专利名称：增强微生物对产生的有机化学物质的耐受性的组合物和方法
技术领域：
本发明的实施方式一般地涉及增强微生物对于有机酸和醇的耐受性和/或提高 微生物产生有机酸和醇的产量的方法、组合物和用途。本申请一般地还涉及提高微生物产 生有机酸或醇的产量的方法、组合物和载体(vector)的用途。特定的实施方式涉及增强细 菌对3-羟基丙酸(3-HP)的耐受性以作为提高产生3-羟基丙酸产量的手段的组合物和方 法。在其它实施方式中，组合物和方法涉及调节一种或多种抑制性分子或增加微生物分支 酸超路径(chorismate super-pathway)的分子以增强微生物对于产生有机酸的耐受性。
背景技术：
在过去几年里石油消费快速增长。现在大部分专家相信这样的消费增长将会持 续，而产油能力将在不远的将来达到峰值。因此必须开发用于产生燃料和其它化学品的廉 价材料和能源的可替代来源。生物炼制(biorefining)技术试图开发出用于这样的目的的 可再生能源，如农业或城市废物。基本的模式包括将废弃材料(例如，玉米)转化成可由 工程化有机体发酵的糖(例如，己糖、戊糖)，以产生如燃料(例如，乙醇或氢)或通用化学 品(commodity chemicals)(例如，单体/聚合物)的具有附加值的产物。尽管关于乙醇 作为汽油替代品的长期商业可行性仍然存在许多争议，但已经证明产生通用化学品的生物 途径是替代常规石化途径的经济上有吸引力的途径。作为一个例子，十年之久的Dupont/ Genencor合作导致Dupont投资开发用于产生1，3-丙二醇(估计50-80亿/年产量)的基 于800，000升大肠杆菌的工艺。有机酸是未来的生物炼制化学的重要的平台。在一个由美国国家再生能源实验室 (National Renewable Energy Laboratory)发布的报告中,将8种不同的有机酸列入包括 3_羟基丙酸(3-HP)在内的前12种具有最高优先级的生物炼制化学品中。现在仍然需要以 低成本的方法快速产生这些生物炼制化学品。发明概述本发明的实施方式涉及增强微生物对于有机化合物的生产的耐受性。特定的实施 方式涉及增强对于生物炼制化学品的耐受性。在其它实施方式中，本发明的组合物和方法 涉及3-羟基丙酸(3-HP)的生产。预期用于本发明的微生物可以包括，但不限于大肠杆菌 (E. coli) ο该路径的产物可以包括，但不限于分支酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、叶酸、泛醌、维生素K2(meniquinone)、莽草酸(shikimate)、D-赤藓糖_4_磷酸、3_脱氧-D-阿 拉伯-庚酮糖酸(h印tulOSOnate)-7-磷酸、3-脱氢奎尼酸、3-脱氢-莽草酸、莽草酸、 莽草酸-3-磷酸、5-烯醇式丙酮酰(enolpyruvyl)-莽草酸-3-磷酸、分支酸、异分支 酸(isochorismate)、予页苯酸(prephenate)、苯丙酮酸(phenylpyruvate)、对轻基苯丙酮 酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、2，3_ 二氢-2，3-二羟基苯甲酸、2，3_ 二羟基苯甲酸、肠杆菌 素、2-琥珀酰基-6-羟基-2，4-环己二烯-1-羧酸、邻琥珀酰基苯甲酸、邻琥珀酰基苯甲 酰-coA、l，4-二羟基-2-萘甲酸(napthoate)、甲基萘醌(menaquinone)、邻氨基苯甲酸 (anthranilate),N-(5'-磷酸核糖基)_邻氨基苯甲酸、1_(邻羧基苯氨基)_1 ‘ _脱氧核 酮糖-5 ‘-磷酸、吲哚-3-甘油-磷酸、吲哚、L-色氨酸、4-氨基-4-脱氧分支酸、对氨基苯 甲酸、7，8-二氢蝶酸(dihydr0pter0ate)、7，8-二氢叶酸、四氢叶酸、4-羟基苯甲酸、3-八异 戊二烯基(octaprenyl) ~4~羟基苯甲酸、2_八异戊二烯基苯酚、2，2-八异戊二烯基_6_羟 基苯酚、2-八异戊二烯基-6-甲氧基苯酚、2-八异戊二烯基-6-甲氧基-1，4-苯醌、2-八异 戊二烯基-3-甲基-6-甲氧基-1，4-苯醌、3-去甲基泛醌-8或泛醌-8、3-脱氧-D-阿拉 伯_庚酮糖酸-7-磷酸合酶(DAHPS)同工酶或其混合物中的一种或多种。某些实施方式涉及增强微生物对3-HP生产的耐受性的组合物，包括具有一种或 多种能够调节微生物的分支酸超路径的遗传元件(geneticelement)的载体，其中，分支酸 超路径的调节增强了微生物对于3-HP的耐受性。在其它实施方式中，组合物可以包括分支 酸超路径的中间体。在再其它的实施方式中，组合物可以包括该路径的一种或多种产物或 前体。该路径的产物可以包括，但不限于分支酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、叶酸、泛 醌、维生素K2、3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸合酶(DAHPS)同工酶、莽草酸、D-赤 藓糖-4-磷酸、3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸、3-脱氢奎尼酸、3-脱氢-莽草酸、 莽草酸、莽草酸-3-磷酸、5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸、分支酸、异分支酸、预苯酸、苯 丙酮酸、对羟基苯丙酮酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、2，3- 二氢-2，3- 二羟基苯甲酸、2，3- 二 羟基苯甲酸、肠杆菌素、2-琥珀酰基-6-羟基-2，4-环己二烯-1-羧酸、邻琥珀酰基苯甲酸、 邻琥珀酰基苯甲酰-coA、1，4- 二羟基-2-萘甲酸、甲基萘醌、邻氨基苯甲酸、N- (5 ‘-磷酸 核糖基)_邻氨基苯甲酸、1_(邻羧基苯氨基)_1'-脱氧核酮糖-5'-磷酸、吲哚-3-甘 油_磷酸、吲哚、L-色氨酸、4-氨基-4-脱氧分支酸、对氨基苯甲酸、7，8- 二氢蝶酸、7，8- 二 氢叶酸、四氢叶酸、4-羟基苯甲酸、3-八异戊二烯基-4-羟基苯甲酸、2-八异戊二烯基苯酚、 2，2-八异戊二烯基-6-羟基苯酚、2-八异戊二烯基-6-甲氧基苯酚、2-八异戊二烯基-6-甲 氧基-1，4-苯醌、2-八异戊二烯基-3-甲基-6-甲氧基-1，4-苯醌、3-去甲基泛醌_8或泛 醌_8中的一种或多种。本发明的其它实施方式包括增强微生物对3-羟基丙酸(3-HP)生产的耐受性的 组合物，该组合物包括，但不限于一种或多种能够调节微生物的分支酸超路径的化合物，其 中，分支酸超路径的诱导提高了微生物产生3-HP的产量。根据这些实施方式，组合物可以 包括，但不限于一种或多种分支酸超路径的中间体或能够增加和/或减少分支酸超路径的 一种或多种中间体的产生的组合物。其它组合物可以包括一种或多种前体或能够增加和 /或减少分支酸超路径的一种或多种前体的产生的组合物。