重组锦鲤疱疹病毒(KHV)或鲤疱疹病毒3(CyHV-3)及用于预防普通鲤鱼或锦鲤中由KHV...的利记博彩app

专利名称：重组锦鲤疱疹病毒(KHV)或鲤疱疹病毒3(CyHV-3)及用于预防普通鲤鱼或锦鲤中由KHV ...的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及重组锦鲤疱疹病毒(koi herpesvirus，KHV)或鲤疱疹病毒3 (Cyprinid herpesvirus-3,CyHV-3)及用于预防普通鲤鱼或锦鲤中由锦鲤疱疹病毒/鲤疱疹病毒3引 发的疾病的疫苗。
背景技术：
普通鲤鱼(Cyprinus carpi ο carpio)是主要在亚洲、欧洲和中东最广泛养殖的供 人食用的一种鱼；而在世界范围内，尤其在日本，锦鲤(Cyprinus carpio koi)亚种是依据 个人爱好或竞赛性展览而养殖的一种贵重美丽、色彩斑斓的宠物鱼。1996年在英国发现一 种病毒，其可使普通鲤鱼和锦鲤患上一种最初被称为锦鲤疱疹病毒病(KHVD)的致死疾病。 随后迅速确认在以色列、美国和德国的普通鲤鱼和锦鲤的大量死亡为这种病毒所致。不幸 的是，普通鲤鱼的密集养殖、锦鲤展览和国际贸易滋长了这种高度传染和极为致命的疾病 在全球迅速蔓延。锦鲤疱疹病毒病(KHVD)的突发对全球范围内的鲤鱼和锦鲤养殖业造成 了严重的金融和经济损失。初步鉴定，所述病毒呈疱疹样结构，具有包膜和壳状结构围绕的100 110纳米 的二十面体电子致密核心。与鲤疱疹病毒1 (CyHV-I)相似，但大于其他大小通常为125 240kb的疱疹病毒成员，所述病毒的基因组包含约295kb的线性双链DNA(dsDNA)。KHV基 因组序列已于最近公布(Aoki et al.，J Virol,81, pages 5058-5065(2007))。KHV 的基 因组所包含显著量的与其他任何已知的病毒序列无同源性的序列。此外，与多种dsDNA病 毒(如疱疹病毒、痘病毒、虹彩病毒和其他大型DNA病毒)类似，其具有高度趋异(highly divergent)的编码多肽的DNA序列。所述病毒的独特特征导致了三种不同的命名。首先依据其形态表现将其命名 为锦鲤疱疹病毒，其次依据其对鱼类的致病作用将其命名为鲤间质性肾炎和鳃坏死病毒 (CNGV)，最后依据其与CyHV-I和CyHV_2基因内容的相似性将其命名为CyHV_3。最后的命 名因最新的病毒基因组全长测序的完成而得到进一步支持。但是，以下简称为KHV。在所有已鉴定的疱疹病毒成员中KHV具有最大的基因组，约为295kb。自1996年 首次分离KHV以来，还未获得单一基因在KHV发病机理和感染天然宿主的生物学研究中所 起作用的有关信息。国际专利申请WO 2004/061093A1中已经描述了减毒疫苗候选物。但是，所述疫 苗候选物有两个主要的缺陷，首先，所述减毒是病毒在体外复制时发生的随机突变所致，因 此，减毒的决定机制是未知的，且不能排除其回复到完全致病型。其次，所述疫苗株对幼鱼 有残留毒力以致接种疫苗者死亡达到20%。

发明内容
自1996年首次分离以来，致力于KHV进行了大量的研究。报道了有关病毒基因内容、病毒发病机理、感染的流行病学、感染的诊断和控制方法的数据。然而，迄今为止还没有 制备出KHV重组株，因此，单一基因在KHV发病机理和感染天然宿主的生物学研究中所起作 用还未知。与此类似，没有KHV重组株导致市场上缺乏用于控制疾病的安全和有效的减毒
重组疫苗。KHV的应用研究和基础研究需要制备重组株。最近，细菌人工染色体(BAC)载体的 应用为操作大的疱疹病毒基因组提供了便利(Messerle et al.，Proc Natl Acad Sci U S A，94，14759-14763(1997) ；Wagner et al. , Trends Microbiol，10，318-324 (2002))。这些 载体可在大肠杆菌(E.coli)中进行病毒基因组的保存和高效突变，随后可通过用所得BAC 质粒转染进入允许真核细胞来重构子代病毒颗粒。迄今为止，多种疱疹病毒基因组已以感 染性BAC克隆的形式成功扩增，包括人巨细胞病毒(HCMV)，其有至今为止最大的以BAC形式 克隆的疱疹病毒基因组(230kb) (Borst et al.，J Virol, 73,8320-8329 (1999))
因此，本发明旨在提供可用于控制KHV感染的安全有效的减毒疫苗的研制的作为 疫苗的KHV株或KHV构建体；还旨在提供DNA序列和由KHV衍生的载体，以用于将多核苷酸 (如遗传物质)转移进整个鱼或鱼细胞内。通过在鱼中，优选在鲤类中，更优选在鲤鱼(Cyprinus carpio)中，再更优选在普 通鲤鱼和/或锦鲤中具有免疫原性的重组锦鲤疱疹病毒(KHV)或鲤疱疹病毒3 (CyHV-3)解 决了所述问题。出人意料的是，本发明的重组锦鲤疱疹病毒优选至少一个毒力贡献基因有缺陷， 当用此疱疹病毒感染时，其显示出毒力急剧下降或甚至无鲤类死亡，并且其可提供对野生 型锦鲤疱疹病毒的免疫力。迄今为止，许多科学家小组多年来都尝试以BAC克隆KHV基因组，但是都没有成 功。他们只获得了基因组减小的克隆。这些问题可能是由KHV基因组比迄今为止克隆过的 任何疱疹病毒基因组都大(本领域现在克隆过的最大疱疹病毒基因组大小为235kb，而KHV 基因组大小为290 300kb)所致。更多克隆所述病毒的问题可能是由基因组中包含的可导 致克隆不稳定和大小减小的许多重复序列所致。因此，本发明首次提供了具有290 300kb 的KHV基因组全长的感染性BAC克隆。本发明也首次生产了具有大小290 300kb的疱疹 病毒基因组的减毒重组体。再一实施方式中，可从所述重组锦鲤疱疹病毒的病毒基因组中 切除BAC载体序列，从而在所述疱疹病毒基因组中的切除位点或先前插入位点留下异源序 列。这种切除BAC载体序列的重组锦鲤疱疹病毒构建体也至少一种毒力贡献基因有缺陷， 并显示出所需特性，概述如下。可将本发明的任意形式(KHV BAC克隆或上述从疱疹病毒基因组切除BAC载体序 列的KHV构建体)的重组锦鲤疱疹病毒用于涉及例如基因工程技术的进一步操作，以使基 因组的特定基因产生缺陷。由此，如果删除了多个病毒基因，所述基因组的大小可急剧减 小。由此获得的衍生物仍会在本发明的范围内。在一优选的实施方式中，重组锦鲤疱疹病毒具有给予鱼，优选给予鲤类，更优选给 予鲤鱼(Cyprinus carpio)，再更优选给予普通鲤鱼和/或锦鲤抵抗由锦鲤疱疹病毒(KHV) 或鲤疱疹病毒3 (CyHV-3)引发的疾病的免疫力的能力。重组锦鲤疱疹病毒优选一种或多种复制非必需基因有缺陷。重组锦鲤疱疹病毒更 优选至少一种毒力贡献基因有缺陷。
本发明的重组锦鲤疱疹病毒特别优选至少一种毒力贡献基因有缺陷，所述基因选自 胸苷激酶基因、· ORF12 推定的肿瘤坏死因子(TNF)受体基因、· 0RF16 推定的G蛋白偶联受体(GPCR)基因、· 0RF134 推定的白细胞介素_10同源基因、· 0RF140 推定的胸苷酸激酶基因、或 它们的任何组合。本发明的重组锦鲤疱疹病毒更优选下列基因有缺陷 病毒胸苷激酶基因和 至少另一个选自下列的毒力贡献基因■ ORF12 推定的肿瘤坏死因子(TNF)受体基因、■ 0RF16 推定的G蛋白偶联受体(GPCR)基因、■ 0RF134 推定的白细胞介素-10同源基因、■ 0RF140 推定的胸苷酸激酶基因、或■它们的任何组合。所述重组锦鲤疱疹病毒更特别优选上述所有基因都有缺陷。此外，所述重组锦鲤疱疹病毒另外的基因可有缺陷。在一本发明特别优选的实施方式中，重组锦鲤疱疹病毒(KHV)或鲤疱疹病毒 3(CyHV-3)的胸苷激酶基因有缺陷。更优选的重组锦鲤疱疹病毒(KHV)或鲤疱疹病毒3 (CyHV-3)的0RF140 推定的胸 苷酸激酶基因有缺陷。再更优选的重组锦鲤疱疹病毒(KHV)或鲤疱疹病毒3 (CyHV-3)的胸苷激酶基因和 0RF140 推定的胸苷酸激酶基因有缺陷。在另一实施方式中，重组锦鲤疱疹病毒的一种或多种复制必需基因有缺陷，从而 所述锦鲤疱疹病毒会具有有限的复制特性。在一本发明更优选的实施方式中，所述重组锦鲤疱疹病毒为活型。在转染允许真 核细胞或鱼个体(优选鲤类，更优选鲤鱼(Cyprinuscarpio)，再更优选普通鲤鱼和/或锦 鲤)时，所述重组锦鲤疱疹病毒优选具有重构感染性颗粒的能力。更优选的重组锦鲤疱疹病毒为减毒型。在一本发明更优选的实施方式中，所述重组锦鲤疱疹病毒在被所述疱疹病毒感染 的鱼、优选鲤类、更优选普通鲤鱼或锦鲤中导致 ≤40%，优选 ≤20%，更优选 ≤10%，更优 选 ≤ 1%，更优选 ≤ 0. 的死亡率，且最优选导致0.0%的死亡率。在本发明的另一实施方式中，重组锦鲤疱疹病毒为灭活的且非复制型、或欠减毒 型。可通过缺失KHV的复制必需基因来生产非复制型重组株，在稳定表达所缺失基因(反 式互补)的允许细胞系中培养这种缺失基因的病毒。这种方法已成功用于不同的疱疹病 毒，例如缺失了 gE的猪疱疹病毒(伪狂犬病病毒)和牛疱疹病毒。可使任何复制贡献基因 有缺陷，以获得非复制型重组锦鲤疱疹病毒，换言之，可缺失任何一失活就得到非复制型重 组锦鲤疱疹病毒的基因。为提供非复制型重组锦鲤疱疹病毒，本发明的重组KHV的优选可缺失基因选自ORF 25、ORF 31、ORF 32、ORF 34、ORF 35、ORF 42、0RF43、0RF 45、ORF 51、 ORF 57、ORF 59、ORF 60、ORF 62、0RF65、0RF 66、ORF 68、ORF 70、ORF 72、ORF 78、ORF 81、 0RF84、0RF 89、ORF 90、ORF 92、ORF 95、ORF 97、ORF 99、ORF108、ORF 115、ORF 131、ORF 132、ORF 136、ORF 137、ORF 148、ORF 149。“欠减毒型”是指所述重组锦鲤疱疹病毒具有感染细胞或鱼个体(例如鲤鱼 (Cyprinus carpio)、普通鲤鱼或锦鲤)的能力，但不能复制。本发明的重组锦鲤疱疹病毒更优选包含BAC(细菌人工染色体)载体序列。重组 锦鲤疱疹病毒优选包含插入到锦鲤疱疹病毒基因组中的BAC (细菌人工染色体)载体序列。重组锦鲤疱疹病毒更优选包含BAC (细菌人工染色体)载体序列，其插入到 病毒胸苷激酶基因中、或 另外的任何其它毒力贡献病毒基因中、或/和 病毒复制非必需的任何其他病毒基因中、或/和 任何基因间区域。BAC载体序列两侧特别优选为介导同源重组的序列，优选为loxP。BAC载体序列更 优选包含筛选标记。所述筛选标记再更优选为药物筛选标记。所述筛选标记再更优选为编 码绿色荧光蛋白的基因。在一更优选的实施方式中，所述重组疱疹病毒基因组以质粒的形 式存在。这可通过提取上述包含BAC载体序列的环型重组锦鲤疱疹病毒，并将其导入细菌 细胞而实现。需知，对本发明来说，只要通过基因工程技术使一种或多种所述毒力贡献基因 有缺陷，在一种或多种毒力贡献病毒基因中插入BAC (细菌人工染色体)载体序列是非必需 的。因此，如果一种或多种毒力贡献病毒基因(优选病毒胸苷激酶基因和/或病毒0RF140 推定的胸苷酸激酶基因)有缺陷，可在病毒的任何基因间区域插入BAC载体序列。在本发明的另一实施方式中，从所述疱疹病毒基因组中切除BAC载体序列，从而 在所述疱疹病毒基因组中的切除位点或先前插入位点留下异源序列。异源序列大小优选少 于200个核苷酸。所述切除是通过将所述重组KHV导入表达可切除两侧为IoxP的BAC载体 序列的Cre重组酶的允许真核细胞而实现。由此所得的重组KHV优选能形成感染性颗粒。在一更优选的重组锦鲤疱疹病毒的实施方式中，另外的病毒基因可在活性上经修 饰或有缺陷或缺失。在一更优选的实施方式中，重组锦鲤疱疹病毒还包含异源序列或异源基因。由此， 可将任何基因导入相应的经接种的鱼中。所述另外的异源基因优选为引发鲤春季病毒血症 的棒状病毒的G糖蛋白。所述构建体不仅可保护经疫苗接种的鱼抵抗KHV，并且还抵抗鲤春
