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专利名称：结缔组织修复的利记博彩app
结締组织修复
本发明涉及新型的人干细胞，具体而言为关节软骨千细胞；由所述细胞衍生的细胞群；生产所述干细胞和所述干细胞群的方法；所述干细胞和细胞群在组织修复，具体而言为结締组织修复，更具体地说为关节修复中的用途；以及包含或含有所述干细胞或所述细胞群体的移植物。
背景技术：
关节软骨是无血管、无神经的，并且不具有淋巴管，而且与诸如肌肉之类的其他结締组织的代谢活性相比，关节软骨的代谢活性较低，但对于较大程度上依赖于糖酵解以得到能量的细胞而言，可以被认为具有活性的。此外，关节软骨还具有大量的细胞外基质，其依赖于这些细胞外基质来提供其特征性性质为低摩擦无痛关节的软骨。关节软骨的两种主要成分为高度特化的软骨细胞以及所述的基质，其中所述的软骨细胞是软骨所特有的，而所述的基质由复合物(其为蛋白聚糖、胶原和非胶原蛋白的相互连接的排列)构成(Buckwalter and Hunziker,1999)。
关节软骨在其深度方向可以分为4个主要的区域。这些区域分别为浅表区；过渡区；上部及浅层的辐射区；以及由关节的外表面直至深层软骨下骨骼的钙化软骨区。虽然具有所命名的区域，但是并不存在可以在各区域之间显现的"实际的"边界。在各区域中，具有生物力学和形态学的变化(Dowthwaite ef W， 2004)，这些变化包括在细胞形态学(大小和形状)、细胞包装、代谢活性和层的厚度方面的差异。此外，在各区域之间在基质组合物方面还具有差异，其中各种胶原、蛋白聚糖和非胶原蛋白质在种类和数量方法是变化的。
多数情况下，关节软骨只有几毫米厚，但是在诸如臀之类的大型关节中，关节软骨可以达到7腿。尽管关节软骨只有几毫米厚，但是其仍然能够抵抗压力，并表现出分配负栽、因而依次减小施加在软骨
下骨骼上的压力的能力(Buckwalter and Hunziker， 1999)。软骨细胞
正常的关节软骨包含一种类型的细胞，其为由细胞外基质包围的高度特化的软骨细胞(Buckwalter, 1998)。在多数情况下，除了在组织的大部分浅表部分之外，软骨细胞与其相邻的细胞是"通过细胞质分开的"(Archer and Francis-West, 2003),很少形成细胞-细胞间的接触。因此，各个软骨细胞完全由基质所包围，并且与基质自由作用。在关节软骨的各区域之间，软骨细胞在它们的形态学和代谢活性方面是不同的。通常，软骨细胞具有圆形的或多边形的形态学，不同之处在于在组织的边界处，软骨细胞可以表现为扁平的或盘状的，即在关节的关节表面上(Archer and Francis-West, 2003)。软骨细
胞的主要作用是使软骨复杂的细胞外基质得以保持，具体而言为可溶的、亲水性结构，例如透明质酸和聚集蛋白聚糖(Knudson， 2003)。在软骨细胞的细胞内，含有代谢活性细胞所具有典型的细胞器(Archerand Francis-West, 2003),这些细胞器在基质的合成、持续地进行合成以及将大的基质转换成体积比(volume ratio)方面起到重要的作用，主要由蛋白聚糖、粘多糖和胶原构成(Buckwalter and Hunziker,1999)。某些软骨细胞还包含可以检测基质中的力学变化的、短的突起或微绒毛。当这些突起或微绒毛直接延伸到基质中时，便可逸到上迷效果。胞质内细纤维、脂质、糖原和分泌小泡能够使软骨细胞与基质接触。由于成熟的软骨细胞具有球体的形态学，所以可以容易地将它们与其他细胞区别开。这些成熟的软骨细胞还具有交织成网络的大量的II型胶原，大量的累积的蛋白聚糖以及特定的非胶原蛋白，其中所述的网络形成了覆盖它们的细胞膜并与其结合的软骨基质(Buckwalter and Hunziker， 1999)。