某些实施方式可以进一步包 括，但不限于一种或多种选自分支酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、叶酸、泛醌、维生素K2、莽草酸、D-赤藓糖-4-磷酸、3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸、3-脱氢奎尼酸、3-脱 氢-莽草酸、莽草酸、莽草酸-3-磷酸、5-烯醇式丙酮酰_莽草酸-3-磷酸、分支酸、异分支 酸、预苯酸、苯丙酮酸、对羟基苯丙酮酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、2，3- 二氢-2，3- 二羟基苯 甲酸、2，3- 二羟基苯甲酸、肠杆菌素、2-琥珀酰基-6-羟基-2，4-环己二烯-1-羧酸、邻琥 珀酰基苯甲酸、邻琥珀酰基苯甲酰-coA、l，4-二羟基-2-萘甲酸、甲基萘醌、邻氨基苯甲酸、 N-(5'-磷酸核糖基)_邻氨基苯甲酸、1-(邻羧基苯氨基)_1'-脱氧核酮糖-5'-磷酸、 吲哚-3-甘油-磷酸、吲哚、L-色氨酸、4-氨基-4-脱氧分支酸、对氨基苯甲酸、7，8- 二氢 蝶酸、7，8- 二氢叶酸、四氢叶酸、4-羟基苯甲酸、3-八异戊二烯基-4-羟基苯甲酸、2-八异 戊二烯基苯酚、2，2-八异戊二烯基-6-羟基苯酚、2-八异戊二烯基-6-甲氧基苯酚、2-八异 戊二烯基-6-甲氧基-1，4-苯醌、2-八异戊二烯基-3-甲基-6-甲氧基-1，4-苯醌、3-去 甲基泛醌_8或泛醌-8、3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸合酶(DAHPS)同工酶或其 混合物中的一种或多种的化合物。其它实施方式可以包括诱导微生物的分支酸超路径的一 种或多种酶的化合物。其它示例性的化合物可以包括一种或多种引入产生有机酸的微生物 中的能够调节分支酸超路径的化合物。某些实施方式可以包括用于调节微生物对于3-羟基丙酸(3-HP)生产的耐受性的 组合物，包括一种或多种能够调节微生物的分支酸超路径的化合物，其中，分支酸超路径 的诱导增强了微生物的3-HP耐受性。本发明的特定实施方式涉及包括但不限于一种或多种化合物的组合物，所述一种 或多种化合物包括，但不限于分支酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、叶酸、泛醌、维生素K2、莽 草酸、D-赤藓糖-4-磷酸、3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸、3-脱氢奎尼酸、3-脱氢 莽草酸、莽草酸、莽草酸-3-磷酸、5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸、分支酸、异分支酸、 预苯酸、苯丙酮酸、对羟基苯丙酮酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、2，3- 二氢-2，3- 二羟基苯甲 酸、2，3- 二羟基苯甲酸、肠杆菌素、2-琥珀酰基-6-羟基-2，4-环己二烯-1-羧酸、邻琥珀 酰基苯甲酸、邻琥珀酰基苯甲酰-coA、l，4-二羟基-2-萘甲酸、甲基萘醌、邻氨基苯甲酸、 N-(5'-磷酸核糖基)_邻氨基苯甲酸、1-(邻羧基苯氨基)_1'-脱氧核酮糖-5'-磷酸、 吲哚-3-甘油-磷酸、吲哚、L-色氨酸、4-氨基-4-脱氧分支酸、对氨基苯甲酸、7，8- 二氢 蝶酸、7，8- 二氢叶酸、四氢叶酸、4-羟基苯甲酸、3-八异戊二烯基-4-羟基苯甲酸、2-八异 戊二烯基苯酚、2，2-八异戊二烯基-6-羟基苯酚、2-八异戊二烯基-6-甲氧基苯酚、2-八异 戊二烯基-6-甲氧基-1，4-苯醌、2-八异戊二烯基-3-甲基-6-甲氧基-1，4-苯醌、3-去 甲基泛醌_8或泛醌-8、3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸合酶(DAHPS)同工酶或其 混合物。本发明的其它实施方式包括增强微生物对有机酸的生产的耐受性的方法，该方法 包括，但不限于抑制能够影响微生物的分支酸超路径的阻遏物(repressor)。根据这些实 施方式，可以结合使用能够提高有机酸或醇的产量或对其的耐受性的其它化合物，或单独 地向本发明预期的任何培养物中加入能够提高有机酸或醇的产量或对其耐受性的其它化 合物。另外，本发明设想所公开的方法和组合物可以结合本领域内已知的其它生产3-HP的 技术来使用。根据这些实施方式中的任意一种，可以将一种或多种化合物和/或组合物引入微 生物中，其中，所述化合物和/或组合物能够调节分支酸超路径和增强微生物对于3-HP生产的耐受性。另外，本发明设想本发明的方法和组合物可以结合任何其它已知增强微生物 对于有机酸生产的耐受性或提高有机酸的产量的方法。某些实施方式可以包括提高微生物产生有机酸的产量和/或对于有机酸生产的 耐受性的方法，该方法包括a)获得一种或多种能够调节微生物的分支酸超路径方面的化 合物。在特定的实施方式中，分支酸超路径的调节增强了微生物对于3-HP生产的耐受性； 和b)向微生物的培养物引入该化合物。本发明的特定实施方式涉及有机酸3-HP的生产或对于有机酸3-HP的增强的耐受 性。根据这些实施方式，本发明设想增强对于3-HP的耐受性或提高3-HP的产量的一种或 多种化合物可以包括，但不限于，该组合物包含一种或多种选自以下的分支酸超路径的中 间体D-赤藓糖-4-磷酸、3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸、3-脱氢奎尼酸、3-脱氢 莽草酸、莽草酸、莽草酸-3-磷酸、5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸、分支酸、异分支酸、 预苯酸、苯丙酮酸、对羟基苯丙酮酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、2，3- 二氢-2，3- 二羟基苯甲 酸、2，3- 二羟基苯甲酸、肠杆菌素、2-琥珀酰基-6-羟基-2，4-环己二烯-1-羧酸、邻琥珀 酰基苯甲酸、邻琥珀酰基苯甲酰-coA、l，4-二羟基-2-萘甲酸、甲基萘醌、邻氨基苯甲酸、 N-(5'-磷酸核糖基)_邻氨基苯甲酸、1-(邻羧基苯氨基)_1'-脱氧核酮糖-5'-磷酸、 吲哚-3-甘油-磷酸、吲哚、L-色氨酸、4-氨基-4-脱氧分支酸、对氨基苯甲酸、7，8- 二氢 蝶酸、7，8- 二氢叶酸、四氢叶酸、4-羟基苯甲酸、3-八异戊二烯基-4-羟基苯甲酸、2-八异 戊二烯基苯酚、2，2-八异戊二烯基-6-羟基苯酚、2-八异戊二烯基-6-甲氧基苯酚、2-八异 戊二烯基-6-甲氧基-1，4-苯醌、2-八异戊二烯基-3-甲基-6-甲氧基-1，4-苯醌、3-去 甲基泛醌_8、泛醌-8及其两种或多种的组合或混合物。本发明再其它的实施方式包括提高微生物产生有机酸如3-羟基丙酸(3-HP)的产 量的方法，包括将微生物的培养物与包含分支酸超路径的一种或多种化合物和/或能够 调节分支酸超路径的一种或多种化合物的组合物接触。根据这些实施方式，一种或多种化 合物可以包括具有一种或多种能够调节(如增强或减弱)分支酸超路径的遗传元件的载 体。本发明设想的某些实施方式涉及其它化合物的使用，这些化合物可以包括具有一种或 多种能够增强分支酸超路径的下游成分的遗传元件的载体，以增强微生物对于3-HP的耐 受性。在某些实施方式中，提高微生物的3-羟基丙酸(3-HP)的产量和/或对于3-羟基 丙酸(3-HP)的耐受性的方法可以包括，但不限于遗传操纵微生物的分支酸超路径。微生物 的分支酸超路径的这些遗传操纵中一些选自通过以下方式调节微生物的分支酸超路径添 加载体以引入新的遗传物质；现有遗传物质的遗传插入、破坏或除去；遗传物质的突变及 其组合。遗传操纵可以包括诱导一种或多种分支酸超路径前体分支酸、酪氨酸、苯丙氨酸、 色氨酸、叶酸、泛醌、甲基萘醌、3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸合酶(DAHPS)同工 酶、莽草酸或其混合物。本发明的某些实施方式可以结合本领域已知的其它方法或组合物以提高微生物 对有机酸生产的耐受性。在其它实施方式中，为了鉴别能够产生和/或耐受较高浓度3-HP 的菌株，本发明的方法和组合物可以结合选种过程。