季病毒血症。本发明还提供胸苷激酶基因有缺陷的重组锦鲤疱疹病毒(KHV)或鲤疱疹病毒 3(CyHV-3)。另外，本发明提供0RF140 推定的胸苷酸激酶基因有缺陷的重组锦鲤疱疹病毒 (KHV)或鲤疱疹病毒3 (CyHV-3)。另外，本发明甚至提供胸苷激酶基因和0RF140 推定的胸苷酸激酶基因有缺陷的 重组锦鲤疱疹病毒。出人意料的是，当用胸苷激酶基因有缺陷的重组锦鲤疱疹病毒感染鲤时，所述疱 疹病毒导致所述鲤死亡率急剧下降，且提供抵抗野生型锦鲤疱疹病毒的免疫力。当用胸苷激酶基因和0RF140 推定的胸苷酸激酶基因有缺陷的重组锦鲤疱疹病毒，及仅0RF140 推 定的胸苷酸激酶基因有缺陷的重组锦鲤疱疹病毒感染鲤时，无鲤死亡，且所述疱疹病毒提 供抵抗野生型锦鲤疱疹病毒的免疫力。本发明还提供鱼用疫苗用和/或预防卫生用DNA序列，其中所述DNA序列具有给予鱼，优选给予鲤类，更优选给予鲤鱼(Cyprinuscarpio)，更优选给予普通鲤鱼或锦鲤抵抗 由锦鲤疱疹病毒(KHV)或鲤疱疹病毒3 (CyHV-3)引发的疾病的免疫力的能力。所述DNA序列包含锦鲤疱疹病毒基因组或其一部分。在一优选的DNA序列的实施方式中，所述锦鲤疱疹病毒基因组中 选自下列的至少一种基因有缺陷■胸苷激酶基因、■ ORF12 推定的肿瘤坏死因子(TNF)受体基因、■ 0RF16 推定的G蛋白偶联受体(GPCR)基因、■ 0RF134 推定的白细胞介素-10同源基因、■ 0RF140 推定的胸苷酸激酶基因、或■它们的任何组合； 优选胸苷激酶基因和/或0RF140 推定的胸苷酸激酶基因有缺陷，·更优选所述两个基因都有缺陷。在一更优选的实施方式中，所述DNA序列还包含异源序列或异源基因。由此，可将 任何基因导入到相应的经接种的鱼中。所述另外的异源基因优选为引发鲤春季病毒血症的 棒状病毒的G糖蛋白。本发明还提供含有锦鲤疱疹病毒基因组或其中一部分的载体。在一优选的载体的 实施方式中，所述锦鲤疱疹病毒基因组中 选自下列的至少一种基因有缺陷■胸苷激酶基因、■ ORF12 推定的肿瘤坏死因子(TNF)受体基因、■ 0RF16 推定的G蛋白偶联受体(GPCR)基因、■ 0RF134 推定的白细胞介素-10同源基因、■ 0RF140 推定的胸苷酸激酶基因、或■它们的任何组合； 优选胸苷激酶基因和/或0RF140 推定的胸苷酸激酶基因有缺陷，·更优选所述两个基因都有缺陷。可将本发明的重组锦鲤疱疹病毒和载体作为将目的基因转移入鲤(鲤鱼 (Cyprinus carpio))或源自其的细胞，或者非鲤(鲤鱼(Cyprinuscarpio))鱼类或源自其 的细胞的载体而用于所述鲤(鲤鱼(Cyprinuscarpio))或非鲤(鲤鱼(Cyprinus carpio)) 鱼类。可将本发明的重组锦鲤疱疹病毒和载体用作在所有对野生型锦鲤疱疹病毒或本发明 的重组锦鲤疱疹病毒或本发明的载体感染敏感的鱼类的体内表达载体。所述鱼类优选为 与鲤共生的任一种鱼类。这些鱼类更优选选自罗非鱼类(尼罗蒂长罗非鱼(Oreochromis niloticus))、银倉卢(银倉卢(Bidyanus bidyanus))、白鲢(鲢(Hypophthalmichthys molitrix))、金鱼(金铜P (Carassius auratus))、铜P鱼(欧铜P (Carassius carassius)) >金圆腹雅罗鱼(圆腹雅罗鱼(Leuciscus idus))、鲇(lctalurus nelos)和草鱼(草鱼 (Ctenopharyngodon idella))。这是指可将本发明的重组锦鲤疱疹病毒(KHV)或鲤疱疹病 毒3(CyHV-3)或本发明的包含锦鲤疱疹病毒基因组或其一部分的载体作为将目的多核苷 酸或目的基因转移入鲤(鲤鱼(Cyprinus carpio))或源自其的细胞，或转移入非鲤(鲤鱼 (Cyprinus carpio))鱼类或源自其的细胞的载体。如上所述，本发明的重组锦鲤疱疹病毒 (KHV)或鲤疱疹病毒3(CyHV-3)或本发明的包含锦鲤疱疹病毒基因组或其一部分的载体 优选选自下列的至少一种毒力贡献基因有缺陷■胸苷激酶基因、■ ORF12 推定的肿瘤坏死因子(TNF)受体基因、■ 0RF16 推定的G蛋白偶联受体(GPCR)基因、0RF134 推定的白细胞介素_10同
源基因、■ 0RF140 推定的胸苷酸激酶基因、或■它们的任何组合； 优选胸苷激酶基因(TK)和/或0RF140 推定的胸苷酸激酶基因有缺陷，·更优选所述两个基因都有缺陷。在一再更优选的实施方式中，所述载体还包含异源序列或异源基因。由此，可将任 何基因导入到相应的鱼中。所述另外的异源基因优选为引发鲤春季病毒血症的棒状病毒的 G糖蛋白。所述构建体不仅保护经疫苗接种的鱼抵抗KHV，还抵抗鲤春季病毒血症。所述载体更优选还包含BAC载体序列。所述载体更优选具有复制的能力，并更优 选在被导入允许真核细胞时具有重构感染性颗粒的能力。在一更优选的实施方式中，当所述载体被导入允许细胞或鱼个体时能表达KHV 病毒基因，以诱导抵抗由锦鲤疱疹病毒(KHV)或鲤疱疹病毒3(CyHV-3)引发的疾病的保 护性免疫应答。所述载体更优选具有给予鱼，优选给予鲤类，更优选给予鲤鱼(Cyprinus carpio)，更优选给予普通鲤鱼和/或锦鲤抵抗由锦鲤疱疹病毒(KHV)或鲤疱疹病毒 3(CyHV-3)引发的疾病的免疫力的能力。本发明还提供含有本发明上述重组锦鲤疱疹病毒或DNA序列或载体的细胞。 所述细胞优选为细菌细胞。在另一实施方式中，所述细胞为允许真核细胞，优选为源 自鱼、优选源自鲤类，更优选源自普通鲤鱼或锦鲤的细胞。所述细胞可为原核细胞，或 为真核细胞，可通过本发明上述重组锦鲤疱疹病毒或上述DNA序列或上述载体来感染 或转染获得所述细胞。所述细胞可称为“转化体”。含有将BAC载体序列合并到病毒 胸苷激酶基因中的重组锦鲤疱疹病毒的大肠杆菌菌株被保藏在Belgian Coordinated Collection of Microorganisms (BCCM)(BCCM/LMPB Plasmid Collection, Department of MolecularBiology, Ghent University, Technologiepark 927,9052 Gent-Zwiinaarde, Belgium)。所述细胞保藏于2007年7月13日，保藏号为LMBP5658。特别优选所述细胞。本发明还提供由本发明的细胞生产的病毒或病毒颗粒。本发明还提供生产重组锦鲤疱疹病毒(KHV)或鲤疱疹病毒3 (CyHV-3)的感染性颗 粒的方法，其包括下列步骤 将下列重组锦鲤疱疹病毒(KHV)或鲤疱疹病毒3 (CyHV-3)基因组中的任何一种 导入允许真核细胞
(a)含有细菌人工染色体(BAC)载体序列的重组锦鲤疱疹病毒(KHV)或重组鲤疱 疹病毒3(CyHV-3)基因组；(b)重组锦鲤疱疹病毒(KHV)或重组鲤疱疹病毒3 (CyHV-3)基因组，其中从(a)的 构建体中切除了细菌人工染色体(BAC)载体序列；及 培养宿主细胞，以生产重组锦鲤疱疹病毒(KHV)或重组鲤疱疹病毒3 (CyHV-3)。此外，本发明还涉及通过上述方法生产的感染性颗粒。所提供的更优选的感染性颗粒包含下列任何一种(a)含有细菌人工染色体(BAC)载体序列的重组锦鲤疱疹病毒(KHV)基因组或重 组鲤疱疹病毒3 (CyHV-3)基因组；(b)重组锦鲤疱疹病毒(KHV)基因组或鲤疱疹病毒3 (CyHV-3)基因组，其中从(a) 的构建体中切除了细菌人工染色体(BAC)载体序列。通过注射或浴疗或口服，可将上述重组锦鲤疱疹病毒、上述DNA序列、上述载体或 上述感染性颗粒用于鱼，优选用于普通鲤鱼或锦鲤的免疫接种。因此，本发明还提供经本发 明上述重组锦鲤疱疹病毒或上述DNA序列或上述载体或上述感染性颗粒免疫接种的普通 鲤鱼或锦鲤个体。本发明还提供锦鲤疱疹病毒(KHV)或CyHV-3。所述锦鲤疱疹病毒分离株(在本文 中也称为 FL 株)被保藏在 Belgian CoordinatedCollection of Microorganisms (BCCM) (BCCM/LMPB Plasmi(!Collection,Department of Molecular Biology,Ghent University, Technologiepark 927,9052 Gent_Zwijn￡i￡ffde， Belgium) 。 FL #畠tti^Hi 2007 $ 7月13日，保藏号为LMBP6581CB。所述分离株(FL)有三个重要特性(i)细胞培养时其有非常高效的生长特性；(ii)与可比野生型株相比其有低致病性；及(iii)在2g的普通鲤鱼中显示出2个星期的延迟发病。为了获得所述分离株，体外比较了不同KHV野外分离株的生长特性(

图1)，并在 锦鲤(7g)和普通鲤鱼(2g)中比较它们的毒力(图2)。基于所述测试结果，选出以下称为 FL的株。与KHV/CyHV-3参照株(IS株)相比，FL株在体外复制更高效且在体内有更低致 病性。当在7g的锦鲤中测定时，IS株和FL株分别引发90%和80%的死亡率(图2)。当 在2g的普通鲤鱼中测定时，FL株诱导发病比IS株诱导发病延迟2个星期。鉴于与更高毒 力的KHV IS株相比观察到的2星期的延迟，及根据更高毒力的KHV IS株在1星期后引发 普通鲤鱼发病，认为所述FL株为可用于活减毒重组株开发的合适的亲本株。本发明提供的所述KHV FL株(保藏号LMBP6581CB)对灭活疫苗的生产非常有用， 因而其具有巨大的工业潜力。FL分离株可用于构建本发明的上述重组锦鲤疱疹病毒。例如，将BAC载体序列导 入病毒胸苷激酶基因，以获得本发明的重组锦鲤疱疹病毒。但是，为构建本发明的重组锦鲤 疱疹病毒，可使用任何其他KHV分离株。FL BAC切除株作为对锦鲤的潜在亲本疫苗株进行 分析(见图8)。当用FL株、FL BAC恢复株和FL BAC切除株接种7g的锦鲤时，分别导致 80%、40%和40%的死亡率。这个实验表明破坏所述TK座位贡献于病毒的剧烈减毒。独立 于初次接种用株，所有存活于初次接种的鱼都发展出抵抗有毒FL株再攻毒的保护性免疫应答(见图8中的“攻毒”箭头)。所有这些数据都支持，FLBAC克隆有作为可用于开发多减毒重组疫苗的亲本质粒的潜力。在一本发明更优选的实施方式中，保藏号为LMBP6581CB的锦鲤疱疹病毒(KHV)或 鲤疱疹病毒3 (CyHV-3)具有给予鱼，优选给予鲤类，更优选给予鲤鱼(Cyprinus carpio), 再更优选给予普通鲤鱼和/或锦鲤抵抗由锦鲤疱疹病毒(KHV)或鲤疱疹病毒3 (CyHV-3)引 发的疾病的免疫力的能力。保藏号为LMBP6581CB的锦鲤疱疹病毒(KHV)的衍生物优选一种或多种复制非必
需基因有缺陷。保藏号为LMBP6581CB的锦鲤疱疹病毒(KHV)的衍生物更优选至少一种毒力贡献
