通过添加含二醇的物质调节酶的方法

专利名称：通过添加含二醇的物质调节酶的方法
技术领域：
本发明涉及提高酶的选择性的方法。
背景技术：
酶活性会受到其他分子的影响，例如抑制剂会降低酶活性，而激 活剂会提高酶活性。此外，分子还可提高酶的选择性。
WO 2005/070468公开了使用转谷氨酰胺酶(TGase)来催化包含合 适官能团的化合物向肽中的掺入，其中所述官能团之后被用作进一步 的缀合点。但是，主要产物不能以50%以上的产率获得。因此需要有 改进酶选择性以提高反应经济性的方法。 发明概述
本发明的 一 个方面提供提高酶催化反应的选择性和/或产率的方 法，所述方法包括在选自乙二醇、丙二醇或甘油之一的增效化合物 (enhancing compound)存在下进行反应。
在本发明的一个方面，酶催化反应包括第一化合物和肽之间的共 价一建形成，所述方法包括使第 一化合物与肽在酶和所述增效化合物存 在下在一个或多个步骤中发生反应。
本发明的另一个方面提供可通过该方法获得的肽。 附图简述


图1示出在乙二醇(EG)存在和不存在下酶反应的反应曲线。
图2显示在乙二醇存在和不存在下获自hGH的转氨作用的电泳图。
图3示出TGase Activa WM和TGase MTG P2在乙二醇存在和不 存在下的反应曲线。
图4示出在10-40% v/v乙二醇存在下酶反应的反 曲线。200880005602.9
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图5示出在40-70% v/v乙二醇存在下酶反应的反应曲线。 图6示出不同浓度的TGaseMTGP2在乙二醇存在和不存在下的 反应曲线。
图7示出在乙二醇、甘油、丙二醇(propyleneglycol)或1,3丙二醇 (1,3 propanediol)存在下酶反应的反应曲线。
图8示出不同浓度的TGaseMTGP2在甘油存在下的反应曲线。 发明详述
"转谷氨酰胺酶(TGase)"(E.C.2.3.2.13)也称蛋白质-谷氨酰胺卞谷 氨酰转移酶，能催化以下通式反应
q_1Lnh2 + q'—nh2 ->q~^"^j-q' + nh3
胺接纳体(acceptor)可代表含谷氨酰胺的肽，胺供体(donor)则代表 第一化合物。或者，胺接纳体可代表第一化合物，胺供体则代表含赖 氨酸的肽。
不同的转谷氨酰胺酶在例如谷氨酰胺(Gln)周围需要什么氨基酸 残基才能使肽成为底物方面互不相同，即取决于什么氨基酸残基邻近 Gln残基，不同的转谷氨酰胺酶会以不同的含Gln的肽作为底物。
有用的转谷氨酰胺酶的实例包括微生物转谷氨酰胺酶，例如来自 以下孩￡生物茂原链霉菌(5Vw/7tomycas 、 肉桂链霉菌
(5Vre; tomyc^ cz力wamowewm)和灰肉色链霉菌(5Vr印tow少ces gn、eocamewm)(均乂>开于US 5,156,956,该专利通过引用并入本文)， 以及薰衣草链霉菌CSV"/7tomyc" /avem/w/ae)(公开于US 5,252,469，该 专利通过引用并入本文)和&^ptom_ycas /a^^mwm (JP2003199569 ，该 专利通过引用并入本文)。应注意，以前的4仑枝链霉菌属 (Streptoverticillium)的各成员现在纳入链霉菌属(Streptomyces) (Kaempfer, J.Gen.Microbiol. H2, 1831-1892 (1991))。其他有用的微生物 转谷氨酰胺酶已从枯草芽孢杆菌(5flc"/w (公开于US
5,731,183，该专利通过引用并入本文)和/人各种私菌(myxomycetes)分离到。有用的微生物转谷氨酰胺酶的其他实例，是WO 96/06931 (例 如来自Ba"7/ws (y&ct^的转谷氨酰胺酶)和WO 96/22366中公开的那些 实例，这两个专利通过引用并入本文。有用的非微生物转谷氨酰胺酶 包括豚鼠肝脏转谷氨酰胺酶，和各种海洋生物来源的转谷氨酰胺酶， 例如来自牙鲆(尸agmy (公开于EP 0555649，该专利通过引用并
入本文)和太平洋牡蛎(Cmsm^ea (公开于US 5,736,356,该专
利通过引用并入本文)的转谷氨酰胺酶。
本发明基于某些分子能提高酶的选择性的这样一个发现。本发明 的 一个方面提供提高酶催化反应的选择性和/或产率的方法，所述方法 包括在选自乙二醇、丙二醇或甘油之一的增效化合物存在下进行反 应。在一个实施方案中，增效化合物是乙二醇。
化合物的加入有益地帮助改进反应的经济性。此外，增效化合物 能使反应混合物在储存过程中不易败坏，因为它能防止冷冻和沉淀； 而且它还能使纯化更加容易。
在一个实施方案中，增效化合物以20-95%的浓度范围存在。在一 个实施方案中，增效化合物以30-70%的浓度范围存在。
应理解，增效化合物的浓度还要取决于酶的浓度。优化酶的量和 增效化合物的量，这都在本领域技术人员的普通技能范围内，可例如 用因子设计来进行。
在一个实施方案中，酶催化反应包括第一化合物和肽之间的共价 键形成，所述方法包括使第 一化合物与肽在酶和增效化合物存在下在 一个或多个步骤中发生反应。
在本说明书中，词语"肽"和"蛋白质，，可互换使用，意在表示同一 物质。
术语"肽"意在表示具有两个或更多个通过肽键连接的氨基酸残基 的化合物。组成性氨基酸可来自由遗传密码编码的氨基酸群体，且它 们可以是不由遗传密码编码的天然氨基酸，以及合成氨基酸。不由遗 传密码编码的天然氨基酸例如是羟脯氨酸、y-羧基谷氨酸、鸟氨酸、磷酸丝氨酸、D-丙氨酸和D-谷氨酰胺。合成氨基酸包括通过化学合成
制备的氨基酸，即由遗传密码编码的氨基酸D-异构体，如D-丙氨酸 和D-亮氨酸、Aib(a-氨基异丁酸)、Abu(a-氨基丁酸)、Tie (叔丁基甘 氨酸)、(3-丙氨酸、3-氨基曱基苯曱酸和邻氨基苯曱酸。
术语"肽，，还意在包括被其他肽类、糖类、脂质类或别的有机化合 物取代的所述化合物，以及其中一个或多个氨基酸残基已被化学修饰 的化合物。该术语还意在包括连接有辅基的肽。
在一个实施方案中，酶选自转谷氨酰胺酶、分选酶、蛋白酶、连 接酶、糖基转移酶、糖合成酶(glycosynthase)、糖肽酶、糖苷酶、酪氨 酸酶、赖氨酰氧化酶。在一个实施方案中，酶是转谷氨酰胺酶。
肽必须是根据本发明方法的酶的底物。例如，如果酶是转谷氨酰 胺酶，则要求肽含有Gln或Lys残基，特别是Gln残基。
人们认识到，某化合物是否是指定的酶的底物，原则上取决于反 应条件，例如时间范围(timeframe)。若有足够的时间，许多通常不被 认为是底物的化合物事实上成为底物。当上文陈述到对于指定的酶来 说一些残基可能是底物而其他则不是底物时，意在表示在仍能达到期 望的选择性的程度上"其他则不是"。如果一个或多个残基是酶的底物， 但只有当与该酶长时间接触时才是底物，且需要保持未被缀合，则可 通过在合适时间后除去或灭活该酶来实现选择性。
如果指定的肽不是酶的底物，可以插入一个或多个残基来使该肽 成为底物。例如，可将Gln或Lys残基特别是Gln残基加到该肽序列， 以使该肽成为转谷氨酰胺酶的底物。原则上，这些残基可在序列的任 何位置插入，但是优选在这样的位置插入，即在该位置的插入不会使 该肽的生理活性如治疗活性受影响至该肽不再例如在治疗干预中有 用的地步。氨基酸残基在肽中的插入可通过本领域技术人员知道的标 准技术实现，如翻译后化学修饰或者转基因技术。
任何作为前文所述的酶的底物的肽，都可通过本发明的方法进行 缀合，例如肽可选自但不限于酶类、肽激素类、生长因子类、抗体类、
10细胞因子类、受体类、淋巴因子类和疫苗抗原类，特别值得一提的是
治疗性肽类，如胰岛素、胰高血糖素样肽1 (GLP-1)、胰高血糖素样肽 2 (GLP-2)、生长激素、细胞因子、三叶因子肽(TFF)、黑皮质素受体 调节物(modifier)和VII因子化合物。
名词术语"缀合物"意在表示经修饰的肽，即具有与其连接以修饰 其特性的部分(moiety)的肽。动词术语"缀合"意在表示将某部分连接到 某肽以》务饰该肽的特性的过程。
WO2005/070468 (该专利通过引用并入本文)公开了多种特别适用 于本发明提供的方法的肽。
适用于本发明方法的其他类别的肽或蛋白质包括酶类。有许多酶 用于各种工业用途，特别值得一提的是水解酶(蛋白酶、脂肪酶、纤维 素酶、酯酶)、氧化还原酶(漆酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化 物歧化酶、脂氧合酶)、转移酶和异构酶。
