L-氨基酸或核酸的生产方法

专利名称：L-氨基酸或核酸的生产方法
技术领域：
本发明涉及发酵工业，是一种通过利用微生物的发酵方法在析出L-氨 基酸或核酸的同时进行培养的方法。
背景技术：
L-氨基酸是使用具有L-氨基酸生产能力的属于棒状杆菌型细菌或肠杆 菌科的氨基酸生产菌采用发酵方法工业生产的。作为这些氨基酸生产菌， 为了提高生产率，使用了从自然界分离的菌抹或该菌抹的人工突变抹、或 者通过基因重组而增强了 L-氨基酸生物合成酶的重组体等。
例如，在L-色氨酸发酵中，可以例举增强了邻氨基苯曱酸合成酶活性、 磷酸甘油酸脱氬酶活性、色氨酸合酶活性的细菌(专利文献l)，以及扩增 了色氨酸操纵子的细菌(专利文献2~4)。
此外，在L-谷氨酸发酵中，可以例举通过增强谷氨酸脱氢酶基因(gdh)、 异柠檬酸脱氢酶基因(icdA)、顺乌头酸水化酶基因(acnA,acnB)以及柠 檬酸合酶基因(gltA)来增加L-谷氨酸的生产能力的技术(专利文献5)。
此外，在L-苏氨酸发酵中，可以例举强化了天冬氨酸激酶III基因 (lysC)、天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd)、由thr操纵子所编码的天冬氨 酸激酶I基因(thrA)、高丝氨酸激酶基因(thrB)、苏氨酸合酶基因(thrC ) 的微生物(专利文献6)等。
通过上述微生物的选育、生产方法的改良，L-氨基酸的生产能力得到了 相当程度的提高，但为了应对今后更加旺盛的需求，需要开发更廉价且有 效率的L-氨基酸生产方法。
另一方面，在使培养液中蓄积的L-氨基酸晶析的同时进行发酵的方法 是已知的(专利文献7、 8)。此外，对于L-谷氨酸而言，已经公开了使用 能够在析出L-谷氨酸的同时蓄积L-谷氨酸的微生物来生产L-谷氨酸的方法 (专利文献9)。此外，还已知晶析发酵法，其中将平均粒径1 120nm的 氨基酸晶体添加到培养基中(专利文献IO)。然而，与常规的不析出晶体的发酵相比，上述方法的生产率不足，需 要进一步加以改良。
专利文献1 WO94/08031号 专利文献2特开昭57-71397号 专利文献3特开昭62-244382号 专利文献4美国专利第4,371,614号 专利文献5特开昭63-214189号 专利文献6特开2001-346578号 专利文献7特开昭62-288号 专利文献8欧洲专利公报第1078989号 专利文献9美国专利第6905819号 专利文献10 WO06/109830号

发明内容
发明所要解决的问题
本发明的一个目的是提高使用微生物使L-氨基酸或核酸的晶体在析出 的同时蓄积在培养基中的发酵生产中的生产率。
解决问题的方法
通常认为，发酵过程中搅拌叶轮功率密度的降低会给发酵带来不利的 影响。然而，本发明人经过深入研究后发现，在使L-氨基酸或核酸析出并 蓄积的发酵中，通过在晶体析出后或添加晶种后将搅拌叶轮的功率密度控 制在一定水平以下，可以提高L-氨基酸的生产性。从而完成了本发明。
即，本发明如下述。
(1 ) 一种生产L-氨基酸或核酸的方法，包括在具有搅拌叶轮的发酵罐 内的液体培养基中培养具有生产L-氨基酸或核酸的能力的微生物，并根据 需要向培养基中添加晶种，从而在该培养基中生成并蓄积L-氨基酸或核酸 的晶体，并且从培养物中收集L-氨基酸或核酸的晶体；其特征在于，在晶 体析出后或添加晶种后将搅拌叶轮的功率密度控制在2.4kW/m3以下。
(2)前文所述的方法，其特征在于，所述晶体析出后或添加晶种后的 搅拌叶轮的功率密度为0.5kW/m3以上。(3) 前文所述的方法，其特征在于，在进行培养的同时将晶体析出前 或添加晶种前的搅拌叶轮的功率密度控制在3.0kW/m3以上。
(4) 前文所述的方法，其中，所述微生物是属于肠杆菌科的微生物。
(5) 前文所述的方法，其中，所述微生物是棒状杆菌型细菌或芽孢杆 菌属细菌。
(6) 前文所述的方法，其中，所述L-氨基酸是选自L-色氨酸、L-苯丙 氨酸、L-酪氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰 胺、L-苏氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸或它们的衍生物中的l种或2种以上 的L-氨基酸。
(7) 前文所述的方法，其中，所述核酸是选自肌苷、腺苷、鸟苷、黄 香、肌苷酸、腺苷酸、鸟苷酸、黄苷酸或它们的衍生物中的l种或2种以 上的核酸。
附图简要说明


图1发酵装置的概要图。显示了从发酵罐收集目的物质。 图2显示搅拌叶轮的搅拌功率密度与L-色氨酸生产速度的图。 图3显示搅拌叶轮的搅拌功率密度与L-谷氨酸生产速度的图。 图4显示搅拌叶轮的搅拌功率密度与L-苏氨酸生产速度的图。
实施发明的最佳模式
<1>本发明的生产方法
技术领域：
本发明的方法是这样的方法 一种L-氨基酸或核酸的生产方法，包括 在具有搅拌叶轮的发酵罐内的液体培养基中培养具有生产L-氨基酸或核酸 的能力的微生物，并根据需要向培养基中添加晶种，从而在该培养基中生 成并蓄积L-氨基酸或核酸的晶体，并且从培养物中收集L-氨基酸或核酸的 晶体；其特征在于，在晶体析出后或者添加晶种后将搅拌叶轮的功率密度 (每单位发酵液的功率)控制在2.4kW/m3以下。
在本发明中，对于"L-氨基酸"没有特殊限制，只要其在使用微生物进行 的发酵方法中能够析出同时蓄积在培养基中即可，包括例如L-赖氨酸、 L-鸟氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-瓜氨酸等碱性氨基酸，L-异亮氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-甘氨酸等脂肪族氨基酸，L-苏氨酸、L-丝氨酸等属于羟基单氨基羧酸的氨基酸，L-脯氨酸等环式氨基酸，L-苯丙氨 酸、L-酪氨酸、L-色氨酸等芳香族氨基酸，L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-曱硫 氨酸等含硫氨基酸，L-谷氨酸、L-天冬氨酸等酸性氨基酸，以及L-谷氨酰 胺、L-天冬酰胺等在侧链上具有酰胺基的氨基酸。
优选地，可以例举疏水性氨基酸、酸性氨基酸以及在侧链上具有酰胺 基的氨基酸。特别优选地，作为疏水性氨基酸，可以例举属于脂肪族氨基 酸的L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸，属于芳香族氨基酸的L-色氨酸、L -苯丙氨酸、L-酪氨酸；作为酸性氨基酸，可以例举L-谷氨酸、L-天冬氨酸， 作为在侧链上具有酰胺基的氨基酸，可以例举L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺等。
此外，本发明的L-氨基酸中还包括以上述氨基酸为起始物质而获得的 L-氨基酸衍生物，包括例如GABA、对羟基-D-苯基甘氨酸、DOPA、琥珀 酸、苹果酸、丙酮酸等。
通过本发明生产的L-氨基酸或核酸可以是1种，也可以是2种或更多。
在本发明中，对于"核酸，，没有特殊限制，只要其在使用微生物进行的发 酵方法中能够在析出同时蓄积在培养基中。核酸包括例如嘌呤核苷、噤呤 核苷酸等。嘌呤核苷中包括肌苷、黄苷、鸟苷、腺苷等，噪呤核苷酸中包 括噪呤核苷的5，-磷酸酯、例如肌苷酸(肌苷-5，-磷酸，以下也称"IMP，，)、 黄苷酸(黄苷-5，-磷酸，以下也称"XMF，)、鸟苦酸(鸟苦-5，-单磷酸，以 下也称"GMP")、腺苦酸(腺香-5，-单磷酸。以下也称"AMP，，)等。此外， 本发明的核酸中还包括以上述核酸为起始物质获得的核酸衍生物，可以例 举出Ara-U (尿嘧啶阿拉伯糖苷)、ZVA ( Z-伐昔洛韦(Z-valacyclovir))等。 而且，在本发明中，有些情况下将上述L-氨基酸、核酸或它们的衍生物表 述为"目的物质"。
搅拌叶轮是用来搅拌发酵罐中的液体培养基的，对其形状没有限制。 通常，搅拌叶轮由轴和设置在轴上的叶片(blade)构成，叶片或其一部分 也可以构成轴。此外，通常搅拌叶轮以轴为中心旋转，^旦也可以以其它形 式工作。作为叶片的形状，可以使用涡轮形、平桨形、螺旋桨形、锚形、 带形等，对其没有限制。此外，对于叶片的个数、各个叶片的配置也没有 特殊限制。搅拌叶轮是通过发动机等动力机器将动力传至轴而工作的。关 于搅拌叶轮，可以参考例如《化学工程便览》，化学工程协会编，修订第 四版，1310-1311页，丸善株式会社(化学工学便覧化学工学協会編改訂四版 1310 1311^—-丸善株式会社)。
在本发明中，搅拌叶轮的功率密度，是指每单位发酵液的搅拌叶轮的 功率。搅拌叶轮的功率是这样计算的从搅拌发酵液时的动力机器的功率 (输出)减去搅拌空发酵罐时的动力机器的功率(输出)。具体而言，例 如当动力机器是发动机时，动力可以根据发动机中流动的电流和发动机的 效率来计算。此外，也可以通过制作反映发动机中流动的电流与功率之间 关系的校准曲线，使用该校准曲线从电流进行换算，来测定功率。而且， 可以使用转矩计或转矩传感器等测定转矩的机器来测定与搅拌叶轮相关的 转矩，由该值根据下式计算出动力。
功率P [kW] = Tx2x;cxn/1000
T:转矩[N'm]
n:搅拌叶轮的转数[/s]
用如上述测定的功率值除以培养基液体量而得到的值就是搅拌叶轮的 功率密度。
在本发明中，优选对搅拌叶轮的功率密度加以控制，使晶体析出后或 添加晶种后搅拌叶轮的功率密度为2.4kW/m3以下。理想的是，将搅拌叶轮 的功率密度控制在更优选为2.0kW/m3以下，特别优选为1.5kW/mS以下，最 优选为1.0kW/m3以下。此外，对于搅拌叶轮功率密度的下限没有特殊限制， 只要不降低微生物的物质生产或者微生物的生长即可，优选控制在0.4 kW/r^以上、优选0.5kW/m3以上、更优选0.6kW/m3以上、最优选0.7kW/m3 以上。
在晶体析出后或添加晶种后将搅拌叶轮的功率密度控制在上述范围， 优选对其进行连续控制直至发酵结束。此外，只要将搅拌叶轮的功率密度 基本上控制在上述范围内，暂时性地超出上述范围也是可以的。具体地说， 如果从晶体析出后或添加晶种后直至发酵结束或目的物质的蓄积达到最高
点为止的期间的50%以上、优选70%以上、更优选90%以上的时间内，搅 拌叶轮的功率密度满足上述范围，搅拌叶轮的功率密度就基本上得到了控制。
优选的是，晶体析出前或添加晶种前搅拌叶轮的功率密度比上述晶体 析出后或添加晶种前的范围高，优选为2.6kW/m3以上，更优选为2.8kW/m3 以上，特别优选为3.0kW/mS以上。而且，只要搅拌叶轮的功率密度基本上控制在该范围内，暂时地低于上述范围是也可以的。具体地说，如果从发 酵开始或后述的目的物质生产期起直至晶体析出或添加晶种为止的期间的
50%以上、优选70%以上、更优选90°/。以上的时间内，搅拌叶轮的功率密 度满足上述范围，搅拌叶轮的功率密度就基本上得到了控制。
在本发明中，如果目的物质的蓄积超过其饱和溶解度，或者超过过饱 和状态，则会自然析出目的物质的晶体。因此，当微生物具有在培养基中 蓄积超过饱和溶解度的量的目的物质的能力时，不需要进行使目的物质析 出的操作，但也可以添加晶体来促进目的物质的析出。晶种是指为了这样 的目的而根据需要向培养基中添加的晶体。晶种只要具有促进晶体析出的 效果即可，不限于是目的物质，但理想的是目的物质，例如在L-色氨酸发 酵中理想的是L-色氨酸。
至于所添加的晶种的浓度，当生产目的物质的微生物具有在发酵步骤 中在培养基内析出晶体的能力时，优选是将0.5g/L以上、优选lg/L以上、 更优选5g/L以上、更优选10g/L以上的晶种添加到培养基中。
当微生物不具有在培养基中蓄积超过饱和溶解度的量的目的物质的能 力时，必须在培养基中添加使得目的物质的浓度达到饱和溶解度以上的量 的目的物质。这种情况下，添加的目的物质可以是溶液，也可以是粉末或 晶体；但优选至少包含晶体作为晶种。这种情况下，优选晶种的量为10g/L 以上、优选20g/L、更优选30g/L、更优选50g/L以上。而且，在本发明中 为了促进目的物质析出而添加的物质如无特殊说明也包括在晶种中，即使 如前文所述那样在培养基中添加的目的物质为溶液或粉末。
此外，任何情况下，添加晶种的浓度上限没有限制，只要不是显著降 低微生物的物质生产或者微生物的生长的浓度即可，适合地为100g/L以下、 优选90g/L以下、更优选80g/L以下、特别优选70g/L以下。
添加晶种的时间可以是将具有目的物质生产能力的微生物接种至培养 基之前、或者是将纟鼓生物接种至培养基后的培养期间中的任何时间，例如， 优选是在将微生物接种至培养基后，从培养基中的目的物质浓度达到饱和 溶解度时前后到培养基中析出目的物质的晶体之前；更优选培养基中的目 的物质浓度处于过饱和状态，且在培养基中析出目的物质晶体之前。若以 培养时间表示，则在下述时间添加是理想的距培养开始或后述的目的物 质生产期的起始点5小时后、理想地为10小时后、更理想地为15小时后、更理想地为20小时后、最理想地为25小时后，或者上述时间的附近。此 外，当以目的物质的总培养时间或从目的物质生产期到培养结束的时间为1 时，优选在经过了总体的0.2、优选0.3、更优选0.4的时间点上或它们的附
近添力口晶种。
这里，所谓饱和溶解度，是指液体培养基被目的物质饱和时溶解在液 体培养基中的目的物质的浓度。即当目的物质的过饱和解除时目的物质所 达到的恒定浓度。