例如，如本文所提到的，库富集的多尺 度分析(Multi-Scale Analysis of LibraryEnrichments) (SCALE)可以用来鉴别在连续流 动选择中赋予较高适应度(fitness)的基因。这些选择可以基于选择性化合物(如一种或多种感兴趣的有机酸或醇)的存在或缺失。某些实施方式涉及抑制水平下具有增加的有机 酸，例如，3-羟基丙酸(3-HP)的选择。这些选择过程可以单独基于SCALES，或结合其它选 择技术，例如，其它基因组选择技术。在特定的实施方式中，本发明预想包括试剂盒。在特定的实施方式中，用于提高微 生物的有机酸产量的试剂盒可以包括，但不限于一种或多种能够调节分支酸超路径的化合 物，和一个或多个容器。根据这些实施方式，试剂盒可以包括一种或多种选自以下的化合 物分支酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、叶酸、泛醌、维生素K2、3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖 酸-7-磷酸合酶(DAHPS)同工酶、莽草酸、分支酸超路径的前体、一种或多种分支酸超路径 的酶、D-赤藓糖-4-磷酸、3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸、3-脱氢奎尼酸、3-脱 氢-莽草酸、莽草酸、莽草酸-3-磷酸、5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸、分支酸、异分支 酸、预苯酸、苯丙酮酸、对羟基苯丙酮酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、2，3- 二氢-2，3- 二羟基苯 甲酸、2，3- 二羟基苯甲酸、肠杆菌素、2-琥珀酰基-6-羟基-2，4-环己二烯-1-羧酸、邻琥 珀酰基苯甲酸、邻琥珀酰基苯甲酰-coA、l，4-二羟基-2-萘甲酸、甲基萘醌、邻氨基苯甲酸、 N-(5'-磷酸核糖基)_邻氨基苯甲酸、1-(邻羧基苯氨基)_1'-脱氧核酮糖-5'-磷酸、 吲哚-3-甘油-磷酸、吲哚、L-色氨酸、4-氨基-4-脱氧分支酸、对氨基苯甲酸、7，8- 二氢 蝶酸、7，8- 二氢叶酸、四氢叶酸、4-羟基苯甲酸、3-八异戊二烯基-4-羟基苯甲酸、2-八异 戊二烯基苯酚、2，2-八异戊二烯基-6-羟基苯酚、2-八异戊二烯基-6-甲氧基苯酚、2-八异 戊二烯基-6-甲氧基-1，4-苯醌、2-八异戊二烯基-3-甲基-6-甲氧基-1，4-苯醌、3-去 甲基泛醌_8、泛醌-8及其两种或多种的组合或混合物。在特定的实施方式中，用于提高微生物的有机酸产量的试剂盒可以包括，但不限 于一种或多种能够调节分支酸超路径的化合物，其中，所述调节涉及选自以下的分支酸超 路径的一种或多种中间体的细胞内水平D-赤藓糖-4-磷酸、3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮 糖酸-7-磷酸、3-脱氢奎尼酸、3-脱氢-莽草酸、莽草酸、莽草酸-3-磷酸、5-烯醇式丙酮 酰-莽草酸-3-磷酸、分支酸、异分支酸、预苯酸、苯丙酮酸、对羟基苯丙酮酸、L-苯丙氨 酸、L-酪氨酸、2，3_ 二氢-2，3-二羟基苯甲酸、2，3_ 二羟基苯甲酸、肠杆菌素、2-琥珀酰 基-6-羟基-2，4-环己二烯-1-羧酸、邻琥珀酰基苯甲酸、邻琥珀酰基苯甲酰-coA、l，4-二 羟基-2-萘甲酸、甲基萘醌、邻氨基苯甲酸、N- (5 ‘-磷酸核糖基)-邻氨基苯甲酸、1-(邻 羧基苯氨基)-1'-脱氧核酮糖-5'-磷酸、吲哚-3-甘油-磷酸、吲哚、L-色氨酸、4-氨 基-4-脱氧分支酸、对氨基苯甲酸、7，8-二氢蝶酸、7，8-二氢叶酸、四氢叶酸、4-羟基苯甲 酸、3-八异戊二烯基-4-羟基苯甲酸、2-八异戊二烯基苯酚、2，2-八异戊二烯基-6-羟基苯 酚、2-八异戊二烯基-6-甲氧基苯酚、2-八异戊二烯基-6-甲氧基-1，4-苯醌、2-八异戊二 烯基-3-甲基-6-甲氧基-1，4-苯醌、3-去甲基泛醌-8、泛醌-8及其两种或多种的组合或 混合物。技术人员将认识到，尽管本发明的方法和组合物是采用增强微生物对于3-HP的 生产的耐受性的应用的实施方式进行描述的，但它们也可以用于微生物的其它类型的有机 酸的耐受性。说明性实施方式的描述下面的附图构成本说明书的一部分并包括在本说明书中以进一步展示特定的实 施方式。通过参考这些附图中的一个或多个并结合对本发明的具体实施方式
的详细描述可以更好地理解所述实施方式。
图1A-1D代表来自3-HP选择的全基因组多尺度分析的示意图。A)代表与1000个 碱基对(bp)尺度有关的信号，B)代表与2000bp尺度有关的信号，C)代表与4000bp尺度有 关的信号，和D)代表与超过SOOObp尺度有关的信号。图2代表在3-HP的存在下对适应度作出贡献的7个路径的示例性直方图。图3A代表分支酸超路径的示例性的图解。图3B代表与指定的分支酸超路径相关基因的拷贝数增加有关的适应度改变(生 长速度的提高)的示例性条形图。图4代表在外加的有机分子或分子的组合存在或不存在的情况下微生物的生长 的示例性条形图。定义如本文所用，“一”(“a〃或〃 an")可以指一个或多于一个的项目。如本文所用，“调节”(〃modulate"或"modulating〃或"modulation")可以 指改变、增加或减少。发明详述在下面的部分中，为了详细说明本发明的各种实施方式，对各种不同的示例性组 合物和方法进行了描述。对于本领域的技术人员来说显而易见的，实施所述的各种实施方 式不需要采用本文列出的全部或者甚至某些特定的细节，而是可以通过常规的实验改变浓 度、时间、温度和其它特定细节。在某些情况下，说明书没有包括公知的方法或成分。根据本发明的实施方式，可以使用本领域技能范围内的常规的分子生物学、微生 物学和重组DNA技术。文献中(参见，例如，Sambrook，Fritsch& Maniatis，Molecular Cloning :A Laboratory Manual，第二片反 1989，ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, N. Y. ；Animal CellCulture，R. I. Freshney 编辑，1986)完整解释了这样的 技术。生物炼制涉及将可再生的碳源和能量源转化成大量的通用化学品的高效方法的 开发。美国能源部(USDOE)已公布了用于未来的生物炼制努力方向的基本组成化学品 (building block chemical)的优先目录，其包括例如，3-羟基丙酸(3-HP)。通过开发将 葡萄糖转化成3-HP的重组宿主实现了先前的生产。已经有人提出需要至少100g/L的最终 3-HP滴定度以确保工业生产的经济可行性，但这些培养物中低至10g/L的高密度就可能抑 制生长。已经对于在大肠杆菌中生产3-HP研究了几种不同的遗传策略。由于大肠杆菌与 可选择的生物体相比具有大的营养源范围(例如，戊糖)、快速生长和易于遗传修饰的能 力，其是有吸引力的宿主生物体。一个问题是微生物对于有机化合物的高水平生产的低耐 受性。通常，增加的有机化合物对于微生物是毒性的。现在存在着提高微生物产生有机酸 和醇的产量和微生物对于有机酸和醇生产的耐受性的需要。库富集的尺度分析(SCALE)是可以用来监测基因组文库群体中单个克隆的富集 和稀释的高分辨率、全基因组方法。该方法包括建立具有可变的插入片段大小的代表性基 因组文库，使克隆在选择性环境中生长，使用微阵列探询(interrogation)所选择的群体 和进行数学多尺度分析以鉴别其中拷贝数增加提高总体适应度的基因。该方法已经用来开发与有机酸表型，例如3-HP耐受性表型(数据没有显示)，相关的定向选种的技术。