其他适用于本发明方法的肽或蛋白质包括ACTH、促肾上腺皮质 激素释放因子、血管紧张素、降钙素、胰岛素及其片段和类似物、胰 高血糖素、IGF-1、 IGF-2、肠胃泌素(enterogastrin)、胃泌素、四肽胃 泌素、五肽胃泌素、尿胃泌素(urogastrin)、表皮生长因子、分泌素、 神经生长因子、促曱状腺素释放激素、促生长素抑制素、生长激素释 放激素、生长调节素、甲状旁腺激素、血小板生成素、促红细胞生成 素、下丘脑释》文因子、催乳素、曱状腺刺激激素、内啡肽、脑啡肽、 血管加压素、催产素、阿片样物质(opiods)及其类似物、天冬酰胺酶、 精氨酸酶、精氨酸脱氨酶、腺苷脱氨酶和核糖核酸酶。
本文所用的指涉多肽的术语"类似物"，是指其中该肽的一个或多 个氨基酸残基已被其他氨基酸残基取代的经修饰肽，和/或其中一个或 多个氨基酸残基已从该肽缺失的经修饰肽，和/或其中一个或多个氨基 酸残基已向该肽添加的经修饰肽。氨基酸残基的这种添加或缺失，可 在肽的N末端和/或在肽的C末端进行，或者在肽序列的内部进行。 所有没有指明旋光异构体的氨基酸都要理解为意指L-异构体。来源，其中所述肽可以在它存在于自然界中这个意义上是"天然的"， 或者在它仅因为人类干预而存在这个意义上是"非天然的"。在一个实施方案中，第一化合物包含一个或多个在构成所述肽的 任何氨基酸残基中不易接近的官能团或者潜在官能团。在一些实施方案中，第一化合物由下式表示 H2N—D—R—X其中D代表键或氧； R代表接头或4定；X包含一个或多个在构成所述肽的任何氨基酸残基中不易接近的 官能团或者潜在官能团。在这种实施方案中，X可选自或者可被活化成酮-、醛-、-NH-NH2、 -0-C(0)-NH-NH2 、 -NH-C(0)-NH-NH2 、 -NH-C(S)-NH-NH2 、 -NHC(0)-NH-NH-C(0)-NH-NH2 、 -NH-NH-C(0)-NH-NH2 、 -NH-NH-C(S)-NH-NH2 、 -NH-C(0)-C6H4-NH-NH2 、 -C(0)-NH-NH2 、 -0-NH2 、 -C(0)-0-NH2 、 -NH-C(0)-0-NH2 、 -NH-C(S)-0-NH2 、 C(0)-NH2、 Ar-NH2、炔、叠氮化物或腈-氧化物。在一个实施方案中，第一化合物选自4-(氨基曱基)苯乙酮、4-(2-氨基乙基)苯乙酮、N-(4-乙酰苯基)2-氨基乙酰胺、1-[4_(2-氨基乙氧基) 苯基]乙酮、l-[3-(2-氨基乙氧基)苯基]乙酮、1，4-双(氨基氧基)丁烷、3-氧杂戊烷-l,5-二氧基胺、1,8-二氨基氧基-3,6-二氧杂辛烷、1,3-双(氨基 氧基)丙-2-醇、1,11-双(氨基氧基)-3,6,9-三氧杂十一碳烷、1,3-二氨基-2-丙醇、1,2-双(氨基氧基)乙烷和1，3-双(氨基氧基)丙烷。在一个实施方案中，将反应緩冲到6-9之间的pH。在一个实施方 案中，将反应緩冲到7-8.6之间的pH。在一个实施方案中，反应在15-45。C之间的温度下进行。在一个实施方案中，反应在20-37。C之 间的温度下进行。在一个实施方案中，所述方法另外包括以下步骤(b) 任选活化潜在的官能团；和(c) 使所述官能化的肽与包含一个或多个官能团的第二化合物在 一个或多个步骤中发生反应，其中所述官能团不与构成所述肽的氨基 酸残基中易接近的官能团反应，且其中所述第二化合物中的所述官能 团能够与所述第一化合物中的所述官能团发生反应，使得所述官能化 肽和第二化合物之间形成共价键。在一个实施方案中，第二化合物由下式表示 Y—E—Z其中Y代表包含一个或多个能与X中存在的官能团反应的官能团 的基团(radical)，且所述官能团不会与所述肽中易接近的官能团反应； E代表接头或键； Z是待与肽缀合的部分。X和Y中包含的官能团之间的反应会形成部分(moiety)。该部分 原则上可以属任何类型，但由期望最终缀合肽有什么特性而定。在一 些情况中，可能需要有可在某后期阶段例如通过某种酶促作用或通过 光分解断裂的不稳定键。在其他情况中，可能需要有稳定的键以获得 稳定的缀合肽。特别值得一提的是通过胺衍生物和羰基基团之间的反 应形成的那类部分，如肝部分、腙部分、苯腙部分和半卡巴腙部分。在本说明书中，术语"肟部分"表示包含"肟键"的部分，即意在表 示式-C-N-O-所示的部分。在本说明书中，术语"腙部分"表示包含"腙键"的部分，即意在表 示式-C-N-N-所示的部分。在本说明书中，术语"苯腙部分"表示包含"苯腙键"的部分，即意 在表示下式所示的部分—C=N—N在本说明书中，术语"半卡巴腙部分"表示包含"半卡巴腙键"的部 分，即意在表示式-C-N-N-C(O)-N-所示的部分。在一个实施方案中，X和Y的官能团选自羰基如酮基和趁基团， 以及氨基衍生物。应理解，如果X中包含的官能团是羰基基团，则Y中包含的官能 团是胺衍生物，反之亦然。由于大多数肽中存在-NH2基团，如果X 包含酮或醛官能团(fimctionality),可获得更好的选择性。X和Y中存在的合适的一对官能团的另一个实例，是叠氮化物衍 生物(-N3)和炔，它们能反应形成三唑部分。合适的一对的又一个实例 是炔和腈-氧化物，它们能反应形成异嚼唑烷部分。应理解，X中包含的官能团可在其与Y-E-Z反应前必须进行活化 这个意义上是潜在的。举例说，X可包含在与合适的试剂反应时被转 化成醛或酮的部分。第一化合物和第二化合物都包含接头，分别为R和E。这些相互 独立的接头可不存在或选自以下烷烃、烯烃或炔烃二价基团(dimdical) 和杂烷烃、杂烯烃和杂炔烃二l介基团，其中一个或多个任选取代的芳 族同素环状(homocyclic)二价基团或者杂环化合物的二价基团如亚苯 基或哌啶二价基团可插入到前述的二价基团中。应理解，这种接头还 可包含被选自羟基、囟素、硝基、氰基、羧基、芳基、烷基和杂芳基 的基团进行的取代。术语"烷烃"意在表示饱和的直链、支链和/或环状的烃。除另有指 明碳原子数目的外，该术语意在表示具有1-30 (包括l和30)个碳原子， 例如1-20 (包括1和20)个，例如1-10 (包括1和IO)个，如1-5 (包括1 和5)个；或者15-30 (包括15和30)个^友原子的烃。术语"烯烃，，意在表示包含至少一个碳-碳双键的直链、支链和/或环状的烃。除另有指明碳原子数目的外，该术语意在表示具有2-30 (包 括2和30)个碳原子，例如2-20 (包括2和20)个，例如2-10 (包括2 和10)个，如2-5(包括2和5)个；或者15-30 (包括15和30)个碳原子 的烃。术语"炔烃"意在表示包含至少一个碳-碳三键的直链、支链和/或 环状的烃，且它可任选包含一个或多个碳-碳双键。除另有指明碳原子 数目的外，该术语意在表示具有2-30 (包括2和30)个碳原子，例如 2-20 (包括2和20)个，例如2-10 (包括2和IO)个，如2-5 (包括2和 5)个；或者15-30 (包括15和30)个碳原子的烃。术语"杂烷烃"、"杂烯烃"和"杂炔烃"意在表示所述部分的结构中 已插入一个或多个杂原子或基团的如上定义的烷烃、烯烃和炔烃。杂 基团和原子的实例包括-O-、 -S-、 -S(O)-、 -S(0)r、 -C(O)-、 -C(S)-和 -N(R*)-，其中11*代表氢或Cl-C6-烷基。术语"同素环状芳族化合物"(或基团)意在表示芳烃如苯和萘。术语"杂环化合物"意在表示包含5、 6或7个环原子，其中1、 2、 3或4个是选自N、 0和/或S的杂原子的环状化合物。杂环芳族化合 物的实例包括噻吩、呋喃、吡喃、吡咯、咪唑、p比哇、异噻唑、异噁 唑、吡，定、吡。秦、嘧咬、。达，秦以及它们的部分或完全氢化的对等物 (equivalent),如味咬、他哇烷、p比咯烷、吡唂啉(pyroline)、咪哇烷、 咪哇啉、口底口秦和吗啉o术语"囟素，，意在表示元素周期表第七主族的成员，例如F、 Cl、 Br和I。在本说明书中，术语"芳基"意在表示其中至少一个环是芳环的同 素环状芳环基团或稠合同素环状环系基团。典型的芳基基团包括苯 基、联苯基、萘基、四氢化萘基等。术语"基团"或"二价基团"意在表示已分别除去一个或两个氢原子 的化合物。当具体指明时，基团还可表示通过从化合物正式去除大的 原子团如羟基形成的部分。本文中单独或组合使用的术语"杂芳基"，是指具有例如5-7个环 原子的芳环基团，或者指具有例如7-18个环原子的稠合芳族环系基 团，其中至少一个环是芳环且含有一个或多个选自氮、氧或硫的杂原 子作为环原子，其中N-氧化物和一氧化硫和二氧化硫是可允许的杂芳 族取代。