各L-氨基酸以及核酸的溶解度如表1、 2所示，优选在达到这些浓度时 的前后添力n晶种。
表1
L-氨基酸溶解度(2(TC) g/L溶解度(40°C) g/L
L-色氨酸10.614
....k苯丙多^—________27.438
L-酪氨酸0.380.75
L-异多多酸.................41.244
23.826
L-缬氨酸57.565
7.215
90122
L-谷氨一酰胺37.366
L-组氨酸3858
L二M專^ 一6.08.3
L-半胱氨酸160
L-胱氨酸0.09
表2核苦、核苷酸溶解度(20°C ) g/L溶解度(40°C ) g/L
肌香_________4—4—:483.4
90.421.05
腺苷3.08.3
肌瞽酸137241
鸟香酸206260
在本发明中，所谓晶体析出后，是指培养液中超过目的物质的饱和溶 解度，目的物质的晶体析出之后。此外，在本发明中，理想的是晶体析出 前或添加晶种前搅拌叶轮的功率比晶体析出后或添加晶种后高。而且，晶 体析出前或添加晶种前的搅拌叶轮的功率只要在适合微生物生长的范围内
即可，理想的是控制在2.4kW/m3以上、优选2.6kW/m3以上、更优选2.8kW/m3 以上、更优选3.0kW/m3以上、最优选3.2kW/mS以上。
此外，本发明的方法可以包含使具有目的物质生产能力的微生物增殖 的阶段(增殖期)和产生目的物质的阶段(目的物质生产期)。在这种情 况下，优选在增殖期使微生物充分生长，而在目的物质生产期最大限度地 蓄积目的物质。此外，目的物质析出或添加晶种的时间优选为增殖期的最 后阶段或目的物质生产期。晶种的添加可以一次进行，也可以分2次或3 次以上来添加，而且还可以连续地进行。
本发明中的"增殖期"，是指碳源主要用于菌体生长的时期，即微生物进 行对数增殖的时期；本发明中的"目的物质生产期"，是指从培养开始起10 小时以后、优选15小时以后、特别优选20小时以后，碳源主要用于L-氨 基酸生产的时期。
对于增殖期中搅拌叶轮的功率没有特殊限制，只要在适于微生物生长 的范围即可，具体地说，与前文所述的晶体析出前或添加晶种前的搅拌叶 轮的功率的情况相同。
本发明中使用的培养基可以是任何培养基，只要其包含碳源、氮源作 为营养源即可。此外，本发明的方法可以采用分批培养(batch culture )、 流加培养(Fed-batch culture )、连续培养法(continuous culture )中的任何 方法。
这里，在本发明中，上述流加培养是指下述培养方法将培养基连续 地或间歇地添加至培养中的容器中，并且在培养完成之前不从容器中取出 培养基。此外，所谓连续培养，是指这样的培养方法连续地或间歇地将培养基流加至培养中的容器中，同时从容器中取出培养基(通常而言，等于 所流加的培养基的量)。"初始培养基，，的意思是在流加培养或连续培养中，
流加流加培养基之前的分批培养中所用的培养基；"流加培养基，，的意思是在 进行流加培养或连续培养时，提供至发酵罐的培养基。流加培养基中可以 包含微生物生长所必需的全部成分，也可以仅包含这些成分中的 一部分。 此外，在本发明中，"发酵培养基，，是指发酵罐中的培养基，可从该发酵培养 基回收目的物质。此外，在本发明中，"发酵罐"是指进行目的物质生产的容 器，其形状不限，例如可以使用发酵槽，也可以使用小型发酵罐。此外， 其容量只要是能够生成、回收目的物质的容量即可。
作为用于本发明的培养基中包含的碳源，可以使用葡萄糖、甘油、果
糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解物、糖蜜等糖类，特别是 优选葡萄糖、蔗糖。除此之外，醋酸、柠檬酸等有机酸，乙醇、曱醇等醇 类也可以单独或与其它碳源组合来加以使用。此外，可以使用的作为碳源 的原料包括甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜、高级漂白糖蜜(hightestmolasses)、柑桔糖 蜜、转化糖，还可以使用纤维素、淀粉、玉米、谷物、木薯淀粉等天然原 料的水解物。此外，培养液中溶解的二氧化碳也可以作为碳源使用。这些 碳源可以用于初始培养基，也可以用于流加培养基。培养基中可以仅含这 些碳源中的1种，也可以包含2种以上。此外，初始培养基可以与流加培 养基使用相同的碳源，也可以将流加培养基的碳源改变为与初始培养基不 同。例如，有些情况下，初始培养基的碳源为葡萄糖，而流加培养基的碳 源为蔗糖。
作为本发明的培养基中包含的氮源，可以使用氨气、硫酸铵、碳酸铵、 氯化铵、磷酸铵、醋酸铵、尿素等铵盐或硝酸盐等，pH调整中使用的氨 气、氨水也可作为氮源利用。此外，还可以利用蛋白胨、酵母提取物、肉 提取物、麦芽提取物、玉米浆、大豆水解物等。培养基中可以只含这些氮 源中的1种，也可以含有2种以上。这些氮源可以用于初始培养基，也可 以用于流加培养基。此外，初始培养基、流加培养基中可以使用相同的氮 源，也可以将流加培养基的氮源改变为与初始培养基不同。
此外，本发明的培养基中，除了碳源、氮源之外，优选还包含磷酸源。 作为磷酸源，可以利用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、焦磷酸等磷酸多聚物等。
此外，本发明的培养基除碳源、氮源之外，还可以包含生长促进因子(具有生长促进效果的营养素)。能够使用的生长促进因子包括痕量金属、氨基 酸、维生素、脂肪酸、核酸以及含有前述物质的蛋白胨、酪蛋白氨基酸、 酵母提取物、大豆蛋白降解产物等。特别是对于芳香族氨基酸、支链氨基 酸而言，因为生物合成系统是共有的，所以有些情况下，如后述的那样， 微生物的目的氨基酸以外的生物合成被弱化。在这样的情况下，优选在培
养基中添加生物合成系统被弱化了的氨基酸。例如，当目的氨基酸是L-色 氨酸时，理想的是添加L-苯丙氨酸和/或酪氨酸；当目的氨基酸为L-苯丙氨 酸时，理想的是添加L-色氨酸和/或L-酪氨酸(WO2003048374号小册子)。 作为微量金属类，可以例举铁、锰、镁、钙等；作为维生素，可以例 举维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、烟酸酰胺、维生素B12、吡 喷醇、泛酸等。这些生长促进因子可以包含在初始培养基中，也可以包含 在流加培养基中。
此外，在使用其生长需求氨基酸等的营养缺陷型突变抹时，优选添补 所需求的营养素。特别是，可在本发明中使用的L-氨基酸生产菌大多如后 述地强化了 L-氨基酸生物合成途径，而弱化了 L-氨基酸分解能力，因此， 理想的是添加选自L-赖氨酸、L-高丝氨酸、L-异亮氨酸、L-曱硫氨酸中的1 种或2种以上。对于核酸生产菌，同样地优选在培养基中添加必要的物质。
初始培养基和流加培养基的培养基组成可以相同，也可以不同。而且， 当流加培养基的流加分多个阶段进行时，各流加培养基的组成可以相同， 也可以不同。
对于培养而言，优选在发酵温度20-45。C、特别优选30-42。C下进行 通气培养。作为供给至发酵罐的气体，除空气之外，可以将高浓度氧与空 气同时供给，提高供给气体中的氧浓度(参照特公平05-048117号公报、特 公平5-39594号公报)。
氧供给量可以是使得培养基中的氧浓度为2 ~ 4ppm的量，优选以1/10 ~ 1.5/1VVM供给包含氧浓度40%-100%的高浓度氧与空气的混合气体。高 浓度氧可以使用氧浓缩器制备。这里，氧浓缩器有PSA式、氧富集膜式， 可以采用用蒸发器将液态氧气化后供给到发酵罐中、或者将液态氧直接供 给到发酵罐中的方法。
此外，将pH控制在5 ~ 9来进行通气培养。当培养过程中pH下降时， 例如可以加入碳酸钙，或用氨气、氨气水等石咸来中和。而且，当目的氨基
12酸为酸性氨基酸例如L-谷氨酸时，希望在pH 3 ~ 9、优选3 ~ 5的条件下进 行。通过在这样的条件下优选培养10小时~ 120小时左右，培养液中可蓄 积显著量的目的物质。蓄积的目的物质的浓度只要是比野生抹高，且能够 从培养基中收集、回收的浓度即可，对于L-氨基酸而言，优选为50g/L以 上、优选75g/L以上、更优选100g/L以上，对于核酸而言，优选为50g/L 以上、优选75g/L以上、更优选100g/L以上。
从培养结束后的培养液中收集目的物质的方法可以采用公知的回收方 法来进行。例如，析出到培养基中的目的物质可以通过离心分离或过滤等 来回收。此外，对于析出到培养基中的目的物质，可以在溶解于培养基中 的目的物质晶析后一并加以分离。
在本发明中，为了确保目的物质的蓄积高于一定水平，可以将微生物 的培养分为种子培养(seed culture)和主培养(main culture)来进行，例如，种 子培养可通过使用培养瓶等的振荡培养或通过分批培养来进行，而主培养 可以以流加培养、分批培养或连续培养的方式进行；或者，种子培养和主 培养均可以以分批培养的方式进行。此外，在种子培养和主培养之前，可 以进行1次、2次或更多的前培养，顺次进行规模放大。
在采用这些培养方法时，可以在达到预定目的物质浓度时，取出一部 分目的物质并添加新培养基，反复进行培养。新添加的培养基优选是包含 碳源以及具有生长促进效果的营养素(生长促进因子)的培养基。作为碳 源，优选葡萄糖、蔗糖、果糖，作为生长促进因子优选氮源、磷酸、氨基 酸等。作为氮源，可以使用氨、硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵、醋酸 铵、尿素等铵盐或硝酸盐等。此外，作为磷酸源，可以使用磷酸二氢钾、 磷酸氢二钾，作为氨基酸，在使用营养缺陷型突变抹的情况下，优选补加 所要求的营养素。
本发明中，当进行流加培养或连续培养时，可间歇地流加流加培养基， 使糖或营养源的供给暂时停止。此外，优选的是，停止流加培养基供给的 时间为流加进行时间的至多30%，理想的是至多20%,特别理想的是至多 10%。当间歇流加流加培养液时，可添加 一定时间的流加培养基，并如下 控制第二次及以后的添加在某个添加期前面的添加停止期中发酵培养基 内碳源耗尽时pH的上升和溶氧浓度的上升通过计算机被检测到时，即开 始添加；并且因此培养罐(culture tank)中的基质浓度可一直自动地保持在低水平(美国专利5,912,113号说明书)。
作为碳源，优选葡萄糖、蔗糖、果糖；作为生长促进因子，优选氮源、 磷酸、氨基酸等。作为氮源，可以使用氨、硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷 酸铵、醋酸铵、尿素等铵盐或硝酸盐等。此外，作为磷酸源，可以使用磷 酸二氢钾、磷酸氢二钾，作为氨基酸，在使用营养缺陷型突变株时，优选 添补所要求的营养素。此外，流加培养基可以是l种，也可以混合2种以 上的培养基。在使用2种以上的流加培养基时，这些培养基可以混合起来 通过1个进^牛罐流加，也可以通过多个进料罐流加。
此外，在进行流加培养时，优选这样进行流加，使4寻作为流加培养液 或者发酵培养基总体的碳源量的糖量不超过30g/L，优选控制在20g/L以下、 10g/L以下。特别是优选控制糖浓度使得微生物的对数生长结束以后的糖浓 度在所述浓度范围内。碳源的流加速度可以采用美国专利5，912，13号说明 书记载的方法来控制。此外，优选以这样的浓度流加糖和磷酸，使得糖和 磷酸成为菌体生长的限制因子；流加培养液中包含的磷酸的量以P/C比计 为2以下、优选1.5以下、更优选1以下(参照美国专利5,763,230号说明 书)。
在将连续培养方法用于本发明时，可以同时进行取出和流加；也可以 取出一部分后再进行流加。此外，所述方法也可以是对菌体进行再利用的 连续培养方法，其中将包含目的物质和细胞的培养液取出，并且仅将细胞
返回到发酵罐中(参照法国专利号2669935号说明书)。作为连续或间歇流 加营养源的方法，使用与流加培养中所用的相同方法。
这里，在间歇地取出培养液的情况下，可以在达到预定的目的物质浓 度时取出一部分目的物质，并且新添加培养基以进行培养。此外，优选进 行培养使添加的培养基的量最终与取出之前培养液的量为等量。这里，"等 量，，的意思是取出之前培养液量的大约93~107%的量。
在将培养液连续取出的情况下，优选在流加营养培养基的同时或之后 开始取出。例如，取出开始于流加开始之后的至多5小时后，优选3小时 后，更优选至多1小时后。此外，至于培养液的取出量，优选取出的量和 流加的量为等量。
所谓再利用菌体的连续培养方法，是如下所述的方法在达到了预定 的目的物质浓度水平时，将发酵培养基间歇或连续地取出，仅取出目的物质，并且将包含菌体的过滤残余物或离心上清液再循环到发酵罐中，这种
方法可通过参考例如法国专利号2669935说明书来实施。
此外，可以在培养过程中从发酵罐中取出采用本发明的晶析方法析出 的晶体。具体地，可以采用通过下述方法来提高生产性的方法在发酵罐 中采用本发明的方法进行晶析发酵，从发酵液中取出包含目的物质、菌体 的发酵液，对目的物质的晶体进行离心处理、浓缩，取出晶体，将发酵液 返回到发酵罐中。例如可以采用下述方法在图1所示的装置中，包含目 的物质、菌体的发酵液从管线A开始循环，将目的物质的晶体通过离心处 理B加以浓缩并通过管线C取出，将发酵液通过管线D返回发酵罐。此时， 可以将菌体返回发酵罐，也可以不返回发酵罐。晶体的离心分离处理适合 使用液体旋流器(特开平5-92944 )。
