专利名称：：对于有机介质中的亲水性底物具有高耐受性的改性的固定化酶的利记博彩app
技术领域：
：本发明涉及固定于固体载体上的改性的界面酶，其中，所述酶为疏水性微环境所包围，由此可避免在亲水性试剂、底物和/或反应产物存在下失活和/或聚集。本发明的改性的界面酶可以通过被覆有共价结合的脂质基团而得到保护。所述载体可以通过吸附于官能团上或通过与官能团共价结合而能够结合所述酶。更具体而言，所述载体可以是有机的，也可以是无机的，并且优选地选自由如二氧化硅类或氧化铝类载体等无机载体和如聚合物类载体等有机载体组成的组，其中所述载体可以含有离子基团和如环氧基或醛基等活性官能团，或者所述载体为离子交换树脂。所述脂质环氧化物可选自脂肪酸、脂肪酸烷基酯、糖脂肪酸酯、中链和长链烷基糖苷、磷脂、聚乙二醇衍生物和季铵盐。在另一实施方式中，本发明的改性的界面酶通过固定在提供疏水性微环境的疏水性固体载体上或埋入所述载体中而得到保护。所述酶可以是脂肪酶、酯酶或磷脂酶。更具体而言，所述酶可以是南极假丝酵母(Candidaantarctica)、刍皮褶假丝酵母(Candidarugosa)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)、假单胞菌(Pseudomonassp.)、雪白根霉(Rhizopusniveus)、米黑毛霉(Mucormiehei)、爪哇毛霉(Mucorjavanicus)、米根霉(Rhizopusoryzae)、黑曲霉(Aspergillusniger)、卡门禾白青霉(Penicilliumcamembertii)、产碱杆菌(Alcaligenessp.)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderiasp.)、疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosa)、粘稠色杆菌(Chromobacteriumviscosum)、木瓜籽和胰酶中的任何一种。另一方面，本发明涉及制备固定于不溶性载体上的改性的界面酶的方法，所述酶可避免在亲水性试剂、底物和/或反应产物存在下失活和/或聚集，所述方法包括下列步骤(a)提供由水性缓冲溶液和至少一种含有脂质环氧化物的有机溶剂组成的体系；(b)将所述界面酶与步骤(a)所提供的双溶剂体系混合；(c)将所述载体加入到步骤(b)的混合物中并进行混合；(d)从步骤(c)所获得的混合物中分离出固定于所述载体上的界面酶。在一个实施方式中，所述载体为多孔载体，其可以是有机或无机的，优选地选自由多孔无机载体(如二氧化硅类或氧化铝类载体)和有机载体(如聚合物类载体)组成的组，其中所述载体可以可选地含有如环氧基或醛基等活性官能团，或者离子基团。在另一实施方式中，所述有机溶剂选自烷类(如辛烷)、醚类(如二异丙醚)、醇类(如正辛醇)、醛类(如癸醛)和酮类(如2-辛酮)以及它们的任何混合物。在又一实施方式中，所述脂质环氧化物选自脂肪酸、脂肪酸甲酯、糖脂肪酸酯、中链和长链烷基糖苷、磷脂、聚乙二醇衍生物和季铵盐。另一方面，本发明提供了制备固定于固体载体上的改性的界面酶的方法，其中，所述酶为疏水性微环境所包围，由此可避免在亲水性底物和/或反应产物存在下失活和/或聚集，所述方法包括下列步骤(a)提供由水性缓冲溶液和至少一种含有脂质环氧化物，特别是脂肪酸环氧化物或甘油三酯环氧化物的有机溶剂组成的双相体系；(b)将所述界面酶与步骤(a)所提供的具有大量过量的环氧化物的双相体系混合，以使酶的亲核性表面反应基，特别是氨基，与环氧基反应，制造共价地被覆有脂肪酸或被覆有甘油三酯的酶(图1);(c)将所述载体加入到步骤(b)的混合物中并进行混合；(d)从步骤(c)所获得的混合物中分离出固定于所述载体上的脂质_界面酶复合物。在与酶双相溶液混合之前，可选地洗涤所述载体以除去盐和有机物。