实例包括呋喃基、噻吩基(thienyl)、噻吩基(thiophenyl)、吡咯 基、咪唑基、p比峻基、三唑基、四唑基、噻唑基、嗨唑基、异嚼唑基、 噁二唑基、噻二唑基、异噻唑基、吡啶基、哒。秦基、吡嗪基、嘧啶基、 喹啉基、异喹啉基、苯并呋喃基、苯丙噻吩基、吲咮基和吲唑基等。E和R都代表键或接头，在本说明书中术语"接头"意在表示充当 将Y与Z隔开和将X与NH2-D-隔开的手段的部分。接头E和R的一 个功能可以是提供肽和缀合部分Z之间的连键的足够柔性。E和R的 典型实例包括直链、支链和/或环状的Cwo亚烷基、CwQ亚烯基、C2-10 亚炔基、C2—u)亚杂烷基、Cw()亚杂烯基、Cw()亚杂炔基，其中可插入 一个或多个同素环状芳族化合物二价基团或杂环化合物二价基团。WO 2005/070468 (该专利通过引用并入本文)公开了多种特别适 用于本发明提供的方法的键和接头。Z的具体实例包括包含一个或多个标记如荧光标志的基团，如 荧光素基团、罗丹明基团、TexasRed⑧基团和藻胆蛋白基团；酶底物， 如对硝基苯酚乙酸酯(p-nitrophenol acetate)基团；和放射性同位素，如 Cu-64、 Ga67、 Ga-68、 Zr-89、 Ru画97、 Tc-99、 Rh-105、 Pd-109、 In画lll、 1-123、 1-125、 1-131、 Re-186、 Re-188、 Au-198、 Pb-203、 At-211、 Pb画212 和Bi-212;有机部分，如PEG或mPEG基团及其氨基衍生物(包括直 链和支链PEG和mPEG基团)；直链、支链和/或环状的Cw2烷基、C"2烯基、Cw2炔基、Q.22杂烷基、C2.22杂烯基、02.22杂炔基，其中可插入一个或多个同素环状芳族化合物二价基团或杂环化合物二价基团，且其中所述d-22或C2-22基团可任选被一个或多个选自羟基、 卣素、羧基杂芳基和芳基的取代基取代，其中所述芳基或杂芳基可任选被一个或多个选自羟基、卣素和羧基的取代基取代；类固醇基团；16脂质基团；多糖基团，例如葡聚糖；聚酰胺基团，例如聚氨基酸基团； PVP基团；PVA基团；聚(l画3-二氧杂环戊烷(dioxalane));聚(l，3,6-三 嗯烷)；乙烯/马来酸肝聚合物；Cibacron染料，如Cibacron Blue 3GA; 指明长度的聚酰胺链，如WO 00/12587中所公开(该专利通过引用并 入本文)；和幾烷基淀粉，如羟乙基淀粉，如WO 03/074087和WO 02/80979中所公开(该两个专利通过引用并入本文)。术语"PEG"意在表示分子量在大约100到大约1,000,000 Da之间 的聚乙二醇，包括其类似物在内，其中例如末端OH基团已被烷氧基 如甲氧基、乙氧基或丙氧基替代。具体的说，其中末端OH基团已被 曱氧基替代的PEG称为mPEG。术语"mPEG"(或者更正确的说"mPEG基")意指以下结构的多分散 或单分散基团其中m为大于1的整数。因此，其中m为90的mPEG其分子量为3991 Da,即大约4kDa。 同样，平均分子量为20kDa的mPEG其平均m值为454。由于生产 mPEG的工艺，这些分子往往具有分子量分布。这种分布由多分散性 指数描述。本文所用的术语"多分散性指数"意指聚合物化学领域所知的重均 分子量与数均分子量之比(参见例如"Polymer Synthesis and Characterization", J.A. Nairn,美国犹他州大学，2003)。例如，当提及20kDaPEG或20kDamPEG时，意在表示多分散 性指数在1.06以下、如1.05以下、如1.04以下、如1.03以下、如1.02-1.03 之间的化合物(或者事实上为各化合物的混合物)。特别值得一提的是d。—2。烷基如ds烷基和Cn烷 (尤其是直链 d5烷基和C17烷基)衍生物和下式的苯曱酮衍生物o特别值得一提的是包含如下所示的cibacronyl基团的Z:SO。H SO，H与才艮据本发明的肽缀合的PEG或mPEG可以具任何分子量。具 体的说，分子量可以在500-1000,000 Da之间，如500-500,000 Da之 间，如500-100,000 Da之间,如500-60,000 Da之间，如1000-40,000 Da 之间，如5000-40,000 Da之间。具体的说，可4吏用分子量在 10，000-40,000 Da之间、如20,000 Da-40,000 Da之间、如20,000-30,000 Da之间或30,000-40，000 Da之间的PEG。特别值得一提的是分子量为 10,000、 20,000、 30,000或40,000 Da的PEG或mPEG。z可以为支链，使得z包含超过一个上述标记或基团。例如， mPEG40K通常是作为两臂各包含mPEG20k的支链mPEG来得到。在一个实施方案中，Z包含一个或多个已知能结合血浆蛋白质如 清蛋白的部分。某化合物结合清蛋白的能力可如J.Med.Chem， 41, 1986-1992 (2000)中所述进行测定，该文献通过引用并入本文。在本说 明书中，某化合物如果Ru/Da在0.05以上、如0.10以上、如0.12以 上乃至0.15以上，则定义为与清蛋白结合。在本发明的一个实施方案中，清蛋白结合部分是肽，如包含不到 40个氨基酸残基的肽。J. Biol Chem. 277(38), 35035-35043 (2002)中公 开了多种作为清蛋白结合部分的小肽，该文献通过引用并入本文。WO2005/070468 (该专利通过引用并入本文)公开了多种特别适用 于本发明提供的方法的式Y-E-Z化合物。反应后，可通过本领域公知的技术将肽分离和纯化。因此，在一 个实施方案中，本发明提供可按本发明方法获得的肽。肽还可转化成 药物可接受盐或前体药物，如果适当的话。具体的说，所述方法还包 括将所得的缀合肽配制成药物组合物的步骤。在本说明书中，术语"药物可接受盐"意在表示对患者无害的盐。 这种盐包括药物可接受的酸加成盐、药物可接受的金属盐、铵和烷基 化铵盐。酸力口成盐包括无机酸及有机酸的盐。合适的无机酸的代表性 实例包括盐酸、氢溴酸、氢碘酸、磷酸、硫酸、硝酸等。合适的有机 酸的代表性实例包括曱酸、乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸、丙酸、苯曱 酸、肉桂酸、4科蒙酸、富马酸、乙醇酸、乳酸、马来酸、苹果酸、丙 二酸、扁桃酸、草酸、苦味酸、丙酮酸、水杨酸、琥珀酸、甲磺酸、 乙磺酸、酒石酸、抗坏血酸、朴姆酸、双亚曱基水杨酸(bismethylene salicylic acid)、乙二磺酸、葡糖酸、柠康酸、天冬氨酸、硬脂酸、椋 榈酸、EDTA、乙醇酸、对氨基苯曱酸、谷氨酸、苯磺酸、对曱苯磺 酸等。药物可接受的无机酸或有机酸加成盐的更多实例，包括J. Pharm. Sci. 1977,^,2(通过引用并入本文)中列举的药物可接受盐。金属盐的 实例包括锂盐、钠盐、钾盐、镁盐等。铵和烷基化铵盐的实例包括铵 盐、曱基铵盐、二甲基铵盐、三曱基铵盐、乙基铵盐、羟乙基铵盐、 二乙基铵盐、丁基铵盐、四曱基铵盐等。本文所用的术语"前体药物"意在表示这样的化合物，它不一定具 有治疗活性，但在给予时会被体内发生的反应转化成治疗活性化合 物。通常，这种反应包括水解(例如通过酯酶进行)或氧化。前体药物 的实例包括可生物水解的酰胺和可生物水解的酯，亦涵盖a)其中这种 前体药物中的可生物降解官能团涵盖在根据本发明的化合物中的化 合物，和b)可在指定官能团处发生生物氧化或还原以产生根据本发明 的药物物质的化合物。这些官能团的实例包括1,4-二氢吡啶、N-烷基羰基-l,4-二氢吡啶、1,4-环己二烯、叔丁基等。本文所用的术语"可生物水解的酯"是药物物质(这里指的是根据 本发明的化合物)的酯，其a) 不会干扰母体物质的生物活性，但给该物质赋予有利的体内特 性，如作用的持续时间、作用的启动等；或者b) 不具有生物活性，但可容易地被受治疗者体内转化成生物活性 要素物质(principle)。优点是例如溶解性提高，或者可生物降解的酯口服后/人肠道吸收 而在血浆中转化成根据本发明的化合物。许多这类实例是本领域知道 的，举例说包括低级烷基酯(例如Cl-C4)、低级酰氧基烷基酯、低级 烷氧基酰氧基烷基酯、烷氧基酰氧基酯、烷基酰基氨基烷基酯和胆碱 酯。本文所用的术语"可生物水解的酰胺"是药物物质(这里指的是根 据本发明的化合物)的酰胺，其a) 不会干扰母体物质的生物活性，但给该物质赋予有利的体内特 性，如作用的持续时间、作用的启动等；或者b) 不具有生物活性，但可容易地被受治疗者体内转化成生物活性 要素物质(principle)。