而且，在核酸的生产方法中，通过使噤呤核香磷酸化酶和磷酸核糖转 移酶作用于采用本发明的方法生产的肌苷或鸟苷，可以获得5，-肌苷酸或者 5，-鸟苷酸。
此外，还可以使磷酸转移酶作用于使用本发明的微生物生产的噤呤核 苷来对其进行磷酸化，来生产嘌呤核苷酸(核苷-5，-磷酸酯)(特开 2000-295996)。例如，可以采用下列方法使用导入了编码大肠杆菌肌苷鸟 苷激酶的基因的埃希氏菌属细菌的嘌呤核苷酸生产方法(W091/08286号小 册子)、使用导入了编码乙酰微小杆菌(Exiguobacterium acetylicum)肌苷鸟苷 激酶的基因的产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammnoniagenes)的噪呤核苷酸 生产方法(W096/30501号小册子)。
磷酸、苯基磷酸、氨曱酰基磷酸中的磷酸供体、以及具有生成核苷-5，-磷酸 酯的能力的微生物或酸性磷酸酶(EC 3丄3.2)相互作用，来生产嘌呤核苷酸 (核苷-5，-磷酸酯)。对于具有生成核苷-5，-磷酸酯能力的微生物没有特殊限 制，只要是具有将嘌呤核苷转化为嘌呤核苷酸的能力的微生物即可，例如， 可以例举诸如国际/>开小册子WO9637603号记载的孩先生物。
此外，还有诸如特开平07-231793公开的蟑螂埃希氏菌(Escherichia blattae)JCM 1650、无花果沙雷氏菌(Serratia ficaria) ATCC 33105、植生克雷 伯氏菌(Klebsiella planticola) IFO 14939 (ATCC 33531)、肺炎克雷伯氏菌 (Klebsiella pneumoniae) IFO 3318 (ATCC 8724)、 土生克雷伯氏菌(Klebsiellaterrigena) IFO 14941 (ATCC 33257)、摩氏摩根氏菌(Morganella morganii) IFO 3168、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)IFO 12010、产气肠杆菌IFO 13534 (ATCC 13048)、河生色杆菌(Chromobacterium fluviatile) IAM 13652、紫色色 4干菌(Chromobacterium violaceum) IF012614、 4i氏西i也西菌(Cedecea lapagei) JCM 1684、 Cedeceadavisiae JCM 1685、奈氏西地西菌(Cedecea neteri) JCM 5909等。
作为酸性磷酸酶，例如可以使用诸如特开2002-000289公开的酸性磷酸 酶，更优选可以使用对核苷的亲和性提高的酸性磷酸酶(参照特开平 10-201481)或核香酸酶活性降低的突变型酸性磷酸酶(参照WO9637603)、磷 酸酯水解活性降低的突变型酸性磷酸酶(特开2001-245676)等。
还可以通过对利用本发明的微生物生产的噤呤核苦进行化学磷酸化， 来获得噤呤核苷酸(Bulletin of the Chemical Society of Japan 42， 3505)。此外， 还可以采用下列方法利用微生物所具有的ATP再生系统，使本发明的具 有XMP生产能力的微生物与XMP氨基化酶(7 $于一if )活性偶联来获得 GMP的方法、使其与肌苷激酶偶联来获得IMP的方法 (Biosci.Biotech.Biochem.， 51， 840(1997),特开昭63-230094)。
就上述。票呤核苷酸的生产中使用的、采用本发明的方法生产的肌苷或 鸟苷或嘌呤核苷而言，可以是经过纯化的，也可以是嘌呤核苷的发酵液或 含噤呤核香的粗纯化品。
2>能够用于本发明的微生物
对于本发明中使用的微生物没有特殊限制，只要该樣i生物具有L-氨基 酸或核酸生产能力，且在液体培养基中进行培养时能够在培养基中蓄积L-氨基酸或核酸即可。蓄积的L-氨基酸或核酸的量可以是任意的，只要能够 蓄积到可从培养基中回收的程度即可，优选具有能够使目的物质从培养基 中晶析出来的能力，例如，理想的是能够蓄积所述表l、 2中记载的浓度以 上的浓度的目的物质。
例如，如果降低含L-谷氨酸的水溶液的pH,则L-谷氨酸在Y-羧基的 pKa(4.25)附近溶解度显著减少，在等电点(pH3.2)处的溶解度达到最低。虽 然因培养基组成而异，但通常来说，L-谷氨酸在约3CTC的条件下，pH3.2 时溶解10 20g/L, pH4.0时溶解30 40g/L, pH4.7时溶解50~60g/L。以埃希氏菌属(Escherichia)细菌、泛菌属(Pantoea)细菌为i'戈表的属于肠杆菌 科(Enterobacteriaceae)的微生物，或者使用棒状杆菌型细菌等。此外，也可 以使用能够由曱醇生产L-氨基酸的曱醇同化细菌，例如曱基菌属 (Afe/ /oZ)"c/〃"力细菌、嗜曱基菌属(71^//^/0/^//"力细菌等。其它属于肠杆 菌科的微生物的实例包括肠杆菌属(五mwo^"w)、克雷伯杆菌属 (y/eZwW/fl)、沙雷氏菌属(&rraA》)、欧文氏菌属(五nW"/")、沙门氏菌属 (Sa/wo"e〃a)和摩根氏菌属(Morgawe〃a)等属于y-变形细菌(y-iVc^o6a"en'a) 的肠杆菌科细菌。此外，作为其它微生物，可以例举脂环酸杆菌属 (^//cyc/o^c/〃^y)细菌、芽孢杆菌属C8acz7/w力细菌以及属于酵母属 OSacc/Mrowycay)、假丝酵母属(Owc^a)等的酵母等。
作为埃希氏菌属细菌的实例，可以利用Neidhardt等的著作(Neidhardt， F.C.等,^Esc/zen'c/n'a co// and 5Wmowe〃a T^/n.wwr/wm, American Society for Microbiology, Washington ， D.C. ， 1028,表1)中所列的，例如大肠杆菌等。 作为大肠杆菌的野生4朱，可以例举K12林或其衍生4朱、大肠杆菌MG1655 抹(ATCC 47076)、以及大肠杆菌W3110抹(ATCC 27325)等。这些在例如 美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC，地址 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108， 1, United States of America)有分售。 即，每个菌抹都被给予登录号，可以利用该登录号订购该菌抹。与各菌抹 对应的登录号记载在美国典型培养物保藏中心的产品目录中(参照http: 〃www.atcc.org/)。
此夕卜，肠杆菌属细菌的实例包括成团肠杆菌(五"&ra6acfer agg/omerara) 禾口产气肠杆菌(￡"/ero6a"er aeragewas)等；泛菌属纟田菌的实例包括尸朋toea cm朋afe。而且，在近几年中，基于16SrRNA核苷酸序列分析，有些成团 肠才干菌净皮重#斤分类为成团;乏菌(户awtoea agg7omera w)、户cw/oea G"awa/z's和 斯氏泛菌WewaW〃)等。在本发明中，可以使用归类在肠杆菌科中 的任何细菌，无论属于肠杆菌属或泛菌属均可。在利用基因工程手段选育 尸aw/oea amwafe的场合，a/7a"""s AJ13355抹(FERM BP-6614)、 AJ13356抹(FERMBP-6615)、 AJ13601抹(FERM BP-7207)和它们的衍生物 均可使用。这些菌抹在当初分离时被鉴定为成团肠杆菌，并进行了保藏。 但如上所述，通过使用16S rRNA核芬酸序列的分析，已将它们重分类为
17作为嗜曱基菌属细菌，具体地可以例举食曱基嗜曱基菌 (Me/Z^/o/^//^ w"/^/0&0p/2w力，作为其代表性菌4朱可以例举出AS1菌才朱 (NCIMB 10515)等。食曱基嗜曱基菌AS1菌株可以从国立工业和海洋细菌 保藏中心(National Collections of Industrial and Marine Bacteria, 地址 NCIMBLts.， Torry Research Station 135， Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG， United Kingdom)获得。
作为曱基菌属细菌，具体地可以例举糖原曱基菌(Me^y/ok^7/w g/，oge"e力、鞭毛曱基菌(Mef/yz/oZ^cW/w/7age〃flfwm)等。作为糖原曱基菌， 可以例举T-ll菌抹(NCIMB 11375)、 ATCC 21276菌抹、ATCC 21371菌抹、 ATR80菌株(见Appl. Microbiol. Biotechnol.， (1994),第42巻，p67匿72记 载)和A513菌抹(见Appl. Microbiol. Biotechnol.， (1994)，第42巻，p67-72 记载)等。糖原曱基菌NCIMB 11375菌株可以从国立工业和海洋细菌保藏 中心(National Collections of Industrial and Marine Bacteria,地址NCIMB Lts,， Torry Research Station 135， Abbey Road， Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom)获得。此外，鞭毛曱基菌包括例如KT菌株(见Arch. Microbiol.， 1988,第149巻，pp.441-446记载)等。
作为棒状杆菌型细菌，可以利用下述微生物它们是在《Bergey，s Manual of Determinative Bacteriology》第8版599页(1974)中定义的一组孩支生物，被 分类为需氧性、革兰氏阳性、非耐酸性、无芽孢形成能力的杆菌。此外， 棒状杆菌型细菌包括曾经归类于短杆菌属C^eW^cfen'wm)、但现在已经统一 归类于棒杆菌属(Corynebacterium)的那些细菌(Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1991))，并且还包括属于与棒杆菌属极其近缘的短杆菌属或微杆菌属 (M"/cTo6ac&Wwm)的细菌。
这样的棒状杆菌型细菌的实例如下。
p耆乙酰乙酉臾才奉4干菌(Co/^weZ a"en'w柳acetoacz.t/op/n'/wm)
醋谷棒杆菌(Co^3^ e^cten'謹acefog/齒/m,cww)
坑S享净奉一干菌(Corjv"we6acfen.wm a/feawoiydcMw)
美棒軒菌(Co^y"e6ac&n'wm ca〃柳ae)
谷氛酸棒軒菌(C。7we6(3Cfe"'ww g/幽mz'c謂)
百合花棒軒菌(Co;r"e6acfer/Mm朋wm)
栖糖蜜棒軒菌(G97we6ac&"-wm me/oweco/a)p耆-A产氨4奉4干菌(Co^"e6acten'wm ^zenwoaw/"oge"as1) (Co/^"e6ac&n.w附
力士寺奉4干菌(Co^7"e6fl"en'ww /zercM/Z力 二歧短軒菌(&ev/6acfeWww (i/va〃'c齒附) 黄色4豆4干菌(6reW&a"er/Mm y/flvw附)
孝L发酵4豆4干菌(5revz.6"c/en.wm /ac^/^7ne"/"w)
解4唐4豆4干菌(5reW6acfen'wm sacc/2a7-0/少WcMw)
生石危4豆4干菌(5rev/6ac&n.wm
产氨4豆4干菌(Co/j"eZwcfen'ww awwom'age"es)
白色才奉才干菌(5rev/6a"en'wm a/6ww)
虫普状短軒菌(万rev/Z flc敏/廳cer/"謂)
p耆氨孩^U干菌(jWJfcro6acfen'wm <amwo"/a_p/ 7"w)
具体而言，可包括例如以下菌林
嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC 13870
醋谷才奉杆菌ATCC 15806
烷醇棒杆菌ATCC 21511
美棒杆菌ATCC 15991
谷氨酸才奉杆菌ATCC 13020、 ATCC 13032、 ATCC 13060 百合花棒杆菌ATCC 15990 栖糖蜜才奉杆菌ATCC 17965 嗜热产氨棒杆菌AJ 12340 (FERMBP-1539) 力士4奉杆菌ATCC 13868 二歧短杆菌ATCC 14020
黄色短杆菌ATCC 13826、 ATCC 14067、 AJ 12418 (FERM BP-2205) 5rev/6(3cfen'wm /mman》/ /2z7w附ATCC 14068 乳发酵短杆菌ATCC 13869 (谷氨酸棒杆菌ATCC 13869) 玫瑰色短杆菌ATCC 13825 解糖短杆菌ATCC 14066 生石克短杆菌ATCC 19240产氨棒杆菌ATCC 6871 、 ATCC 6872 白色短杆菌ATCC 15111 蜡状短杆菌ATCC 15112 嗜氨孩i杆菌ATCC 15354