以前的 工作已确认了一些减轻产物毒性的机制，包括生物膜形成、渗透性改变、转运提高、产物修 饰或碳利用和特定的代谢改变。在特定的实施方式中，本发明的方法试图评估由与分支酸 生物合成路径有关的细胞内有机酸应激(例如，3-HP应激)特异性的代谢效应所导致的抑 制。特定的实施方式涉及生物炼制、生物质(例如，农作物、树、草、作物残体、森林残 留物)和使用生物转化、发酵、化学转化和催化以产生和利用有机化合物。随后这些有机化 合物可以转变为有价值的衍生化学品。但是，有机酸本质上是有毒的，因而低水平时对于生 产生物体是抑制性的。为了优化有机酸中间体的产生，对有机酸的耐受性进行工程设计可 以是其中一个因素。这可以通过供应外源分子以提高产量或抑制非许可分子的表达而允许 提高生产水平来实现。由于通用化学试剂存在于竞争性的环境中，优化可能对于生物炼制 的经济可行性是必需的。因而，本文公开的组合物和方法涉及鉴别菌株和分子中的遗传区 域，所述分子提高用于产物和系统的生物生产的有机化合物的产量或对有机化合物的耐受 性。分支酸超路径分支酸超路径是细胞存活必需的基本代谢路径。例如，分支酸是细胞存活需要的 许多芳香氨基酸(酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)和维生素(叶酸、泛醌和甲基萘醌)的共同 前体。在一个更特别的实例中，在分支酸合成的第一步骤中具有活性的3-脱氧-D-阿拉 伯-庚酮糖酸-7-磷酸合酶(DAHPS)同工酶(aroF、aroG、aroH)显示出受到下游产生的芳 香氨基酸池增加的明显的反馈抑制。在本发明的一种实施方式中，分支酸超路径可以受到 3-HP应激的抑制，其可以通过向生长培养基中加入分支酸超路径的下游产物而部分地减 轻。在一种更特别的实施方式中，下游产物可以是莽草酸。加入来自分支酸的各种下游产 物显示出比生长(specific growth)和最终的细胞密度的至少部分再生。在一种特别的实 施方式中，加入莽草酸可以导致与野生型生长相比大约20%的生长再生，表明抑制可能发 生在莽草酸形成之前，从而导致在细胞内氨基酸和维生素池的减少。在各种实施方式中，可以通过鉴别可利用调节的表达来增强对于有机化合物的耐 受性和/或有机化合物的产量的基因而促进生长。在某些实施方式中，调节可以包括分支 酸超路径的一种或多种基因的表达或活性的增加。在其它实施方式中，调节可以包括分支 酸超路径的一种或多种基因的表达或活性的减少。在其它实施方式中，分支酸超路径的调 节可以包括增加某些基因的表达和/或活性而同时减少其它基因的表达和/或活性的组 合。在某些实施方式中，能够改变分支酸超路径的基因可以包括改变该路径的中间体的形 成和/或改变该路径的前体的基因。本发明预期遗传操纵可以包括增加和/或减少中间体 通过分支酸超路径的通量。用来检测单个化合物的遗传筛选通常一次处理一个细胞。选择与特定环境中的生 存能力联系在一起。因此，在一种实施方式中，表明具有提高的生长或对有机酸的耐受性的 细菌生物体可以对其影响生长、产量和/或所确认的耐受性的遗传区域进行选择。在某些 实施方式中，编码酪氨酸的遗传区域的选择显示出细菌中产生的有机酸分子的产量提高和 /或对有机酸分子的耐受性增强。本发明的特定实施方式涉及调节能够增强微生物对于有机化合物生产的耐受性的分支酸超路径。根据这些实施方式，该路径中的特定分子的表达能够通过调节该路径的 基因的表达而增强对于有机化合物的耐受性。这种新型的耐受性策略将允许提高有机化合 物(如3-HP)的产量。例如，已被工程化生产3-HP的菌株可以通过调节本文公开的分支酸 超路径中的一种或多种基因进行改变，以增强该菌株对于3-HP生产的耐受性。另外，这些 方法可以与用于生物体的遗传改变和遗传选择策略的SCALE技术(2004年9月20日提交 的美国临时申请第60/611，377号和2005年9月20日提交的美国专利申请第11/231,018 号，二者的题目都是"Mixed-Library Parallel Gene Mapping Quantitation Microarray Techniquefor Genome Wide Identification of Trait Conferring Genes“，其完整弓I入 本文作为参考)结合使用。在某些实施方式中，微生物的遗传操纵可以用来做出需要的遗传改变，其可以导 致需要的表型而且可以通过许多技术来实现。这些技术包括，但不限于使用i)引入新的 遗传物质的载体；ii)现有遗传物质的遗传插入、破坏或除去；以及iii)遗传物质的突变； 或i、ii和iii的任意组合，其导致所寻求的具有希望的表型的希望的遗传改变。载体可以 包括，但不限于，任何用来将新的遗传物质引入生物体的遗传元件。这些载体可以包括，但 不限于任何拷贝数的质粒、在任何拷贝中整合到基因组中的可整合元件、病毒、噬菌体或噬 粒。在本发明的其它实施方式中，可以包括基因插入、破坏或除去而作为将新的遗传元件插 入基因组、通过可以影响插入位点以外的基因组较大区域的插入破坏转录或正常的调节功 能、及删除或除去基因组区域的部分。进行这些工作可以使用的技术包括，但不限于定向敲 除或突变、基因置换、转座子、随机诱变或其组合。除了包括，但不限于易错PCR或通过PCR 的定向诱变、突变基因菌株和随机诱变的那些技术以外，突变可以是通过本领域已知的任 何技术，利用需要载体、插入、破坏或除去的任何技术进行定向的或随机的突变。在特定的实施方式中，SCALE可以用来监测单个克隆在基因组文库群体中的富集 和稀释。该方法包括建立具有可变插入片段大小的代表性基因组文库，在选择性的环境中 生长克隆，使用微阵列探询选择的群体和进行数学多尺度分析以鉴别其拷贝数增加提高总 体适应度的基因。另外，本发明预期的特定实施方式涉及抑制与增强基因(例如，提高微生物的有 机酸的产量或增强对有机酸生产的耐受性的基因)对应的阻遏基因的表达或活性。在其它 实施方式中，携带TyrR区域(酪氨酸阻遏基因区域)(该阻遏区域对应于酪氨酸和分支酸 路径)缺失的克隆可以用来增加酪氨酸池。这种阻遏物与其它分支酸路径突变的组合可以 导致与莽草酸生产的提高和相应的3-HP耐受性的增强相关的中间体池的改变。在特定的 实施方式中，等于、对应于或包括MACHl培养中跨越2736799-2738100的基因区域(酪氨 酸A克隆)和/或跨越2736700-2739223的基因区域(酪氨酸A克隆)的大约50%、或大 约60 %、或大约70 %、或甚至大约80 %或大约90 %的遗传区域可以在本发明中用来提高微 生物的3-HP的产量或增强对3-HP生产的耐受性。另外，本发明设想等于、对应于或包括跨 越1384744-1386285 (酪氨酸R克隆)的基因区域的大约50%、大约60%、大约70%、大约 80%或大约90%的遗传区域中的突变/缺失可以在本发明中用来提高微生物的3-HP的产 量或增强对3-HP生产的耐受性。在一种实施方式中，一种或多种突变/缺失在编码能够抑 制分支酸超路径中产生的任何氨基酸(如酪氨酸)的阻遏物的遗传区域内。注意本发明 考虑的百分比可以包括非连续的区域。