在本发明的此方法中，不溶性载体通过物理吸附或通过共价结合于官能团上而能够结合界面酶。载体优选为多孔载体，其可以是有机或无机的，优选地选自由多孔无机载体(如二氧化硅类或氧化铝类载体)和有机载体(如聚合物类载体)组成的组，其中所述载体可以可选地含有如环氧基或醛基等活性官能团，或者离子基团。据称，本发明的环氧化方法的步骤(a)中所用的有机溶剂可以为但不限于烷类(如辛烷)、醇类(如正辛醇)、醛类(如癸醛)、醚类(如二异丙醚)或酮类(如2-辛酮)以及它们的任何混合物。通过本发明的方法制备的界面酶优选为脂肪酶、酯酶或磷脂酶。具体的非限制性实例为源自南极假丝酵母(Candidaantarctica)、皱褶假丝酵母(Candidarugosa)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)、假单胞菌(Pseudomonassp.)、雪白根霉(Rhizopusniveus)、爪哇毛霉(Mucorjavanicus)、米黑毛霉(Mucormiehei)、米根霉(Rhizopusoryzae)、黑曲毒(Aspergillusniger)、卡门禾白青毒(Penicilliumcamembertii)、产碱杆菌(Alcaligenessp.)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderiasp.)、疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosa)、粘稠色杆菌(Chromobacteriumviscosum)、木瓜禾子禾口姨酶的酶。固定于固体多孔载体上的本发明的界面酶锁定在其活性构象，通过共价地被覆有大量所述脂质的分子(通过其初始的环氧基团与酶的表面官能团结合)而被改性，并且特征在于对于如短链醇和短链脂肪酸等亲水性底物的高耐受性。本发明的环氧化方法中所用的载体通过物理吸附于官能团上或通过共价结合于官能团而能够结合所述脂质被覆的酶，并可以是有机载体或无机载体，优选地选自如二氧化硅类或氧化铝类载体等无机载体和如聚合物类载体等有机载体，并且所述载体可以含有离子基团和如环氧基或醛基等活性官能团，或者所述载体可以为离子交换树脂。在本发明的此脂质被覆的酶的制备中，脂质优选但不限于游离脂肪酸或脂肪酸烷基酯环氧化物、糖脂肪酸酯环氧化物、中链和长链烷基糖苷、磷脂环氧化物、聚乙二醇环氧化物衍生物或季铵盐环氧化物。不饱和脂质底物的环氧化物通常如下获得通过化学或生化催化(例如在过氧化氢存在下利用脂肪酶)将至少一个双键氧化为环氧基团。在另一实施方式中，本发明涉及一种制备固定于固体载体上的改性的界面酶的方法，其中，所述酶为疏水性微环境所包围，由此可以避免在亲水性底物和/或反应产物存在下失活和/或聚集，所述方法包括以下步骤(a)提供(i)由水性缓冲剂组成的体系或(ii)由水性缓冲剂和有机溶剂组成的双相体系；(b)向任一所述体系(i)或(ii)中加入疏水性聚合物载体；(c)向步骤(b)所获得的混合物中加入所述界面酶并进行混合；和(d)从步骤(c)所获得的混合物中分离出固定在所述疏水性载体上的界面酶。在此方法中，所述有机溶剂可以为但不限于正辛烷、异辛烷、正己烷、正辛醇二异丙基醚和油类甘油三酯。疏水性聚合物载体可以为但不限于疏水性脂肪族丙烯酸类交联聚合物或疏水性芳香族交联聚合物，其实例分别为AmberliteKXAD7HP和AmberliteKXAD1600。在本发明的所有方法中，酶可以是脂肪酶、酯酶或磷脂酶，例如南极假丝酵母(Candidaantarctica)、刍皮褶假丝酵母(Candidarugosa)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)、米黑毛霉(Mucormiehei)、假单胞菌(Pseudomonassp.)