优点是例如溶解性提高，或者可生物降解的酰胺口服后从肠道吸 收而在血浆中转化成根据本发明的化合物。按本发明方法进行缀合的治疗性肽可在治疗中使用，这也是本发 明的一个实施方案。在一个实施方案中，本发明提供本发明的缀合肽 在诊断中的用途。胰岛素被用来治疗或预防糖尿病，在一个实施方案中，本发明因 此才是供治疗I型或II型糖尿病的方法，所述方法包括将治疗有效量的 根据本发明的胰岛素或者胰岛素化合物缀合物给予有需要的受治疗 者。术语"胰岛素化合物，，包含具有胰岛素活性的胰岛素类似物和衍生 物。GLP-1可用于治疗高血糖、II型糖尿病、葡萄糖耐量降低、I型糖尿病、肥胖症、高血压、X综合征、血脂异常、(3-细胞凋亡、p-细胞缺乏、炎性肠道综合征、消化不良、认知障碍(例如认知增强)、神 经保护、动力永粥样^更化、冠心病和其4也心血管疾病。本文所用的名词和动词"治疗"意指为抗击某种状况如疾病(disease)或病恙(disorder)的目的对患者进行的管理和照料。该术语意 在包括对患者所患特定病症(condition)的全套治疗，如给予活性化合物 以减轻症状或并发症，延迟疾病、病恙或病症的进展，减轻或緩解症 状和并发症，和/或治愈或消除疾病、病恙或病症。待治疗的患者可以 是哺乳动物，特别是人，但也可包括动物，如狗、猫、牛、绵羊和猪。在一个实施方案中，本发明因此提供治疗所述疾病的方法，该方 法包括将治疗有效量的根据本发明的GLP-1或GLP-1化合物缀合物给 予有需要的受治疗者。术语"GLP-1化合物，，包含具有GLP-1活性的 GLP-1类似物和衍生物。GLP-2可用于治疗导致营养物吸收不良的肠衰竭，具体的说， GLP-2可用于治疗小肠综合征、炎性肠道综合征、节段性回肠炎、大 肠炎(包括胶原大肠炎、放射性大肠炎)、放射后萎缩(post radiation atrophy)、非热带(麸质不耐受)和热带性口炎性腹泻、血管阻塞或创伤 后的组织损伤、旅行者腹泻(tourist diarrhoea)、脱水、菌血症、脓血症、 神经性食欲缺乏、化疗后的组织损伤、早产儿、硬皮病、胃炎(包括萎 缩性胃炎、窦切除术后萎缩性胃炎和幽门螺旋杆菌胃炎)、溃疡、肠炎、 盲肠(cul-de-sac)、淋巴管阻塞、血管病和移植物抗宿主病、手术后痊 愈、放射后萎缩和化疗以及骨质疏松症。因此，本发明的一个目标是提供治疗上述疾病的方法，该方法包 括将治疗有效量的根据本发明的GLP-2或GLP-2化合物缀合物给予有 需要的受治疗者。术语"GLP-2化合物"包含具有GLP-2活性的GLP-2 类似物和书f生物。生长激素可用于治疗生长激素缺乏症(GHD); Turner综合征；21Prader-Willi综合征(PWS); Noonan综合征；Down综合征；慢性肾病； 青年期类风湿性关节炎；嚢性纤维变性；接受HAART治疗的儿童的 HIV感染(HIV/HALS儿童)；小于胎龄短小儿童(short children born short for gestational age)(SGA);除SGA外身材短小伴极低出生体重 (VLBW)儿重(short stature in children born with very low birth weight (VLBW) but SGA);骨骼发育异常；软骨发育不良；软骨发育不全； 特发性身材矮小(ISS);成人GHD;长骨如胫骨、腓骨、大腿骨、肱 骨、桡骨、尺骨、锁骨、掌骨(matacarpea)、跖骨(matatarsea)和指趾的 骨折；松质骨如头骨、手基部(baseofhand)和脚基部(baseoffood)的骨 折；在例如手、膝或肩中进行腱或韧带手术后的患者；进行了或正进 行手术骨分离成骨的患者；进行了髋或盘(discus)置换、半月板修复、 脊柱融合或假体固定的患者，例如在膝、髋、肩、肘、腕或颚中；体 内固定了骨合成材料如钉子、螺丝和板的患者；骨折不能愈合或愈合 不佳的患者；骨切开术后的患者，例如从胫骨或大脚趾切开；移植物 植入后的患者；创伤或关节炎引起的膝盖关节软骨变性；Turner综合 征患者中的骨质疏松症；男人中的骨质疏松症；长期透析的成人患者 (APCD); APCD中的营养不良相关心血管疾病；APCD中恶病质的逆 转；APCD中的癌症；APCD中的慢性阻塞性肺疾病(abstractive pulmonal disease); APCD中的HIV; APCD老年患者(elderly with APCD); APCD中的慢性肝病；APCD中的疲劳综合征；节段性回肠 炎；肝功能受损；HIV感染的雄性；短肠综合征；中心性肥胖；HIV 相关脂肪营养不良综合征(HALS);雄性不育症；重大选择性外科手术 (major elective surgery)、酒精/药物解毒或神经创伤后的患者；衰老； 体弱老人；骨关节炎；创伤损害的软骨；勃起功能障碍；纤维肌痛； 记忆障碍；抑郁；创伤性脑损伤；蛛网膜下腔出血；极低出生体重； 代谢综合征；糖皮质激素肌病；或者儿童中糖皮质激素治疗所致的身 材矮小。生长激素还已用于加速肌肉组织、神经组织或伤口的痊愈；加速或改善向受损组织的血液流动；或者降低受损组织中的感染率；或者 降低受损组织中的感染率；所述方法包括将治疗有效量的本文所定义 治疗性肽给予有需要的患者。本发明因此提供治疗这些病恙、疾病或状态的方法，该方法包括 将治疗有效量的根据本发明的生长激素或生长激素化合物缀合物给 予有需要的患者。术语"生长激素化合物"包含具有生长激素活性的生 长激素类似物和衍生物。细胞因子与许多涉及免疫系统的疾病的病因有关。尤其提到的 是，IL-20可能涉及牛皮癣及其治疗，IL-21涉及癌症而可构成对癌症 的治疗。本发明因此提供治疗这些病恙、疾病或状态的方法，该方法包括 给予治疗有效量的根据本发明的IL-20或IL-20化合物缀合物。术语 "IL-20化合物"包含具有IL-20活性的IL-20类似物和衍生物。TTF肽可用来提高受治疗者中黏液层的粘度，用来减少唾液的分 泌，例如当唾液分泌增加是由辐射疗法、抗胆碱能药物治疗或Sj6gren 综合征引起时，用来治疗过敏性鼻炎、创伤继发的应激诱导胃溃疡、 休克、大手术、肾病或肝病、用NSAID(如阿司匹林)、类固醇或酒精 进行的治疗。TTF肽还可用来治疗节段性回肠炎、溃疡性结肠炎、角 膜结膜炎、慢性膀胱感染、肠膀胱炎(intestinalcystitis)、乳头状瘤和膀 胱癌。在一个实施方案中，本发明因此提供治疗上述疾病或状态的方 法，该方法包括将治疗有效量的根据本发明的TTF缀合物或TTF化 合物缀合物给予有需要的受治疗患者。术语"TTF化合物"包含具有 TTF活性的TTF类似物和书f生物。黑皮质素受体调节物特别是黑皮质素4受体激动剂已被用于治疗 和预防肥胖症和相关疾病。黑皮质素4受体激动剂还已被用于治疗选 自以下的疾病动脉粥样硬化、高血压、糖尿病、II型糖尿病、葡萄 糖耐量降低(IGT)、血脂异常、冠心病、胆嚢病、胆石、骨关节炎、癌症、性功能障碍和过早死亡风险。在一个实施方案中，本发明因此提供治疗上述疾病或状态的方 法，该方法包括将治疗有效量的本发明黑皮质素4受体激动剂缀合物 或黑皮质素4受体激动剂化合物缀合物给予有需要的受治疗者。术语"黑皮质素4受体"包含具有黑皮质素4受体活性的黑皮质素4受体类 似物和书f生物。VII因子化合物已被用于治疗与凝血有关的疾病，特别是生物活 性VII因子化合物已被用于治疗血友病患者、体内有VIII因子和IX 因子的抑制剂的血友病患者、血小板減少症患者、血小板病如 Glanzmann血小板机能不全血小板释放缺陷和贮库缺陷(storage pool defect)的患者、vonWillebrand病患者、有肝病和与创伤或手术相关的 出血问题的患者。生物活性VII因子化合物已被用于治疗处于高凝状 态(hypercoagluablestate)的患者，例如有脓血症、深静脉血^全的患者， 处于心肌感染或血栓性中风、肺栓塞的危险中的患者，急性冠状动脉 综合征患者，进行冠状动脉强心治疗、防止接受血管成形术后出现心 脏事件和再狭窄的患者，外周血管疾病和急性呼吸窘迫综合征患者。在一个实施方案中，本发明因此提供治疗上述疾病或状态的方 法，该方法包括将治疗有效量的4艮据本发明的VII因子缀合物或VII 因子化合物缀合物给予有需要的受治疗者。术语"VII因子化合物"包 含具有VII因子活性的VII因子类似物和衍生物。在一个实施方案中，本发明提供如上所述的按本发明方法缀合的 治疗性肽在制造用于治疗上述疾病或状态的药物中的用途。