在一种示例性的方法中，路径适应度分析确认了多种路径，其各在对于高水平 3-HP特异性的生长抑制中发挥作用，包括分支酸超路径和组氨酸、嘌呤和嘧啶生物合成超 路径(PRPP)(参见，例如图2)。这种全基因组的定量方法使得我们能够确认与由于3-HP应 激导致的生长抑制相关的完整代谢路径。某些实施方式涉及用于增强微生物对于3-羟基丙酸(3-HP)的耐受性的组合物， 包括一种或多种能够调节微生物的分支酸超路径的化合物，其中，分支酸超路径的调节增 强对于3-HP的耐受性。在特定的实施方式中，该组合物包括分支酸超路径的中间体。在其 它实施方式中，该组合物包括分支酸超路径的前体。在再另外的实施方式中，该组合物包括 调节分支酸超路径的通量。在某些实施方式中，调节可能指增加或减少分支酸超路径的一 种或多种基因的表达或活性。根据这些实施方式，一种或多种化合物可以诱导微生物的分 支酸超路径的酶。在其它实施方式中，化合物可以包括具有能够调节分支酸超路径的遗传 元件的载体。本发明预期使用的组合物和方法可以包括，但不限于一种或多种分支酸超路径的 中间体，选自D-赤藓糖-4-磷酸、3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸、3-脱氢奎尼酸、 3-脱氢-莽草酸、莽草酸、莽草酸-3-磷酸、5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸、分支酸、异 分支酸、预苯酸、苯丙酮酸、对羟基苯丙酮酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、2，3- 二氢-2，3- 二羟 基苯甲酸、2，3_ 二羟基苯甲酸、肠杆菌素、2-琥珀酰基-6-羟基-2，4-环己二烯-1-羧酸、邻 琥珀酰基苯甲酸、邻琥珀酰基苯甲酰-C0A、1，4- 二羟基-2-萘甲酸、甲基萘醌、邻氨基苯甲 酸、N-(5'-磷酸核糖基)_邻氨基苯甲酸、1-(邻羧基苯氨基)_1'-脱氧核酮糖-5'-磷 酸、吲哚-3-甘油-磷酸、吲哚、L-色氨酸、4-氨基-4-脱氧分支酸、对氨基苯甲酸、7，8_ 二 氢蝶酸、7，8- 二氢叶酸、四氢叶酸、4-羟基苯甲酸、3-八异戊二烯基-4-羟基苯甲酸、2-八 异戊二烯基苯酚、2，2-八异戊二烯基-6-羟基苯酚、2-八异戊二烯基-6-甲氧基苯酚、2-八 异戊二烯基-6-甲氧基-1，4-苯醌、2-八异戊二烯基-3-甲基-6-甲氧基-1，4-苯醌、3-去 甲基泛醌_8、泛醌-8或其两种或多种的组合或混合物。本发明预期使用的组合物和方法可以包括，但不限于一种或多种分支酸超路径的 前体，选自D-赤藓糖-4-磷酸、3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸、3-脱氢奎尼酸、 3-脱氢-莽草酸、莽草酸、莽草酸-3-磷酸、5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸、分支酸、异 分支酸、预苯酸、苯丙酮酸、对羟基苯丙酮酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、2，3- 二氢-2，3- 二羟 基苯甲酸、2，3_ 二羟基苯甲酸、肠杆菌素、2-琥珀酰基-6-羟基-2，4-环己二烯-1-羧酸、邻 琥珀酰基苯甲酸、邻琥珀酰基苯甲酰-coA、1，4- 二羟基-2-萘甲酸、甲基萘醌、邻氨基苯甲 酸、N-(5'-磷酸核糖基)_邻氨基苯甲酸、1-(邻羧基苯氨基)_1'-脱氧核酮糖-5'-磷 酸、吲哚-3-甘油-磷酸、吲哚、L-色氨酸、4-氨基-4-脱氧分支酸、对氨基苯甲酸、7，8- 二 氢蝶酸、7，8- 二氢叶酸、四氢叶酸、4-羟基苯甲酸、3-八异戊二烯基-4-羟基苯甲酸、2-八 异戊二烯基苯酚、2，2-八异戊二烯基-6-羟基苯酚、2-八异戊二烯基-6-甲氧基苯酚、2-八 异戊二烯基-6-甲氧基-1，4-苯醌、2-八异戊二烯基-3-甲基-6-甲氧基-1，4-苯醌、3-去 甲基泛醌_8、泛醌-8及其两种或多种的组合或混合物。本发明预期使用的组合物和方法可以包括，但不限于一种或多种能够改变分支酸 超路径的一种或多种中间体的细胞内水平的组合物，所述中间体选自D-赤藓糖-4-磷酸、 3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸、3-脱氢奎尼酸、3-脱氢-莽草酸、莽草酸、莽草酸-3-磷酸、5-烯醇式丙酮酰_莽草酸-3-磷酸、分支酸、异分支酸、预苯酸、苯丙酮酸、对羟 基苯丙酮酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、2，3- 二氢-2，3- 二羟基苯甲酸、2，3- 二羟基苯甲酸、 肠杆菌素、2-琥珀酰基-6-羟基-2，4-环己二烯-1-羧酸、邻琥珀酰基苯甲酸、邻琥珀酰基 苯甲酰-coA、1，4- 二羟基-2-萘甲酸、甲基萘醌、邻氨基苯甲酸、N- (5 ‘-磷酸核糖基)-邻 氨基苯甲酸、1-(邻羧基苯氨基)-1'-脱氧核酮糖-5'-磷酸、吲哚-3-甘油-磷酸、吲 哚、L-色氨酸、4-氨基-4-脱氧分支酸、对氨基苯甲酸、7，8- 二氢蝶酸、7，8- 二氢叶酸、四氢 叶酸、4-羟基苯甲酸、3-八异戊二烯基-4-羟基苯甲酸、2-八异戊二烯基苯酚、2，2-八异戊 二烯基-6-羟基苯酚、2-八异戊二烯基-6-甲氧基苯酚、2-八异戊二烯基-6-甲氧基-1， 4-苯醌、2-八异戊二烯基-3-甲基-6-甲氧基-1，4-苯醌、3-去甲基泛醌-8、泛醌-8及其 两种或多种的组合或混合物。本发明预期使用的组合物和方法可以包括，但不限于一种或多种能够改变分支酸 超路径的一种或多种前体的细胞内水平的组合物，所述前体选自D-赤藓糖-4-磷酸、3-脱 氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸、3-脱氢奎尼酸、3-脱氢-莽草酸、莽草酸、莽草酸-3-磷 酸、5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸、分支酸、异分支酸、预苯酸、苯丙酮酸、对羟基苯丙 酮酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、2，3_ 二氢-2，3-二羟基苯甲酸、2，3_ 二羟基苯甲酸、肠杆 菌素、2-琥珀酰基-6-羟基-2，4-环己二烯-1-羧酸、邻琥珀酰基苯甲酸、邻琥珀酰基苯甲 酰-coA、1，4- 二羟基-2-萘甲酸、甲基萘醌、邻氨基苯甲酸、N- (5 ‘-磷酸核糖基)-邻氨 基苯甲酸、1_(邻羧基苯氨基)_1'-脱氧核酮糖-5'-磷酸、吲哚-3-甘油-磷酸、吲哚、 L-色氨酸、4-氨基-4-脱氧分支酸、对氨基苯甲酸、7，8- 二氢蝶酸、7，8- 二氢叶酸、四氢叶 酸、4-羟基苯甲酸、3-八异戊二烯基-4-羟基苯甲酸、2-八异戊二烯基苯酚、2，2-八异戊二 烯基-6-羟基苯酚、2-八异戊二烯基-6-甲氧基苯酚、2-八异戊二烯基-6-甲氧基-1，4-苯 醌、2-八异戊二烯基-3-甲基-6-甲氧基-1，4-苯醌、3-去甲基泛醌-8、泛醌-8及其两种 或多种的组合或混合物。本发明预期使用的组合物和方法可以包括，但不限于一种或多种选自以下的化合 物分支酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、叶酸、泛醌、维生素K2、3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮 糖酸-7-磷酸合酶(DAHPS)同工酶、莽草酸、D-赤藓糖-4-磷酸、3-脱氧-D-阿拉伯-庚 酮糖酸-7-磷酸、3-脱氢奎尼酸、3-脱氢-莽草酸、莽草酸、莽草酸-3-磷酸、5-烯醇式丙 酮酰-莽草酸-3-磷酸、分支酸、异分支酸、预苯酸、苯丙酮酸、对羟基苯丙酮酸、L-苯丙氨 酸、L-酪氨酸、2，3_ 二氢-2，3-二羟基苯甲酸、2，3_ 二羟基苯甲酸、肠杆菌素、2-琥珀酰 基-6-羟基-2，4-环己二烯-1-羧酸、邻琥珀酰基苯甲酸、邻琥珀酰基苯甲酰-coA、l，4-二 羟基-2-萘甲酸、甲基萘醌、邻氨基苯甲酸、N- (5 ‘-磷酸核糖基)-邻氨基苯甲酸、1-(邻 羧基苯氨基)-1'-脱氧核酮糖-5'-磷酸、吲哚-3-甘油-磷酸、吲哚、L-色氨酸、4-氨 基-4-脱氧分支酸、对氨基苯甲酸、7，8-二氢蝶酸、7，8-二氢叶酸、四氢叶酸、4-羟基苯甲 酸、3-八异戊二烯基-4-羟基苯甲酸、2-八异戊二烯基苯酚、2，2-八异戊二烯基-6-羟基苯 酚、2-八异戊二烯基-6-甲氧基苯酚、2-八异戊二烯基-6-甲氧基-1，4-苯醌、2-八异戊二 烯基-3-甲基-6-甲氧基-1，4-苯醌、3-去甲基泛醌-8或泛醌-8。