区域浅表区
所述的浅表区(参见图2)是特别薄的，并且由两层构成。大多数的浅表层是非细胞的，并且由被称为发光层(lamina splendens )的无定形材料形成的薄且清澈的膜构成，其中所迷的膜位于一片细致紧密包装的II型胶原微纤维的上方(Buckwalter and Hunziker，1999)，并且主要包含润滑素(lubricin),更深的细胞层由被围绕在富含胶原的基质内的扁平且盘状的软骨细胞构成，该层与关节表面平行(Dowthwaite ef a/， 2003)。这些细胞合成了与深沉区域相比，富含胶原、纤连蛋白和水，而蛋白聚糖的含量较低的基质。
胶原纤维的致密层具有与表面平行的方向，并且提供了具有特征
性力学性质的软骨，其中所述的特征性力学性质包括高的抗张强度并且能够抵抗施加在其上的剪切力(Buckwalter and Hunziker, 1999)。胶原纤维的网络还可以使分子(例如分别为抗体和大型软骨分子)进入和移出软骨。
大量研究表明，关节软骨的表层区与组织形成和生长的调节有关。在我们试验室中的发育研究确定，关节软骨通过关节表面的外加生长而生长(Hayes e, a/ 2001)，并且这种生长方法使得待建立的异质组织的区域构造是不同的。这些研究还表明，这种生长是通过关节软骨表层区中的软骨细胞群体发生緩慢分裂、并且过渡区中的细胞群体发生更快速的分裂来驱动的(Hayes et al 2001)。这些观察结果不仅解释了关节软骨生长与区域变化的外加性质(appositional
nature)，还表明了特定关节软骨细胞祖细胞群在表层区.中的存在以及短暂扩增细胞群在过渡区中的存在。此外，已经发现所述的表层区由于表达多种生长因子及其受体而成为信号传导中心，其中所述的生长因子及其受体通过差别的基质合成而在动关节的形态形成中起到重要的作用(Dowthwaite a/， 2003)。此外，已经表明表层区在体内是关节软骨的外加生长的原因(Hayes W， 2001)，并且近来的体外研究表明关节软骨的表层区包含祖细胞群(Dowthwaite W a/， 20(M)。此外，美国专利2006/0239980教导了由人軟骨组织表层区得到的关节軟骨可以被酶消化，从而产生软骨细胞群，这些软骨细胞群通过培养而去分化形成软骨祖细胞组织。但是，在这些文献中没有关于该组织的表型稳定性的数据，并且没有断定或表明所述组织代表了经分离的干细胞，因此，这种去分化组织作为用于组织修复材料的可靠来源的用途是有疑问的。
过去，我们已经鉴定出了牛关节软骨的表层区中的软骨祖细胞群
(Dowthwaite et al 2004)。该细胞群是通过研究牛软骨细胞与纤连蛋白的差异性粘附而得到的。此外，软骨祖细胞以及其与纤连蛋白的粘附增大的特征还具有增加的集落形成效率。此外，当在卵内(/力oro)对软骨祖细胞群进行测定时，该细胞群在分化途径方面表现出可塑性。除了软骨以外，还将牛软骨祖细胞移植到各种小鸡结締组织系(例如腱和骨)中，并且移植的细胞表达特征性的组织标志物(例如I型胶原)，并且这些细胞定向为功能性的方式。
进来，我们扩展了之前的研究，并且惊奇地发现可以从整个深度的人软骨组织中分离人千细胞群。这与传统的知识是相对的，其中传统的知识教导我们，软骨的浅表或表层区负责组织生长和发育。
事实上，我们的试验表明，可以从软骨组织的中部以及表层区域中分离人干细胞群。
我们工作中的另一个令人惊奇的方面是这样的事实，即，我们的干细胞是由老化的人组织衍生得到的。老化的人软骨往往比正常的软骨更薄，并且代谢活性更低。
此外，我们发现，我们分离的人干细胞似乎是永生的，因为它们现在已经超过了 80代的群体倍增，并仍保持生活能力。这与我们之前分离到的、特征在于群体倍增为大约50代(此时，大量的端粒酶依赖性衰老的特征是明显的)的上述牛软骨祖细胞形成了对比。这些事实表明，我们的牛软骨祖细胞并非为千细胞。