基因有缺陷。本发明的保藏号为LMBP6581CB的锦鲤疱疹病毒(KHV)的衍生物特别优选至少一 种选自下列的毒力贡献基因有缺陷 胸苷激酶基因、· ORF12 推定的肿瘤坏死因子(TNF)受体基因、· 0RF16 推定的G蛋白偶联受体(GPCR)基因、· 0RF134 推定的白细胞介素-10同源基因、· 0RF140 推定的胸苷酸激酶基因、或 它们的任何组合。本发明的保藏号为LMBP6581CB的锦鲤疱疹病毒(KHV)的衍生物更优选病毒胸苷 激酶基因和至少另一种选自下列的毒力贡献基因有缺陷· ORF12 推定的肿瘤坏死因子(TNF)受体基因、· 0RF16 推定的G蛋白偶联受体(GPCR)基因、· 0RF134 推定的白细胞介素-10同源基因、· 0RF140 推定的胸苷酸激酶基因、或 它们的任何组合。本发明的保藏号为LMBP6581CB的锦鲤疱疹病毒(KHV)的衍生物更特别优选上述 所有基因都有缺陷。此外，所述保藏号为LMBP6581CB的锦鲤疱疹病毒的衍生物可另外的病毒基因有缺陷。保藏号为LMBP6581CB的锦鲤疱疹病毒(KHV)的衍生物更优选胸苷激酶基因和/ 或0RF140 推定的胸苷酸激酶基因有缺陷。保藏号为LMBP658ICB的锦鲤疱疹病毒(KHV)的衍生物优选胸苷激酶基因和 0RF140 推定的胸苷酸激酶基因有缺陷。在一本发明更优选的实施方式中，保藏号为LMBP6581CB的锦鲤疱疹病毒(KHV)的 衍生物为活型。保藏号为LMBP6581CB的锦鲤疱疹病毒(KHV)的衍生物优选在被导入允许 真核细胞或鱼个体(优选鲤类，更优选鲤鱼(Cyprinus carpio)，再更优选普通鲤鱼和/或 锦鲤)时具有重构感染性颗粒的能力。保藏号为LMBP6581CB的锦鲤疱疹病毒(KHV)的衍生物更优选为减毒型。在一本发明更优选的实施方式中，保藏号为LMBP6581CB的锦鲤疱疹病毒(KHV)的衍生物在被所述疱疹病毒感染的鱼(优选鲤类，更优选普通鲤鱼或锦鲤)中导致≤40%，优选≤ 20%，更优选≤10%，更优选≤ 1%，更优选≤0. 的死亡率，最优选导致0.0%死亡率。在本发明的另一实施方式中，保藏号为LMBP6581CB的锦鲤疱疹病毒(KHV)的衍生 物为灭活的且非复制型、或者欠减毒型。本发明还提供疫苗，其用于预防和/或治疗由锦鲤疱疹病毒(KHV)或CyHV-3引发 的疾病。所述疫苗更优选包含本发明的 上述重组锦鲤疱疹病毒、或 上述DNA序列、或 上述载体、或 上述感染性颗粒、或 保藏号为LMBP6581CB的锦鲤疱疹病毒(KHV)或CyHV_3、或者其衍生物。在一更优选的实施方式中，上述疫苗用于预防和/或治疗由锦鲤疱疹病毒(KHV) 或CyHV-3引发的疾病。本发明还提供下列物质用于生产预防和/或治疗由锦鲤疱疹病毒(KHV)或鲤疱疹 病毒3(CyHV-3)引发的疾病的药物/疫苗中的用途 上述重组锦鲤疱疹病毒、或 上述DNA序列、或 上述载体、或 上述感染性颗粒、或 保藏号为LMBP6581CB的锦鲤疱疹病毒(KHV)或CyHV_3、或者其衍生物。本发明的疫苗对预防和/或治疗由锦鲤疱疹病毒(KHV)或CyHV-3引发的疾病非 常有用。可生产任何类型的疫苗，例如灭活疫苗、灭活的且非复制疫苗、重组减毒疫苗、表达 外源转基因的重组减毒疫苗、DNA疫苗等。施用所述疫苗的优选途径为口服、浴疗和注射， 但不排除其他途径。本发明还提供预防和/或治疗由引发鲤春季病毒血症的棒状病毒引发的疾病的 疫苗。所述疫苗包含所述重组锦鲤疱疹病毒或所述DNA序列或所述载体，其中的每一个还 包含源自所述棒状病毒的异源序列或异源基因，优选所述引发鲤春季病毒血症的棒状病毒 的G糖蛋白。 本文所用的术语“疫苗”指能够建立或提高宿主针对特定疾病的免疫力的物质。当 疾病由病原体引发时，所述疫苗物质通常由减毒或灭活的病原体或其部分构成。所述疫苗 可预防性地或治疗性地产生免疫力。 通常，将疫苗制成液体溶液、乳液或悬液以用于注射或输液。例如，可制成液体乳 液或乳化原液，以便将其添加到养鱼的水箱或水缸。还可制成适于在施用之前溶解或悬浮 于液体媒质，或与固体食物混和的固体(如粉)形式。该疫苗也可为可用灭菌稀释剂复原 的即用冻干培养物形式。例如，冻干细胞可用0.9%的生理盐水(可选作为包装疫苗产品的 一部分提供)复原。优选的可注射疫苗制剂是乳液。可在添加到鱼圈(pen)、鱼箱或鱼缸 前，将液体或复原形式的疫苗在少量水(例如1 100个体积)中稀释。
在一优选的实施方式中，包含所述重组KHV或所述KHV FL株的疫苗制剂可为干 型，例如粉末形式、冻干形式、压缩片剂或锭剂形式等。在另一实施方式中，所述病毒可为组 织培养液的形式。所述液体可在周围环境中保存，优选在-70°C保存，最优选用含有甘油的 溶液保存。在一具体实施例中，所述组织培养液含有20%甘油。本发明公开的重组KHV或KHV FL株可通过多种方法转变成干型。特别优选的干 燥形式是通过冻干。在干燥前，例如冻干处理前，可将各种成分(如防腐剂、抗氧化剂或还 原剂、各种赋形剂等)添加到介质中。所述的赋形剂也可在干燥步骤后添加到干的(如冻 干的)活减毒病毒中。因此，在一优选的实施方式中，本发明的疫苗为冻干形式。为复原冻干组合物，将 其悬浮于生理可接受的稀释液中。所述稀释液可为例如灭菌水或生理盐水的简单溶液。在 更复杂形式中，所述冻干的疫苗可悬浮于乳液中(例如在EP1，140，152中所述)。免疫通常通过将灭活病毒、灭活的且非复制病毒、欠减毒病毒、重组减毒病毒、表 达外源转基因的重组减毒病毒、无毒病毒形式(如活减毒病毒)、DNA疫苗添加到含待免疫 鱼的水中进行免疫。也可将疫苗制剂直接注射入鱼中。为增强免疫应答，特别当制剂用于 注射时，所述制剂还可包括各种佐剂、细胞因子或其他免疫刺激剂。特别当将所述疫苗制剂 导入到含鱼水中时，所述疫苗制剂也可包括各种稳定剂、抗生素等。
在一本发明的实施方式中，所述疫苗还包括免疫调节佐剂、稳定剂、抗生素、免疫 刺激剂或其他物质。佐剂为增强宿主非特异性免疫应答的免疫刺激物质。可知已在人药和 兽药中使用的这些佐剂。所述佐剂可为亲水性佐剂(如氢氧化铝或磷酸铝)或疏水性佐剂 (如基于矿物油的佐剂)。可将下列佐剂与灭活的病毒上清混合，所述佐剂例如胞壁酰二 肽、阿夫立定、氢氧化铝、磷酸铝、油、油乳液、皂甙、硫酸葡聚糖、葡聚糖、细胞因子、嵌段共 聚物、免疫刺激寡核苷酸和其他本领域已知的佐剂。优选的佐剂为弗氏不完全佐剂(FIA)。 佐剂的添加量依佐剂本身性质而定。将FIA用灭活的病毒上清以约1 1的体积比乳化是 有利的。在鱼类养殖中常用佐剂的例子有胞壁酰二肽、脂多糖、多种葡聚糖和聚糖及 Carbopol (一种均聚物)。合适佐剂可为油包水(w/o)乳液、o/w乳液和w/0/ W双层乳液。适用于w/o乳液的油佐剂为例如矿物油或可代谢油。矿物油可为例如 Bayol 、Marcol 和Drakeol ;可代谢油为例如植物油(如花生油和豆油)或动
物油(如鱼油)、角鲨烷和角鲨烯。另外，使用在EP 382，271中描述的维生素E(生育酚) 增溶物是有利的。非常合适的o/w乳液可从5 50% w/w水相和95 50% w/w油佐剂开 始获得，更优选使用20% 50% w/w水相和80 50% w/w油佐剂。佐剂的添加量依佐剂 本身性质而定，所述添加量的信息由制造商提供。在一优选的实施方式中，本发明的疫苗还含有稳定剂。可将稳定剂添加到本发明 的疫苗以防止其降解，延长保质期或提高冻干效率。有用的稳定剂可为SPGA(BoVarnik et al.，1950，J. Bacteriology, vol. 59，p. 509)、脱脂乳、明胶，牛血清白蛋白、碳水化合物(如 山梨醇、甘露醇、海藻糖、淀粉、蔗糖、右旋糖酐或葡萄糖)、乳糖、蛋白质(如清蛋白或酪蛋 白或其降解产物)和缓冲液(如碱金属磷酸盐)。可添加抗生素(如新霉素、链霉素)以防止病菌的潜在生长。所述免疫刺激剂可 提高由疫苗所提供的保护，并提供针对多种疾病的非特异性保护。许多已报道的在鱼中具有免疫刺激特性的化学物质和其他物质即为化学物质和葡聚糖、水藻藻胶提取物(海藻酸 和甲硅烷酯)和细胞因子。
另外，所述疫苗包含一种或多种适合的表面活性化合物或乳化剂，例如Span 或Tweeu 。所述疫苗也包含所谓“媒质(vehicle)”。媒质为本发明的KHV病毒(或为 病毒颗粒形式或为DNA形式)所粘附(与其非共价结合)的化合物。所述媒质为生物微 胶囊、微藻酸盐、脂质体和大分子物(macrosol)，均为本领域已知。该媒质的特殊形式为 上述Iscom形式。无需多言，将其他稳定剂、载体、稀释剂、乳液等与本发明的疫苗混和当 然也在本发明范围内。所述添加剂如熟知的“Remington :the science and practice of pharmacy" (2000，Lippincot, USA, ISBN 683306472)和“Veterinary vaccinology" (P. Pastoret et al. ed.，1997，Elsevier, Amsterdam, ISBN 0444819681)之类的操作手册所 述。当在疫苗中以干型使用重组KHV或KHV FL株时，其还包括复原液，优选无菌水、盐 溶液或生理溶液。其也包含在加工过程中残留的少量细胞蛋白质、DNA、RNA等之类物质。而 所述物质本身不是添加剂，但其可存在于疫苗制剂中。本发明还涉及免疫鱼抵抗由上述KHV引发的病毒感染的方法，所述方法包括给易 感鱼施用含有本发明的重组KHV或KHV FL株的疫苗制剂，以足以诱导针对随后的KHV的感 染的免疫力的量施用。所述疫苗可通过口服的方式，例如通过它们的饲料或通过灌服或通过注射(肌肉 或腹膜内途径)，施用给水产鱼个体。同时所述疫苗可通过对包含整个鱼群的水体进行喷 洒、溶解和/或浸泡所述疫苗来施用。在不限于池塘、水族馆、自然栖息地和淡水水库之类 的各种环境中，这些方法对所有鱼类(如食用鱼和观赏鱼)的接种都有作用。本发明另一方面涉及包含本发明的重组KHV的DNA疫苗。核酸疫苗(或被称为基 因疫苗(gene-vaccine或genetic-vaccine))需要定靶媒质或递送媒质，以用于靶定或对 所述疫苗进行保护，或促进宿主(细胞)对所述疫苗的摄取。所述媒质可为生物或合成的 媒质，例如噬菌体、病毒样颗粒、脂质体，微型颗粒、粉型颗粒或纳米颗粒。可通过皮内应用，例如用基因枪⑧之类的无针注射器，轻易施用DNA疫苗。所述使 用方法可直接将DNA导入待接种的动物细胞内。包含在本发明药物组合物(如下文述)中 的本发明核酸、DNA片段或重组DNA分子的优选量在IOpg IOOOyg的范围内。使用的量 优选在0. Iyg IOOyg的范围内。另外，可将鱼浸泡在含有例如IOpg 1000 μ g的待施 用DNA的溶液中。所有这些均为本领域所熟知。同样，包含本发明核酸、DNA片段或重组DNA分子的定靶媒质或递送媒质在本发明 载体的范围内。其使用可将核酸递送到靶生物或其细胞内，或使蛋白在靶生物或其细胞内 表达。本发明另一方面涉及通过施用药学有效量的在药学可接受的载体中的本发明疫 苗来疫苗接种鱼的方法。“药学有效量”将在下文详述。本发明的疫苗可采取适合水产养殖中施用及复合所需应用途径及所需效果的任 何形式。本领域技术人员可通过常规手段生产本发明的疫苗。优选将本发明的疫苗制成适于注射或浸泡接种的形式，例如悬液、溶液、分散液、 乳液等。所述疫苗通常制成无菌形式。