这些菌4朱在例如美国典型培养物保藏中心(地址P.O. Box 1549, Manassas, VA 2010812301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America)有分售。此外，根据布达佩斯条约的规定，将AJ12340菌 抹于1987年10月27日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研 究所(现独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心)(〒305-8566 日本国茨城县筑波市东1 丁目1番地1中央第6)，保藏号FERMBP-1539。 此外，根据布达佩斯条约的规定，将AJ12418菌抹于1989年1月5日保藏 在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，保藏号FERM BP-2205。
在使用芽孢杆菌属细菌时，芽孢杆菌属细菌的例子包括枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短小芽孢杆 菌(Bacillus pumilus)等。
作为枯草芽孢杆菌，可以例举枯草芽孢杆菌168 Marburg (ATCC6051)、 枯草芽孢杆菌PY79 (Plasmid， 1984, 12, l-9)等;作为解淀粉芽孢杆菌， 可以例举解淀粉芽孢杆菌T (ATCC23842)以及解淀粉芽孢杆菌N (ATCC23845)等。此外，作为短小芽孢杆菌，可以例举短小芽孢杆菌Gottheil No.3218 (ATCC No.21005)(美国专利第3,616,206号)等。
以下描述将生产L-氨基酸或核酸的能力赋予如上所述的亲本菌抹的方法。
为了赋予生产L-氨基酸或核酸的能力，可使用在棒状杆菌型细菌或埃 希氏菌属细菌等的选育中常规使用的方法(参见《氨基酸发酵》(抹)学会出 版中心，1986年5月30日第l版，第77-100页)(7$/酸発酵、(株) 学会出版i y夕一、1986年5月30日初版発行、第77 100頁)，如 获得营养缺陷突变体、类似物抗性菌抹或代谢调控突变体，或构建将L-氨基酸或核酸的生物合成系统酶的表达增强的重组菌株等。这里，在L-氨基酸生产菌的选育中，营养缺陷突变、类似物抗性、代谢调节突变等性 质可以单独赋予一种，也可以赋予两种或三种以上。此外，表达增强的L-氨基酸生物合成系统酶可以是单独一种，也可以是两种或三种以上。此外， 也可以将营养缺陷性、类似物抗性或代谢调节突变等性质的赋予与生物合 成系统酶活性的增强相结合来进行。
具有生产L-氨基酸或核酸的能力的营养缺陷突变体菌抹、L-氨基酸或 核酸类似物抗性菌抹或代谢调控突变体菌抹可以这样获得对亲本菌抹或 野生型菌抹施以常规的突变处理，即用X-射线或紫外线照射处理，或用诱 变剂例如N-曱基-N，-硝基-N-亚硝基胍等处理；然后，从所得突变林中选择 显示营养缺陷、类似物抗性或代谢调控突变、且具有L-氨基酸生产能力的 那些菌株。
具有L-氨基酸生产能力的营养缺陷型突变株、L-氨基酸类似物抗性抹 或代谢调控突变抹可以这样获得对亲本抹或野生株实施常规的突变处理， 即用X-射线或紫外线照射处理，或用N-曱基-N，-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、 曱磺酸乙酯(EMS)等诱变剂处理；然后，从所得突变抹中选择显示营养缺陷、 类似物抗性或代谢调控突变、且具有L-氨基酸生产能力的那些菌林。
以下，具体示例赋予氨基酸生产能力的方法和氨基酸生产菌。
L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸均为芳族氨基酸，并且共享生物合 成系统。编码芳族氨基酸生物合成系统酶的基因的实例包括脱氧阿拉伯-庚酉同冲唐酸石奔酸合酵(deoxyarabino-heptulosonate phosphate synthase) (aroG)、 3-脱氢奎宁酸合酶(aroB)、莽草酸脱氢酶(aroE)、莽草酸激酶(aroL)、 5-烯醇 丙酉同酰莽草酸3画石岸酸合酶(5-enolpyruvylshikimate扁3-phosphate synthase) (aroA)和分支酸合酶(chorismate synthase) (aroC)(欧洲申请公开763127号说 明书)。已知这些基因由酪氨酸抑制子(tyrR)调控，所以也可通过缺损tyrR 基因来增加芳族氨基酸的生物合成系统酶活性(参考欧洲专利763127的说 明书)。此外，酶名称后的括号内为基因名称(后文中亦然)。
此外，当强化各种氨基酸生产能力时，可以弱化目的芳族氨基酸以外 的生物合成系统。例如当目的氨基酸为L-色氨酸时，可以减弱L-苯丙氨酸 生物合成系统、L-酪氨酸生物合成系统(US4，371,614)。
此外，3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶(aroF， aroG)受到芳族氨 基酸的反馈抑制，因此可以对其进行修饰，以使其不受反馈抑制。例如， 对于aroF，可以将N末端起第147位的L-天冬氨酸或第181位的L-丝氨 酸取代为其它氨基酸残基的突变型aroF基因导入宿主，而对于aroG，可以将N末端起第146位的L-天冬氨酸、第147位的L-曱硫氨酸、第150 位的L-脯氨酸或第202位的L-丙氨酸中的1个氨基酸残基、或者第157 位的L-曱硫氨酸和第219位的L-丙氨酸这两个氨基酸残基取代为其它氨基 酸的突变型aroG基因导入宿主，从而获得芳族生产氨基酸生产菌 (EP0488424)。
此外，作为与支链氨基酸的合成相关的基因，可以例举ilvGMEDA操 纵子。该操纵子受L-缬氨酸和/或L-异亮氨酸和/或L-亮氨酸的操纵子表达 调控(弱化作用)，因此，通过使微生物携带除去或突变了弱化作用所必需 的区域的ilvGMEDA操纵子，能够提高它们的L-氨基酸生产率。
芳族氨基酸、支链氨基酸分别共享生物合成系统，因此优选使用除目 的L-氨基酸以外的芳族氨基酸、支链氨基酸的固有生物合成系统经过了弱 化的菌抹。例如，当目的氨基酸为L-色氨酸时，可以通过弱化L-苯丙氨酸、 L-酪氨酸的固有生物合成系统；当目的氨基酸为L-苯丙氨酸时，可以通过 弱化L-色氨酸、L-酪氨酸的固有生物合成系统；当目的氨基酸为L-缬氨酸 时，可以通过减弱L-亮氨酸、L-异亮氨酸的固有生物合成系统；当目的氨 基酸为L-异亮氨酸时，可以通过减弱L-缬氨酸、L-亮氨酸的固有生物合成 系统；当目的氨基酸为L-亮氨酸时，可以通过减弱L-缬氨酸、L-异亮氨酸 的固有生物合成系统，来获得高效生产目的L-氨基酸的菌株。可以通过下 述方法实现弱化生物合成系统的目的分别对编码该生物合成系统的酶的 基因导入突变；以及使用含有由希望被弱化的生物合成系统所合成的L-氨基酸的合成培养基来获得在合成培养基中需要该L-氨基酸的菌抹。
以下，例示出赋予L-氨基酸生产能力的方法以及能够在本发明中使用 的被赋予了 L-氨基酸生产能力的微生物。
L-色氨酸生产菌
L-色氨酸生产菌或用于诱导L-色氨酸生产菌的亲本抹的例子包括、但 不限于下述属于埃希氏菌属的菌4朱大肠杆菌JP4735/pMU3028 (DSM10122)和JP6015/pMU91 (DSM10123)，其色氨酰-tRNA合成酶缺陷， 该酶由突变的trpS基因编码(美国专利5,756,345);大肠杆菌SV164 (pGH5)，其具有编码不受丝氨酸反馈抑制性的磷酸甘油酸脱氢酶的serA 等位基因和编码不受色氨酸反馈抑制的邻氨基苯曱酸合酶(anthranilate synthase)的trpE等位基因(美国专利6,180,373);色氨酸酶缺陷的大肠杆菌AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263)和AGX6 (pGX50) aroP (NRRL B-12264) (美国专利4,371,614);磷酸烯醇丙酮酸的生产能力增加的大肠杆菌 AGX17/pGX50, pACKG4-pps(W09708333，美国专利6,319,696)等等。此 外，还可以使用由yedA基因或yddG基因编码的蛋白的活性增强的属于埃 希氏菌属的L-色氨酸生产菌(美国专利申请公开2003/0148473 Al和 2003/0157667 Al)。
L-色氨酸生产菌或用于诱导L-色氨酸生产菌的亲本林的例子还包括增 力口 了选自邻氨基苯曱酸合酶(trpE)、磷酸甘油酸脱氢酶(serA)和色氨酸合酶 (trpAB)中的1种以上的酶的活性的菌抹。邻氨基苯曱酸合酶和磷酸甘油酸 脱氢酶两者都受L-色氨酸和L-丝氨酸的反馈抑制，因此可以向这些酶中引 入使反馈抑制解除的突变。具有此类突变的菌株的具体实例包括具有脱敏 型邻氨基苯曱酸合酶的大肠杆菌SV164、和通过将质粒pGH5 (WO 94/08031)导入大肠杆菌SV164而获得的转化菌株，所述质粒pGH5包含编 码解除了反馈抑制的磷酸甘油酸脱氢酶的突变的serA基因。
此外，作为L-色氨酸生产菌或用于衍生L-色氨酸生产菌的亲本抹的例 子，可以例举增强了 3-磷酸丝氨酸磷酸酶(serB)活性的菌抹(US4，371,614)、 增强了磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(pckA)活性的菌抹(W02004/090125)、组成型 表达马来酸合酶-异柠檬酸裂合酶-异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶操纵子(ace 操纵子)或者增强了该操纵子的表达的菌抹(W02005/103275)。
L-色氨酸生产菌或用于诱导L-色氨酸生产菌的亲本抹的例子还包括导 入了包含编码抑制解除型邻氨基苯曱酸合酶的基因的色氨酸操纵子的菌 抹(特开昭57-71397号，特开昭62-244382号，美国专利第4,371,614)。此 外，可以通过增加色氨酸操纵子(trpBA)中编码色氨酸合酶的基因的表达来 赋予L-色氨酸生产能力。色氨酸合酶由a和P亚单位组成，这两种亚单位 分别由trpA和trpB基因编码。另外，可以通过增强异柠檬酸裂合酶-马来 酸合酶搡纵子的表达来改进L-色氨酸生产能力(W02005/103275)。
作为棒状杆菌型细菌，可以使用下列菌抹磺胺胍(sulfaguanidine)抗 性抹谷氨酸棒杆菌AJ12118 (FERMBP-478,特许01681002号)、导入了色 氨酸操纵子的棒状杆菌型细菌(特开S63240794号公报)，导入了编码棒状 杆菌型细菌来源的莽草酸激酶的基因的棒状杆菌型细菌(特开01994749号 公报)。L-苯丙氨酸生产菌
L-苯丙氨酸生产菌或用于诱导L-苯丙氨酸生产菌的亲本抹的例子包 括，但不限于下述属于埃希氏菌属的菌抹大肠杆菌AJ12739(tyrA::Tn10， tyrR) (VKPM B-8197);保持有突变型pheA34基因的大肠杆菌HW1089 (ATCC 55371)(美国专利5,354,672);大肠杆菌MWEC101-b (KR8903681); 大肠杆菌NRRL B-12141 ，NRRL B-12145，NRRL B-12146和NRRL B-12147 (美国专利4，407，952)等。此外，也可以使用大肠杆菌K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566)，大肠杆菌K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659)，大肠杆菌K画12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)和命名为AJ 12604的大肠杆菌K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB](FERMBP-3579)作为亲本菌抹(EP 488424 Bl)。此外，还可使用 增加了由yedA基因或yddG基因所编码的蛋白的活性的、属于埃希氏菌属 的L-苯丙氨酸生产菌(美国专利申请公开2003/0148473 Al和2003/0157667 Al)。
作为棒状杆菌型细菌中的苯丙氨酸生产菌，可以使用下列菌抹降低 了磷酸蜂醇丙酮酸羧化酶或丙酮酸激酶活性的谷氨酸棒杆菌BPS-13林 (FERM BP-1777), K77 (FERM BP-2062)和K78 (FERM BP-2063)(欧洲专利 公开公报331145， JP02303495)，酪氨酸营养缺陷4朱(JP05049489)等。
此外，对于苯丙氨酸生产菌，通过进行修饰使得将副产物摄入细胞内， 例如通过增加L-色氨酸摄取基因tnaB或mtr或者L-酪氨酸摄取基因tyrP 的表达量，也可以获得高效地生产L-苯丙氨酸的菌抹(EP1484410)。
L-酪氨酸生产菌
作为酪氨酸生产菌的例子，包括具有不受酪氨酸抑制的脱敏型预苯酸 脱水酶基因(tyrA)的埃希氏菌属细菌(欧洲专利申请公开1616940号公报)。 L-缬氨酸生产菌
L-缬氨酸生产菌或用于诱导L-缬氨酸生产菌的亲本抹的例子包括但不 限于经修饰而过表达ilvGMEDA操纵子的菌林(美国专利第5,998,178号)。 优选将ilvGMEDA操纵子的衰减所必需的区域移除以使操纵子的表达不 会被产生的L-缬氨酸所削弱。此外，优选将操纵子中的ilvA基因破坏从 而降低苏氨酸脱氨酶的活性。