与此截然不同的是，我们的干细胞表现出自我更新；这可通过连续的群体倍增来证明，为了将我们当前得到的80代的群体倍增数据引入本发明，必须记住，Hayflick的群体倍增数据为52。 LeonardHayflick在1965年观察到，细胞培养中进行分裂的细胞在死亡前分裂大约50次。具有持续再生新细胞能力的千细胞在内源有机体的整个寿命期存活。
此外，我们已经表明，当我们的这些人干细胞在70代的群体倍 增之后在可以进行团块培养的条件下进行培养时，这些人干细胞还能 够产生软骨。
因此可以断定，考虑到提供新的结締组织，我们的经分离的人干 细胞具有发生大量扩增的能力，并且事实上，扩增的量可以使得人们 能够使用这种单一的干细胞源来替代完整的一块或一部分人组织，例 如软骨。
此外，我们的新型干细胞表现出表型可塑性，这是因为这些细胞 可以功能性地移植到各种类型的结締组织中，从而产生不同种类的结 締组织。
我们的新型组织的分离涉及对独特组织特征的开发。该特征是表 达如下蛋白质序列，该蛋白质序列可以以特别高的亲合力与纤连蛋白 中的RGD序列选择性地结合。纤连蛋白中的RGD序列包括氨基酸精氨 酸、甘氨酸和天冬氨酸。如果培养足够长的时间(通常为几小时)， 大量的细胞都具有与所述的序列结合的能力。与此截然不同的是，我 们的干细胞即使在经历相当强烈的酶分离之后，仍可以在几分钟内结 合所述的序列，事实上，在20分钟之后，便可以分离出包含我们的人 干细胞的集落。
最后，当将所述的干细胞源移植到发育中的小鸡结締组织中时， 由该干细胞源得到的分化组织至少表达出一种结构相关的蛋白质，命 名为I型胶原。
本文所引用的术语干细胞包括如下细胞，其能够连续地产生未改 变的子细胞，并且还具有产生具有不同的更加有限性质的子细胞的能 力
本文所引用的术语祖细胞包括具有分化能力的分裂中的细胞，该 细胞包括其中自我更新还没有被证实的假定的干细胞。
对本领域的技术人员显而易见的是，软骨组织具有有限的自我修 复的能力。就恢复长期的功能性的动关节而言，在关节的自我修复能力方面存在若干的局限性。软骨修复組织在透明软骨和纤维软骨之间 具有中间结构和组合物，如果其曾经复制了关节软骨的实际结构，仅 是少数情况。对胶原纤维的取向和组织的破坏，使得不能进行大分子
(具体而言为蛋白聚糖及胶原纤维状网络)之间的重要的相互作用， 因而导致硬度以及抵抗压力负载的能力降低。促成关节软骨的低修复 能力的主要因素在于所述的组织是无血管的，且无神经的。
已经研发多种治疗方法来试图和克服在尝试治疗关节软骨缺陷 时所面临的问题。潜在的治疗方法需要成功地将与关节软骨具有相同 的力学和结构性质的组织整合到缺陷中。当前基于细胞的移植治疗涉 及应用增殖的自体软骨细胞用于移植到缺陷中，从而产生有望与天然 关节软骨相似的修复组织。这种基于细胞的移植治疗被称为自体软骨
细胞移植(ACI)，并由Brittberg "a/所描述(1994)，用于治疗完整 厚度的软骨缺陷。该技术的问题在于其涉及由关节的非损伤、非负重 区域提取健康关节软骨。现代研究倾向于间充质干细胞(MSC)作为细胞 源用于组织工程及其渗透到生物可降解支架中的潜在用途。目前广泛 地聚焦在骨髓衍生的MSC,但是许多其他类型的组织(例如软骨和滑 膜)现在已经被认为是MSC的来源。
因此可以断定，我们的千细胞在软骨修复中具有重要的用途。而 且，我们的干细胞可以用于修复其他形式的结締组织，例如韧带、皮 肤或骨骼。
此外，尽管我们的干细胞适用于自体修复，特别是软骨修复，但 是这些细胞还可以用于同种异体修复，这是因为许多其他的干细胞已 经显示出是免疫抑制性的。
发明概迷