、雪白根霉(Rhizopusniveus)、爪哇毛霉(Mucorjavanicus)、米根霉(Rhizopusoryzae)、黑曲霉(Aspergillusniger)、卡门禾白青霉(Penicilliumcamembertii)、产碱杆菌(Alcaligenessp.)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderiasp.)、疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosa)、粘稠色杆菌(Chromobacteriumviscosum)、木瓜禾子禾口胰酶。本发明的改性的固定化疏水化酶或通过本发明的方法制备的改性的固定化疏水化酶可以有利地用于制造脂肪酸烷基酯，所述脂肪酸烷基酯可用作生物柴油或用作表面活性成分制备用中间体。由此，本文提供了制备结构化的脂质的酶促方法，所述方法包括以下步骤在本发明的改性的固定化酶或通过本发明的方法制备的改性的固定化酶存在下，将如游离脂肪酸、甘油三酯、脂肪酸酯、偏甘油酯、磷脂或其它脂肪酸衍生物等脂肪酸源与如甲醇等醇反应。在另一实施方式中，本发明涉及制备脂肪酸短链烷基酯、优选为脂肪酸甲酯(生物柴油)的方法，所述方法包括逐步将甲醇加入到由含有本发明的脂肪酶或者通过本发明的方法制备的脂肪酶的植物油、动物油、海藻油或鱼油或者至少两种上述油的混合物所获得的脂肪酸源中，并使反应在适当条件下进行，直到所述脂肪酰基或脂肪酸被转化为脂肪酸甲酯。在此方法中，植物油可以为但不限于大豆油、芥花籽油、油菜籽油、橄榄油、蓖麻油、棕榈油、葵花籽油、花生油、棉花籽油、麻疯果油、废烹调油或源自非食用植物源的任何油类甘油三酯。下面将参照以下附图更详细地描述本发明。图1:使用脂肪酸环氧化物共价被覆酶的方法的示意性说明。图2A:在缓冲溶液中，本发明的固定化米黑毛霉(M.miehei)脂肪酶的水解活性与固定化及表面活性剂或脂质非共价被覆的同样的酶的水解活性的对比。图2B:在缓冲溶液中，本发明的固定化M.miehei脂肪酶的合成活性与固定化及表面活性剂或脂质非共价被覆的同样的酶的水解活性的对比。图3A:在丙酮中，本发明的固定化M.miehei脂肪酶的水解活性与固定化及表面活性剂或脂质非共价被覆的同样的酶的水解活性的对比。图3B:在丙酮中，本发明的固定化M.miehei脂肪酶的合成活性与固定化及表面活性剂或脂质非共价被覆的同样的酶的水解活性的对比。图4A:在正己烷中，本发明的固定化M.miehei脂肪酶的水解活性与固定化及表面活性剂或脂质非共价被覆的同样的酶的水解活性的对比。图4B:在正己烷中，本发明的固定化M.miehei脂肪酶的合成活性与固定化及表面活性剂或脂质非共价被覆的同样的酶的水解活性的对比。图5:在连续型酯交换反应中，利用固定于使用同一批生物催化剂的各种基质上的疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosa)脂肪酶时转化为脂肪酸甲酯的反应转化8率(％)。反应条件将大豆油(2.5g)、甲醇(0.3g，分为三份间隔1小时加入)和固定化脂肪酶(250mg)在3(TC于恒温摇动器中混合4小时。图6:在连续型酯交换反应中，利用固定于使用同一批生物催化剂的各种基质上的南极假丝酵母B(CandidaAntarcticaB)脂肪酶时转化为脂肪酸甲酯的反应转化率(%)。反应条件如图5中所示。图7:在连续型酯交换反应中，利用固定于使用同一批生物催化剂的各种基质上的洋葱假单胞菌(Pseudomonasc印acia)脂肪酶时转化为脂肪酸甲酯的反应转化率(％)。反应条件如图5中所示。图8:在连续型酯交换反应中，利用固定于使用同一批生物催化剂的各种基质上的产碱杆菌(Alcaligenessp.)脂肪酶时转化为脂肪酸甲酯的反应转化率(％)。反应条件如图5中所示。