用于衍生本发明的L-缬氨酸生产菌的亲本林的实例还包括在氨酰t-RNA合成酶中具有突变的突变抹(美国专利第5,658，766号)。例如，可以 使用大肠杆菌VL1970,该菌抹在编码异亮氨酸tRNA合成酶的ileS基因 中具有突变。大肠杆菌VL1970于1988年6月24日保藏在俄罗斯国立工 业孩吏生物保藏中心(VKPM) (Russia, 117545 Moscow, 1st Dorozhny proezd， 1),保藏号为VKPMB-4411。
此外，还可以使用其生长需要硫辛酸(lipoic acid)和/或缺失HT-ATP酶的 突变抹(WO96/06926)作为亲本抹。
作为棒状杆菌型细菌中的L-缬氨酸生产菌，包括例如通过修饰而增强 了编码L-缬氨酸生物合成相关酶的基因的表达的菌株。L-缬氨酸生物合成 相关酶的实例包括由ilvBNC操纵子编码的酶，即，由ilvBN编码的乙酰 羟酸合酶、由ilvC编码的异构还原酶(isomero-reductase)(国际公开小册子 WO00/50624号)。此外，由于ilvBNC操纵子受到L-缬氨酸和/或L-异亮氨 酸和/或L-亮氨酸的操纵子表达调控(transcriptional regulation),所以最好解 除弱化作用，以解除由所生成的L-缬氨酸导致的表达抑制。
作为具有L-缬氨酸生产能力的棒状杆菌型细菌，可以通过P务低或者缺 损至少一种与减少L-缬氨酸产生的物质代谢途径相关的酶的活性来进行。 例如，可以考虑降低涉及L-亮氨酸合成的苏氨酸脱水酶的活性，或降低涉 及D-泛酸合成的酶的活性(国际^Hf小册子WO0050624号)。
其它赋予L-缬氨酸生产能力的方法还包括例如赋予对氨基酸类似物等 的抗性的方法。
例如，可以使用L-异亮氨酸和L-曱石克氨酸营养缺陷性的、并对D-核 糖、噪呤核糖核苷或嘧啶核糖核苷有抗性的、并且具有L-缬氨酸生产能力 的突变菌抹(FERM P-1841， FERM P-29,特公昭53-025034),对聚酮类有 抗性的突变菌抹(FERMP-1763， FERMP-1764;特公平06-065314),在以 醋酸为唯一碳源的培养基中对L-缬氨酸有抗性、且在以葡萄糖为唯一碳源 的培养基中对丙酮酸类似物(氟丙酮酸(fluoropyruvic acid)等)敏感的突变菌 抹(FE固BP-3006， BP-3007，特许3006929号)。
L-异亮氨酸生产菌
L-异亮氨酸生产菌或用于诱导L-异亮氨酸生产菌的亲本抹的例子包 括，但不限于对6-二曱基氨基噤呤有抗性的突变抹(特开平5-304969号)， 对异亮氨酸类似物如^^代异亮氨酸(thiaisoleucine)和异亮氨酸氧肟酸等具有抗性的突变林，以及对DL-乙硫氨酸(DL-ethionine)和/或精氨酸氧肟酸具 有抗性的突变抹(特开平5-130882号)。此外，还可以使用以编码涉及L-异亮氨酸生物合成的蛋白(如苏氨酸脱氨酶、乙酰羟酸合酶(acetohydroxate synthase)等)的基因转化的重组菌抹作为亲本抹(特开平2-458号，FR 0356739,和美国专利第5,998,178号)。
棒状杆菌型细菌中的L-异亮氨酸生产菌的例子包括扩增了编码支链 氨基酸分泌蛋白的brnE基因的棒状杆菌型细菌(特开2001-169788)、通过与 L-赖氨酸生产菌进行原生质体融合而赋予了 L-异亮氨酸生产能力的棒状杆 菌型细菌(特开昭62-74293)、增强了高丝氨酸脱氢酶的棒状杆菌型细菌(特 开昭6入91193)、苏氨酸氧肟酸(threonine hydroxamete)抗性菌抹(特开昭
62- 195293)、 a-酮丙二酸(a-ketomalonic acid)抗性菌抹(特开昭61-15695)和曱 基赖氨酸抗性菌抹(特开昭61-15696)。
L-亮氨酸生产菌
L-亮氨酸生产菌或用于诱导L-亮氨酸生产菌的亲本抹的例子包括，但 不限于下述属于埃希氏菌属的菌抹对亮氨酸有抗性的大肠杆菌菌抹(例 如，菌抹57(VKPMB隱7386，美国专利第6,124,121号))或对亮氨酸类似物 (包括p-2-噻吩丙氨酸、3-羟基亮氨酸、4-氮亮氨酸、5，5,5-三氟亮氨酸等) 有抗性的大肠杆菌菌抹(特公昭62-34397号和特开平8-70879号)；通过 WO96/06926中描述的基因工程方法获得的大肠杆菌菌株；大肠杆菌 H-卯68 (特开平8-70879号)，等等。
本发明的细菌可以通过增加涉及L-亮氨酸生物合成的一种以上的基 因的表达来加以改进。这些基因的实例可优选例举以编码解除了 L-亮氨酸 反馈抑制的异丙基苹果酸合酶的突变leuA基因(美国专利第6,403,342号) 为代表的leuABCD操纵子中的基因。此外，可以通过增加编码从细菌细 胞分泌L-氨基酸的蛋白的 一种以上的基因的表达来改进本发明的细菌。这 类基因的实例包括b2682和b2683基因(ygaZH基因)(EP 1239041 A2)。
棒状杆菌型细菌中的L-亮氨酸-生产菌的例子包括2-噻唑丙氨酸和卩-羟基亮氨酸抗性菌抹(特开平8-266295),缬氨酸类似物抗性菌抹(特开昭
63- 248392)，缬氨酸营养缺陷菌株(特公昭38-4395)， S-(2-氨基乙基)-L-半 胱氨酸(AEC)抗性菌抹(特公昭51-37347)以及苯丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸 营养缺陷菌抹(特公昭54-36233)。L-谷氨酸生产菌
关于适合作为L-谷氨酸生产菌的菌抹，可以例举出进行修饰使得编码 L-谷氨酸生物合成相关酶的基因的表达增强的方法。作为L-谷氨酸生物合 成相关酶，相关基因的实例包括但不限于编码如下酶的基因谷氨酸脱氢 酶(gdhA)、谷氨酰胺合成酶(glnA)、谷氨酸合成酶(gltAB)、异柠檬酸脱氢 酶(icdA)、顺乌头酸水合酶(acnA， acnB)、柠檬酸合酶(gltA)、磷酸烯醇丙 酮酸羧化酶(ppc)、丙酮酸脱氢酶(aceEF, lpdA)、丙酮酸激酶(pykA， pykF)、 磷酸烯醇丙酮酸合酶(ppsA)、烯醇化酶(eno)、磷酸甘油酸变位酶(pgmA， pgml)、磷酸甘油酸激酶(pgk)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapA)、丙糖磷酸异 构酶(tpiA)、果糖二磷酸醛缩酶(fbp)、磷酸果糖激酶(pfkA， pfkB)和葡糖磷 酸异构酶(pgi)、曱基柠檬酸合酶(prpC),等等。
经修饰而增强了柠檬酸合成酶基因、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因、异 柠檬酸脱氢酶基因、丙酮酸脱氢酶基因和/或谷氨酸脱氢酶基因的表达的菌 抹的实例包括在EP1078989A、 EP955368A和EP952221A、 EP1033407A 中公开的那些菌抹。
用于赋予L-谷氨酸生产能力的修饰，还可以通过降低或缺损下述酶的 活性来实现，所述酶催化从L-谷氨酸生物合成途径中分支而产生其它化合 物的反应。这类催化从L-谷氨酸生物合成途径中分支并产生除L-谷氨酸外 的化合物的反应的酶的实例包括异柠檬酸裂合酶(aceA), a-酮戊二酸脱氢 酶(sucA)，乙酰羟酸合酶(acetohydorxy acid synthase)(ilvG)，乙酰乳酸合酶 (ilvl),曱酸乙酰转移酶(pfl)，乳酸脱氢酶(ldh)，谷氨酸脱羧酶(gadAB), 1-p比略口林-5-羧酸脱氬酶(1 -pyrroline-5画carboxilate dehydrogenase)(putA)等。
例如，可以通过4吏用编码a-酮戊二酸脱氬酶的Elo亚基的sucA (odhA) 基因来进行修饰，从而降低a-酮戊二酸脱氢酶的活性。a-酮戊二酸脱氢酶 活性降低的菌林包括例如如下菌抹
乳发酵短杆菌AS菌株(国际公开95/34672号小册子)
乳发酵短杆菌AJ12821 (FERMBP-4172;参照法国专利公报9401748 号说明书)
黄色短杆菌AJ12822 (FERMBP-4173;参照法国专利公报9401748号说 明书)
谷氨酸棒杆菌AJ12823 (FERMBP-4174;参照法国专利公报9401748号i兌明书)
7W固麵融i AJ13601 (FERM BP-7207)
植生克雷伯氏菌(尺/eZwW/ap/a""co/a) AJ13410菌才朱(FERM BP-6617) 尸贈謹画"ato AJ13355 (FE画BP-6614)。
这里，Pa"toea朋a加^ AJ13356因aKGDH-El亚基基因(sucA)的破坏 而缺损了 a-酮戊二酸脱氢酶活性。该菌株在分离当时被鉴定为成团肠杆菌 (五wteraZ)ac&r agg7omeram)，作为成团肠杆菌AJ 13356进行了保藏。 <旦是， 基于16S rRNA核苷酸序列等，其被重新分类为a"a"afe。尽管 AJ13356在上述保藏机构中是作为成团肠杆菌保藏的，在本说明书中仍将 其描述为朋朋ato。
而且，可以通过下述方法赋予棒状杆菌型细菌以L-谷氨酸生产能力 扩增yggB基因(NCgl 1221; NP—600492. Reports small-conductance, [gi: 19552490]; WO2006/070944)的方法，和导入编码区中导入了突变的突变 型yggB基因的方法。
磷酸_磷酸酮醇酶和/或果糖6-磷酸磷酸酮醇酶活性的微生物。
对于D-木糖5-磷酸-磷酸酮醇酶活性以及果糖6-磷酸磷酸酮醇酶活性， 可以仅活化其中的 一种，也可以两种均加以活化。
其它赋予或增强L-谷氨酸生产能力的方法还包括赋予对有机酸类似 物、呼吸链抑制剂等的抗性的方法，和赋予对细胞壁合成抑制剂的敏感性 的方法。这类方法的实例包括赋予单氟乙酸抗性的方法(特开昭50-113209)、 赋予腺嘌呤抗性或胸腺嘧啶抗性的方法(特开昭57-065198)、弱化脲酶的方 法(特开昭52-038088)、赋予丙二酸抗性的方法(特开昭52-038088)、赋予针 对苯并吡喃酮或萘醌类的抗性的方法(特开昭56-1889)、赋予HOQNO抗性 的方法(特开昭56-140895)、赋予a-酮丙二酸抗性的方法(特开昭57-2689)、 赋予胍抗性的方法(特开昭56-35981)和赋予青霉素敏感性的方法(特开平 4-88994)，等等。
这些抗性菌抹的具体实例包括如下菌抹 黄色短杆菌AJ3949 (FERMBP-2632;参考特开昭50-113209) 谷氨酸棒杆菌AJ11628 (FERMP-5736;参考特开昭57-065198) 黄色短杆菌AJ11355 (FERMP-5007;参考特开昭56-1889)谷氨酸棒杆菌AJ11368 (FERMP-5020;参考特开昭56-1889号7>才艮) 黄色短杆菌AJ11217 (FERMP-4318;参考特开昭57-2689号公报) 谷氨酸棒杆菌AJ11218 (FERMP-4319;参考特开昭57-2689号公报) 黄色短杆菌AJ11564 (FERMP-5472;参考特开昭56-140895号公报) 黄色短杆菌AJ11439 (FERMP-5136;参考特开昭56-35981号公报) 谷氨酸棒杆菌H7684 (FERM BP-3004;参考特开平04-88994号公报) 乳发酵短杆菌AJ11426(FERMP-5123;参考特开平56-048890号公报) 谷氨酸棒杆菌AJ11440 (FERM P-5137;参考特开平56-048890号公报) 乳发酵短杆菌AJ11796 (FERMP-6402;参考特开平58-158192号公报) L-苏氨酸生产菌
用于本发明的L-苏氨酸生产菌的优选实例包括增强了 L-苏氨酸生物合 成系统酶的属于肠杆菌科的细菌。编码L-苏氨酸生物合成系统酶的基因的 实例包括天冬氨酸激酶III基因(lysC)、天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd)、 thr 操纵子所编码的天冬氨酸激酶I基因(thrA)、高丝氨酸激酶基因(thrB)和苏氨 酸合酶基因(thrC)。可以导入这些基因中的两种以上。可将L-苏氨酸生物合 成系统基因导入苏氨酸分解受阻抑的属于肠杆菌科的细菌中。苏氨酸分解 受阻抑的埃希氏菌属细菌的实例包括例如苏氨酸脱氢酶活性缺损的TDH-6 菌抹(特开2001-346578号)等等。
L-苏氨酸生物合成系统酶的酶活性受终产物L-苏氨酸的抑制。因此， 为了构建L-苏氨酸生产菌，优选对L-苏氨酸生物合成系统酶进行修饰以使 所述酶不受L-苏氨酸的反馈抑制。上述thrA、 thrB和thrC基因组成苏氨 酸操纵子，苏氨酸操纵子形成弱化子(attenuator)结构。苏氨酸操纵子的表 达受到培养液中异亮氨酸和苏氨酸的抑制，并且表达受到弱化作用的抑 制。可通过去除弱化区中的前导序列或弱化子来实现弱化作用的消除或降 低(参照Lynn， S. P,, Burton, W. S.， Donohue， T. J., Gould, R. M., Gumport, R. I., and Gardner, J. F. J. Mol. Biol. 194: 59-69 (1987);国际公开第02/26993 号小册子；国际公开第2005/049808号小册子)。