根据本发明的第一个方面，提供了从老化的人软骨分离的人干细胞。
本文所述的老化的人软骨包括来自成人的软骨，最优选的是成熟 的成人或者其软骨往往比正常的软骨更薄和/或代谢活性更低的成人。 根据本发明的另一个方面，提供了从全部深度的软骨组织分离的人干细胞。
在本发明的优选的实施方案中，所述的人干细胞分离自软骨的表 层区和/或中间区域。
本文所引用的"全部深度的软骨组织"是指从表面到基底的整个 深度的组织都被用作干细胞的来源。
根据本发明的另一个方面，提供了其特征在于以下特性中的任意
一种或多种人千细胞
3. 群体倍增超过52代；
4. 能够分化成任意结締组织类型；
5. 表达出以下干细胞标志物中的任意一种或多种STROl、 MSX1或 notch 1;
6. 从人老化的软骨中分离得到。
根据本发明的另一个方面，提供了在the National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC)(位于Blanche Lane， South Mimms, Potters Bar, Hertfordshire EN6 3QG，以编号A— 保藏的人干细胞群。
根据本发明的另 一个方面，提供了从之前所述的干细胞衍生得到 的人结締组织细胞群。
根据本发明的另一个方面，提供了之前所述的干细胞在组织修复 冲的用途。
根据本发明的另 一个方面，提供了从本文所述的干细胞衍生得到 的人结締组织细胞群在组织修复中的用途。
根据本发明的另一个方面，提供了用于组织修复的移植物，其包 含本文所述的干细胞或者由其衍生得到的细胞群。
根据本发明的另一个方面，提供了用于分离人千细胞的方法，该 方法包括
a) 从全部深度的软骨组织得到人关节软骨组织；
b) 通过使用酶消化所述的组织，从而释放出软骨细胞；
c) 将分离的软骨细胞暴露于纤连蛋白和/或其包含RGD序列的片段；以及
d) 分离与纤连蛋白或所述的片段结合的细胞。
在本发明优选的方法中，将所述的被释放的软骨细胞培养在纤连 蛋白或RGD序列(例如包含RGD序列的纤连蛋白的片段)上。
在本发明其他优选的方法中，使用链霉蛋白酶与胶原酶的组合来 消化所述的关节软骨，更优选的是将所述的关节软骨在37'C下暴露于 70单位/ml链霉蛋白酶3小时，然后在37X:下暴露于300单位/ml胶 原酶更长的时间，通常为过夜。
在本发明的另一个方面中，过滤或离心所述的经消化的软骨细 胞，从而分离软骨细胞组织。
在进行离心的情况下，在2000rpm下离心5分钟。
然后，优选的是，将分离的软骨细胞接种到涂敷有纤连蛋白的孔中。
在本发明优选的方法中，关节软骨组织是指老化的组织。 现在参见以下附图来描述本发明，其中

图1示出了穿过软骨组织的切片；
图2A示出了人软骨细胞与纤连蛋白的初始粘附。应该注意的是， 与对照物相比，大量的软骨细胞在20分钟内与纤连蛋白粘附(p < 0. 05);
图2B示出了在20分钟内与纤连蛋白粘附的软骨细胞到第8天时 形成由多于32个细胞构成的集落，此外，与对照相比，集落的数量在 培养物中随时间而增加(P < 0. 0";
图2C示出了可以广泛地对克隆衍生的人干细胞或软骨祖细胞进 行亚培养，并且这些细胞发生了多于80代的群体倍增；
图3示出了通过与纤连蛋白的差异性粘附而衍生得到的克隆细胞 以及来自同一患者的未经选择的细胞的外观，其中使用抗体对所述细 胞表面的信号传导分子Notch 1、干细胞标志物STR01以及转录因子 MSX1进行了免疫标记。在克隆细胞系中，每一个细胞都是用针对Notch l和Strol的抗体进行了标记，并且大部分的细胞都使用了针对MSX1的抗体进行了标记。与此截然不同的是，单层的培养物包含较少的用
针对千细胞标志物STROl、 Notch 1和MSX1的抗体标记的细胞(图 3A-C);