具体实施例方式为了搜寻一种用于制备高度活性并且稳定的固定化界面酶、特别是对于亲水性底物(如短链醇和短链脂肪酸)具有高耐受性的脂肪酶和磷脂酶的新方法，本发明人发现，酶的活性部位附近的酯交换反应介质的疏水性微环境可作为增强脂肪酶的活性和提高其对亲水性短链醇和酸以及反应混合物中可能存在的其它亲水性试剂的耐受性的手段。由此本发明人开发出不同的酶制品，其中酶固定于不溶性基质上并被赋予了疏水性。如下所示，所述酶既可以例如通过附着亲脂性残基(例如用脂质环氧化物环氧化)而直接被赋予疏水性，也可以通过固定于疏水性基质上而被赋予疏水性，所述疏水性基质提供包围酶或埋入酶的疏水性微环境。本发明证明，酶的活性部位附近的疏水性微环境起到了缓冲区的作用，所述缓冲区能够防止酶暴露于抑制浓度的具有亲水性部分的底物和产物。为酶提供的疏水性微环境负责控制非抑制浓度范围的短链醇进入酶的活性部位，并负责将酶的活性部位附近形成的亲水性反应产物除至反应介质中。因此，根据本发明的一个方面，疏水性固定化酶可通过两步技术制备，所述技术基本上如下步骤1:通过将界面酶分子与由水相和含有脂质环氧化物的有机相组成的双相体系的脂质环氧化物反应，强迫所有界面酶分子采用其活性构象(参见图1)。脂质环氧化物大量过量地存在，因此每个酶分子都共价地被覆有大量的脂质分子。步骤2:将合适的载体加入到已经含有所述共价被覆的酶的双相体系中。在这些条件下，位于双相界面处的共价地被覆有脂质残基或复合物的酶分子，通过简单物理吸附、与含有官能团(如环氧基或醛基等)的活化树脂共价结合或通过在离子交换树脂上的吸附，可以轻易地固定到所述载体上。在本发明的活性改性的固定化界面酶的制备中采用了该两步技术。根据这一方面，本发明涉及一种制备稳定、高度活性的改性的固定化界面酶、特别是脂肪酶、酯酶和磷脂酶的方法，其中，提供由水性缓冲溶液和至少一种含有脂质环氧化物的有机溶剂组成的双相体系；将所述界面酶与大量过量的所述双相体系混合；将固体载体加入到所述混合物中；并且分离出固定于所述载体上的脂质共价被覆的界面酶。固体载体优选为多孔载体，其可以是有机或无机的，特别是选自由多孔无机载体9(如二氧化硅类或氧化铝类载体)和有机载体(如聚合物类载体)组成的组，其中所述载体可以可选地含有如环氧基或醛基等活性官能团，或者离子基团。下面的实施例、特别是表1中给出了一些具体载体。双相体系由适当的水性缓冲剂和有机溶剂制备。有机溶剂可以为但不限于烷类(如辛烷)、醚类(如二异丙基醚)、醇类(如正辛醇)、醛类(如癸醛)、酮类(如2-辛酮)以及它们的任何混合物。本发明的固定化酶或通过本发明的上述环氧化方法制备的固定化酶非常具有活性、特别稳定并对如短链醇和短链脂肪酸等亲水性底物具有高耐受性。即使在10次反应循环后仍保留有约90%的活性。该稳定性具有重大的经济意义。另一方面，本发明涉及脂肪酶疏水化的备选方法，所述方法避免了对环氧化和使用脂质部分被覆酶的需要。物理附着于疏水性微环境的固定化酶通过将疏水性多孔聚合物基质与水溶液或与含有不同脂肪酶的水-有机溶剂双层[亦称为双相]体系接触而制得。在用于制造生物柴油和甘油的油类甘油三酯与甲醇之间的酯交换反应中测试如此制造的固定化酶，该酯交换反应用作本发明中的反应模型。不受任何理论的限制，结果表明，微环境的疏水性可造成酶分子附近的亲水性物质的浓度降低。这些亲水性物质可能是反应中所使用的底物，也可能是反应所形成的产物。这种"疏水化"生物催化剂确保了到达酶附近的亲水性短链醇和酸反应物的浓度受到控制，和/或可迅速除去酶分子附近形成的任何亲水性物质。作为主要结果，通过控制到达固定化酶附近的反应物的浓度及快速除去一旦反应形成的亲水性产物，酶分子得以免受疏水性底物和产物的影响。使用四种不同的脂肪酶对上述说法进行测试，其中，每种脂肪酶均独立地固定于四种疏水性不同的载体上，如实施例5所示。在另一实施方式中，本发明涉及制备脂肪酸短链烷基酯、特别是脂肪酸甲酯(生物柴油)的方法。一般而言，在该方法中，首先逐步将甲醇加入到如植物油、动物油、海藻油、鱼油或源自真菌的任何油或者至少两种上述油的混合物等脂肪酸源中。