在一个实施方案中，提供包含如上所述的按本发明方法缀合的治 疗性肽、用于治疗如上所述的疾病、病恙或病症的药物组合物。许多疾病是在治疗中用超过一种的同时给予或依序给予的药物 进行治疗。因此，将本发明的各种肽缀合物互相组合在治疗方法中用 来治疗上述疾病之一，或者作为其他通常用于治疗所述疾病的确立疗 法的补充，或者与这些确立疗法联用，这都落入本发明的范围内。以的治疗活性化合物进行组合，用于制造所述疾病的药物，这也落入本 发明的范围内。另 一个目的是提供包含本发明的缀合肽如缀合生长激素(GH)的 药物组合物，所述缀合肽以10-15 mg/ml-200mg/ml、如10-10 mg/ml-5 mg/ml的浓度存在，其中所述组合物的pH为2.0-10.0。该组合物还可 包含緩冲系统、防腐剂、张度剂、螯合剂、稳定剂和表面活性剂。在本发明的一个实施方案中，药物组合物是含水组合物，即包含 水的组合物。这种组合物通常是溶液或悬浮液。在本发明的又一个实 施方案中，药物组合物是含水溶液。术语"含水组合物"定义为包含至 少50 % w/w的水的组合物。同样，术语"含水溶液"定义为包含至少 50 % w/w的水的溶液，术语"含水悬浮液"定义为包含至少50 % w/w 的水的悬浮液。在一个实施方案中，药物组合物是冷冻干燥組合物，医生或患者 在临用前向其中加入溶剂和/或稀释剂。在一个实施方案中，药物组合物是不用先溶解就可使用的干燥组 合物(例如冷冻干燥或喷雾干燥)。在一个实施方案中，本发明涉及包含肽缀合物如GH缀合物和緩 冲剂的含水溶液的药物組合物，其中所述肽缀合物如GH缀合物以 0.1-100 mg/ml或以上的浓度存在，且其中所述组合物的pH为约2.0 至约10.0。在本发明的一个实施方案中，組合物的pH选自以下pH值2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2,6、2.7、2.8、 2.9、 3.0、 3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、 4.3、 4.4、 4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5,4、5.5、5.6、 5.7、 5.8、 5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、 7.1、 7.2、 7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8,2、8.3、8.4、 8.5、 8.6、 8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7,,9,8、 9,9和10.0。在本发明的一个实施方案中，緩冲剂选自乙酸钠、碳酸钠、柠檬 酸盐、甘氨酰甘氨酸、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、磷酸二氢 钠、磷酸氢二钠、磷酸钠和三(羟甲基)氨基曱烷、二(羟乙基)甘氨酸(bicine)、三(羟曱基)曱基甘氨酸(tricine)、苹果酸、琥珀酸盐、马来酸、 富马酸、酒石酸、天冬氨酸或者它们的混合物。这些具体的緩冲剂的 每一个都构成本发明的可供选4奪的实施方案。在本发明的 一个实施方案中，组合物还包含药物可接受的防腐 剂。防腐剂在药物组合物中的使用是技术人员公知的。为方便起见， 参考Remington: The Science and Practice of Pharmacy (雷明顿制药 科学与实践)，第20版，2000。在本发明的一个实施方案中，组合物还包含等渗剂。等渗剂在药 物组合物中的使用是技术人员公知的。为方便起见，参考Remington: The Science and Practice of Pharmacy (雷明顿制药科学与实践)，第 20版，2000。在本发明的一个实施方案中，组合物还包含螯合剂。螯合剂在药 物组合物中的使用是技术人员公知的。为方便起见，参考Remington: The Science and Practice of Pharmacy (雷明顿:制药科学与实践)，第 20版，2000。在本发明的一个实施方案中，组合物还包含稳定剂。稳定剂在药 物组合物中的使用是技术人员公知的。为方便起见，参考Remington: The Science and Practice of Pharmacy (雷明顿:制药科学与实践)，第 20版，2000。更具体的说，本发明的組合物是稳定化的液体药物组合物，其治 疗活性成分包括在液体药物组合物中保存过程中可能会显示聚集体 形成(aggregate formation)的蛋白质。所谓"聚集体形成"意指蛋白质分从溶液中沉淀出来的大的可见聚集体。所谓"保存过程中"意指液体药 物組合物或组合物一旦制备出来，并不立即给予受治疗者。相反，在制备后以液体形式、冷冻状态或干燥形式包装进行保存，干燥形式是 供以后复溶成适合给予受治疗者的液体形式或其他形式。术语"稳定化的组合物"是指物理稳定性提高、化学稳定性提高或 者物理和化学稳定性提高的组合物。 一般来说，在有效期到期前，组 合物必须在使用和保存过程中稳定(遵循推荐的使用和保存条件)。本文所用的蛋白质组合物的"物理稳定性"这个术语，是指蛋白质 因为暴露于热-机械胁迫和/或与去稳定性界面和表面如疏水表面和界 面发生相互作用，而形成蛋白质的生物失活和/或不可溶的聚集体的倾 向。本文所用的蛋白质组合物的"化学稳定性"这个术语，是指蛋白质 结构中的会导致形成化学降解产物的化学共价变化，这些化学降解产 物与天然蛋白质结构相比，具有潜在减低的生物效价和/或潜在增加的 免疫原性特性。取决于天然蛋白质的类型和性质及蛋白质所暴露的环 境，可形成各种不同的化学降解产物。所谓"干燥形式"是指液体药物组合物或组合物是通过冷冻干燥(即冻干法，参见例如Williams和Polli (1984) J. Parenteral Sci. Technol. M:48-59)、喷雾干燥(参见Masters (1991), Spray-Drying Hand-book (第 5版,Longman Scientific and Technical, Essez， U.K.),第491-676页； Broadhead W a/. (1992) Drug Deve.Ind. Pharm. Jl:l 169-1206;和 Mumenthaler a o/. (1994) Pharm. Res. 11:12-20)或者空气干燥 (Carpenter和Crowe (1988) Cryobiology 21:459-470;和Roser (1991) Biopharm. 4:47-53)进行干燥的。蛋白质在液体药物组合物的保存过程中的聚集体形成，会不利地 影响该蛋白质的生物活性，导致药物组合物的治疗功效的损失。此外， 聚集体形成还可《1起其他问题，例如当用输注系统给予含蛋白质的药 物组合物时管子、膜或泵的堵塞。本发明的药物组合物还可进一步包含一定量的足以降低蛋白质 在组合物保存过程中的聚集体形成的氨基酸碱(amino acidbase)。所谓"氨基酸碱"意指某种氨基酸或者几种氨基酸的组合，其中任何给定氨 基酸以其游离碱形式或以其盐形式存在。在使用几种氨基酸的组合的 情况中，所有的氨基酸都可以它们的游离碱形式存在，所有的都可以 它们的盐形式存在，或者有一些可以它们的游离^5威形式存在，而其他 的则以它们的盐形式存在。在一个实施方案中，用于制备本发明组合 物的氨基酸是具有带电荷侧链的那些氨基酸，如精氨酸、赖氨酸、天 冬氨酸和谷氨酸。特定氨基酸(甲硫氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、 异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸和它们的混合物)的任何立体异 构体(即L或D异构体或者它们的混合物)，或者这些立体异构体的組 合，或者甘氨酸，或者有机碱如但不限于咪唑，可在本发明的药物组 合物中存在，只要该特定氨基酸或有机碱以其游离碱形式或其盐形式 存在。在一个实施方案中，使用氨基酸的L-立体异构体。本发明的组合物还可用这些氨基酸的类似物配制。所谓"氨基酸类似物，，是指天然氨基酸的能带来如下期望效果的衍生物降低蛋白质在本发明液体药物组合物保存过程中的聚集体形成。