图4示出了釆用卵内测定法，表明克隆衍生的软骨干细胞被移植 到多种鸡组织(包括骨、腱和软骨)中，并且表明这样移植的千细胞 合成了结构相关的蛋白质，即所谓I型胶原(图4);以及
图5示出了对老化人组织的石蜡切片，使用针对转录因子MSX1 的抗体标记(N20， Santa Cruz Biotechnology; 5ug mr溶于PBS中， 持续l小时)，并使用抗兔FITC缀合的二级抗体(Sigma; 1: 100溶于 PBS中，持续1小时)进行检测。MSX1阳性细胞存在于所述组织的表层 区和中间区域中，表明这些区域为干细胞在所迷組织中存留的位置。 箭头表示阳性细胞内标记。
材料和方法
在4r下，将12孔板用溶于包含ImM MgCh和ImM CaCl2的PBS (PBS+) 中的10pg mP血浆纤连蛋白(Sigma， UK)涂敷过夜。将所述的板用溶 于PBS+中的1% BSA (Sigma)封闭，然后加入软骨细胞。对照板使用 PBS+在41C下处理过夜。
在完全获得伦理委员会批准的条件下，从经历半侧关节切开术的 患者获得组织。由总体上正常的大腿骨节上移取全部深度的软骨，并 在包含10% FCS (Gibco)的l:l DMEM/F12 (GibcQ)中温育过夜，然后 如之前所述(Dowthwaite et al 20(H)，依次通过链霉蛋白酶(Roche) / 胶原酶(Sigma)消化来分离软骨细胞。简言之，将软骨碎片在37匸下 用链霉蛋白酶(70 units m广溶于包含5% FCS的DMEM/F12中)温育3 小时。除去链霉蛋白酶，并将软骨在37匸下与胶原酶(300 units ml一1， 溶于含有5% FCS的DMEM/F12中)温育过夜。将软骨细胞在2000rpm 下离心5分钟，除去上清液，然后再次悬浮于不含血清的DMEM/F12 中，并计数。分离后，将软骨细胞(l,OOO mr)接种到12孔板的各孔 中，然后在37TC下在含有0. 19i庆大霉素(DMEM/F12-)的1: 1 DMEM/F12 中温育20分钟，20分钟后，除去媒介物(以及未粘附的细胞)，并将所得物在37t:下在第二个板中放置40分钟，然后除去媒介物(以 及未粘附的细胞)，再将所得物放置在第三个板中。在20和40分钟 时除去媒介物后，将新鲜的包含0. 1%庆大霉素和10%FCS (DMEM/F12+) 的1:1DMEM/F12加入到剩余的粘附细胞中，其中所述剩余的粘附细胞 保持培养至多17天。对照包含在使用溶于PBS+中的1。/。BSA涂敷的板 上发生差异性粘附的细胞。
在经历3小时内的铺板后，使用倒置式显微镜(其装配有相位差 光学器件)通过计数与所述板的底部粘附的细胞的总数来测定初始软 骨细胞的粘附情况，并且将初始软骨细胞粘附情况表示为初始接种密 度的百分率。使用相同的显微镜，在第8、 12、 14和17天计数由多于 32个细胞构成的软骨细胞集落。通过将群落数除以粘附细胞的初始数 量来计算集落的形成效率(CFE)。
一旦形成由多于32个细胞构成的集落，则在光学显微镜下对它 们进行鉴定。对克隆进行胰蛋白酶消化(0. 25%; Gibco)，并在DMEM/F12 + 10% FCS中进行广泛的亚培养。在各代计算细胞数量并绘制群体动 力学。
将克隆细胞系在95% EtOH (Notch 1、 STR01)或10% NBFS (MSX1) 中固定5分钟，然后用针对的Notch 1的抗体(C20， 5ug ml、 Santa Cruz Biotechnology) 、 STR01的抗体(纯的TC上清液，由R 0reffo， Southampton University赠与)和MSX1的抗体(N20， 5ug ml-1; Santa Cruz Bio techno logy)免疫标记该细胞系。使用相关的荧光缀合的抗体 定位一级抗体，并在荧光显微镜下观察这些抗体。