将固定于共价地被覆有脂质的固体载体上的改性的脂肪酶(通过例如本发明的方法而制备)或本发明的固定于疏水性基质上的脂肪酶加入到甲醇/脂肪酸源混合物中，并使反应进行，直至脂肪酸源转化为脂肪酸甲酯。在本申请的上下文中，术语"载体"、"基质"、"吸附剂"同义，可互换使用。如本文所公开和说明，应该理解本发明不限于本文所公开的特定的实例、方法步骤和材料，因为这些方法步骤和材料在某种程度上可以变化。还应该理解本文所用的术语仅仅是用于说明具体实施方式的目的而不是意在限制，因为本发明的范围仅受所附权利要求及其等同物的限制。必须注意的是，如本说明书和所附权利要求所用，"a"、"an"和"the"等单数形式包括复数的指代物，除非内容中另有明确说明。在整个本说明书和后附权利要求书中，除非上下文另有规定，否则词语"包括"和"包含"将被理解为意味着包含所说明的整体或步骤或者多个整体或多个步骤的组，但不排除任何其它的整体或步骤或者多个整体或多个步骤的组。下列实施例是本发明人在实施本发明的各方面时采用的技术的代表。应该理解的是，尽管这些技术是用于本发明的实施的优选实施方式的示例，然而本领域技术人员根据本公开内容将会意识到可以在不背离本发明的预期范围的情况下进行各种修改。实施例实施例1固定化脂肪酶(LipozymeTL)的制备将源自疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosa)的脂肪酶(lml的LipozymeTLlOOL，Novozymes，丹麦)混合到由lml磷酸盐缓冲剂(0.05M，pH6.5)和10ml含有脂质环氧化物的正己烷组成的双溶剂体系中。搅拌该混合物48小时。将载体(lg)加入该体系中并搅拌该混合物8小时。滤出含有改性的固定化酶的载体并在干燥器中干燥过夜，从而得到高度活性的脂质共价被覆的固定化脂肪酶。表l显示了固定于不同载体上的LipozymeTL100L的相对酯交换活性。反应通过将固定化脂肪酶(0.2g)加入到大豆油(2.5g)和甲醇(0.3g)中来进行。将反应体系在3(TC磁力搅拌或通过振摇而混合。通过测量在上述条件下反应1小时后生成的脂肪酸甲酯来确定反应速率。表1:将不同的脂肪酸环氧化物改性的Lipozyme用于大豆油甘油三酯的酯交换以获得脂肪酸甲酯(FAME)时的反应速率。反应条件将橄榄油(2.5g)和甲醇(0.2g)与改性的固定于不同载体上的脂肪酶TL100L(0.2g)混合1小时。将反应混合物以300rpm在30。C振摇。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>载体类型反应速率(微摩尔FAME/分钟克生物催化剂)DuoliteC467(Rohm&Haas)6AmberlystA-21(RohmMfeas)10Dowexmonosphere77(DOW，USA)13Do腦optiporeL493歸，USA;i12DowstyreneDVB歸，USA)18MTODo腦optiporeSD-2歸，USA)10Do腦MAC-39AmberliteFPA53(Rohm組aas)11AmberliteFPC22H(Rohm&Haas)10AmberliteFPA40C1(Rohm組aas)2AmberlitelRC50(Rohm&Haas)7PurolireA109(Purolite，USA)12实施例2固定化脂肪酶的制备使用不同的脂肪酶(lOOmg)和使用甘油三酯环氧化物重复实施例1的固定化程序。上述条件下生成脂肪酸甲酯的反应速率如表2中所示。表2:将不同的脂肪酸环氧化物改性的脂肪酶用于大豆油甘油三酯的酯交换以获得脂肪酸甲酯(FAME)时的反应速率。反应条件将大豆油(2.5g)和甲醇(0.3g)与不同的共价地被覆有甘油三酯环氧化物并固定于AmberliteXAD4上的脂肪酶(0.2g)混合1小时。将反应混合物以300rpm在30°C振摇。