在某些实施方式中，本发明使用的组合物和方法可以涉及使用调节微生物的分支 酸超路径的一种或多种酶的化合物。在特定的实施方式中，本发明使用的组合物和方法可 以涉及化合物的使用，该化合物通过引入一种或多种具有能够改变分支酸超路径的代谢物的遗传元件的载体来调节一种或多种化合物。在特定的实施方式中，本发明使用的组合物 和方法可以涉及一种或多种能够调节改变分支酸超路径的代谢物的遗传变化的化合物。其它实施方式涉及使用一种或多种能够增强微生物对于3-HP的耐受性的化合物 提高微生物的3-羟基丙酸(3-HP)的产量的组合物和方法，其中，组合物诱导对于至少30g/ L的3-HP的耐受性。预期的其它实施方式包括对于至少35g/L的3-HP、至少40g/L的3-HP、 野生型组合物至少1. 2倍的3-HP、野生型组合物至少1. 4倍的3-HP、野生型组合物至少1. 6 倍的3-HP的耐受性，其中，野生型组合物很少或没有改变分支酸超路径的组合物或方法。本发明预期的其它示例性的方法涉及提高微生物的有机酸的产量或增强对有机 酸生产的耐受性，包括调节微生物的分支酸超路径。根据这些示例性的方法，调节微生物的 分支酸超路径可以包括向微生物引入能够调节分支酸超路径的化合物。预期用于提高微生 物的有机酸的产量或增强对有机酸生产的耐受性的其它方法可以包括获得一种或多种能 够调节微生物的分支酸超路径的中间体的化合物，其中，分支酸超路径的调节提高了微生 物的有机酸的产量或增强对有机酸的耐受性；和向微生物的培养物中引入所述化合物。在 特定的更特别的实施方式中，有机酸是3-HP或3-HP组合物。在某些实施方式中，化合物可以选自分支酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、叶酸、泛 醌、维生素K2、3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸合酶(DAHPS)同工酶、莽草酸、D-赤 藓糖-4-磷酸、3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸、3-脱氢奎尼酸、3-脱氢-莽草酸、 莽草酸、莽草酸-3-磷酸、5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸、分支酸、异分支酸、预苯酸、苯 丙酮酸、对羟基苯丙酮酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、2，3- 二氢-2，3- 二羟基苯甲酸、2，3- 二 羟基苯甲酸、肠杆菌素、2-琥珀酰基-6-羟基-2，4-环己二烯-1-羧酸、邻琥珀酰基苯甲酸、 邻琥珀酰基苯甲酰-coA、1，4- 二羟基-2-萘甲酸、甲基萘醌、邻氨基苯甲酸、N- (5 ‘-磷酸 核糖基)_邻氨基苯甲酸、1_(邻羧基苯氨基)_1'-脱氧核酮糖-5'-磷酸、吲哚-3-甘 油_磷酸、吲哚、L-色氨酸、4-氨基-4-脱氧分支酸、对氨基苯甲酸、7，8- 二氢蝶酸、7，8- 二 氢叶酸、四氢叶酸、4-羟基苯甲酸、3-八异戊二烯基-4-羟基苯甲酸、2-八异戊二烯基苯酚、 2，2-八异戊二烯基-6-羟基苯酚、2-八异戊二烯基-6-甲氧基苯酚、2-八异戊二烯基-6-甲 氧基-1，4-苯醌、2-八异戊二烯基-3-甲基-6-甲氧基-1，4-苯醌、3-去甲基泛醌_8、泛 醌_8或其两种或多种的组合或混合物中的一种或多种。在本发明预期的某些实施方式中，3-HP的组合物可以包含3-HP和任选的3，3_ 二 氧丙酸(3，3-di0Xpr0priniC acid)和丙烯酸中的一种或多种的混合物。本发明预期的某些示例性的方法涉及提高微生物的有机酸的产量或增强对有机 酸生产的耐受性，包括获得一种或多种能够调节微生物的分支酸超路径的前体的化合物， 其中，分支酸超路径的诱导提高微生物的有机酸的产量或增强对有机酸的耐受性；和向微 生物的培养物中弓I入所述化合物。在某些更特别的方法中，提高微生物的3-羟基丙酸(3-HP)产量可以包括使微生 物培养物与包含一种或多种分支酸超路径的化合物或者能够对分支酸超路径进行调节的 组合物接触。根据这些实施方式，该化合物可以包括含有能够调节分支酸超路径的遗传元 件的载体。其它用于提高微生物的3-羟基丙酸(3-HP)的产量和/或增强对3-羟基丙酸的 耐受性的示例性的方法可以包括遗传操纵微生物的分支酸超路径。本发明预期的分支酸超 路径的遗传操纵可以包括通过添加载体以引入新的遗传物质；现有遗传物质的遗传插入、破坏或除去；遗传物质的突变或其两种或多种的组合而改变一种或多种涉及微生物的分支 酸超路径的基因的表达。示例性的遗传插入可以包括调节一种或多种以下物质的细胞内水平分支酸、酪 氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、叶酸、泛醌、维生素K2、3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸合 酶(DAHPS)同工酶、莽草酸、D-赤藓糖-4-磷酸、3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸_7_磷酸、
3-脱氢奎尼酸、3-脱氢莽草酸、莽草酸、莽草酸-3-磷酸、5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷 酸、分支酸、异分支酸、预苯酸、苯丙酮酸、对羟基苯丙酮酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、2，3- 二 氢-2，3- 二羟基苯甲酸、2，3- 二羟基苯甲酸、肠杆菌素、2-琥珀酰基-6-羟基-2，4-环己二 烯-1-羧酸、邻琥珀酰基苯甲酸、邻琥珀酰基苯甲酰-coA、l，4-二羟基-2-萘甲酸、甲基萘 醌、邻氨基苯甲酸、N-(5'-磷酸核糖基)_邻氨基苯甲酸、1-(邻羧基苯氨基)_1' _脱氧核 酮糖-5 ‘-磷酸、吲哚-3-甘油-磷酸、吲哚、L-色氨酸、4-氨基-4-脱氧分支酸、对氨基苯 甲酸、7，8- 二氢蝶酸、7，8- 二氢叶酸、四氢叶酸、4-羟基苯甲酸、3-八异戊二烯基-4-羟基 苯甲酸、2-八异戊二烯基苯酚、2，2-八异戊二烯基-6-羟基苯酚、2-八异戊二烯基-6-甲氧 基苯酚、2-八异戊二烯基-6-甲氧基-1，4-苯醌、2-八异戊二烯基-3-甲基-6-甲氧基-1，
4-苯醌、3-去甲基泛醌-8、泛醌-8及其两种或多种的组合或混合物。在某些实施方式中，预期试剂盒用于本发明预期使用的组合物和方法。特定的实 施方式包括用于提高微生物的有机酸的产量的试剂盒，包括一种或多种能够调节分支酸 超路径的化合物和一个或多个容器。根据这些实施方式，本发明使用的试剂盒可以提供分 支酸超路径改变或补充的组合物，该组合物能够改变用于生产3-HP的微生物的分支酸超 路径的通量。特定的实施方式可以包括，但不限于一种或多种选自以下的化合物分支酸、 酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、叶酸、泛醌、维生素K2、3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸合 酶(DAHPS)同工酶、莽草酸、D-赤藓糖-4-磷酸、3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸_7_磷酸、