本发明的疫苗应用于靶标生物的剂量方案可为单剂量或多剂量，可以剂量和制剂 匹配的方式，且以免疫有效量同时或相继给药。本领域技术人员具有良好能力以确定治疗 是否为“免疫有效”，例如对经疫苗接种的动物施用实验性攻毒感染，接下来确定靶动物的 疾病临床体征、血清学参数，或通过检测病原体的再次分离物。基于本发明核酸的本发明疫苗含有的“药学有效量”取决于所需效果和靶生物。本 领域普通技术人员可很好确定所述有效量。包含在本发明的药物组合物中的核酸、DNA片 段或重组DNA分子的优选量如上文所述。含有本发明的重组KHV病毒或KHV FL株的疫苗的优选量用例如噬斑形成单位 (PfU)、集落形成单位(Cfu)或半数组织培养感染剂量(TCID50)表示。例如，对活病毒载体 来说，使用1 IOltl噬斑形成单位(pfu)/动物剂的剂量是有利的，优选为IO2 IO6Pfu/剂。 合适的病毒剂量范围为约IO2 109TCID50(接种培养的半数组织培养感染剂量)/单剂，优 选为约IO4 108TCID50/单剂，更优选为约IO6 107TCID50/单剂，最优选约107TCID50/ 单剂。优选将单剂量单位施用给待处理的鱼。可应用本领域已知许多施用方法。优选通过 注射(肌肉内或腹膜内途径)、浸泡、浸渍或口服对鱼施用本发明的疫苗。施用方法可依据 标准接种疫苗接种实践进行优化。优选通过浸泡或口服施用所述疫苗。这在商业水产养殖中使用所述疫苗时特别有 效。本发明上述疫苗贡献于主动免疫接种(active vaccination)，即其引发宿主防御 系统。本发明还提供预防和/或治疗由锦鲤疱疹病毒(KHV)或CyHV-3引发的疾病的方 法，其包括将治疗有效量的上述重组锦鲤疱疹病毒或上述DNA序列或上述载体或上述感 染性颗粒或上述保藏号为LMBP 6581CB的锦鲤疱疹病毒(KHV)或CyHV_3、或者其衍生物导 入到鱼(优选鲤类，更优选普通鲤鱼和/或锦鲤)中，以预防和/或治疗由锦鲤疱疹病毒 (KHV)或CyHV-3引发的疾病。实施方式本发明提供一种重组锦鲤疱疹病毒(KHV)或鲤疱疹病毒3 (CyHV-3)，其优选其在 鱼，优选鲤类，更优选鲤鱼(Cyprinus carpio)，再更优选普通鲤鱼或锦鲤中具有免疫原性。 在一本发明实施方式中，所述重组锦鲤疱疹病毒在被导入允许真核细胞时，其具有重构感 染性颗粒的能力。本发明的发明人以稳定的感染性BAC克隆的形式实现了 KHV基因组克隆。 通过将经修饰的两侧为IoxP的BAC盒插入胸苷激酶座位而达到该目标。所述插入可生产 KHV BAC克隆，其在细菌中保持稳定且当转染允许细胞时可再生病毒颗粒。但是，只要使一 种或多种毒力贡献病毒基因有缺陷，就可将所述BAC (细菌人工染色体)载体序列插入所述 KHV疱疹病毒基因组的任何位点。所述毒力贡献基因优选选自 胸苷激酶基因、· ORF12 推定的肿瘤坏死因子(TNF)受体基因、· 0RF16 推定的G蛋白偶联受体(GPCR)基因、· 0RF134 推定的白细胞介素-10同源基因、· 0RF140 推定的胸苷酸激酶基因、或
它们的任何组合。所述重组KHV中有缺陷的毒力贡献基因更优选为胸苷激酶基因(TK)和/或0RF140 推定的胸苷酸激酶基因(TMPK)。所述重组KHV再更优选胸苷激酶基因(TK)和/或0RF140 推定的胸苷酸激酶基 因(TMPK)都有缺陷。此外，可通过在表达Cre重组酶的允许细胞内培养以从重构的病毒颗粒基因组中 切除两侧为IoxP的BAC盒。因此，本发明首次提供了 KHV基因组的BAC克隆和与KHV—般 大的疱疹病毒基因组的BAC克隆。所述KHC BAC的应用为一个重大的进步，其可用于涉及 KHV发病机理的病毒基因的鉴定和减毒重组候选疫苗的生产。可通过将经修饰的两侧为IoxP的BAC盒插入假定的非KHV复制必需的胸苷激酶 基因(TK)来克隆KHV基因组来完成了本发明。所述插入可产生BAC重组病毒，其基因组在 细菌中保持稳定，且当转染允许细胞时可重构病毒颗粒。BAC克隆体系相比现有技术中使用的粘粒载体的核心优势为在每个细胞中仅含有 的1个或最多2个拷贝的F质粒，可减少DNA片段间重组的可能性，更重要的是，可避免克 隆的细菌基因的致死过表达。而所述BAC仅以单拷贝存在是指可需从大量的培养物中提取 质粒DNA，以获得足够测序的DNA，且可通过本文实施例中所述的简化步骤完成。术语“BAC载体”指用大肠杆菌的F质粒生产的质粒和在大肠杆菌等细菌中保持 稳定且产生约300kb或300kb以上的大尺寸DNA片段的载体。所述BAC载体包含至少一个 BAC载体复制必需的区域。所述复制必需的区域的例子包括但不仅限于F质粒及其变异体 的复制起点。本文所述术语“BAC载体序列”指包含BAC载体功能必需序列的序列。所述BAC载 体序列还可任选包含“依赖于重组蛋白的重组序列”和/或“筛选标记”。本文所述术语“同源重组”是指两个不同的同源核酸分子相互遭遇时，发生交换从 而产生了新的重组核酸。本文所述术语“介导同源重组的序列”指依赖于催化、进行或促进 同源重组的特异性重组蛋白而致同源重组的序列。所述重组蛋白优选特异性作用于“介导 同源重组的序列”，但不作用于其他序列。所述序列和催化、进行或促进同源重组的特异性重组蛋白的典型配对的例子包括 但不仅限于源于噬菌体Pl的IoxP (Pl交换座位)序列和Cre (环化重组)蛋白的组合、 Flp蛋白和FRT位点的组合、C31和attB或attP的组合、解离酶和res位点的组合。本文所述术语“筛选标记”指可充当含有BAC载体的宿主细胞的筛选指示的基因。 筛选标记的例子包括但不仅限于荧光标记、发光标记和药物筛选标记。“荧光标记”的例 子为但不仅限于编码绿色荧光蛋白(GFP)之类荧光蛋白的基因。“发光标记”的例子为但 不仅限于编码荧光素酶之类发光蛋白的基因。“药物筛选标记”的例子为但不仅限于编 码选自下列的蛋白的基因二氢叶酸还原酶基因、谷氨酰胺合酶基因、天冬氨酸转氨酶、金 属硫蛋白(MT)、腺苷脱氨酶(ADA)、腺苷脱氨酶仏1^)1、2)、黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转 移酶、UMP合酶、P-糖蛋白、天冬酰胺合酶、和鸟氨酸脱羧酶。药物筛选标记和药物的组合 的例子包括二氢叶酸还原酶基因(DHFR)和甲氨喋呤(MTX)的组合、谷氨酰胺合酶(GS)基 因和甲硫氨酸硫酰亚胺(Msx)的组合、天冬氨酸转氨酶(AST)基因和N-膦酰基-L-天冬 氨酸)(PALA)的组合、MT基因和镉(Cd2+)的组合、腺苷脱氨酶(ADA)基因和腺苷、阿拉诺新或2'-脱氧肋间型霉素的组合、腺苷脱氨酶(AMPD1、2)基因和腺嘌呤、偶氮丝氨酸或肋间型霉素的组合、黄嘌呤_鸟嘌呤_磷酸核糖转移酶基因和霉酚酸的组合、UMP-合酶基因和 6-azaulysine或pyrazofuran的组合、P-糖蛋白(P_gp，MDR)基因和多种药物的组合，天冬 酰胺合酶(AS)基因和天冬氨酰氧肟酸或脲基丙氨酸的组合、和鸟氨酸脱羧酶(ODC)基因和 二氟甲基鸟氨酸(DFMO)的组合。方便地，本文所述的BAC盒还包含赋予氯霉素(CmR)抗性的基因(在原核细胞中 的筛选标记)。在所述BAC盒中还包含与EGFP融合的G418 (NeoR)抗性基因(EGFP-Neo)。 结果，所诉EGFP和Neo的融合蛋白可提供EGFP荧光和G418抗性。所述EGFP-Neo基因在 HCMV IE启动子控制下，且可作为真核细胞中的筛选基因。本文所述术语“载体”指由核苷酸制成或含有可转移多核苷酸序列或目的基因至 靶细胞的多核苷酸的媒质。所述载体可为“病毒载体”或“质粒载体”或一结合两者特性的 构建体。所述载体的例子包括下述载体其能够自我复制或能够合并到宿主细胞(例如原 核细胞、酵母、动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、全动物和全植物)染色体内，且在适于多核 苷酸或基因转录的位点包含启动子。本文所述的术语“表达载体”指包含结构基因、调控其表达的启动子和此外的各种 调控元件(以使它们在宿主细胞内可操纵的状态存在)的核酸序列。调控元件可优选包括 终止子、药物抗性基因(例如卡那霉素抗性基因、潮霉素抗性基因等)之类的筛选标记和增 强子。本领域技术人员熟知，生物类型、表达载体和调控元件类型随宿主细胞而变。本文所述术语“启动子”指决定基因转录起始位点的碱基序列，且其为可直接调控 转录频率的DNA区域。转录由结合到启动子的RNA聚合酶起始。除非另有说明，本文所述术语“转化”、“转导”和“转染”可互换使用，且指将核酸 导入宿主细胞。作为转化方法，可使用任何将DNA导入宿主细胞的技术，其包括各种熟知的 技术，例如电转染法、粒子枪法(基因枪)、磷酸钙法等。本文所述术语“转化体”指整个有机体或有机体的一部分，例如通过转化产生的细 胞。转化体的例子包括原核细胞、酵母、动物细胞、植物细胞、昆虫细胞等。依客体不同，转 化体可被称为转化细胞、转化组织、转化宿主等。本文所述的所有形式均被包括在内，而在 具体的情况下可指具体形式。本文所述术语“TK”指胸苷激酶基因，且术语“TMPK”指0RF140 推定的胸苷酸激酶 基因。所述标记“TK—”指胸苷激酶基因有缺陷的情况。所述标记“TK+”指胸苷激酶基因有 功能的情况。所述标记“TMPK-”指推定的胸苷酸激酶基因有缺陷的情况。所述标记“TMPK+” 指推定的胸苷激酶基因有功能的情况。附图简述图1示三种KHV野外分离株的生长特性的体外比较。用指定的KHV野外分离株 (感染复数0. 5PFU/细胞)感染CCB细胞(鲤鱼脑细胞)。在2小时的温育期后，用PBS洗 涤细胞，然后覆盖培养基，如材料和方法中所述。感染后5天，收集感染的培养物上清，并通 过对CCB的噬斑测定来确定感染性病毒的量。图2示KHV IS株和KHV FL株的病原性的比较。如材料和方法(鱼KHV疾病的诱 导)所述，在O天，用所述IS株( )或FL株(■)感染7g的锦鲤(η= 10)和2g的普 通鲤鱼(n = 10) 0随感染后天数表示存活鱼的百分比。
