中所述DNA分子还编码Hly基因。
27.权利要求10的细菌，其中所述真核基因是动物基因。
28.权利要求10的细菌，其中所述真核基因是哺乳动物或鸟类基因。
29.权利要求10的细菌，其中所述至少一个靶基因是癌相关基因。
30.向动物细胞递送微小RNA(miRNA)或miRNA前体的方法，所述方法包括用权利要求 10-29中任一项的所述细菌感染所述动物细胞。
31.权利要求30的方法，其中所述动物细胞是人细胞。
32.权利要求30的方法，其还包括在感染后裂解所述细菌。
33.在动物细胞中调节至少一个靶基因表达的方法，所述方法包括步骤用权利要求10的所述细菌感染动物细胞；和裂解所述细菌以释放其内容物，由此允许来自所述内容物的miRNA或从所述内容物产 生的miRNA与靶基因的mRNA相互作用，并由此调节所述基因的表达。
34.权利要求33的方法，其中所述mRNA通过翻译阻抑、mRNA降解或其两者调节所述基 因表达。
35.在动物中治疗或预防病征的方法，所述方法包括通过用包含微小RNA(miRNA)、 miRNA前体，或至少编码所述miRNA或所述前体的DNA分子的细菌感染动物细胞，来调控所 述病征中已知涉及的至少一个靶基因的表达，其中所述miRNA能够调节至少所述靶基因的表达。
36.权利要求35的方法，其中所述动物是哺乳动物或鸟类。
37.在动物中治疗或预防癌的方法，所述方法包括通过用包含微小RNA(miRNA)、miRNA 前体，或至少编码所述miRNA或所述前体的DNA分子的细菌感染动物细胞，来调控所述癌中 已知涉及的至少一个靶基因的表达，其中所述miRNA能够调节至少所述靶基因的表达。
38.权利要求35的方法，其中所述动物是哺乳动物或鸟类。
39.在动物中治疗或预防由动物中至少一个缺陷型微小RNA(miRNA)引起的病征的方 法，所述方法包括通过用包含所述miRNA的功能版本、所述功能性miRNA的RNA前体，或至 少编码所述功能性miRNA或所述前体的DNA分子的细菌感染动物细胞。
40.权利要求37的方法，其中所述动物是哺乳动物或鸟类。
41.在动物中治疗或预防由动物中至少一个上调的微小RNA(miRNA)引起的病征的方 法，所述方法包括通过用包含所述miRNA的反义版本、所述miRNA反义版本的RNA前体，或 至少编码所述反义版本或所述前体的DNA分子的细菌感染动物细胞。
42.权利要求37的方法，其中所述动物是哺乳动物或鸟类。
43.发现或确认治疗靶标的方法，所述方法包括以下步骤用权利要求10的细菌感染动物细胞；裂解所述细菌以释放其内容物；和研究底物与来自所述内容物或从所述内容物产生的miRNA之间的相互作用。
44.权利要求39的方法，其中所述底物调节所述miRNA。
45.权利要求39的方法，其中所述miRNA调节所述底物。
46.制备微小RNA(miRNA)的方法，所述方法包括以下步骤用至少编码miRNA的原核载体感染至少一种细菌；在所述细菌中表达所述miRNA ；和从所述细菌中收集所述miRNA。
47.制备微小RNA(miRNA)的方法，所述方法包括以下步骤用至少编码miRNA前体的第一个原核载体和编码将所述miRNA前体加工成miRNA的至 少一种酶的第二个原核载体感染至少一种细菌； 在所述细菌中表达所述miRNA前体和所述酶；和 从所述细菌中收获所述miRNA。
全文摘要
本发明提供合成、加工和/或使用细菌，优选细菌的非致病性或治疗性菌株向真核细胞中递送miRNA或其前体，以在真核细胞中引起基因调节的方法。
文档编号C12Q1/68GK102149826SQ200880104973
公开日2011年8月10日 申请日期2008年6月30日 优先权日2007年6月29日
发明者C·李 申请人:波士顿生物医药公司