3-脱氢奎尼酸、3-脱氢-莽草酸、莽草酸、莽草酸-3-磷酸、5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷 酸、分支酸、异分支酸、预苯酸、苯丙酮酸、对羟基苯丙酮酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、2，3- 二 氢-2，3- 二羟基苯甲酸、2，3- 二羟基苯甲酸、肠杆菌素、2-琥珀酰基-6-羟基-2，4-环己二 烯-1-羧酸、邻琥珀酰基苯甲酸、邻琥珀酰基苯甲酰-coA、l，4- 二羟基-2-萘甲酸、甲基萘 醌、邻氨基苯甲酸、N-(5'-磷酸核糖基)_邻氨基苯甲酸、1-(邻羧基苯氨基)_1' _脱氧核 酮糖-5 ‘-磷酸、吲哚-3-甘油-磷酸、吲哚、L-色氨酸、4-氨基-4-脱氧分支酸、对氨基苯 甲酸、7，8- 二氢蝶酸、7，8- 二氢叶酸、四氢叶酸、4-羟基苯甲酸、3-八异戊二烯基-4-羟基 苯甲酸、2-八异戊二烯基苯酚、2，2-八异戊二烯基-6-羟基苯酚、2-八异戊二烯基-6-甲氧 基苯酚、2-八异戊二烯基-6-甲氧基-1，4-苯醌、2-八异戊二烯基-3-甲基-6-甲氧基-1，
4-苯醌、3-去甲基泛醌-8、泛醌-8及其两种或多种的组合或混合物。在本发明预期的某些实施方式中，组合物可以包括能够调节通过分支酸超路径的 代谢物的通量的组合物，以增加和/或减少通过该路径的代谢物的产生。在特定的实施例 中，通量的增加可以是从D-赤藓糖-4-磷酸到莽草酸；和/或从莽草酸到分支酸；和/或从 分支酸到对氨基苯甲酸；和/或从分支酸到泛醌；和/或从分支酸到色氨酸；和/或从分支 酸到预苯酸；和/或从分支酸到异分支酸；和/或从对氨基苯甲酸到四氢叶酸；和/或从预 苯酸到L-苯丙氨酸；和/或从预苯酸到酪氨酸；和/或从异分支酸到肠杆菌素，从异分支酸 到维生素K2 ；和/或从酪氨酸到硫胺素。
在某些实施方式中，可以进行遗传操纵以改变分支酸超路径的中间体的细胞内浓 度。根据这些实施方式，该路径可以被反馈抑制，从而导致一种或多种可预计引起反馈抑 制降低的特定中间体的减少，并因而增加通过分支酸超路径的通量和显示出增强对于3-HP 的耐受性的下游产物的供应量。在特定的实施方式中，遗传操纵可以用来减少分支酸超路 径的中间体的量，且该减少可以导致微生物对于3-HP的耐受性的增强。为了对该路径进行调节，预期用于本发明的方法和组合物中的分支酸超路径的一 种或多种基因可以包括基因的全部或部分。例如，也许基因的30%或更多，基因的50% 或更多，基因的70%或更多，或基因的80%或更多，或基因的90%或更多，或甚至基因的 100%或更多可以用于本发明预期的方法和组合物中，以增强微生物的3-HP耐受性(参见， 例如，Tyr A基因)。在特定的实施方式中，预期的是具有选自参与分支酸超路径的基因的序 列、含有至少 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或更多的连续的核苷酸的寡核苷酸。另外，预期的是 使用遗传操纵和其它耐受性诱导方法的方法组合。3-HP耐受性是重要的，因为增强的耐受性可以导致3-HP生产的工业发酵中产量 和滴定度的提高。基本的发酵模式包括废料或可再生的糖原料(例如，玉米)转化为糖(例 如，己糖、戊糖)，其可以由工程化的生物体发酵以产生具有附加值的产物，如燃料(例如， 乙醇或氢)或通用化学试剂(例如，单体/聚合物)，如3-HP。3-HP可以转化为化学工业、 生物技术、服装业和可能的卫生保健康业感兴趣的高价值化学品，包括新聚合物和材料，以 及传统的市场上大量销售的化学品，如丙烯酸、丙烯酰胺、甲基-丙烯酸、1，3-丙二醇。核酸可以通过本领域的技术人员已知的任何技术制备本发明预期范围之内的核酸。核 酸，尤其是合成的寡核苷酸的例子可以包括通过使用磷酸三酯、亚磷酸酯或亚磷酰胺化学 反应的体外化学合成和经脱氧核苷H-膦酸酯中间体的固相技术制造的核酸。在特定的实 施方式中，可以产生本发明预期的核酸序列且可以进行修饰。修饰的核酸序列的例子包括 可以在扩增反应(如PCR )或寡核苷酸合成之后进行修饰的那些核酸序列。生物产生的核 酸的例子包括在活细胞中产生的重组核酸，如细菌中产生的重组DNA载体。碱基(nucleobase)、核苷和核苷酸模拟物或衍生物是本领域公知的，且现有技术 已经描述了它们。嘌呤和嘧啶碱基包括天然存在的嘌呤和嘧啶及其衍生物和模拟物。这些 包括，但不限于一个或多个烷基、羧烷基、氨基、羟基、卤素(例如，氟、氯、溴或碘)、硫醇或 烷基硫醇基团取代的嘌呤和嘧啶。烷基取代基可以包括大约1、2、3、4或5到大约6个碳原 子。考虑用来修饰本发明产生的核酸的嘌呤和嘧啶的例子可以包括，但不限于脱氮嘌 呤(deazapurine) ,2,6- 二氨基嘌呤、5_氟尿嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、8_溴鸟嘌呤、8-氯 鸟嘌呤、溴胸腺嘧啶、8-氨基鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤、8-甲基鸟嘌呤、8-硫鸟嘌呤、氮鸟嘌 呤、2-氨基嘌呤、5-乙基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-乙基尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、 5_氯尿嘧啶、5-丙基尿嘧啶、硫尿嘧啶、2-甲基腺嘌呤、甲基硫腺嘌呤、N，N-二甲基腺嘌呤、 氮杂腺嘌呤、8-溴腺嘌呤、8-羟基腺嘌呤、6-羟基氨基嘌呤、6-硫嘌呤、4-(6_氨基己基/胞 嘧啶)等。另外，嘌呤和嘧啶衍生物或模拟物可以在本文公开的任一种方法中用作碱基取 代。
为了其中将核酸片段合并入载体如质粒、粘粒或病毒的应用，这些片段可以结合 其它DNA序列，如启动子、聚腺苷酸化信号、限制性酶切位点、多重克隆位点、其它编码片段 等，以使得其全长可以显著地改变。预期可以采用几乎任何长度的核酸片段，优选整体长度 受到制备的简便性和在预期的重组DNA方案中的应用的限制。在某些实施方式中，可以将编码特定基因的DNA片段引入重组宿主细胞，并用于 表达特定的结构蛋白或调节蛋白。或者，通过基因工程技术的应用，可以采用所选择的基因 的亚部分(subportion)或衍生物。可以分离含有调节区域(如启动子区域)的上游区域 并随后用于所选择的基因或选择的基因片段的表达。在产生出表达产物的情况下，核酸序列在保持编码同样产物的能力的同时发生改 变是可能的。扩增扩增也可以用于产生给定的核酸序列的多个拷贝的重复过程 (iterativeprocess)。在本发明的范围内，可以通过本领域已知的任何方法实现扩增。引物本发明所需的引物意思是包括能够在模板依赖性的过程中引发新生核酸的合成 的任何核酸。典型地，引物是大约5-100碱基对长度的寡核苷酸，但可以使用更长的序列。 可以提供双链或单链形式的引物。在某些实施方式中，通过混合在各个位置等摩尔量的各含氮碱基(A、C、G和T)以 产生非常短的片段的大量的变换(permutation)(例如，“η"是寡链长度的情况)来获得 随机区域的扩增。这提供了与由单一小鼠产生的鼠抗体的10. 9-1011变异体相比，显著更 高的发现高亲和力核酸序列的可能性。许多模板依赖性的过程可用于扩增给定的模板样品中存在的标记序列(marker sequence) 0 了解最多的扩增方法之一是聚合酶链反应(称为PCR)，其在美国专利第 4，683，195,4, 683，202和4，800, 159号中进行了详细描述，这些文献完整引入本文作为参考。