合适的精氨酸类似物包括例如氨基胍、乌氨酸和N-—乙基L-精氨酸，合适的曱硫氨酸 类似物包括乙硫氨酸(ethionine)和丁疏氨酸(buthionine)，合适的半胱氨 酸类似物包括S-曱基-L半胱氨酸。如同其他氨基酸一样，氨基酸类似 物也是以它们的游离碱形式或它们的盐形式掺入到组合物中。在本发 明的又一个实施方案中，氨基酸或氨基酸类似物以足以防止或延迟蛋 白质的聚集的浓度使用。在本发明的一个实施方案中，当作为治疗剂的蛋白质是包含至少 一个易于发生曱疏氨酸残基向曱硫氨酸亚砜的氧化的曱硫氨酸残基 的蛋白质时，可加入甲硫氨酸(或其他含硫氨基酸或氨基酸类似物)来 抑制这一氧化。所谓"抑制"意指随时间的推移使曱硫氨酸氧化种类的 积累最小。抑制曱硫氨酸氧化可导致蛋白质更多地保持其正确分子形 式。可使用曱硫氨酸的任何立体异构体(L或D异构体)或者它们的任 何组合。要加入的量应是这样的量，它足以抑制甲硫氨酸残基的氧化，28使得曱硫氨酸亚砜的量为监管机构所接受。通常，这意味着组合物含有不超过约10%至约30%甲硫氨酸亚砜。 一般来说，这可这样获得 加入甲硫氨酸，使得所加入的甲硫氨酸与甲硫氨酸残基之比在约1:1 至约1000:1、如10:1至约100:1的范围。在本发明的一个实施方案中，组合物还包含选自高分子聚合物或 低分子化合物的稳定剂。在本发明的又一个实施方案中，稳定剂选自 聚乙二醇(例如PEG 3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、羧基/ 羟基纤维素或其衍生物(例如HPC、 HPC-SL、 HPC-L和HPMC)、环 糊精、含硫物质如一硫代甘油、硫代乙醇酸和2-甲基硫代乙醇和不同 的盐(例如氯化钠)。这些具体的稳定剂的每一个都构成本发明的可供 选择的实施方案。药物组合物还可包含能进一步提高其中的治疗活性蛋白质的稳 定性的另外稳定剂。对本发明特别有意义的稳定剂，包括但不限于能 保护蛋白质免于发生曱硫氨酸氧化的曱硫氨酸和EDTA,和能保护蛋 白质免于发生冷冻-解冻或机械剪切所致的聚集的非离子型表面活性 剂。在本发明的一个实施方案中，组合物还包含表面活性剂。表面活 性剂在药物组合物中的使用是技术人员公知的。为方便起见，参考 Remington: The Science and Practice of Pharmacy (雷明顿制药牙牛学与 实践)，第20版，2000。有可能其他成分也可存在于本发明的药物组合物中。这种额外成 分可包括润湿剂、乳化剂、抗氧化剂、增量剂(bulking agent)、张度调 节剂、螯合剂、金属离子、含油介质、蛋白质(例如人血清清蛋白、明 胶或蛋白质)和两性离子(例如氨基酸如甜菜碱、牛磺酸、精氨酸、甘 氨酸、赖氨酸和组氨酸)。这些额外成分当然不应不利影响本发明药物 组合物的总体稳定性。含有根据本发明的肽缀合物如GH缀合物的药物组合物，可在几 个部位给予需要这种治疗的患者，例如在局部部位，如皮肤和黏膜部位；在省略吸收的部位，如在动脉中、在静脉中、在心脏中给予；和在涉及吸收的部位，如在皮肤中、在皮肤下、在肌肉中或在腹部给予。 根据本发明的药物组合物的给予可通过几个给予途径来进行，例 如口服、直肠、鼻内、肺部、局部(包括口腔和舌下)、透皮、池内(intracistemal)、腹膜内、阴道和胃肠外(包括皮下、肌肉内、鞘内、静 脉内和真皮内)途径。应认识到，优选的途径要取决于待治疗的受治疗 者的一般状况和年龄，待治疗的病症的性质和所选择的活性成分。本发明的组合物可以以几种剂型给予，例如作为溶液剂、混悬剂、 乳剂、微乳剂、润湿剂、泡沫剂、油膏剂、糊剂、硬膏剂、软膏剂、 片剂、包衣片剂、洗剂、胶嚢剂(例如硬明胶胶嚢和软明胶胶嚢)、栓 剂、直肠胶嚢、滴剂、凝胶剂、喷雾剂、散剂、气溶胶剂、吸入剂、 滴眼剂、眼用软膏剂、眼用洗剂、阴道栓剂、阴道环、阴道软膏剂、 注射溶液、原位转化溶液(例如原位胶凝、原位固化、原位沉淀、原位 结晶化)、输注溶液和植入物来给予。本发明的组合物还可混合在或连接到(例如通过共^介、疏水和静电 相互作用)药物载体、药物递送系统和先进(advanced)药物递送系统， 以进一步提高GH缀合物的稳定性，提高生物利用度，提高溶解度， 降低不良反应，实现本领域技术人员7>知的时间疗法(chronotherapy), 提高患者依从性或者前述各项的任何组合。载体、药物递送系统和先 进药物递送系统的实例包括但不限于聚合物，例如纤维素和^f汙生物、 多糖如葡聚糖和衍生物、淀粉和衍生物、聚乙烯醇、丙烯酸和曱基丙 烯酸聚合物、聚乳酸和聚乙醇酸及它们的嵌段共聚物、聚乙二醇；载 体蛋白，例如清蛋白；凝胶，例如热胶凝系统，如本领域技术人员公 知的嵌段共聚系统；胶束；脂质体；微球体；纳米颗粒；液晶及其分 散体；L2相及其*体，脂质-水系统中的相行为领域的技术人员公 知；聚合胶束；复合乳剂；自乳化；自微乳化；环糊精及其衍生物； 和树状聚体。本发明的组合物适用于固体、半固体、粉末和溶液的组合物，用来例如使用计量剂量吸入器、干粉吸入器和喷雾器进行肽缀合物如 GH缀合物的肺部给予，所述各种器具的本领域技术人员公知的。本发明的组合物特别适用于控制释放、持续释放、延长释放、延 迟释放和緩慢释放药物递送系统的组合物。更具体的说但不局限于此 的是，组合物适用于本领域技术人员公知的胃肠外控制释放和持续释 放系统的组合物(这两个系统都能导致给予次数减少许多倍)，为本领 域技术人员熟知。甚至更优选的是皮下给予的控制释放和持续释放系 统。有用的控制释放系统和组合物的实例有水凝胶、含油凝胶、液晶、 聚合胶束、微球体、纳米颗粒，举出这些实例并不意在限制本发明的 范围。制造适用于本发明组合物的控制释放系统的方法，包括但不限于 结晶、缩合、共结晶、沉淀、共沉淀、乳化、分散、高压均质化、包 嚢、喷雾干燥、微包嚢、凝聚、相分离、溶剂蒸发以产生微球体、挤出和超临界流体过程。 一般参考Handbook of Pharmaceutical ControlledRelease (Wise, D丄.(编辑).Marcel Dekker, New York, 2000)和Drug andthe Pharmaceutical Sciences vol. 99: Protein Composition and Delivery(MacNally， E丄(编辑).Marcel Dekker, New York, 2000)。胃肠外给予可凭借注射器(任选为笔式注射器)通过皮下、肌肉内、腹膜内或静脉内注射来进行。或者，胃肠外给予可凭借输注泵进行。 又一个选项是这样的组合物，其可为溶液剂或混悬剂，供以鼻腔或肺部喷雾剂的形式给予肽缀合物如GH缀合物。作为还又一个选项，含 有本发明肽缀合物如GH缀合物的药物组合物，也可适用于透皮给予， 例如通过无针注射给予或者从贴剂(任选离子电渗贴剂)给予，或者透 黏膜给予例如口腔给予。在本发明的一个实施方案中，包含缀合物的药物组合物能稳定使 用超过6个星期和稳定储存超过三年。在本发明的一个实施方案中，包含缀合物的药物组合物能稳定使 用超过4个星期和稳定储存超过三年。31在本发明的一个实施方案中，包含缀合物的药物组合物能稳定使 用超过6个星期和稳定储存超过两年。在本发明的一个实施方案中，包含缀合物的药物组合物能稳定使 用超过两个星期和稳定储存超过两年。缀合肽或其组合物通常要以能达到预定结果的有效量使用，例如 以能有效治疗或预防所治疗的特定疾病的量使用。化合物可进行治疗 给予，以实现治疗益处。所谓治疗益处是指所治疗的潜在病恙的根除 或改善，和/或一个或多个与潜在病恙有关的系统的根除或改善。治疗 益处还包括停止或减慢疾病的进展，不管是否实现了改善。精确剂量要取决于给药的频率和方式，所治疗的受治疗者的性 别、年龄、体重和一般状况，所治疗病症的性质和严重程度，以及要 治疗的任何伴随疾病和本领域技术人员显而易见的其他因素。应认识 到，适当剂量的确定可采用常规实验，通过构造数值矩阵并测试该矩 阵中的不同点来实现，这完全在训练有素的医生或兽医的普通技能范围内。当将缀合肽或其药物可接受盐、溶剂合物或前体药物，与对同一 疾病状态有活性的第二治疗剂进行组合使用时，每种化合物的剂量可 与其单独使用时不同。本领域技术人员会容易确知适当的剂量。所有本文引述的参考文献，包括出版物、专利申请和专利在内， 都通过引用整体并入本文，如同每个参考文献被单独和具体指出通过 引用并入本文和在本文中完整呈现(至法律允许的最大程度)。所有标题和副标题在本文中是为了方便起见使用，不应被解释为 以任何方式限制本发明。本文提供的任何和全部实例或者示例性语言(例如"如")的使用， 仅意在更好地阐述本发明，并不构成对本发明范围的限制，除非另有 声明。