载体类型反应速率(微摩尔FAME/分钟克生物催化剂)南极假丝酵母(C肌dickMiterctica)9.612载体类型反应速率(微摩尔FAME/分钟克生物催化剂)皱褶假丝酵母(Candidarugosa)7.7米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)12.5洋葱假单胞菌(Pseudomonascepacia)16.2卡门禾白青毒(PeniciIliumcamembertii)4.2产碱杆菌(Alcaligenessp.)12.3雪白根霉(Rhizopusniveus)3.4爪哇毛霉(Mucorjavanicus)12.3米根霉(Rhizopusoryzae)14.2黑曲霉(Aspergillusniger)6.3伯克霍尔德氏菌(Burkholderiasp.)12.1疏绵状嗜热丝包菌(Thermomyceslanuginosa)17.1粘稠色杆菌(Chromobacteriumviscosum)15.1实施例3用于制备脂肪酸甲酯(生物柴油)的固定化脂肪酶使用AmberliteXAD8或Celite(硅藻土，粉末)作为载体，缓冲剂(对照)正己烷或丙酮(Ac)作为有机溶剂，按照实施例1的程序制备固定化改性的M.miehei脂肪酶制PIPRo将这些制品用于脂肪酸甲酯(生物柴油)的制备。通过加入固定化脂肪酶(lOOmg)并在3(TC振摇反应介质6小时而引发反应。将不同的酶制品[酶共价地被覆有油酸的缓冲剂_环氧化物-OA和酶共价地被覆有油(甘油三酯，例如三油酸甘油酯)的缓冲剂_环氧化物_油]的水解活性和合成活性与下述其它酶制品(未共价地被覆有脂质)的活性相比较酶简单地固定于载体上的缓冲剂(对照)；载体固定化酶被覆有脂肪酸的缓冲剂-油酸(缓冲剂-0A);载体固定化酶被覆有脱水山梨醇单硬脂酸酯的缓冲剂-SMO。结果如图2图4中所示。如我们所观察到的，本发明的共价地被覆有脂质成分13的酶的水解活性和合成活性相当显著地高于其它酶制品的活性。另外，即使在10次以上的反应循环后仍保留了酶的大部分活性(数据未示出)。因此，本发明的环氧化改性的酶制品表现出高活性和提高的稳定性。实施例4脂肪酶在缓冲剂或双相体系中的固定化在室温下将脂肪酶[3000单位疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomycesla皿ginosa)脂肪酶、南极假丝酵母(Candidaantarctica)脂肪酶B(二者皆来自Novozymes，丹麦)、洋葱假单胞菌(Pseudomonasc印acia)月旨肪酶(AmanoEnzymeInc.，日本)或者产碱杆菌(Alcaligenessp.)脂肪酶(MeitoSangyo，日本)]在含有聚合物载体(lg)的缓冲溶液(10ml，pH=7)中混合8小时。滤出固定化酶并在干燥器中于二氧化硅上干燥。在由相同体积的缓冲溶液和有机溶剂(例如异辛烷)组成的双相体系中执行相同的程序。使用了全部由美国Rohm&Haas制造的以下载体-AmberliteXAD1600，定义为疏水性吸附剂；-AmberliteXAD761，定义为亲水性吸附剂；-AmberliteXAD7HP，定义为极性和非极性吸附剂；禾口-AmberliteIRA_958，定义为极性阴离子交换树脂。实施例5实施例4的固定化脂肪酶在生物柴油制造中的应用利用油类甘油三酯和甲醇的酯交换来评价实施例4中制备的固定化脂肪酶在生物柴油及作为副产物的甘油的制造中的活性。通过向磁力搅拌的含有甲醇(0.3g，分为3份在4小时内每间隔1小时加入1份)的大豆油(2.5g)中加入10重量％的固定化脂肪酶来引发反应。图58中显示了在使用同一批生物催化剂同时于4小时后交换反应介质时，固定于不同基质的不同脂肪酶的将油类转化为脂肪酸甲酯的转化率(％)。