图3示生产感染性KHV FL BAC质粒的策略的示意图。(A)最上示两侧为直接末端重复子(LTR和RTR)的KHV FL株的基因组。将两侧为IoxP的BAC盒插入pGEMT-TK载体的TK (胸苷激酶)ORF的Rsr 11位点以获得pGEMT-TKBAC 载体。在后一载体中，所述BAC盒两侧为558bp 577bp的KHV同源区。(CmR:提供氯霉素抗性。所述基因受原核启动子的控制。RedF 位点特异性重组酶基因(其为截短型，且不知该基因产物是否具有功能)；repE 介导在0ri2的复制复合体的装配；parA.parB.parC 这三个元件确保所述BAC以单拷贝形式存在于每个细胞中；NeoR :G418 抗性基因(与 EGFP 融合)；EGFP-Neo 所述ORF编码EGFP和Neo的融合蛋白。所述ORF的表达产物赋予绿色 荧光和G418抗性。所述ORF受HCMV IE启动子的控制，该基因是真核细胞中的筛选标记。(B)显示下列步骤的流程图 生产 KHV FL BAC 质粒， 控制其感染性(FL BAC恢复株)， 证实从重构病毒(FL BAC切除株)的基因组除去两侧为IoxP的BAC盒的可能 性，和 生产从FL BAC质粒衍生的野生型回复株。图4示KHV FL BAC质粒和衍生株的结构分析。(A)SacI限制性酶切得到的一些片段的示意图。最上示KHV FL株和KHV FL BAC 回复株的基因组。TK、BAC和TR探针用粗水平线表示。片段大小以kb表示。要注意此图 未按实际长度比例绘制。(B)将所述 KHV FL BAC 质粒和所述 KHV FL 株、FL BAC 株、FL BAC 恢复株、FL BAC 切除株和FL BAC回复株的基因组通过SacI限制性酶切分析(左数第一图)，并使用与TK ORF(左数第二图)、BAC盒(左数第三图)或所述TR(左数第四图)对应的探针通过DNA印 迹对其进行进一步的检测。包含所述TK ORF和所述BAC盒的限制性片段分别用黑/白箭 头和开放箭头标明。与TR探针杂交的限制性片段用灰色箭头标明。在左边显示以kb表示 的标记物大小(MS)。图5示KHV FL BAC质粒的异质性。从24个大肠杆菌独立集落中分离BAC质粒， 并通过HindIII分析。KHV亲本株(FL株)和FL BAC株作为对照，在左边显示以kb表示的 标记物大小(MS)。图6示在连续培养20天的含有KHV FL BAC质粒的大肠杆菌DHlOB细胞中的KHV FL BAC质粒的稳定性实验。在指定的天数，按“材料和方法”所述制备BAC DNA，然后用SacI 消化。所述KHV亲本株作为对照，在左边显示以kb表示的标记物大小(MS)。图7示KHV FL分离株的特征。(A)病毒合胞体的落射荧光分析。用KHV FL株(i iii)、FLBAC株(iv iv)、 FL BAC恢复株(vii ix)、FL BAC切除株(χ xii)和FL BAC回复株(xiii xv)感染 CCB细胞(0. IPFU/细胞的Μ0Ι)，并覆盖含有10% FCS和0.6% (w/v)羟甲基纤维素(Sigma) 的DMEM以获得分离的合胞体。感染后7天，分别使用Mab 8G12和GAM Alexa 568作为第 一抗体和第二抗体通过间接免疫荧光染色显示合胞体。同一行的三组小图显示对同一合胞体的分析。分别分析了小图⑴、(iv)、(Vii)、(X)、(Xiii)和小图(ii)、(V)、(Viii)、 (Xi)、(Xiv)的 EGFP 和 GAM 568 荧光发射。小图(iii)，(vi)，(ix)，(xii)和(xv)示 EGFP 和Alexa 568的混合信号。在每个小图侧对应着200 μ m。(B)如“材料和方法”所述比较KHV重组株和亲本KHV FL株的复制动力学。所得
数据为三次重复测量的平均值。图8示用FL BAC质粒衍生株质粒感染鲤类的累积存活率。如材料和方法所述，在0天，通过IP注射 模拟感染培养基(A)及參含 3 X IO2PFU 的■ FL (TK+) (A)、■ FL BAC 恢复株(ΤΓ) (B)、■ FL BAC 切除的(ΤΓ)⑶、禾口■ FL BAC 回复株(TK+) (C)的培养基来接种各由10只锦鲤(7g)组成的5组(由13只鲤组成的模拟感染组除外)。在 感染后32天，通过IP注射亲本FL株(3X102PFU/鱼)对存活的鱼进行攻毒。随感染后天 数来显示成活百分比。所示结果为三次有代表性的独立实验的结果。图9示生产感染性KHV FL BAC galK重组质粒和衍生病毒株的策略的示意图。(A)左边部分含单末端重复序列的KHV FL BAC质粒的示意图。标出了所述BAC 盒和三种目的ORF (12、16和140)。右边部分以pGalK为模板用HOgalK引物PCR扩增HOgalK盒。在所述盒中， galK ORF的两侧为50bpKHV同源区。使用相同方法生产12galK盒和16galK盒。(B)生产KHV FL BAC galK重组质粒的步骤的流程图，以证实从重构病毒(FL BAC 切除株)的基因组移除两侧为IoxP的BAC盒的可能性，及生产从FL BAC质粒衍生的野生 型回复株(后一点只适用于0RF140)。图10示KHV FL BAC galK重组质粒和衍生病毒株的鉴定。(A)KHV FL BAC galK重组质粒和衍生病毒株的结构分析。所述KHV FL BAC质粒、 所述衍生galK重组质粒、和从切除株和回复株中衍生的基因组通过SacI限制性酶切进行 分析(左图)，并使用与0RF12 推定的肿瘤坏死因子(TNF)受体基因、0RF16 推定的G蛋白偶联(GPCR)受体基因、0RF140 推定的胸苷酸激酶基因、或TK ORF对应的探针通过DNA印迹(右图)对其进行进一步的检测。白色箭头和开放箭头分别指示含有相应的ORF和galK盒的限制性片段。灰色箭 头指示含有TK ORF的限制性片段。在左边显示以kb表示的标记物的大小(MS)。(B)如“材料和方法”所述比较KHV FL BAC galK重组株和亲本KHV FL株的复制 动力学，所得数据为三次重复测量的平均值。
图11示从多缺失重组株衍生的BAC感染鲤类的累积存活率。在第0天，通过IP 注射眷模拟感染的培养基(A)及參含 3 X IO2PFU 的■ FL 株(TK+、TMPK+) (A)、■ FL BAC 切除株(ΤΓ、TMPK+) (B)、■ FL BAC Δ ORF12 切除株(ΤΓ、TMPK+) (B)、■ FL BAC Δ ORF16 切除株(ΤΓ、TMpK+) (C)、■ FL BAC Δ ORF140 切除株(ΤΓ、ΤΜΡΓ) (C)、禾口■ FL BAC Δ 0RF140TK 回复株(ΤΚ+、ΤΜΡΓ) (D)的培养基对各由10只锦鲤(7g)组成的7组进行接种。在接种后27天，通过IP注射FL株 (3X IO2PFU/鱼)对存活的鱼进行攻毒。随感染后时间显示存活百分比。所示结果为三次 有代表性的独立实验的结果。图12通过在普通鲤鱼上使用生物发光成像技术示由所述FL BACA0RF140切除株 赋予的临床保护和病毒保护。(A)所述实验的示意图。在第0天，用模拟感染的培养基或FLBAC Δ 0RF140切除株 通过浴疗(40PFU/ml)对各由8只普通鲤鱼(8g)组成的2组进行感染。在感染后30天，用 有毒性的受人IE启动子调控的表达荧光素酶的KHV FL LUC株通过浴疗(40PFU/ml)对所 有鱼进行攻毒。然后在攻毒后3天和6天(初次感染后33天和36天)麻醉鲤鱼，并利用 体内成像系统(IVIS)对其进行分析。(B和C)生物发光成像。用伪彩色度(psudocolor scale)表示荧光素酶活性，使 用红色作为光子通量的最高水平而紫色作为光子通量的最低水平。代表性图以均勻最小和 最大光子通量阈值提供。生物发光信号以伪彩色显示且在灰度图像上叠加。图13示作为KHV潜伏位点的脑的鉴定。对各由10只锦鲤(平均重27g)组成的 两组进行模拟感染或浴疗感染。将所述KHV FL LUC株添加到水中至达到40PFU/ml的终浓 度以进行感染。感染后5天，处死、解剖急性感染后存活的鲤(η = 3)，并用体内成像系统 (IVIS)对分离的器官进行分析。用伪彩色度表示荧光素酶活性，使用红色作为光子通量的 最高水平而紫色作为光子通量的最低水平。每组一只代表性的鲤。代表性的图以均勻最 小光子通量阈值和最大光子通量阈值提供。生物发光信号以伪彩色显示且在灰度图像上叠 力口。发出可检测信号的唯一器官是脑(白圈所示)。
实施例材料和方法a)细胞和病毒。用含有4. 5g/l葡萄糖(D-葡萄糖一水合物，Merck)和10%胎 牛血清(FCS)的最小必需培养基(MEM，Invitrogen)培养鲤鱼脑细胞(CCB) (Neukirch et al.，Bull. Eur. Ass. Fish. Pathol.，19 (5)，221-224 (1999))。细胞在 25°C、含有 5% CO2 的 潮湿气氛中培养。从由KHV(CER Marloie，Belgium)致死的鱼肾中分离所述KHV FL株。 FL 代表分离此株的 Francois Lieffrigo KHV IS 株和 KHV-U 株分别由 Μ. Kotler (Hebrew University-Hadassah MedicalSchool, Jerusalem,Israel)禾口 R. Hedrick(University ofCalifornia, School of Veterinary Medicine, USA)友情提供(Ronen et al. , Vaccine, 21 (32), 4677-4684 (2003) ；Hedrick et al.，Bull. Fish. Res. Agen.，S2，1-7 (2005))。b)牛长实验。用KHV FL株、KHV IS株和KHV-U株(感染复数0. 5PFU/细胞)感 染三个平行的CCB细胞培养物。在接种2小时后，用PBS洗涤细胞然后覆盖含有4. 5g/l葡 萄糖和10% FCS的Dulbecco' s改良的必需培养基(DMEM，Invitrogen)培养基。感染后 5天，收集感染的培养物上清，并如上所述通过对CCB细胞进行噬斑分析以确定感染性病毒 量(Gillet et al. ，J Gen Virol,86,907-917(2005)) c) KHV的BAC克降。首先，以KHV FL DNA为模板通过PCR扩增得到1137bpDNA片 段，其对应着所述KHV基因组的TK 0RF(0RF55)和0RF56。用于扩增的引物如下正向引物5' -ATGGCTATGCTGGAACTGGTG-3‘禾口反向引物5 ‘ -CTCAACAGGGAAGAGTGGCG-3 ‘分别对应着KHV TK ORF的第1 第21个核苷酸和0RF56的第279 第297个核苷酸(Genbank 登录号 DQ177346)。扩增产物通过TA克隆进pGEMT-easy载体(Promega)而得到pGEMT-TK(图3A)。 对三个独立克隆进行了测序。通过PmeI消化pBeloBAC改良的-EGFPNeo载体释放BAC盒 (Dewals et al.，J GenViroi，87，509-517 (2006))，然后将其连接到所述 pGEMT-TK 载体的 Rsr II位点得到pGEMT-TKBAC载体(图3A)，在此载体中BAC盒的两侧为与KHV基因组同 源的序列。通过在真核细胞中同源重组，这些558bp 577bp的同源区可用于生产KHV FL BAC重组株(图3B)。简言之，以0. 5PFU/细胞的MOI用KHV感染新接种的CCB细胞。在接 种后2h，用Lipofectamine Plus(Invitrogen)用环状的pGEMT-TKBAC载体转染细胞。感染 后4天，收集感染细胞的细胞上清，并在G418 (终浓度为500 μ g/ml)存在下接种到汇合的 CCB单层细胞(IO6细胞/9. 5cm2)。重复此步骤三次直到获得纯的BAC-重组群。将此病毒 制剂以IPFU/细胞的MOI对新接种的细胞进行接种。如上文所述，在感染后20h提取环化 形式的病毒 BAC-重组基因组(Morgan et al. ,Avian Dis，34，345-351. (1990))，并如其他 所述将2ygDNA电转染(2250V，132Q，40yF)进大肠杆菌DHlOB细胞(Invitrogen)。将电 转染的细胞平铺于添加氯霉素(17 μ g/ml)的固体LB平板上。要注意，此步骤的关键是要 避免液体预培养，以避免含有不完整的KHV BAC质粒的细菌的优先生长。d)由所述KHV FL BAC质粒重构感染性病毒。将所述FL BAC质粒转染 (Lipofectamine Plus, lnvitrogen)进允许 CCB 细胞，以生产 FL BAC 恢复株。将 FL BAC 质粒和pGEMT-TK载体(分子比1 75)共转染进CCB细胞，以生产从所述BAC衍生的野生 型回复株。转染后7天，挑选对EGFP表达呈阴性的病毒噬斑，并通过三轮连续的噬斑纯化 富集。