根据制造商提供的说明书，用lOuM细胞示踪绿(cell tracker green) (Invitrogen)标记克隆细胞系，然后将这些细胞注射到3天大 (HH St 12-14)鸡胚(其之前是已经开窗)的翅芽中.将胚用透明胶带 重新密封，并温育不同的时间，多至10天(HH St 36-37),将翅膀固 定于10% NBFS中，并进行石蜡包埋处理。将样品以10pm切片，脱蜡， 并固定于DPX中，然后在荧光显微镜下进行检查。使用抗体5D8 (抗 人I型胶原；Abeam)对其他切片进行免疫标记，并在荧光显微镜下进行观察。
如图5所示，已经使用针对转录因子MSX1 (—种干细胞标志物) 的抗体标记的老化人组织的石蜡切片显示干细胞存在于关节软骨的 表层区和中间区域中。这与传统的知识是相对的，传统的知识推测， 干细胞进存在于软骨组织的表面上。
参考文献
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Dowthwaite, GP， Bishop JC, Redman SN, Khan IM, Rooney P， Evans DJ，
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权利要求
1.分离自老化的人软骨的人干细胞。
2. 根据权利要求1的干细胞，其中所述的细胞分离自全部深度的 软骨组织。
3. 根据权利要求1的干细胞，其中所迷的干细胞分离自软骨组织 的表层区或中间区，或者两者。
4. 其特征在于以下特性中的任意一种或多种的人干细胞(1) 从全部深度的人关节软骨中分离得到；(2) 通过与纤连蛋白或包含RGD序列的片段的高亲合力粘附而分 离得到；(3) 群体倍增超过52代；(4) 能够分化成任意结締组织类型；(5) 表达以下干细胞标志物中的任意一种或多种STROl、 MSX1或 notch lj(6) 从人老化的软骨中分离得到。
5. 从根据权利要求1至4的干细胞衍生得到的人结締组织细胞群。
6. 根据权利要求1-4的千细胞在组织修复中的用途。
7. 根据权利要求5的人结締组织细胞在用于组织修复中的用途。
8. 用于组织修复中的移植物，其包含根据权利要求1至4的干细 胞或根据权利要求5的细胞群。
9. 用于分离人干细胞的方法，该方法包括(a) 从全部深度的软骨组织得到人关节软骨组织；(b) 通过使用酶消化所述的组织，从而释放出软骨细胞；(c) 将分离的软骨细胞暴露于纤连蛋白和/或其包含RGD序列的片 段；以及(d) 分离与纤连蛋白或所述的片段结合的细胞。
10. 根据权利要求9的方法，其中将所述的被释放的软骨细胞培养 在纤连蛋白或RGD序列，例如包含RGD序列的纤连蛋白的片段上。
11. 根据权利要求9或10的方法，其中使用链霉蛋白酶与胶原酶 的组合来消化所述的关节软骨。
12. 根据权利要求9-11的方法，其中过滤或离心所述的经消化的 软骨细胞，从而分离出软骨组织。
13. 根据权利要求9-12的方法，其中关节软骨组织是指老化的组织。
14. 参见书面说明书以及其中所包含的附图而依次描述的人干细 胞、人结締组织细胞群、所述干细胞或所述组织细胞的用途或用于分离 人干细胞的方法。
全文摘要
本发明涉及由全部深度的人软骨组织分离得到的和/或由老化的人软骨分离得到的人干细胞；及其用途。
文档编号C12N5/077GK101646765SQ200880006167
公开日2010年2月10日 申请日期2008年2月6日 优先权日2007年2月8日
发明者C·W·阿彻, G·杜斯韦特, S·N·黑文 申请人:加的夫大学学院咨询有限公司