与其它相同但固定于其它类型载体上的酶相比，固定于如AmberliteKXAD1600等疏水性载体(吸附剂)上的脂肪酶在多得多的批数的反复应用中保持了其酯交换活性。此外，还可以清楚地看到，对于这类反应，所有固定于亲水性载体上的脂肪酶表现出了较差的酯交换活性并且连续批次的反复应用性较差。还注意到，固定于如AmberliteKXAD761和AmberliteKIRA-958等亲水性载体上的脂肪酶形成了生物催化剂的聚集体，其上具有饱和的反应所形成的亲水性产物，即甘油。由于形成的产物的累积，同时由于在固定化酶附近的高浓度的甲醇，生物催化剂表现出较低的活性和较少的反复应用次数。相反，固定于如AmberliteKXAD1600和AmberliteKXAD7HP等疏水性载体上的脂肪酶、特别是疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosa)脂肪酶和洋葱假单胞菌(Pseudomonasc印acia)脂肪酶获得了较高的酯交换活性，并且在使用同一批生物催化剂时于超过50次的反复循环中保持了其酯交换活性。1权利要求一种固定于固体载体上的改性的界面酶，其中，所述酶为疏水性微环境所包围，由此避免在亲水性试剂、底物和/或反应产物存在下失活和/或聚集。2.如权利要求1所述的改性的界面酶，其中，所述酶共价地被覆有脂质基团。3.如权利要求2所述的改性的界面酶，其中，所述载体通过吸附或通过共价结合于官能团上而能够结合所述酶。4.如权利要求2和3的任一项所述的改性的界面酶，其中，所述载体为有机的或无机的，优选地选自由如二氧化硅类或氧化铝类载体这样的无机载体和如聚合物类载体这样的有机载体组成的组，其中所述载体可以含有离子基团和如环氧基或醛基这样的活性官能团，或者所述载体为离子交换树脂。5.如权利要求24的任一项所述的改性的界面酶，其中，所述脂质环氧化物选自脂肪酸、脂肪酸烷基酯、糖脂肪酸酯、中链和长链烷基糖苷、磷脂、聚乙二醇衍生物和季铵盐。6.如权利要求1所述的改性的界面酶，其中，所述固体载体为疏水性固体载体。7.如权利要求16的任一项所述的酶，所述酶为脂肪酶、酯酶或磷脂酶。8.如权利要求7所述的酶，其中，所述酶选自由南极假丝酵母(Candidaantarctica)、皱褶假丝酵母(Candidarugosa)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)、假单胞菌(Pseudomonassp.)、雪白根霉(Rhizopusniveus)、米黑毛霉(Mucormiehei)、爪哇毛霉(Mucorjavanicus)、米根霉(Rhizopusoryzae)、黑曲霉(Aspergillusniger)、卡门禾白青毒(Penicilliumcamembertii)、产减杆菌(Alcaligenessp.)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderiasp.)、疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosa)、粘稠色杆菌(Chromobacteriumviscosum)、木瓜籽和胰酶组成的组。9.一种用于制备固定于不溶性载体上的改性的界面酶的方法，所述方法包括以下步骤(a)提供由水性缓冲溶液和至少一种含有脂质环氧化物的有机溶剂组成的体系；(b)将所述界面酶与步骤(a)所提供的双溶剂体系混合；(c)将所述载体加入到步骤(b)的混合物中并进行混合；(d)从步骤(c)所获得的混合物中分离出固定于所述载体上的所述界面酶。10.如权利要求9所述的方法，其中，所述载体为有机多孔载体或无机多孔载体，优选地选自由如二氧化硅类或氧化铝类载体这样的多孔无机载体和如聚合物类载体这样的有机载体组成的组，其中所述载体可选地含有离子基团或者如环氧基或醛基这样的活性官能团。11.