苏氨酸操纵子上游存在天然启动子，可用非天然(non-native)启动子将 其取代(参考WO 98/04715号小册子)。或者，可以构建苏氨酸操纵子使得 苏氨酸生物合成的相关的基因的表达受到X噬菌体的阻遏物(repressor)和 启动子的调控(参考欧洲专利第0593792号说明书)。而且，为了对埃希氏菌属细菌进行修饰使其不受L-苏氨酸的反馈抑制，可以通过选择对a-氨基 -卩-羟基戊酸(AHV)有抗性的菌抹来获得。
对于如上所述经修饰而不受L-苏氨酸的反馈抑制的苏氨酸操纵子而 言，优选的是其在宿主微生物中拷贝数增加，或者是其连接于强启动子而 表达量增加。除了通过使用质粒的扩增来增加拷贝数，还可以通过使用转 座子、Mu噬菌体等向基因组上转入苏氨酸操纵子来增加拷贝数。
对于天冬氨酸激酶III基因(lysC),优选使用经过修饰而不受L-赖氨酸 的反馈抑制的基因。这样的经过修饰而不受反馈抑制的lysC基因可使用美 国专利5,932,453中描述的方法来获得。
理想的是，除了 L-苏氨酸生物合成系统酶之外，还增强糖酵解系统、 TCA循环和呼吸链中涉及的基因、调控这些基因表达的基因、和糖摄取基 因。这些在L-苏氨酸生产中有效的基因的实例包括转氢酶基因(pntAB)(欧 洲专利733712号说明书)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(pepC)(国际公开 95/06114号小册子)、磷酸烯醇丙酮酸合酶基因(pps)(欧洲专利877090号 说明书)、棒状杆菌型细菌或芽孢杆菌属细菌的丙酮酸羧化酶基因(国际公 开99/18228号小册子、欧洲申请公开1092776号说明书)。
此外，增强赋予L-苏氨酸抗性的基因和/或赋予L-高丝氨酸抗性的基 因的表达，或对宿主赋予L-苏氨酸抗性和/或L-高丝氨酸抗性，也是理想 的。赋予抗性的基因的实例包括rhtA基因(Res. Microbiol. 154: 123-135 (2003))、 rhtB基因(欧洲专利申请^^开第0994190号说明书)、rhtC基因(欧 洲专利申请公开第1013765号说明书)和yfiK、 yeaS基因(欧洲专利申请公 开第1016710号说明书)。此外，关于对宿主赋予L-苏氨酸抗性的方法， 可参考欧洲专利申请z^开第0994190号说明书、国际公开第卯/04636号小 册子记载的方法。
L-苏氨酸生产菌的例子包括大肠杆菌VKPM B-3996菌抹(参照美国专 利第5,175,107号说明书)。该VKPM B-3996菌抹在1987年11月19日以 登录号VKPM B-3996保藏在俄罗斯国立工业孩i生物保藏中心(Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika)(;也 i止Russia, 117545 Moscow, 1st Dorozhny proezd， 1)。 jt匕夕卜，i亥VKPM B-3996 菌抹保持有质粒pVIC40 (国际公开第90/04636号小册子)，所述质粒pVIC40 是通过将苏氨酸生物合成系统基因(苏氨酸操纵子thrABC)插入具有链霉素抗性标记的广i普载体质粒pAYC32 (参照Chistorerdov, A. Y., and Tsygankov, Y. D. Plasmid, 16， 161-167 (1986))中而获得的。在该pVIC40 中，苏氨酸操纵子中的thrA所编码的天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I解 除了 L-苏氨酸的反馈抑制。
此外，大肠杆菌VKPM B-5318抹(参照欧洲专利第0593792号说明书) 也是合适的L-苏氨酸生产菌的实例。VKPM B-5318菌抹在1990年5月3 曰以登录号VKPM B-5318保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) , GNII Genetika )(Russia, 117545 Moscow, 1st Dorozhny proezd， 1)。该VKPM B-5318 菌抹是异亮氨酸非营养缺陷型菌抹，并且携带如下所述而构建的重组质粒 DNA:缺失了天然具有的转录调节区一一弱化子区的苏氨酸操纵子(即苏氨 酸生物合成相关基因)位于X噬菌体温度敏感性C1阻遏物、PR启动子和Cro 蛋白的N末端部分的下游，并且苏氨酸生物合成相关基因的表达受所述X 噬菌体阻遏物和启动子的调控。
L-谷氨酰胺生产菌
作为通过选育来赋予L-谷氨酰胺生产能力的方法，包括例如进行修饰 而使得编码L-谷氨酰胺生物合成相关酶的基因的表达增强的方法。例如， 作为L-谷氨酸生物合成相关的酶，可以例举谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脱氢 酶(特开2002-300887)。
用于赋予L-谷氨酰胺生产能力的修饰可以通过降低或缺损下述酶的活 性来进行，所述酶催化从L-谷氨酰胺生物合成途径中分支而生成其它化合 物的反应。例如，可以考虑降低细胞内的谷氨酰胺酶活性(特开 2004-187684)。
为了通过选育来赋予或增强L-谷氨酰胺生产能力，可以例举赋予对氨 基酸类似物等的抗性的方法。实例包括赋予6-重氮-5-氧-正亮氨酸抗性的 方法(特开平3-232497)、赋予。票呤类似物抗性和/或曱硫氨酸亚砜抗性的方 法(特开昭61-202694)、赋予a-酮丙二酸抗性的方法(特开昭56-151495)、赋 予对包含谷氨酸的肽的抗性的方法(特开平2-186994)等。
作为具有L-谷氨酰胺生产能力的棒状杆菌型细菌的具体例子，可以例 举诸如下述的菌林。
黄色短杆菌AJ11573 (FERMP-5492;参照特开昭56-151495公报)黄色短杆菌AJ12210 (FERMP-8123;参照特开昭61-202694公报) 黄色短杆菌AJ12212 (FERMP-8123;参照特开昭61-202694公报) 黄色短杆菌AJ12418 (FERM BP-2205;参照特开平2-186994公报) 黄色短杆菌DH18 (FERM P-l 1116;参照特开平3-232497公报) 栖糖蜜棒杆菌DH344 (FERM P-l 1117;参照特开平3-232497公报) 谷氨酸棒杆菌AJ11574(FERMP-5493;参照特开昭56-151495公报) L-半胱氨酸生产菌
作为L-半胱氨酸生产菌的例子，包括但不限于下列属于埃希氏菌属的 菌抹用编码反馈抑制抗性的丝氨酸乙酰转移酶的不同cysE等位基因转化 的大肠杆菌JM15抹(美国专利第6,218，168号、俄罗斯专利申请第 2003121601号)；过量表达编码适于向细胞分泌毒素物质的蛋白质的基因的 大肠杆菌W3110 4朱(美国专利第5,972,663号)；半胱氨酸脱巯基酶活性降l氐 的大肠杆菌菌抹(JP11155571A2);由cysB基因编码的半胱氨酸调节子的正 转录调控因子活性提高的大肠杆菌W3110(WO0127307Al)等。
在本发明中使用的L-氨基酸生产菌中，除编码天然的生物合成系统酶 的基因之外，糖摄取、糖代谢(糖酵解系统)和能量代谢中涉及的基因也可以 是经过扩增的。
糖代谢中涉及的基因的实例是编码糖酵解途径的酶的基因或糖摄取的 基因，包括葡糖-6-磷酸异构酶基因(pgi;国际公开第01/02542号小册子)、 磷酸烯醇丙酮酸合酶基因(pps;欧洲申请公开877090号说明书)、磷酸葡糖 变位酶基因(pgm;国际公开03/04598号小册子)、果糖二磷酸醛缩酶基因 (fbp;国际公开03/04664号小册子)、丙酮酸激酶基因(pykF;国际公开 03/008609号小册子)、转醛醇酶(transaldolase)基因(ta旧；国际公开03/008611 号小册子)、延胡索酸酶基因(fUm;国际公开01/02545号小册子)、磷酸烯醇 丙酮酸合酶基因(pps;欧洲申请公开877090号小册子)、非-PTS蔗糖才聂取基 因(csc;欧洲申请公开149911号小册子)和蔗糖同化基因(scrAB操纵子；国 际公开90/04636号小册子)。
能量代谢中涉及的基因的实例包括转氢酶基因(pntAB;美国专利 5,830,716号说明书)和细胞色素bo型氧化酶基因(cyoB;欧洲专利申请/> 开1070376号说明书)。
下面，示例说明赋予微生物核酸生产能力的方法以及核酸生产菌。具有核酸生产能力的细菌微生物可以这样获得对于诸如上述的细菌 微生物赋予例如噤呤核苷营养缺陷性、或进一步赋予对。票呤类似物等药物 的抗性(参照特公昭38-23099、特公昭54-17033、特公昭55-45199、特公昭 57-14160、特公昭57-41915、特公昭59-42895)。例如，具有营养缺陷性以 及药物抗性的芽孢杆菌属细菌，可以这样获得使用N-甲基-N，-硝基-N-亚 硝基胍(NTG)或EMS(曱磺酸乙酯)等常规的突变处理中使用的突变剂进行 处理。
作为生产噤呤核苷的芽孢杆菌属细菌，可以例举如下。 作为属于芽孢杆菌属的肌苷生产抹的具体例子，可以使用枯草芽孢杆 菌KMBS16抹。该菌林是已知的枯草芽孢杆菌trpC2株(168 Marburg)的衍 生物，其中引入了编码嘌呤操纵子阻遏物的purR基因的缺损(purR::spc)、 编码琥珀酰-AMP合酶的purA基因的缺损(purA::erm)、和编码噤呤核苷磷 酸化酶的 deoD基因的缺损(deoD::kan)(特开2004-242610 ， US2004166575A1)。此外，还可以使用枯草芽孢杆菌菌才朱AJ3772 (FERM P-2555)(特开昭62-014794)等。
作为具有鸟苷生产能力的芽孢杆菌属细菌，可以例举如下IMP脱氢
酶的活性提高了的芽孢杆菌属细菌(特开平3-58787)、将携带嘌呤类似物抗 性或德夸菌素(decoyinine)抗性基因的载体导入腺嘌呤营养缺陷性突变抹而 得到的芽孢杆菌属细菌(特公平4-28357)等。
此外，作为生产噤呤核苦酸的芽孢杆菌属细菌，可以例举如下。 作为肌香酸生产菌，已报告有磷酸酶活性减弱的枯草芽孢杆菌肌苷生 产菌抹(Uchida, K. etal.， Agr. Biol. Chem,, 1961, 25， 804-805、 Fujimoto, M. Uchida， K., Agr. Biol. Chem.， 1965， 29, 249-259)。作为鸟苷酸生产菌， 可以例举具有腺噤呤营养缺陷性，且具有德夸菌素或曱硫氨酸亚砜抗性， 并且具有5，-鸟苷酸(鸟苷-5，-单磷酸，以下也称"GMP")生产能力的芽孢杆菌 属的突变株(特公昭56-12438号公报)。
此外，黄苷酸生产菌可以4吏用在以产氨4奉杆菌(Corynebacterium ammmoniagenes)为中心的棒状杆菌型细菌的选育中采用的方法来构建。例 如，可以通过获得PRPP酰胺转移酶(amidotransfemse)强化抹(特开平 8-168383)、脂肪族氨基酸抗性株(特开平4-2627卯)、脱氢脯氨酸抗性林(韩 国专利公开公报2003-56490)来构建黄苷酸生产菌。
33此外，作为具有噤呤类物质生产能力的芽孢杆菌属细菌的选育方法， 可以例举提高噤呤核芬和噪呤核苷酸共享的噤呤生物合成的相关酶，即嘌 呤生物合成酶的细胞内活性的方法。优选该酶的细胞内活性与芽孢杆菌属 细菌的非修饰抹例如野生型的芽孢杆菌属细菌相比有所提高。所谓"活性提 高"，相当于每个细胞平均的酶分子数增加，或者每个酶分子平均的比活性 提高等情形。例如，可以通过提高所述酶的基因的表达量来提高活性。作 为所述噪呤生物合成的相关酶，可以例举磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶、磷
酸核糖焦磷酸合成酶(PRPP synthetase [EC: 2.7.6.l])等。
进入戊糖磷酸系统的葡萄糖等糖源经代谢生成的分解代谢物的 一部分 经由核酮糖-5-磷酸转变为核糖-5-磷酸。由生物合成的核糖-5-磷酸出发，生 成噪呤核苷、组氨酸和色氨酸生物合成中不可或缺的前体物质磷酸核糖焦 磷酸(PRPP)。具体地，磷酸核糖焦磷酸合成酶将核糖-5-磷酸转变为PRPP。 因此，通过进行使得磷酸核糖焦磷酸合成酶的活性提高的修饰，可以赋予 或增强芽孢杆菌属细菌的嘌呤类物质生产能力。
所谓"磷酸核糖焦磷酸合成酶的活性提高"，是指磷酸核糖焦磷酸合成酶 的活性相对于野生株或亲本抹等非修饰株有所增加。磷酸核糖焦磷酸合成 酶的活性可以采用例如Switzer等的方法(Methods Enzymol.， 1978,51,3-11)、 Roth等的方法(MethodsEnzymol.， 1978, 51， 12-17)来测定。磷酸核糖焦磷 酸合成酶的活性提高了的芽孢杆菌属细菌可以例如这样构建如特开 2004-242610号公报所述的方法那样，通过使用质粒的方法或在染色体上进 行重组的方法等，使编码磷酸核糖焦磷酸合成酶的基因在芽孢杆菌属细菌 中高表达。