本说明书中的任何语言都不应被解释为指出任何非要求保护的 要素对于本发明的实施是必要的。任何对这些专利文献的有效性、可专利性和/或可实施性的观点。本发明包括可适用的法律允许的所附权利要求书中述及的主题 的所有^^改方案和等同方案。 实施例将参考以下实施例对本发明作进一步的限定。本领域技术人员会 明白，可不偏离本发明的范围，对材料和方法两者实施许多修改方案。 缩写TGase:(a) TGase Activa WM，日本味之素公司，60 mg/ml于20mM磷酸 盐緩冲液pH 8.5中。茂原轮链丝菌(5Vre/ toveWd〃Zwm mo6arae似e)的 Activa WM酶在麦芽糊精中以干燥形式配制，含有1% w/w蛋白质)(6.7或者(b) 用大肠杆菌作为表达系统以可溶形式表达的茂原轮链丝菌(&^ptover"7/ww woZ^raewe)的TGase MTG P2，在20 mM磷酸钠緩沖液，pH 6.0中与2 mM DTT和5 w/v。/。麦芽糊精配制。酶浓度在0.7和4.5 mg/ml之间。分析方法毛细管电泳毛细管电泳(CE)用Agilent Technologies 3D-CE系统(Agilent Technologies)进行。数据采集和信号处理用Agilent Technologies 3DCE ChemStation进行。毛细管为Agilent的64.5cm (56.0 cm有效长度) 50pm内径"加长光径毛细管(Extended Light Path Capillary)"。紫外检测 在200nm(16nmBw，参比380 nm和50 nm Bw)处进行。运行电解质 为磷酸盐緩冲液50mMpH7.0。毛细管用0.1MNaOH调节3分钟，然 后用Milli-Q水调节2分钟和用电解质调节3分钟。每次运行后，将毛细管用Milli-Q水沖洗2分钟，然后用磷酸冲 洗2分钟，接着用Milli-Q水冲洗2分钟。流体动力学注射在50mbar 下进行4.0秒。电压为+25kV。毛细管温度为30C，运行时间为10.5分钟。hGH缀合的示例性方案按以下方案合成Nsl41-[2-(4-(4-(40KDa mPEG基)丁酰基)-氨基-丁 氧基亚氨基)-乙基]hGH:<formula>formula see original document page 34</formula>TGase催化步骤的方法向1,3-二氨基-1-丙醇于三乙醇胺20mM pH8.6緩冲液(14^U)中的 1M溶液，加入三乙醇胺20mMpH8.6緩沖液(20.6|^1)、乙二醇(53.6pl) (40% w/v))和人生长激素(50mg/ml)于三乙醇胺20mM pH8.6緩沖液 (40pl)中的溶液。加入TGase MTG P2溶液(0.35mg/ml， 5.8|^1)启动反应。 反应混合物在环境温度下温育，接着进行毛细管电泳。 实施例lhGH在乙二醇存在和不存在下的转氨作用反应是用以下浓度，按与上述方法类似的方式进行。-[hGH]=0.67mM(14.9mg/ml终浓度)画[1，3-二氨基2-丙醇]:300mM-緩冲液20mM三乙醇胺pH8.6-+/-乙二醇40%(v/v)-[TGase MTG P2]= 0.39岸总体积134^1环境温度图1所示的结果证明，在11小时后获得期望的pos.l41-hGH的 75%最大产率。在对照实验中，在4小时反应时间后获得期望产物的 53%最大产率。电泳图是在期望产物处在其最大产率时的反应时间从反应混合物获得，即对于无乙二醇的反应混合物为4小时，对于含有40。/。v/v 乙二醇的反应混合物为11小时。结果在图2中显示。
实施例2
用TGase Activa WM或TGase MTG P2比專交乙二醇的作用 反应是用以下浓度，按与上述方法类似的方式进行。 -[hGH]-0.67mM(14.9mg/ml终浓度) - [1,3-二氨基2-丙醇]-300mM -緩冲液20mM三乙醇胺pH8.6 -+/-乙二醇40%^ )
-[TGase MTG P2]= 0.39 或[TGase Activa WM]= 1 .95jiM
环境温度
图3显示的结果证明，两种酶的反应曲线非常相似。 实施例3
hGH在10-40。/。 v/v乙二醇存在下的转氨作用
反应是用以下浓度，按与上述方法类似的方式进行。
-[hGH]-0.67mM(14.9mg/ml终浓度)
-[1,3-二氨基2-丙醇]-300mM
-緩沖液20mM三乙醇胺pH8.6
隱+/-乙二醇10-40% (v/v)
-[TGase MTG P2]= 0.39 juM
总体积134jul
在环境温度温育
图4所示的结果揭示，当增加乙二醇的浓度时，获得的pos.141 TA-hGH产率提高。 实施例4
hGH在40-70。/。 v/v乙二醇存在下的转氨作用
反应是按与上述方法相似的方式进行，例外的是在5小时反应时
35间后加入更多的酶。反应^f吏用到以下浓度
-[hGH]-0.67mM(14,9mg/ml终浓度) -[1，3-二氨基2-丙醇]-300mM -緩冲液20mM三乙醇胺pH8.6 -+/隱乙二@享40-70% (v/v)
-[TGase MTG P2]= 0.39 |LtM,然后在5小时时为0.78 jiM
总体积134^1
环境温度
结果在图5中显示。 实施例5
用不同浓度的TGase MTG P2比4交乙二醇的作用
反应是用以下浓度，按与上述方法类似的方式进行。
画[hGH]=0.67mM(14.9 mg/ml终浓度)
-[1,3-二氨基2-丙醇]-300mM
陽緩冲液20mM三乙醇胺pH8.6
-+/-乙二醇40%^ )
-[TGase MTG P2]= 0.39 pM或0.16
环境温度
图6显示的结果证明，0.39 MTG P2酶和40%乙二醇得出最 高的产物产率。 实施例6
比较相关结构的化合物的作用
反应是用乙二醇、甘油、丙二醇和1,3丙二醇，用以下浓度，按 与上述方法类似的方式进行。
-[hGH]=0,67mM(14.9mg/ml终浓度)
-[1,3-二氨基2-丙醇]-300mM
-緩冲液20mM三乙醇胺pH8.6
-十A增效化合物7.18M-[TGase MTG P2]= 0.39 pM 总体积134^1 环境温度
图7显示的结果证明，乙二醇得出最高产率。丙二醇的最高产率 其次。发现甘油减少了所形成的副产物(pos.40-TA-hGH和二转氨的 hGH)的量，因此甘油也改进了反应的选择性。
1,3丙二醇完全抑制反应。
实施例7
用不同浓度的TGase MTG P2比较甘油的作用
反应是用甘油按与上述方法相似的方式进行，例外的是在5小时 反应时间后加入更多的酶。反应使用以下浓度
-[hGH]=0.67mM(14.9 mg/ml终浓度)
-[1,3-二氨基2-丙醇]-300mM
-緩冲液20mM三乙醇胺pH8.6
-甘油7.18M
-[TGaseMTGP2]=0.39|uM,然后在5小时时1.17 pM
总体积134^1
环境温度
图8显示的结果证明，当向反应混合物中加入更多的酶时，可提 高用甘油获得的产率。
权利要求
1.一种提高酶催化反应的选择性和/或产率的方法，所述方法包括在选自乙二醇、丙二醇或甘油之一的增效化合物存在下进行反应。
2. 权利要求1的方法，其中所述增效化合物是乙二醇。
3. 权利要求1或权利要求2的方法，其中所述酶催化反应包括第 一化合物和肽之间的共价键形成，所述方法包括使第 一化合物与肽在 酶和增效化合物存在下在一个或多个步骤中发生反应。
4. 权利要求1-3中任一项的方法，其中所述酶是转谷氨酰胺酶。
5. 权利要求4的方法，其中所述第一化合物由下式表示 H2N—D—R—X其中D代表键或氧； R代表接头或键；X选自或者可活化成酮-、醛-、-NH-NH2、 -0-C(0)-NH-NH2、 陽丽画C(0)-NH画丽2 、 -NH-C(S)-NH-NH2 、-NHC(0)-NH-NH-C(0)-NH-NH2 、 -NH-NH-C(0)-NH-NH2 、 -NH-NH-C(S)-NH-NH2 、 -NH-C(0)-C6H4-NH-NH2 、 -C(0)-NH-NH2 、 -0-NH2、 -C(0)-0-NH2、 -NH-C(0)-0-NH2、 -NH-C(S)-0-NH2、 C(0)-NH2、 Ar-NH2、炔、叠氮化物或腈-氧化物。