类似地，将FL BAC质粒和编码融合到核定位信号(Gilletet al. ,J Gen Virol,86, 907-917(2005))的Cre重组酶的pEFIN3-NLS_Cre载体(分子比1 70)转染进CCB细胞， 以用从病毒基因组的切除BAC盒重构病毒粒子。e)DNA 印迹。如上所述进行 DNA 印迹分析(Markine-Goriaynoffet al.，J Gen Virol, 85, 355-367 (2004)) ο使用了多种探针。用分别对应着KHV TK ORF的第1 第21个核苷酸和0RF56的第279 第297个核苷酸(Genbank登录号DQ177346)的TK正向引物( TKfw) 5 ‘ -ATGGCTATGCTGGAACTGGTG-3 ‘和反向引物(TKrev) 5 ‘ -CTCAACAGGGAAGAGTGGCG-3 ‘，以KHV FL基因组作为模板，通过PCR产生TK探针。TR探针对应KHV基因组(Genbank 登录号DQ177346)LTR的第3817 第4228个核苷酸和RTR的第276494 第276905个核 苷酸。通过PmeI消化从pBeIoBAC改良的-EGFPNeo载体释放BAC探针。ORF12探针、ORF16 探针和0RF140探针对应这些ORF的基因座。f)间接免疫荧光染饩。固定CCB细胞，且用丙酮-乙醇(50 50)在_20°C下透 化CCB细胞10分钟。用含有10% FCS的PBS进行免疫荧光染色(温育和洗涤)。将样品与 抗在感染细胞的细胞核中表达的非鉴定的KHV抗原的鼠单克隆抗体(Mab)8G12在25°C下温 育45分钟。三次洗涤后，将样品与作为二级缀合物的Alexa Fluor 568羊抗小鼠IgG (H+L) (GAM 568，2 μ g/μ 1，Molecular Probes)在 25°C下温育 30 分钟。r)显微镜镜检分析。如上所述用配备有DC 300F CCD照相机(Leica)的DMIRBE 显微镜(Leica)进行落射荧光镜检分析。
h)多步牛长曲线。以0. 5PFU/细胞的MOI感染三个平行的CCB细胞培养物。在2小 时接种期后，用PBS洗涤细胞，然后覆盖含有4. 5g/l葡萄糖和10% FCS的Dulbecco' s改 良的必需培养基(DMEMdnvitrogen)。在感染后的连续间期内收获感染的培养物上清，并如 上所述通过对CCB细胞的噬斑分析来确定感染性病毒的量(Gillet et al.，J Gen Virol, 86，907-917(2005))。i)通过细菌中的galK阳件筛诜牛产KHV FL BAC重组质粒。用所述的细菌中的galK阳性筛选生产缺失ORF12 推定的肿瘤坏死因子(TNF)受体基因、0RF16 推定的G蛋白偶联(GPCR)受体基因、或0RF140 推定的胸苷酸激酶基因的 KHV FL BAC 重组质粒(Warming et al.，Nucleic AcidsResearch, 33 (4) (2005))(图 9)。所述重组片段由半乳糖苷酶(galK)基因(1331bp)构成，在该基因的两侧为待删 除的对应ORF起点和终点的50bp序列。可用pgalK作为模板通过PCR产生这些片段。用于扩增的引物如下· 0RF12 ■正向引物 5 ‘ -ATGAAGCTGCTTGTGATTCTGGGTCTTGGACTCTGCTACCTGGCTGTTCACCTGT TGACAATTAATCATCGGCA-3‘禾Π■反向引物 5 ‘ -TCAACTTCTCTTTGGTTTTCTGCACATATTCGTCCCCCCCACGGTTTTCATCAGC ACTGTCCTGCTCCTT-3‘；· 0RF16 ■正向引物 5 ‘ -ATGAAACCTCTGGGTCTTTTTGTTTCTGTGCTCGGGCTGCTTGCCCTGTCCCTGT TGACAATTAATCATCGGCA-3‘禾Π■反向引物 5 ‘ -TCATAGGACGCCATCGGTTGAGTTCGCTGCGGCTGCGACTCCCAGTCCTCTCAGC ACTGTCCTGCTCCTT-3‘；· ORF140
■正向引物 5' -ATGGAACCCGAGCCTCGACAGCAGAACCGCGAGCTCCCTTTCATGCCTGTTGACA ATTAATCATCGGCA-3‘禾口■反向引物 5 ‘ -TCAAGACCATAAAGTGGGAAGGTGTCGTCGAAGCCGTCTCTGGAGTCGTTCAGCA CTGTCCTGCTCCTT-3 ‘ (Genbank 登录号 DQ177346)。纯化扩增产物，并在-20°C下储存备用。同时，将Iyg KHV FL BAC质粒电转染 (2500V, 100 Ω , 25 μ F)进大肠杆菌SW102细胞。电转染的细胞在含氯霉素(17 μ g/ml)的液 体LB培养基中，在32 °C下生长。下一步，用上述的2. 5ng PCR产物电转染含有KHV FL BAC质粒的可电转染的SW102细胞。如其他所述，将电转染的细胞平铺在补充20%半乳糖和氯霉素(17yg/ml)的 固体M63最小培养基，以筛选其中发生同源重组的细菌。最后，如其他所述，在MacConkey指示平板上用所得的克隆划线，以确保galK阳性 克隆的产生。 )在龟中诱导KHV病。在水温为24°C的60升的鱼缸中饲养无特定病原体的锦鲤 和普通鲤鱼。1)为检测KHV野生株在体内的致病性，使用了两组鱼，每组包含10只锦鲤和10 只普通鲤鱼。通过IP注射0. Iml的含有3X IO2PFU的KHV IS株或KHV FL株来感染锦鲤 (7g)。通过将鱼放在300ml的鱼缸中浴处理感染普通鲤鱼(2g)，在鱼缸的水中添加KHV IS 株或KHV FL株以达到30PFU/ml的终浓度，在所述条件下2h后普通鲤鱼被转移到更大的鱼 缸。2)为比较KHV FL BAC衍生株的致病性，使用了 5组鱼，每组包含10只锦鲤(7g) (由13只锦鲤组成的模拟感染组除外)。通过IP注射0. Iml的含有3 X IO2PFU的KHV FL 株、KHV FL BAC恢复株、KHV FL BAC切除株、KHV FL BAC回复株感染锦鲤。在接种前对病 毒接种量进行滴定并在接种后对其进行反滴定，以确保各组间剂量相等。在相同条件用培 养基感染对对照组(模拟感染组)进行注射。每天检查鱼的KHV病的临床症状并将死鱼除 去。3)如上所述(见第 2 点)研究了多缺失的 KHV FL BAC Δ 0RF12、Δ 0RF16、Δ 0RF140 切除株和FL BACA0RF140TK回复株在锦鲤中的致病性。动物研究得到当地的LiSge大学 (比利时)伦理委员会的批准。k)使用细菌中的^tlK阳性筛选和阴性筛选来制备KHV FL LUC重组株。表达萤火虫荧光素酶的KHV FL LUC重组子的制备如下所述。首先，如上所述用KHV FL BAC质粒和细菌的galK阳性筛选制备了携带galK盒进 入0RF136和0RF137基因间区域(GenBank登录号DQ177346)的KHV FL BAC质粒。第二，用细菌的galK阴性筛选，用对应于受人巨细胞病毒立即早期启动子的控制 的萤火虫荧光素酶基因的LUC盒替代galK盒(Warming et al. ,Nucleic Acids Research, 33 (4) (2005))，以获得 KHV FL BAC LUC 质粒。第三，如上所述，将编码LUC表达盒和野生型TK序列的重构的感染性颗粒，KHV FL BAC LUC质粒和pGEMT-TK载体共转染进CCB细胞，以获得KHV FL LUC株。可证明在体外， KHV FL LUC株和亲本FL株在复制上相似。在体内，当通过给8g的普通鲤鱼浴处理来接种 时，KHV FL LUC株和亲本FL株显示出相似的毒力。由两株诱导的死亡率都在80%左右(未显示数据)。1)牛物发光成像。在由冷却电荷偶合器件照相机(Xenogen)组成的Xenogen体 内成像系统(IVis)上进行鱼的萤火虫荧光素酶成像。简言之，用150mg/kg的D-荧光素 (Xenogen)对鱼进行IP注射，然后用苯佐卡因(在水中50mg/l)麻醉鱼，在施用D-荧光素 IOmin后开始成像。用Imin的曝光时间、4的分块因子和1的f/stop获取图像。获取每只 鱼左侧和右侧的图像。将从体内生物发光的透射光的相对强度表现为从紫色(最小强度) 到红色(最大强度)的伪彩色图像。图表示为均勻最小光子通量阈值和最大光子通量阈值。 用活体成像分析软件(Xenogen)叠加相应的灰度图像和彩色荧光素酶图像。_仿丨丨1 :KHV FL紐捕絲白妒物Φ白働目M辦制■碰性检测了野生株在体外的生长特性和体内的毒力。在此筛选过程末选取如产生衍 生的减毒重组株的亲本株的KHV FL株。图1示相比两种KHV参照株(IS株和KHV-U株) 的KHV FL株的生长特性，所述FL株在体外复制更高效。图2表明在体内所述KHV FL株比 KHVIS株的致病性低。确实，当对7g的锦鲤进行测定时，所述IS株和所述FL株分别导致 90%和80%的死亡率(图2)。有趣的是，当对2g的普通鲤鱼进行测定时，与IS株相比，所 述FL株诱发的疾病延迟两周。着眼于与更高毒力的KHV株相比观察到的2星期的延迟和 根据更高毒力的KHV株在约1星期后弓I发普通鲤鱼发病，将所述FL株选为亲本株用于进一 步实验(FL代表分离所述株的Francois Lieffrig)(保藏号为LMPB 6581CB)。实施例2 在大肠杆菌中的KHV基因组的克降将KHV FL株的基因组克隆为BAC，以生产KHV重组株。使用如图3所述的方法来BAC克隆KHV。在所述方法的第一步需要在真核细胞中通过同源重组将BAC盒插入KHV基 因组。因当本发明人开始进行研究时KHV的基因组仅被部分测序，所述BAC盒的插入位点 选在TK基因的末端(图3A)。将pGEMT-TKBAC转染进感染KHV的CCB细胞产生了 KHV FL BAC株(图3B)。后一病毒在G418存在下生长的能力使其可从亲本株中被分离。此外，由 KHV FL BAC株诱导的EGFP表达可用于监测筛选过程。在G418存在下，使病毒传代三次，获 得了纯的KHV FL BAC群。所述KHV FL BAC株的分子结构通过SacI限制性内切酶和DNA 印迹方法的组合确定(图4)。在亲本FL株中，TK ORF包含在约5. 2kb的DNA片段中。在 FL BAC株中，由于BAC盒插入TK座位中的结果，所述TK序列被分成约5. 3kb和9. Ikb的 两段(图4)。下一步，我们尝试将FL BAC的环状中间体克隆进细菌。出人意料的是，尽管 我们筛选了多于500个独立克隆，仍不能筛选到编码FL BAC基因组的单克隆。获得的BAC 质粒产生异源限制性酶切图谱(restriction profiles)，只有少数条带与预期的限制性酶 切图谱相对应(图5)。由于KHV基因组的大尺寸，可假设与编码全长KHV BAC克隆的细菌 相比，编码不完整KHV BAC质粒的细菌具有选择性的优势；结果，转化细菌的液体培养(在 平铺到固体培养基前进行)可导致选取到含有只编码部分KHV基因组的BAC质粒的细菌。 为检测所述假设，在电转染后立刻将大肠杆菌在固体LB培养基上平铺。这种方法导致获得 BAC质粒，其编码的大多数限制性片段可在FL BAC株基因组中发现。但是，只有 2% 的克隆表现出与FL BAC株基因组相似的限制性酶切图谱。