另一方面，当生成了噤呤核苷、组氨酸和色氨酸生物合成中不可或缺 的前体物质PRPP时，其一部分会通过嘌呤生物合成的相关酶群转变为嘌呤 核香酸、。票呤核苷。编码这样的酶群的基因包括例如枯草芽孢杆菌的嘌呤 操纵子，具体而言有purEKB-purC(orf)QLF-purMNH(J)-purD操纵子的基因 (Ebbole DJ and Zalkin H, J. Biol. Chem.， 1987, 262， 17, 8274-87)(现在也 称为purEKBCSQLFMNHD: Bacillus subtilis and Its Closest Relatives， Editor in Chief: A丄.So腿shein, ASM Press ， Washington D.C. ， 2002。 Genbank登 录号.NC—000964)和大肠杆菌的pur调节子的基因(Escherichia and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C. Neidhardt, ASM Press,Washington D.C.， 1996)。
因此，可以也通过增强这些基因的表达来赋予或增强噪呤类物质生产 能力。此外，可在本发明中使用的嘌呤操纵子基因不限于所述这些，还可 以利用其它微生物或动植物来源的基因。
作为增加噪呤操纵子的表达量的方法，可以例举通过使用质粒的方法 或重组到染色体上的方法等来在芽孢杆菌属细菌中高表达嘌呤操纵子基因 的方法。
作为增加噤呤操纵子的表达量的第2种方法，可以例举这样的方法 将。票呤操纵子的天然启动子更换为更强力的启动子，或者将天然启动子的
-35、 -10区更换为共有序列。
例如，在枯草芽孢杆菌(B. subtilis 168 Marburg抹；ATCC6051)中，嘌 呤操纵子的-35序列为共有序歹iJ(TTGACA)，但-10序列为TAAGAT，与共 有序列TATAAT不同(Ebbole, D. J. andH. Zalikn, J. Biol. Chem., 1987， 262， 8274-8287)。因此，通过将-10序列(TAAGAT)改变为共有序列、或者进行 修饰使其变为TATAAT、 TATGAT或TAAAAT而接近共有序列，可以提高 噪呤操纵子的转录活性。而且，启动子序列的取代可以采用与下述的基因 取代相似的方法来进行。
作为增加嘌呤操纵子表达量的第3种方法，可以例举降低。票呤操纵子 的阻遏物的表达量的方法(USP6，284,495号)。"。票呤操纵子的阻遏物的表达" 包括。票呤操纵子基因的转录、以及转录产物的翻译这两个方面。此外，"降
低表达量"包括表达量比非修饰抹例如野生型的芽孢杆菌属细菌中的表达 量低，以及表达基本上消失。
为了降低嘌呤操纵子的阻遏物(嘌呤阻遏物)的表达量，例如可以采用下 列方法通过对芽孢杆菌属细菌进行紫外线照射或使用NTG或EMS等通 常突变处理中使用的突变剂进行处理，并选择嘌呤阻遏物的表达量降低的 突变抹。
此外，除突变处理之外，嘌呤阻遏物的表达量降低的芽孢杆菌属细菌 还可以这样获得例如通过采用基因重组法的同源重组法(Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory press (1972); Matsuyama， S. and Mizushima， S., J. Bacteriol.， 1985， 162, 1196-1202)将染色体上的编 码噤呤阻遏物的基因(purR; GenBank Accession NC—000964(编码区域为碱基号54439~55293)替换成不能正常发挥功能的基因(以下也称"破坏型基因，，)。 而且，也可以通过减弱。票呤类物质向细胞内的摄入来强化噤呤类物质
生产能力。例如，嘌呤核苷向细胞内的摄入可以通过阻断嘌呤核苷向细胞
内的摄入的相关反应来减弱。上述嘌呤核苷细胞内摄入的相关反应包括例
如核苷通透酶所催化的反应。
而且，在生产。票呤核苷时，为了增强噪呤核苷生产能力，可以降低分
解噪呤类物质的酶的活性。作为这样的酶，可以例举例如噤呤核芬石粦酸化酶。
从PRPP出发通过噪呤生物合成的相关酶群而生物合成的嘌呤核苷酸 经过脱磷酸化转变为嘌呤核苷。为了有效率地蓄积噪呤核苷，优选降低将 嘌呤核苷进一步分解并转变为次黄嘌呤等的嘌呤核苷磷酸化酶的活性。即， 理想的是进行修饰，使得以嘌呤核苷(以肌苷为代表)为底物的嘌呤核苷磷酸 化酶弱化或者缺损。
噤呤核香磷酸化酶活性的降低具体而言可以通过在芽孢杆菌属细菌中 破坏编码。票呤核普磷酸化酶的deoD基因和pupG基因来实现。本发明的芽 孢杆菌属细菌也可以是经过修饰而使得诸如上述的deoD基因和pupG基因 单独或同时被破坏的细菌。deoD基因、pupG基因可以利用例如芽孢杆菌属 来源的基因(deoD ; Genbank登录号.NC—000964 (编码区域为 2134672-2135370)， pupG; Genbank登录号.NC—000964 (编码区域为 2445610-2446422)。
此外，为了增强嘌呤类物质生产能力，可以降低琥珀酰-AMP合酶的活 性。作为编码琥珀酰-AMP合酶的基因，可以例举purA基因。作为purA基 因，可以例举以GenBank登录号.NC—000964 (编码区域为互补链的碱基 号4153460-4155749)登录的石咸基序列。
而且，为了增强噤呤类物质生产能力，可以降低肌苷单磷酸(IMP)脱氢 酶的活性。作为编码IMP脱氢酶的基因，可以例举guaB基因。作为guaB 基因，可以例举出例如具有以GenBank登录号.NCJ)00964(编码区域为 15913-17376)登录的碱基序列的基因。
此外，作为增强噪呤类物质生产能力的方法，可以考虑扩增编码具有 噪呤类物质分泌活性的蛋白质的基因。作为这样的基因得到扩增的细菌，
可以例举例如扩增了 rhtA基因的芽孢杆菌属细菌(特开2003-219876)。
36在基于基因重组的微生物选育中使用的基因不限于具有上述基因信息 的基因或具有公知序列的基因，在不损害编码的蛋白质的功能的条^f牛下， 还可以使用上述基因的同源物或人工修饰体等具有保守突变的基因。即，
还可以是编码具有下述序列的蛋白质的基因所述序列是在公知蛋白质的 氨基酸序列中，在1个或者数个位置上包含1个或者数个氨基酸的取代、 缺失、插入或增加等而形成的序列。
这里，所谓"l个或者数个，，，虽然因氨基酸残基在蛋白质立体结构中的 位置或氨基酸残基的种类而异，但具体而言优选是1 20个、更优选1~10 个、更优选1~5个。此外，所谓保守突变，当取代部位为芳族氨基酸时， 是指在Phe、 Trp、 Tyr之间相互取代的突变，当取代部位为疏水性氨基酸时， 是指在Leu、 Ile、 Val之间相互取代的突变，当取代部位为极性氨基酸时， 是指在Gln、 Asn之间相互取代的突变，当取代部位为碱性氨基酸时，是指 在Lys、 Arg、 His之间相互取代的突变，当取代部位为酸性氨基酸时，是指 在Asp、 Glu之间相互取代的突变，当取代部位为带有羟基的氨基酸时，是 指在Ser、 Thr之间进行相互取代的突变。典型的保守突变是保守取代，视 为保守取代的取代具体地可以例举从Ala到Ser或Thr的取代，从Arg到 Gln、 His或Lys的取^C， 乂人Asn到Glu、 Gln、 Lys、 His或Asp的取^， 乂人 Asp到Asn、 Glu或Gln的取代，从Cys到Ser或Ala的取代，从Gln到Asn、 Glu、 Lys、 His、 Asp或Arg的取^， /人Glu到Gly、 Asn、 Gln、 Lys或Asp 的耳又代，从Gly到Pro的取代，从His到Asn、 Lys、 Gln、 Arg或Tyr的取 代，从Ile到Leu、 Met、 Val或Phe的取代，从Leu到Ile、 Met、 Val或Phe 的取代，/人Lys到Asn、 Glu、 Gln、 His或Arg的取^K， 乂人Met到Ile、 Leu、 Val或Phe的取代，从Phe到Trp、 Tyr、 Met、 lie或Leu的取代，从Ser到 Thr或Ala的取代，从Thr到Ser或Ala的取代，从Trp到Phe或Tyr的取 代，从Tyr到His、 Phe或Trp的取代，以及从Val到Met、 Ile或Leu的取 代。此外，如上所述的氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位等还包括 因基于作为基因来源的微生物的个体差异、种间差异等情形而天然发生的 突变(mutant或variant)而产生的那些取代、缺失、插入、添加或倒位。这 样的基因例如可以这样获得采用定点突变法对公知基因的碱基序列进行 修饰使得被编码的蛋白质的特定部位处的氨基酸残基包含取代、缺失、插 入或增力口。而且，具有诸如上述的保守突变的基因还可以是编码下述蛋白质的基
因就编码的氨基酸序列全长而言，其与野生型蛋白质具有80%以上、优 选90%以上、更优选95%以上、特别优选97%以上的同源性，且具有与野 生型蛋白质等同的功能。
此外，可以将基因序列中各自的密码子取代为易于在基因所导入的宿 主中使用的密码子。
具有保守突变的基因可以通过突变剂处理等常规突变处理中使用的方
法来获得。
此外，基因还可以是下述DNA，所述DNA与公知基因序列的互补序
基因产物等同的功能的蛋白质。这里，"严格条件"，是指形成所谓特异性杂 交体，但不形成非特异性杂交体的条件。举例说明在具有高同源性的DNA 之间、例如具有80°/。以上、优选90°/。以上、更优选95%以上、特别优选97% 以上的同源性的DNA之间发生杂交，而同源性4氐于上述的DNA之间则不 发生杂交的条件；或者在与常规Southern杂交的洗涤条件即60°C、 lxSSC、 0.1% SDS,优选0.1xSSC、 0.1% SDS,更优选68。C、 O.lxSSC、 0.1% SDS 相当的盐浓度、温度下，清洗1次更优选2~3次的条件。
作为探针，也可以使用基因的互补序列的一部分。这种探针可以通过 PCR制备，其中PCR以基于公知的基因序列制备的寡核苷酸为引物，以包 含这些碱基序列的DNA片段为模板来进行。例如，当使用300bp左右长度 的DNA片段作为探针时，杂交的洗涤条件可以是例如50。C、 2xSSC、 0.1% SDS。
实施例
以下例举出实施例对本发明进行具体说明。但本发明不限于以下的实施例。
实施例1 L-色氨酸的生产
作为L-色氨酸生产菌使用了大肠杆菌No.202 (参照国际公开第 2005/103275号小册子)。该菌株是在L-色氨酸生产菌SV164抹(国际公 开第94/08031号小册子)的染色体上插入包含磷酸甘油酸脱氢酶基因(serA， 来源于质粒pGH5，参照国际公开第94/08031号小册子)以及脱敏型trpE基因(来源于大肠杆菌MTR粒抹，参照美国专利第4,371,614号说明书) 的trp操纵子(来源于质粒pGX100 )而得到的菌林。
将1个接种环量的大肠杆菌No.202的甘油保存液接种到LB-琼脂糖平 板培养基(胰蛋白胨1%、酵母抽提液0.5%、氯化钠0.5%、琼脂糖1.5%)， 3(TC静置培养24小时。
将10 pl的上述培养液接种到置于500ml坂口烧瓶中的50ml LB培养基 (胰蛋白胨1°/。、酵母抽提液0.5%、氯化钠0.5%)中，3(TC振荡下(114 转/分钟)进行8小时的前培养。
将上述前培养液0.9ml接种到具有下述组成的300ml种子培养基中。使 用总容量1L的小型发酵罐，30。C下培养约14小时，培养中搅拌叶轮的功 率密度为4.4kW/m3，同时通入lwm的经过灭菌过滤装置灭菌的压缩空气。 此外，培养中温度保持在3(TC，用氨气将pH保持在6.5。
〔种子培养基组成〕
葡萄糖10g/L
KH2P04lg/L
(NH4)2S042.5g/L
MgS04.7H200.5g/L
FeS04.7H20lOmg/L
MnS04-4H20lOmg/L
大豆水解物0.4g/L
L-曱錄b氨酸50mg/L
L-苯丙氨酸125mg/L
L-酪氨酸125mg/L
维生素Bl5mg/L
他哆醇30mg/L
准备具有下述组成的300ml主培养培养基，其中分别接种种子培养液30ml。使用总容量1L的小型发酵罐，31。C下实施主培养，培养中以4.4kW/m3 的条件进行搅拌，同时通入lwm的经灭菌过滤装置灭菌的压缩空气。此外， 培养期间将温度保持在31。C。用氨气将pH保持在6.7。培养中，通过适当 地流加700g/L的葡萄糖溶液，调节小型发酵罐内的糖浓度为5~20g/L。此 外，在第23小时添加L-色氨酸晶体10g(33g/L)，在将搅拌叶轮的功率密度改变为2.4kW/'m3、 5.5kW/m3、 15.5kW/m3、 19.9kW/m3的4种条件下进行了 培养。
〔主培养培养基组成〕
葡萄糖15g/L
KH2P04lg/L
(NH4)2S04lg/L
大豆水解物0.75g/L
NaCl0.5g/L
MgS04.7H200.3g/L
CaCl2.2H2014.7mg/L
FeS04'7HOlOmg/L
MnS04'4H207.5mg/L
L-曱硫氨酸0.3g/L
L-苯丙氨酸lg/L
维生素Bl5mg/L
p比。多醇36.5mg/L
NH4C1"3g/L
KOHlg/L
培养46小时后，测定培养基中的L-色氨果如图2所示。在功率密度0的条件下并没有进行培养，但在图2中为了 制作近似曲线而亦将其绘出。而且，生产速度是以将搅拌功率密度 15.5kW/m3的条件下的生产率作为1时的相对值来描述的。
参考例2: L-谷氨酸生产菌的构建