6. 权利要求4或权利要求5的方法，其中第一化合物包含一个或 多个在构成所述肽的任何氨基酸残基中不易接近的官能团或者潜在 官能团，所述方法另外包括以下步骤(b) 任选活化潜在的官能团；和(c) 使所述官能化的肽与包含一个或多个官能团的第二化合物在 一个或多个步骤中发生反应，其中所述官能团不与构成所述肽的氨基 酸残基中易接近的官能团反应，且其中所述第二化合物中的所述官能 团能够与所述第一化合物中的所述官能团发生反应，使得所述官能化 肽和第二化合物之间形成共价键。
7. 权利要求4-6中任一项的方法，其中所述第一化合物选自4-(氨 基曱基)苯乙酮、4-(2-氨基乙基)苯乙酮、N-(4-乙酰苯基)2-氨基乙酰胺、 1一[4_(2-氨基乙氧基)苯基]乙酮、l-[3-(2-氨基乙氧基)苯基]乙酮、1,4-双(氨基氧基)丁烷、3-氧杂戊烷-l,5-二氧基胺、1,8-二氨基氧基-3,6-二 氧杂辛烷、1,3-双(氨基氧基)丙-2-醇、1,11-双(氨基氧基)-3，6,9-三氧杂 十一碳烷、1，3-二氨基-2-丙醇、1，2-双(氨基氧基)乙烷和1,3-双(氨基氧 基)丙烷。
8. 权利要求3-7中任一项的方法，其中所述肽选自胰岛素、胰高 血糖素样肽1 (GLP-1)、胰高血糖素样肽2 (GLP-2)、催乳素、生长激 素、白细胞介素、细胞因子、抗体、TFF、黑皮质素受体调节物、凝 血因子和VII因子化合物。
9. 权利要求8的方法，其中所述肽是生长激素，例如人生长激素。
10. 权利要求3-9中任一项的方法，其中所述反应緩沖到6-9之间 的pH。
11. 权利要求10的方法，其中所述反应緩冲到7-8.6之间的pH。
12. 权利要求3-11中任一项的方法，其中所述反应在15-45。C之 间的温度下进行。
13. 权利要求12的方法，其中所述反应在20-37。C之间的温度下 进行。
14. 权利要求1-13中任一项的方法，其中所述增效化合物以 20-95%之间的浓度范围存在。
15. 权利要求14的方法，其中所述增效化合物以30-70%之间的 浓度范围存在。
16. 可通过权利要求1-15中任一项的方法获得的肽。
17. 包含权利要求16中所定义的肽的药物组合物。
18. —种治疗以下病症或患者的方法生长激素缺乏症(GHD); Turner综合征；Prader-Willi综合征(PWS); Noonan综合征；Down综 合征；慢性肾病；青年期类风湿性关节炎；嚢性纤维变性；接受HAART治疗的儿童的HIV感染(HIV/HALS儿童)；小于胎龄短小儿童(SGA); 除SGA外身材短小伴极低出生体重(VLBW)儿童；骨骼发育异常；软 骨发育不良；软骨发育不全；特发性身材矮小(ISS);成人GHD;长 骨如胫骨、腓骨、大腿骨、肱骨、桡骨、尺骨、锁骨、掌骨、恥骨和 指趾的骨折；松质骨如头骨、手基部和脚基部的骨折；在例如手、膝 或肩中进行腱或韧带手术后的患者；进行了或正进行手术骨分离成骨 的患者；进行了髋或盘置换、半月板修复、脊柱融合或假体固定的患 者，例如在膝、髋、肩、肘、腕或颚中；体内固定了骨合成材料如钉 子、螺丝和板的患者；骨折不能愈合或愈合不佳的患者；骨切开术后 的患者，例如从胫骨或大脚趾切开；移植物植入后的患者；创伤或关 节炎引起的膝盖关节软骨变性；Turner综合征患者中的骨质疏松症； 男人中的骨质疏+>症；长期透析的成人患者(APCD); APCD中的营养 不良相关心血管疾病；APCD中恶病质的逆转；APCD中的癌症；APCD 中的慢性阻塞性肺疾病；APCD中的HIV; APCD老年患者；APCD 中的慢性肝病；APCD中的疲劳综合征；节,殳性回肠炎；肝功能受损； HIV感染的雄性；短肠综合征；中心性肥胖；HIV相关脂肪营养不良 综合征(HALS);雄性不育症；重大选择性外科手术、酒精/药物解毒 或神经创伤后的患者；衰老；体弱老人；骨关节炎；创伤损害的软骨； 勃起功能障碍；纤维肌痛；记忆障碍；抑郁；创伤性脑损伤；蛛网膜 下腔出血；极低出生体重；代谢综合征；糖皮质激素肌病；或者儿童 中糖皮质激素治疗所致的身材矮小，生长激素还已用于加速肌肉组 织、神经组织或伤口的痊愈；加速或改善向受损组织的血液流动；或 者降低受损组织中的感染率；所迷方法包括将治疗有效量的权利要求 16中所定义的化合物给予有需要的患者。
19.权利要求16中定义的化合物在制造用于治疗以下病症或患 者的药物中的用途生长激素缺乏症(GHD); Turner综合征； Prader-Willi综合征(PWS); Noonan综合征；Down综合征；慢性肾病； 青年期类风湿性关节炎；嚢性纤维变性；接受HAART治疗的儿童的HIV感染(HIV/HALS儿童)；小于胎龄短小儿童(SGA);除SGA外身 材短小伴极低出生体重(VLBW)儿童；骨骼发育异常；软骨发育不良； 软骨发育不全；特发性身材矮小(ISS);成人GHD;长骨如胫骨、腓 骨、大腿骨、肱骨、桡骨、尺骨、锁骨、掌骨、跖骨和指趾的骨折； 松质骨如头骨、手基部和脚基部的骨折；在例如手、膝或肩中进行腱 或韧带手术后的患者；进行了或正进行手术骨分离成骨的患者；进行 了髋或盘置换、半月板修复、脊柱融合或4艮体固定的患者，例如在膝、 髋、肩、肘、腕或颚中；体内固定了骨合成材料如钉子、螺丝和板的 患者；骨折不能愈合或愈合不佳的患者；骨切开术后的患者，例如从 胫骨或大脚趾切开；移植物植入后的患者；创伤或关节炎引起的膝盖 关节软骨变性；Turner综合征患者中的骨质疏松症；男人中的骨质疏 松症；长期透析的成人患者(APCD); APCD中的营养不良相关心血管 疾病；APCD中恶病质的逆转；APCD中的癌症；APCD中的慢性阻 塞性肺疾病；APCD中的HIV; APCD老年患者；APCD中的慢性肝 病；APCD中的疲劳综合征；节段性回肠炎；肝功能受损；HIV感染 的雄性；短肠综合征；中心性肥胖；HIV相关脂肪营养不良综合征 (HALS);雄性不育症；重大选择性外科手术、酒精/药物解毒或神经 创伤后的患者；衰老；体弱老人；骨关节炎；创伤损害的软骨；勃起 功能障碍；纤维肌痛；记忆障碍；抑郁；创伤性脑损伤；蛛网膜下腔 出血；极低出生体重；代谢综合征；糖皮质激素肌病；或者儿童中糖 皮质激素治疗所致的身材矮小，生长激素还已用于加速肌肉组织、神 经组织或伤口的疾愈；加速或改善向受损组织的血液流动；或者降低 受损组织中的感染率。
20.用于治疗以下病症或患者的权利要求16的肽生长激素缺乏 症(GHD); Turner综合征；Prader-Willi综合征(PWS); Noonan综合征； Down综合征；慢性肾病；青年期类风湿性关节炎；嚢性纤维变性； 接受HAART治疗的儿童的HIV感染(HIV/HALS儿童)；小于胎龄短 小儿童(SGA);除SGA外身材短小伴极低出生体重(VLBW)儿童；骨骼发育异常；软骨发育不良；软骨发育不全；特发性身材矮小(ISS); 成人GHD;长骨如胫骨、腓骨、大腿骨、肱骨、桡骨、尺骨、锁骨、 掌骨、跖骨和指趾的骨折；松质骨如头骨、手基部和脚基部的骨折； 在例如手、膝或肩中进行腱或韧带手术后的患者；进行了或正进行手 术骨分离成骨的患者；进行了髋或盘置换、半月板修复、脊柱融合或 假体固定的患者，例如在膝、髋、肩、肘、腕或顎中；体内固定了骨 合成材料如钉子、螺丝和板的患者；骨折不能愈合或愈合不佳的患者； 骨切开术后的患者，例如从胫骨或大脚趾切开；移植物植入后的患者； 创伤或关节炎引起的膝盖关节软骨变性；Turner综合征患者中的骨质 疏松症；男人中的骨质疏松症；长期透析的成人患者(APCD); APCD 中的营养不良相关心血管疾病；APCD中恶病质的逆转；APCD中的 癌症；APCD中的慢性阻塞性肺疾病；APCD中的HIV; APCD老年 患者；APCD中的慢性肝病；APCD中的疲劳综合征；节段性回肠炎； 肝功能受损；HIV感染的雄性；短肠综合征；中心性肥胖；HIV相关 脂肪营养不良综合征(HALS);雄性不育症；重大选择性外科手术、酒 精/药物解毒或神经创伤后的患者；衰老；体弱老人；骨关节炎；创伤 损害的软骨；勃起功能障碍；纤维肌痛；记忆障碍；抑郁；创伤性脑 损伤；蛛网膜下腔出血；极低出生体重；代谢综合征；糖皮质激素肌 病；或者儿童中糖皮质激素治疗所致的身材矮小，生长激素还已用于 加速肌肉组织、神经组织或伤口的痊愈；加速或改善向受损组织的血 液流动；或者降^f氐受损组织中的感染率。
全文摘要
本发明涉及提高酶的选择性的方法，所述方法包括在选自乙二醇、丙二醇或甘油之一的增效化合物存在下进行反应。
文档编号C12P13/00GK101617053SQ200880005602
公开日2009年12月30日 申请日期2008年2月20日 优先权日2007年2月22日
发明者J·巴查特, M·曾德尔, N·L·约翰森 申请人:诺沃-诺迪斯克保健股份有限公司