这些正确克隆之一通过SacI限 制性内切酶和DNA印迹方法的组合鉴定(图4)。由于细菌中基因组的环化，存在于FL株和 FL BAC株的含有左末端重复序列和右末端重复序列(LTR和RTR)的端侧的两个条带(7. Ikb 和14. Ikb)在FL BAC质粒中丢失(图4)。而FL BAC质粒的限制性酶切图谱中并未显示预期的21.2kb的融合片段(图4)。所述观察结果表明所述BAC含有单个拷贝的末端重复序 列。为检测这种假设，用TR探针通过DNA印迹分析了 SacI酶切图谱。分析结果显示在FL 株图谱和FL BAC株图谱中存在两个条带(7. Ikb和11.3kb)，而在FL BAC质粒中只有一个 条带(11. 3kb)(图4)。这些结果证明所述FL BAC质粒仅含有单个拷贝的末端重复序列。 所述观察结果也通过所述BAC的测序确认。综上所述，其结果证明整个KHV基因组在大肠 杆菌中被克隆为BAC (保藏号为LMPB 6581CB)。实施例3 大肠杆菌中的KHV基因组的稳定件BAC质粒通常在带有可使重组最小化的recA突变的细菌中繁殖。但KHV基因组 的巨大尺寸和复杂结构可导致BAC质粒的相对不稳定性(Ilouze et al. ,Microbiol. Mol. Biol. Rev.，70 (1)，147-156，(2006))。为评估KHV基因组作为BAC质粒的稳定性，连续培养 包含KHV FLBAC质粒的细菌连续20天，每天代表约36代。在培养的各个时期后，提取BAC 质粒，并用SacI酶切消化表征(图6)。在生长的各个不同时期未观察到质粒间的不同，证 明在大肠杆菌中的KHV基因组的高稳定性。实施例4 从所沭KHV FL BAC质粒重构感染件病毒疱疹病毒BAC克隆的有用性需要从BAC质粒重构感染性颗粒的能力。结果，本发 明人检测了是否可通过将KHV FL BAC质粒转染进CCB细胞来生产感染性颗粒(图3B)。转 染后6天，检测了表达EGFP的病毒合胞体。重构病毒DNA (KHV FL BAC恢复株)的SacI限 制性切分析显示其限制性酶切图谱与在KHV FL BAC株中观察到的样式相同(图4)。这些 数据证明可通过将所述KHV FL BAC质粒转染进允许细胞来有效重构感染性KHV FL BAC病 毒颗粒。重要的是，要注意无需任何促进药物的处理，即可产生重构病毒颗粒。这些数据证 明，即使所述BAC只编码单个末端重复序列，其可再生整个基因组和感染性颗粒。为从重构的病毒颗粒基因组切除BAC盒，将FL BAC质粒和表达Cre重组酶的质粒 共转染进CCB细胞(图3B)。可通过EGFP荧光的消失(图7)及通过限制性内切酶和DNA 印迹方法的组合(图4)监测所述BAC盒的删除。由cre_loXP_介导的BAC盒的删除在TK ORF的末端留下了 172bp的序列，其导致SacI限制性酶切片段比其对应的野生型片段稍大。 所述172bp片段包含一个IoxP位点(34bp)及所述IoxP位点的BAC盒上游(126bp)和下 游(12bp)序列。由于所述172bp的异源序列插入到TK ORF中，所述FL BAC切除株表达对 应野生型蛋白(217个残基)的前185个氨基酸(aa)的截断型TK。最后，将FL BAC质粒和pGEMT-TK载体共转染进CCB细胞，以产生回复株(图3B)。 通过EGFP的不表达来筛选FL BAC回复株。酶切分析显示，其限制性酶切图谱与在亲本野 生型FL株观察到的样式相同(图4)。实施例5 :KHV FL BAC衍生株的表征FL BAC衍生株的更多鉴定在细胞培养中进行。首先，免疫染色的病毒合胞体的显微镜镜检显示重组子间没有不同(图7A)。第二，为研究重组过程对病毒在体外生长产生的推定影响，使用多步生长测定对 所有重组株进行比较(图7B)。检测的所有病毒显示相似的生长曲线(P < 0. 05)，以致结 论为，TK破坏不影响KHV在体外复制，且尽管KHV基因组尺寸巨大，但KHV基因组可支持大 片段的插入。实施例6 =BAC衍生的病毒作为疫苗
设计所述KHV FL基因组的BAC克隆策略来破坏胸苷激酶(TK)座位。为检测所述ORF的缺失是否有助于从所述KHV FL BAC衍生的病毒的减毒，在体内比较了 FL BAC恢复 株、FL BAC切除株(两者都为TK-)与FL亲本株、FL BAC回复株(两者都为TK+)。这个实 验在7g的锦鲤上进行(图8)。亲本FL株诱导与KHV相关的所有临床症状包括冷漠、背鳍 折叠、粘液分泌物增加、窒息、不规则的游泳和失去平衡。FL株诱导80%的死亡率。尸检时 在多数鱼中观察到鳃丝变色，疱疹性皮肤损伤和坏死性肾炎。与FL亲本株相比，通过相似 的临床症状和病变，但强度降低表征，FL BAC恢复株和切除株表现出部分减毒的表型。与 所观察到的减毒一致，这些株的死亡率降至40%。重要的是，FL BAC回复株的毒力与亲本 FL株的毒力相近。有趣的是，所有初次感染后存活的鱼发展出抵抗有毒力的FL株的进一步 的攻毒(初次感染后32天)的保护性免疫应答。综上，所述数据都支持所述FL BAC克隆 作为亲本质粒来开发多减毒重组疫苗的可能性。t施例7 诵i寸作为亲本质粒的KHV BAC质粒在细菌中发牛突夺和用galK阳t牛f帝 诜来牛产KHV BAC重组质粒上述结果描述了 TK缺失KHV株(KHV FL BAC切除株)的制备，而当其在锦鲤上进 行分析时，可导致KHV病的减弱(图8)。所述数据支持FL BAC克隆作为用于多减毒重组疫 苗的开发的亲本质粒的可能性。为证明所述概念的可行性，通过在细菌中的同源重组并使用galK阳性筛选 缺失编码推定的肿瘤坏死因子(TNF)受体基因的0RF12的KHV BAC(KHV FL BAC Δ ORF12 质粒)、 缺失编码推定的G蛋白偶联受体(GPCR)基因的0RF16的KHV BAC (KHV FL BAC Δ ORF16 质粒)、禾口 缺失编码推定的胸苷酸激酶基因的0RF140的KHV BAC (KHV FL BAC Δ ORF140质 粒)来生产三种缺失毒力候选基因的KHV BAC重组质粒(图9)。所生产的重组质粒的分子结构可通过SacI限制性内切酶和DNA印迹方法的组合 确认(图10Α)。在亲本KHV FL株和KHV FL BAC质粒中，0RF12和0RF16含在约4. 8kb的 DNA片段中，而0RF140含在约1. 8kb和Ikb的两个DNA片段中。正如所料，在KHV FL BAC的 重组质粒中，包含1. 3kb的galK盒的0RF12、0RF16和0RF140DNA片段分别局限于约5. 7kb、 5kb和3. 5kb的片段中(图10A)。要注意在DNA印迹中对应0RF16的5kb条带略微可见。下一步，将KHV FL BAC重组质粒的DNA和表达Cre重组酶的质粒共转染进CCB细 胞，以从重组质粒的基因组中切除BAC盒(图9B)。可通过EGFP荧光的消失以及限制性内 切酶和DNA印迹方法的组合来监测所述BAC盒的删除。由cre-loxP-介导的BAC盒的缺失 在上述TK ORF的末端留下了 172bp的序列。最后，产生了缺失0RF140但包含野生型转录TK序列的A0RF140TK回复株(图 9B)。所述回复株通过EGFP的不表达来筛选。限制性酶切分析显示与亲本FL株观察的一 样存在所述TK ORF (图10A)。总之，所述结果证明，利用原核重组技术可使用本发明的KHV FLBAC质粒来生产重 组株。因为根据假设KHV基因组的大小和高含量的重复区域会由于基因组内重组(当重组 酶的表达启动时发生)而使该过程不可能发生，所述结果出人意料。
KHV BAC重组株的更多表征通过在细胞培养中使用的多步生长测定进行(图 10B)。检测的所有病毒显示相似的生长曲线(P <0.05)，以致结论为，TK破坏与0RF12、 ORF16或0RF140的破坏偶联，不影响KHV的体外复制。t施彻丨8 :BAC衍牛的多缺失重会目子作为疮苗上述结果描述了 3种多缺失重组株的产生。为检测这些多缺失重组株作为减毒疫 苗的潜力，我们比较了其致病性及其在锦鲤中诱导针对KHV的保护性免疫应答的特性，实 验结果如图11所示。与野生型相比，所述FL BACA0RF12切除株(缺失TK和0RF12)和所 述FL BACA0RF16切除株(缺失TK和0RF16)分别显示出60%和40%的死亡率下降。值 得注意的是，所述FL BAC Δ ORF140切除株(缺失TK和0RF140)导致无死亡率及无KHV病 的临床症状(图11)。类似地，所述FL BACA0RF140TK回复株(缺失0RF140但编码回复的 野生型TK序列)导致无死亡率。在接种后4天，感染的鱼只表现出轻微的(冷漠和背鳍折 叠)和暂时的临床症状。初次接种后27天，用有毒力的FL株对初次接种后存活的鱼进行 攻毒。与用于初次接种的株无关，所有攻毒后存活的鱼均未表现出任何所述疾病的临床症 状。综上，所述数据支持所述多缺失重组株，尤其是FL BACA0RF140切除株作为重组减毒 活体疫苗的潜力。实施例9 用KHV FL BAC A ORF140切除株对龟讲行接种，给予龟抵抗KHV的临床 和病毒保护
上述结果证明FL BACA 0RF140切除株作为重组减毒活体疫苗的潜力。所述病毒能 够诱导针对KHV的保护性免疫应答，且不在被接种对象中诱发死亡率或甚至无临床症状。 下一步，我们讨论用FLBAC Δ 0RF140切除株的接种不仅诱导抵抗KHV疾病的免疫保护(临 床保护)而且当用KHV对被接种对象进行再次接种时，可给予预防进一步感染的免疫应答 (病毒保护)。为评估所述问题，用FL BAC Δ 0RF140切除株通过浴疗对普通鲤鱼(8g重)进行初 次感染(图12)。将用培养基感染鱼的一组作为阴性对照。初次感染后30天，用有毒性的 表达萤火虫荧光素酶的KHVLUC株对所有鱼进行攻毒。攻毒后3天和6天用IVIS分析所有 鱼，以检查用疫苗株给予的保护。所述实验的结果如图12所示。首次用于实验的鱼(在第 0天模拟感染的鱼)在攻毒后3天和6天显示出强烈的生物发光信号(左小图).另一方 面，用FL BAC Δ 0RF140切除株接种的鱼在攻毒后任何时间未显示任何可检测的生物发光信 号(右小图)。此外，所述接种鱼未显示KHV病的任何临床症状。总之，所述数据都支持所 述FL BAC Δ 0RF140切除株作为减毒活体疫苗给予针对KHV的临床和病毒保护的潜力。实施例10 所述FL BAC AORFHO切除株为不能从潜伏期中重新活跃的疫苗株已鉴定鱼脑可作为KHV的潜伏位点(图13)。已知脑细胞不分裂，因此不表达细胞 TK和TMPK核活性。可假设生产的ΤΚ/ΤΜΡΚ双缺失病毒(FL BAC Δ 0RF140切除株)不能从 潜伏期中重新活跃。因此一旦接种动物成为潜在携带者，其不贡献于疫苗株的传播。参考文献Aoki, Τ. , Hirono, 1. , Kurokawa, K. , Fukuda, H. , Nahary, R. , Eldar, A. , Davison, A. J. , ffaltzek, Τ. B. , Bercovier, H. & Hedrick, R. P. (2007). Genome sequences of three koi herpesvirus isolatesrepresenting the expanding distribution of an emerging diseasethreatening koi and common carp worldwide. J Virol 81,5058-65.