如权利要求9和10的任一项所述的方法，其中，所述有机溶剂选自烷类(如辛烷)、醚类(如二异丙醚)、醇类(如正辛醇)、醛类(如癸醛)和酮类(如2-辛酮)以及它们的任何混合物。12.如权利要求911的任一项所述的方法，其中，所述脂质环氧化物选自脂肪酸、脂肪酸甲酯、糖脂肪酸酯、中链和长链烷基糖苷、磷脂、聚乙二醇衍生物和季铵盐。13.—种用于制备固定于固体载体上的改性的界面酶的方法，其中，所述酶为疏水性微环境所包围，由此避免在亲水性底物和/或反应产物存在下失活和/或聚集，所述方法包括下列步骤(a)提供(i)由水性缓冲剂组成的体系或(ii)由水性缓冲剂和有机溶剂组成的双相体系；(b)向任一所述体系(i)或(ii)中加入疏水性聚合物载体；(c)向步骤(b)所获得的混合物中加入所述界面酶并进行混合；禾口(d)从步骤(c)所获得的混合物中分离出固定于所述疏水性载体上的所述界面酶。14.如权利要求13所述的方法，其中，所述有机溶剂选自正辛烷、异辛烷、正己烷、正辛醇二异丙基醚和油类甘油三酯。15.如权利要求13和14的任一项所述的方法，其中，所述疏水性聚合物载体选自疏水性脂肪族丙烯酸类交联聚合物或疏水性芳香族交联聚合物的组，二者分别为如Amberlite^XAD7HP和AmberliteKXAD1600。16.如权利要求915的任一项所述的方法，其中，所述酶为脂肪酶、酯酶或磷脂酶。17.如权利要求16所述的方法，其中，所述酶选自由南极假丝酵母(Candidaantarctica)、刍皮褶假丝酵母(Candidarugosa)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)、米黑毛霉(Mucormiehei)、假单胞菌Pseudomonassp.)、雪白根霉(Rhizopusniveus)、爪哇毛霉(Mucorjavanicus)、米根霉(Rhizopusoryzae)、黑曲霉(Aspergillusniger)、卡门柏青霉(Penicilliumcamembertii)、产碱杆菌(Alcaligenessp.)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderiasp.)、疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosa)、粘稠色杆菌(Chromobacteriumviscosum)、木瓜籽和胰酶组成的组。18.如权利要求18的任一项所述的改性的固定化酶，或者通过如权利要求917的任一项所述的方法制备的改性的固定化酶，其用于制造脂肪酸烷基酯，所述脂肪酸烷基酯用作生物柴油或用作表面活性成分制备用中间体。19.一种用于制备脂肪酸短链烷基酯、优选脂肪酸甲酯(生物柴油)的方法，所述方法包括以下步骤逐步将甲醇加入到植物油、动物油、海藻油或鱼油或者至少两种这些油的混合物中，所述植物油、动物油、海藻油或鱼油或者至少两种这些油的混合物含有权利要求18的任一项所述的脂肪酶或者通过权利要求917的任一项所述的方法制备的脂肪酶，并使反应在适当条件下进行，直到所述油类甘油三酯被转化为脂肪酸甲酯。20.如权利要求19所述的方法，其中，所述植物油为大豆油、芥花籽油、油菜籽油、橄榄油、棕榈油、葵花籽油、花生油、棉花籽油、废烹调油或源自非食用植物源的任何油类甘油三酯。全文摘要本发明公开了固定于固体载体上的改性的界面酶，特别是脂肪酶和磷脂酶的制备，其中，所述酶为疏水性微环境所包围，由此避免在亲水性试剂、底物和/或反应产物存在下失活和/或聚集。通过与被覆酶的脂质基团共价结合或者通过固定或埋入于疏水性固体载体中，酶可以得到保护。本发明还公开了经疏水性保护的酶的制备方法。所述酶可以有效地应用在生物柴油的制备中。文档编号C12N9/20GK101790582SQ200880021830公开日2010年7月28日申请日期2008年5月7日优先权日2007年5月9日发明者苏卜希·巴舍尔申请人:转换生物柴油有限公司