设计了引物1 (SEQIDNO:l)和引物2 (SEQIDNO:2),用于扩增质 粒RSFCPG (欧洲申请公开1233068号说明书)中除gltA基因的ORF以外 的部分；所述质粒具有大肠杆菌来源的gltA基因、ppc基因和gdhA基因。 使用该引物，以RSFCPG为模板进行PCR，得到了约14.9kb的片段。另一 方面，使用引物3 ( SEQ ID NO:3 )和引物4 ( SEQ ID NO:4 ),以大肠杆菌 W3110抹的染色体DNA为模板进行PCR,得到了包含甲基柠檬酸合酶基因 (prpC)的约1.2kb的片H。将两PCR产物分别用BglII、 Kpnl处理并进行连接后，转化大肠杆菌JM109抹。收集全部出现的菌落，提取作为混合物 形式的质粒。用该质粒混合物转化柠檬酸合酶(CS )缺损林大肠杆菌ME8330 抹，将其涂布在含50mg/L尿嘧啶、5mg/L硫胺-HCl的M9极限培养基(葡 萄糖5g、硫酸镁2mM、磷酸二氢钾3g、氯化钠0.5g 、氯化铵lg、磷酸氢 二钠6g溶于纯水1L而得到的培养基)上。从出现的菌抹提取质粒，以其 作为RSFPPG。在Pantoea ananatis SC17sucA林中导入L-谷氨酸生产质粒 RSFPPG,构建了 L-谷氨酸生产菌SC17sucA/RSFPPG (本菌抹称为"NA1 抹，，)。
上述SC17sucA抹是这样得到的作为能够在低pH条件下含L-谷氨酸 和碳源的培养基上增殖的菌抹从自然界分离出AJ13355抹，从AJ13355抹 获得粘液质低生产突变抹(SC17),破坏该菌林的sucA基因从而得到 SC17sucA抹(美国专利第6,596,517号)。SC17sucA抹的内部编号为AJ417， 其于平成16年2月26日保藏于经济产业省工业技术院生命工学工业技术 研究所(现名称产业技术综合研究所专利生物保藏中心，邮政编码 305-8566 茨城县筑波市东1 丁目1番地1中央第6),保藏号FERM BP-08646。
实施例2L-谷氨酸的生产
将1个接种环量的谷氨酸生产菌Pantoea ananatis NA1的甘油保存液接 种到LBGM9-琼脂糖平板培养基(胰蛋白胨1%、酵母抽提液0.5%、氯化钠 1.05%、葡萄糖0.5%、七水合硫酸镁0.05%、十二水磷酸氢二钠1.72%、磷 酸二氢钾0.3%、氯化铵0.1%、琼脂糖2%、四环素盐酸盐25mg/L)上，34 。C静置培养24小时。
将相当于1张平皿的前培养菌体接种到具有下述组成的培养基300ml 中。使用总容量1L的小型发酵罐进行了培养，其中搅拌叶轮的功率密度为 3.3kW/m3，培养同时通入lvvm的经灭菌过滤装置灭菌的压缩空气。此外， 培养中温度保持在34。C，用氨气将pH保持在4.7。在培养的第20小时，通 过适宜地流加700g/L的蔗糖溶液，将小型发酵罐内的糖浓度调节为5~ 20g/L。此外，在培养的第20小时，添加L-谷氨酸的a晶体20g，在将搅拌 的功率密度改变为2.4 kW/m3、 15.5kW/m3、 19.9 kW/m3的3种条件下进行 了培养。〔培养基组成〕
蔗糖 100g/L
MgS04'7H20 0.4g/L
(NH4)2S04 5g/L
KH2P04 6g/L
酵母提取物 6g/L
NaCl 1.5g/L
FeS04'7H20 20mg/L
MnS04.4H20 20mg/L
L-赖氨酸盐酸盐 0.6g/L
DL-曱硫氨酸 0.6g/L
二氨基庚二酸 0.6g/L
CaCl2.2H20 2.64mg/L
ZnS04'7H20 0.72mg/L
CuS04.5H20 0.64mg/L
CoCl2.6H20 0.72mg/L
H3B03 0.4mg/L
Na2Mo04 2H20 1.2mg/L
四环素盐酸盐 25mg/L
培养49小时后，测定培养基中的L-谷氨酸浓度，计算出生产速度，结 果如图3所示。生产速度是以将搅拌功率密度为15.5kW/m3的条件下的生产 性作为1时的相对值来描述的。
实施例3L-苏氨酸的生产
作为L-苏氨酸生产菌，使用了大肠杆菌VKPM B-5318 (欧洲公开第 0593792号)。
将1个接种环量的大肠杆菌VKPM B-5318的甘油保存液接种到LB-琼 脂糖平板培养基(蛋白胨1%、酵母抽提液0.5%、氯化钠0.5%、琼脂糖1.5%、 链霉素硫酸盐100mg/L)上，37。C静置培养24小时。
将相当于1/10平板量的上述培养液接种到置于500ml坂口烧瓶中的 50ml LB培养基(胰蛋白胨1%、酵母抽提液0.5%、氯化钠0.5%、卡那霉素硫酸盐25 mg/L、链霉素硫酸盐20 mg/L )中，40。C振荡下(144转/分钟) 进行4小时的前培养。
准备具有下述组成的主培养培养基300ml，分别接种种子培养液30ml。 使用总容量1L的小型发酵罐，在40。C、 5.5kW/m3的搅拌下实施主培养， 培养同时通入lvvm的经灭菌过滤装置灭菌的压缩空气。此外，培养期间温 度保持在40。C，用氨气将pH保持在7.0。培养中，通过适宜地流加700g/L 的蔗糖溶液，将小型发酵罐内的糖浓度调节为5~20g/L。此外，在第21小 时，添加L-苏氨酸的晶体24g(70g/L)，在将搅拌叶轮的功率密度改变为2.4 kW/m3、 5.5kW/m3、 13.5 kW/m3的3种条件下进行了培养。 〔主培养培养基组成〕
蔗糖 40g/L
MgS04 7H20 0.36g/L
(NH4)2S04 4.5g/L
FeS04 7HO 18mg/L
MnS04 4H20 18mg/L
K2HP04 l,5g/L
NaCl 0.6g/L
酵母提取物 1.8g/L
卡那霉素硫酸盐 25mg/L
链霉素好u酸盐 25mg/L
培养45小时后，测定培养基中的L-苏氨酸浓度，计算出生产速度，结 果如图4所示。生产速度是以将搅拌功率密度为5.5kW/m3的条件下的生产 性作为1时的相对值来描述的。
实施例4L-苯丙氨酸的生产
作为L-苯丙氨酸生产菌，使用大肠杆菌AJ12741抹(特许第3225597 号公报，以下也记作"R/GAL林")。该菌林是在缺失tyrR、 tyrA基因的 大肠杆菌K-12的W3110抹中导入编码反馈抑制解除的3-脱氧-D-阿拉伯庚 酮糖酸-7-磷酸合酶的aroG4基因、编码分支酸变位酶-预苯酸脱水酶的pheA 基因以及编码莽草酸激酶的aroL基因而得到的菌抹。该菌林于平成4年 (1992年)6月11日保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(地址〒305-8566日本国茨城县筑波市东i 丁目i番地1中央第6)， 保藏号FERM P-13000,平成6年(1994年)9月14日转为国际保藏，保藏 号FE謹BP画4796。
将1个接种环量的AJ12741株的甘油保存液接种到LBG-琼脂糖平板培 养基(胰蛋白胨1%、酵母抽提液0.5%、氯化钠1%、琼脂糖1.5%) , 35 'C静置培养24小时。
将相当于1张平皿量的上述前培养菌体接种到具有表5所示组成的培 养基300ml中。使用总容量1L的小型发酵罐培养约16小时，其中，搅拌 叶轮的功率密度为3.3 kW/m3，培养的同时通入lvvm的经灭菌过滤装置灭 菌的压缩空气。此外，培养中温度保持在35。C。用氨气将pH保持在6.5。 〔种子培养基组成〕
葡萄糖 40g/L
MgS04 lg/L
(NH4)2S04 16g/L
KH2P04 lg/L
酵母提取物 2g/L
FeS04'7H20 10mg/L
MnS04'4H20 8mg/L
L-酪氨酸 lg/L
氨苄青霉素钠 lOOmg/L
准备具有下述组成的主培养培养基300ml,在其中接种种子培养液 30ml。使用总容量1L的小型发酵罐，在35。C、搅拌叶轮的功率密度为3.3 kW/m3的搅拌下实施主培养，培养的同时通入lvvm的经灭菌过滤装置灭菌 的压缩空气。此外，培养期间将温度保持在35。C，用氨气将pH保持在6.5。 培养中，通过适宜地流加500g/L的葡萄糖溶液，将小型发酵罐内的糖浓度 调节为5 20g/L。此外，第24小时，添加L-苯丙氨酸的晶体20g,在以下 4个条件下进行培养:将搅拌叶轮的功率密度改变为5.5 kW/m3、 15.5 kW/m3、 19.9 kW/m3的条件，或者控制在2.4 kW/m3以下。 〔主培养培养基组成〕
葡萄糖 40g/L
MgS04 lg/L酵母提取物
FeS04.7H20 MnS04.4H20
L-酪氨酸
(NH4)2SO. KH2P04
i6g/L
2g/L
8g/L
lOmg/L
8mg/L
1.4g/L
氨苄青霉素钠
lOOmg/L
实施例5肌苦和/或鸟苷的生产
将1个接种环量的生产肌苷和鸟苷的解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens) AJ1991抹(VKPM B-8994,参照美国专利第3,575,809 号)的甘油保存液接种到LBG-琼脂糖平板培养基(胰蛋白胨1%、酵母抽 提液0.5%、氯化钠1°/。、琼脂糖1.5°/。) ， 34。C静置培养24小时。AJ1991 抹又名G1136A抹，2005年3月10日保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中 心(Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika) (Russia, 117545 Moscow, 1st Dorozhny proezd， 1)，保藏号VKPM B-8994。 2006年10月13日转为国际保藏。
将1个铂接种环量的上述前培养菌体接种到装在500ml坂口烧瓶中的 下述组成的培养基50ml中，34°C、振荡下(115转/分钟)进行16小时的 前培养。
〔种子培养基组成〕
葡萄糖30g/L
NH4C13g/L
KH2P040.5g/L
MgS04'7H200.4g/L
FeS04.7H20lOmg/L
MnS04.4H20lOmg/L
大豆水解物1.2g/L
酵母提取物0.5g/L
核糖核酸5g/L
准备具有下述组成的主培养培养基300ml,接种种子培养液15ml。使功率密度3.3kW/m3的搅拌 下实施主培养，培养同时通入lvvm的经灭菌过滤装置灭菌的压缩空气。此 外，培养期间保持温度为34°C，用氨气将pH保持在6.5。培养中，通过适 宜地流加500g/L的葡萄糖溶液，将小型发酵罐内的糖浓度调节为5 ~ 20g/L。 此外，在第24小时，添加鸟苷晶体0.8g,并在下述4个条件下进行培养 将搅拌叶轮的功率密度改变为5.5kW/m3、 15.5 kW/m3、 19.9 kW/m3的条件， 或者控制在2.4 kW/m3以下的条件。
〔主培养培养基组成〕
葡萄糖200g/L
NH4C12.5g/L
KH2P041.3g/L
MgS04.7H201.5g/L
FeS04.7H20lOmg/L
MnS04.4H20lOmg/L
大豆水解物1.3g/L
核糖核酸1.24g/L
KC115g/L
DL-曱硫氨酸50mg/L
工业实用性
根据本发明，能够在通过使用具有L-氨基酸或核酸生产能力的微生物 的发酵法进行的L-氨基酸或核酸生产方法中提高L-氨基酸或核酸的生产 率。L-氨基酸或核酸的生产率包括对糖收率的提高、和/或生产速度的提高。
权利要求
1.一种生产L-氨基酸或核酸的方法，包括在具有搅拌叶轮的发酵罐内的液体培养基中培养具有生产L-氨基酸或核酸的能力的微生物，根据需要向培养基中添加晶种，从而在该培养基中生成并蓄积L-氨基酸或核酸的晶体，并且从培养物中收集L-氨基酸或核酸的晶体；其特征在于，在晶体析出后或添加晶种后将搅拌叶轮的功率密度控制在2.4kW/m3以下。
2. 权利要求1所述的方法，其特征在于，所述晶体析出后或添加晶种 后的搅拌叶轮的功率密度为0.5kW/n^以上。
3. 权利要求1所述的方法，其特征在于，在进行培养的同时将晶体析 出前或添加晶种前的搅拌叶轮的功率密度控制在3.0kW/m3以上。
4. 权利要求1~3中任一项所述的方法，其中，所述微生物是属于肠杆 菌科的微生物。
5. 权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述微生物是棒状杆菌 型细菌或芽孢杆菌属细菌。
6. 权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述L-氨基酸是选自 L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-苏氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸或它们的衍生物中 的1种或2种以上的L-氨基酸。
7. 权利要求1 ~6中任一项所述的方法，其中，所述核酸是选自肌苷、 腺苦、鸟苷、黄苷、肌苷酸、腺苷酸、鸟苷酸、黄苷酸或它们的衍生物中 的1种或2种以上的核酸。
全文摘要
一种生产L-氨基酸或核酸的方法，包括在具有搅拌叶轮的发酵罐内的液体培养基中培养具有生产L-氨基酸或核酸的能力的微生物，根据需要向培养基中添加晶种，从而在该培养基中生成并蓄积L-氨基酸或核酸的晶体，并且从培养物收集L-氨基酸或核酸的晶体，其中，在晶体析出后或添加晶种后将搅拌叶轮的功率密度控制在2.4kW/m³以下。
文档编号C12P13/04GK101617054SQ20088000561
公开日2009年12月30日 申请日期2008年1月9日 优先权日2007年2月20日
发明者大西史人, 奥谷聪志, 岩谷真太郎, 日比野涉, 浅野贵弘, 渡边旭启, 荒木政行, 近藤一也, 高桥裕典 申请人:味之素株式会社