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权利要求
重组锦鲤疱疹病毒(KHV)或鲤疱疹病毒3(CyHV-3)，其在下列物种中具有免疫原性●鱼，●优选鲤类，●更优选鲤鱼(Cyprinus carpio)。
2.权利要求1的重组锦鲤疱疹病毒，其具有给予下列物种抵抗由锦鲤疱疹病毒(KHV) 或鲤疱疹病毒3 (CyHV-3)引发的疾病的免疫力的能力 鱼， 优选鲤类， 更优选鲤鱼(Cyprinus carpio)。
3.权利要求1或2的重组锦鲤疱疹病毒，其一个或多个复制非必需的病毒基因有缺陷。
4.权利要求1 3中任一项的重组锦鲤疱疹病毒，其至少一个毒力贡献基因有缺陷。
5.权利要求1 4中任一项的重组锦鲤疱疹病毒，其至少一个毒力贡献基因有缺陷，所 述基因选自 胸苷激酶基因、 0RF12 推定的肿瘤坏死因子(TNF)受体基因、 0RF16 推定的G蛋白偶联受体(GPCR)基因、 0RF134:推定的白细胞介素-10同源基因、 0RF140 推定的胸苷酸激酶基因、或 它们的任何组合。
6.权利要求1 5中任一项的重组锦鲤疱疹病毒，其下列基因有缺陷 病毒胸苷激酶基因和 至少另一个选自下列的毒力贡献基因■0RF12 推定的肿瘤坏死因子(TNF)受体基因、■0RF16 推定的G蛋白偶联受体(GPCR)基因、■0RF134 推定的白细胞介素-10同源基因、■0RF140 推定的胸苷酸激酶基因、或 ■它们的任何组合。
7.权利要求1 4中任一项的重组锦鲤疱疹病毒，其胸苷激酶基因有缺陷。
8.权利要求1 4中任一项的重组锦鲤疱疹病毒，其0RF140推定的胸苷酸激酶基因 有缺陷。
9.权利要求1 4中任一项的重组锦鲤疱疹病毒，其下列基因有缺陷 胸苷激酶基因和 0RF140 推定的胸苷酸激酶基因。
10.权利要求1 9中任一项的重组锦鲤疱疹病毒，其中所述疱疹病毒为活型。
11.权利要求1 10中任一项的重组锦鲤疱疹病毒，其在被导入允许真核细胞或鱼体 时具有重构感染性颗粒的能力。
12.权利要求1 11中任一项的重组锦鲤疱疹病毒，其中所述疱疹病毒为减毒型。
13.权利要求1 12中任一项的重组锦鲤疱疹病毒，其在被所述疱疹病毒感染的 鱼， 优选鲤类，參更优选普 iUiiil (Cyprinus carpi ο carpio)或 锦鲤 (Cyprinuscarpio koi)中导致 ≤ 40%, 优选≤20%, 更优选≤10%， 再优选≤1%, 又再优选≤0. 1%的死亡率，且 最优选0.0%的死亡率。
14.权利要求1 9中任一项的重组锦鲤疱疹病毒，其为 灭活的且非复制型、或者 欠减毒型。
15.权利要求1 14中任一项的重组锦鲤疱疹病毒，其包含BAC(细菌人工染色体)载 体序列。
16.权利要求1 15中任一项的重组锦鲤疱疹病毒，其中将BAC(细菌人工染色体)载 体序列插入锦鲤疱疹病毒基因组。
17.权利要求15或16的重组锦鲤疱疹病毒，其中从所述疱疹病毒基因组中切除BAC载 体序列，从而分别在所述疱疹病毒基因组中的切除位点或先前插入位点留下异源序列。
18.权利要求1 17中任一项的重组锦鲤疱疹病毒，其还包含异源序列或异源基因，优 选引发鲤春季病毒血症的棒状病毒的G糖蛋白。
19.鱼用疫苗用和/或预防卫生用DNA序列，其中所述DNA序列具有给予下列物种抵抗 由锦鲤疱疹病毒(KHV)或鲤疱疹病毒3 (CyHV-3)引发的疾病的免疫力的能力 鱼， 优选鲤类， 更优选鲤鱼(Cyprinus carpio)。
20.权利要求19的DNA序列，其还包含 眷异源序列或异源基因， 优选引发鲤春季病毒血症的棒状病毒的G糖蛋白。
21.载体，其包含锦鲤疱疹病毒基因组或其一部分。
22.权利要求21的载体，其中所述锦鲤疱疹病毒基因组 选自下列的至少一个基因有缺陷■胸苷激酶基因、■0RF12 推定的肿瘤坏死因子(TNF)受体基因、■0RF16 推定的G蛋白偶联受体(GPCR)基因、■0RF134 推定的白细胞介素-10同源基因、■0RF140 推定的胸苷酸激酶基因、或 ■它们的任何组合， 优选下列基因有缺陷 ■胸苷激酶基因和/或 ■ 0RF140 推定的胸苷酸激酶基因， 更优选所述两个基因都有缺陷。
23.权利要求21或22的载体，其还包含 眷异源序列或异源基因， 优选引发鲤春季病毒血症的棒状病毒的G糖蛋白。
24.权利要求21 23中任一项的载体，其还包含BAC载体序列。
25.细胞，其包含 权利要求1 18中任一项的重组锦鲤疱疹病毒、或 权利要求19或20的DNA序列、或 权利要求21 24中任一项的载体。
26.权利要求25的细胞，其具有保藏号LMBP5658。
27.由权利要求26的细胞生产的病毒。
28.生产重组锦鲤疱疹病毒(KHV)或鲤疱疹病毒3(CyHV-3)的感染性颗粒的方法，其包 括下列步骤 将下列重组锦鲤疱疹病毒(KHV)基因组或重组鲤疱疹病毒3 (CyHV-3)基因组中的任 何一种导入允许真核细胞(a)含有细菌人工染色体(BAC)载体序列的重组锦鲤疱疹病毒(KHV)或重组鲤疱疹病 毒3 (CyHV-3)基因组；(b)重组锦鲤疱疹病毒(KHV)或重组鲤疱疹病毒3(CyHV-3)基因组，其中从(a)的构建 体中切除了细菌人工染色体(BAC)载体序列；及 培养宿主细胞，以生产重组锦鲤疱疹病毒(KHV)或重组鲤疱疹病毒3 (CyHV-3)。
29.通过权利要求28的方法生产的感染性颗粒。
30.保藏号为LMBP6581CB的锦鲤疱疹病毒(KHV)或鲤疱疹病毒3(CyHV-3)、或其衍生物
31.疫苗，其用于预防和/或治疗由锦鲤疱疹病毒(KHV)或鲤疱疹病毒3(CyHV-3)引发 的疾病。
32.权力要求28的疫苗，其 包含■权利要求1 18中任一项的重组锦鲤疱疹病毒、或 ■权利要求19或20的DNA序列、或 ■权利要求21 24中任一项的载体或 ■权利要求29的感染性颗粒，或 包含保藏号为LMBP6581CB的锦鲤疱疹病毒(KHV)或(KHV)或鲤疱疹病毒 3 (CyHV-3)、或其衍生物。
33.下列物质用于生产预防和/或治疗由锦鲤疱疹病毒(KHV)或鲤疱疹病毒 3 (CyHV-3)引发的疾病的药物/疫苗中的用途 权利要求1 18中任一项的重组锦鲤疱疹病毒、或 权利要求19或20的DNA序列、或 权利要求21 24中任一项的载体或 权利要求29的感染性颗粒、或 保藏号为LMBP6581CB的锦鲤疱疹病毒(KHV)或CyHV_3、或其衍生物。
34.预防和/或治疗由锦鲤疱疹病毒(KHV)或鲤疱疹病毒3(CyHV-3)引发的疾病的方 法，其包括将治疗有效量的下列物质 权利要求1 18中任一项的重组锦鲤疱疹病毒、或 权利要求19或20的DNA序列、或 权利要求21 24中任一项的载体或 权利要求29的感染性颗粒，或 保藏号为LMBP6581CB的锦鲤疱疹病毒(KHV)或CyHV_3，或其衍生物导入到下列物种中 鱼， 优选鲤类， 更优选普通鲤鱼或锦鲤个体。
35.疫苗，其用于预防和/或治疗由引发鲤春季病毒血症的棒状病毒引发的疾病，所述 疫苗包含 权利要求18的重组锦鲤疱疹病毒、或 权利要求20的DNA序列或 权利要求23的载体。
36.重组锦鲤疱疹病毒(KHV)或鲤疱疹病毒3(CyHV-3)，其胸苷激酶基因有缺陷。
37.重组锦鲤疱疹病毒(KHV)或鲤疱疹病毒3(CyHV-3)，其0RF140 推定的胸苷酸激酶 基因有缺陷。
38.重组锦鲤疱疹病毒(KHV)或鲤疱疹病毒3(CyHV-3)，其下列基因有缺陷 胸苷激酶基因和 0RF140 推定的胸苷酸激酶基因。
39.下列物质作为载体的用途 权利要求1 18、36 38中任一项的重组锦鲤疱疹病毒、或 权利要求19或20的DNA序列、或 权利要求21 24中任一项的载体，以将目的多核苷酸或目的基因转移入眷鲤(鲤鱼(Cyprinus carpio))或源自其的细胞，或眷非鲤(鲤鱼(Cyprinus carpio))鱼类或源自其的细胞。
全文摘要
本发明涉及重组锦鲤疱疹病毒(KHV)或鲤疱疹病毒3(CyHV-3)，其在下列物种中具有免疫原性鱼，优选鲤类，更优选鲤鱼(Cyprinus carpio)；疫苗，用于预防和/或治疗由重组锦鲤疱疹病毒(KHV)或CyHV-3引发的疾病。将5种重组疱疹病毒用于给予下列物种抵抗由锦鲤疱疹病毒(KHV)或鲤疱疹病毒3(CyHV-3)引发的疾病的免疫力鱼，优选鲤类，更优选鲤鱼(Cyprinus carpio)。
文档编号C12N15/85GK101820905SQ200880104727
公开日2010年9月1日 申请日期2008年8月26日 优先权日2007年8月28日
发明者A·梵德普拉斯奇恩, B·考斯特斯, F·莱弗里格 申请人:列日大学