在其它实施方式中，用于扩增核酸的其它方法包括，但不限于连接酶链反应 (〃 LCR “ )、Q0 复制酶(Qbeta R印licase)、等温扩增法(isothermalamplification method)和链置换扩增(SDA)，以及本领域中已知的其它方法。根据本文公开的实施方式可 以使用再另外的扩增方法。其它核酸扩增程序可以包括基于转录的扩增系统(TAS)，包括基 于核酸序列的扩增(NASBA)。在某些公开的方法中，可以通过标准的苯酚/氯仿提取、临床 样品的热变性、用裂解缓冲液和分离DNA和RNA的微型旋转柱(mini-spin column)处理或 RNA的氯化胍提取制备用于扩增的核酸序列。在等温循环反应中，RNA逆转录成双链DNA， 并用聚合酶如T7或SP6再次转录。聚合酶和逆转录酶包括，但不限于热稳定的DNA聚合酶=OnmiBaseTM.测序酶Pfu DNA聚合酶Taq DNA聚合酶Taq DNA聚合酶、SequencingGrade TaqBead. TM.热起动聚合酶 AmpliTaq Gold Tfl DNA 聚合酶 TliDNA 聚合酶 Tth DNA 聚合酶 DNAPOLYMERASES :DNA 聚合 酶I、克林诺片段、核酸外切酶-DNA聚合酶I DNA聚合酶I大(克林诺)片段末端脱氧核苷 酸转移酶T4 DNA聚合酶逆转录酶AMV逆转录酶M-MLV逆转录酶。对于特定的实施方式，可能需要将标记加入核酸序列、扩增产物、探针或引物中。可以使用许多不同的标记，包括但不限于荧光团、发色团、放射性同位素、酶标签、抗体、化 学发光剂、电致发光剂和亲和标记。本发明预期的亲和标记的例子可以包括，但不限于抗体、抗体片段、受体蛋白、激 素、生物素、DNP和结合亲和标记的任何多肽/蛋白质分子。酶标签的例子包括，但不限于脲酶、碱性磷酸酶或过氧化物酶。可以与这样的酶一 起使用色度指示剂物质，以提供人眼可见的或分光光度分析可见的检测手段。本发明公开的以下荧光团包括，但不限于Alexa 350、Alexa 430、AMCA、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL, B0DIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX, Cascade Blue、Cy2、Cy3、Cy5、6_FAM、荧光素(Fluorescein)、HEX>6-JOE> Oregon Green488、Oregon Green 500>Oregon Green 514、Pacific Blue、REG、RhodamineGreeruRhodamine RecUROX、 TAMRA, ΤΕΤ、四甲基罗丹明和TexasRed。凝胶电泳在某些实施方式中，凝胶电泳可以用来分离、部分纯化或纯化本发明使用本领域 已知的标准方法确认或预期的成分。电泳分离是基于本领域内已知的方法。以这种方式分离的样品可以使用连续监测 产生的色斑的光密度的光密度计(densitometer)通过染色和相对意义的定量来可视化。 电解液可以是连续(单一的缓冲液)或非连续的，其中，在样品进入电泳胶/电泳缓冲液 (running gel/runningbuffer)之前，样品借助于缓冲液不连续性堆叠。色谱技术或者，可以使用色谱技术实现分离。有许多种可以使用的色谱方法，例如吸附色 谱、分配色谱、离子交换色谱和分子筛色谱，和许多利用这些色谱方法的专门技术，包括柱 色谱、纸色谱、薄层色谱和气相色谱。微流体技术微流体技术包括在如由ACLARA Biosciences Inc.设计的微毛细管或由Caliper Technologies Inc 制造的 LabChip. 液体集成电路(liquidintegrated circuits)的平 台上进行分离。这些微流体平台只需要纳升体积的样品，与其它分离技术需要微升体积的 样品形成对比。使某些涉及遗传分析的方法小型化已经通过使用本领域内已知的微流体技 术实现。核酸递送脂质体制剂在本发明特定的广泛实施方式中，可以将寡核苷酸或多核苷酸和/或表达载 体包于脂质体中。脂质体是以磷脂双层膜和内部的水性介质为特征的多孔结构。多层 (multilamellar)脂质体具有由水性介质分隔的多个脂质层。脂质成分在形成紧密结构之 前经历自我重排并将水和溶解的溶质包在脂质双层之间(Ghosh和Bachhawat，1991)。也可 以考虑阳离子脂质-核酸复合物，如脂质转染胺(lipofectamine)核酸复合物。在本发明的特定实施方式中，脂质体可以与红细胞凝集病毒(HVJ)复合。这已被 证明有利于与细胞膜的融合并促进脂质体包封的DNA进入细胞(Kaneda等人，1989)。在其 它实施方式中，可以将脂质体与核的非组蛋白性染色体蛋白(HMG 1)复合，或与其联合使 用(Kato等人，1991)。在更进一步的实施方式中，脂质体可以与HVJ和HMG 1复合，或与它们联合使用。既然这样的表达载体已被成功地应用于多核苷酸在体外和体内的转移和表 达，那么它们可以应用于本发明。在细菌启动子应用于DNA构建体中时，理想的是在脂质体 中也包括合适的细菌聚合酶。“脂质体”是通用术语，包括由产生封闭的脂质双层所形成的各种单层和多层脂质 载体。磷脂用来制备本发明的脂质体，且可以携带净的正电荷、净的负电荷或者是电中性 的。联十六烷基磷酸酯可以用来赋予脂质体负电荷，硬脂胺可以用来赋予脂质体正电荷。适用于本发明的脂质可以从商购来源获得。例如，联十四烷基磷脂酰胆碱 ("DMPC“)可以从Sigma Chemical Co.购得；联十六烷基磷酸酯(“DCP")可以从K & K Laboratories (Plainview，NY)购得；胆固醇(“Chol")可以从 Calbiochem Behring 购得；联十四烷基磷脂酰甘油(“DMPG“)和其它脂质可以从Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, Ala.)购得。脂质在氯仿、氯仿/甲醇或叔丁醇中的原液可以在大约20°C下 储存。优选地，氯仿用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。来自天然来源的磷脂，如鸡蛋或大豆的卵磷脂、脑磷脂酸、脑或植物磷脂酰肌醇、 心磷脂和植物或细菌磷脂酰乙醇胺，由于生成的脂质体的不稳定性和易泄漏性，优选不用 作主要的磷脂，即，构成总的磷脂组合物的50 %或更多。可以通过不同的方法制备本发明所用的脂质体。脂质体的大小随合成方法而变 化。悬浮于水性溶液中的脂质体一般为球形小泡的形状，具有一个或多个脂质双层分子的 同心层。各层由式XY所代表分子的平行阵列组成，其中，X是亲水部分和Y是疏水部分。在 水性悬浮液中，同心层的排列使得亲水部分倾向于保持与水相接触，而疏水区域倾向于自 身缔合。例如，当水相同时存在于脂质体之内和之外时，脂质分子将形成排列为XY YX的双 层，称为片层(lamella)。可以根据已知的实验室技术来制备本发明范围内的脂质体。在特定的实施方式中，使用了脂质二油酰磷脂酰胆碱。在过量丁醇的存在下，将耐 核酸酶的寡核苷酸与脂质混合。在丙酮/干冰浴中冷冻之前，旋转(vortex)该混合物。冷冻 的混合物进行冻干，并用H印es缓冲盐水(ImM Hepes, IOmM NaCl,pH7. 5)水合过夜，然后在 槽型超声仪中对脂质体超声10-15分钟。通过亚微颗粒分粒机自动稀释型370(Submicron particle sizer autodilute model 370) (Nicomp, Santa Barbara, CA)测定，月旨质体寡核 苷酸的大小通常为直径200-300nm。定点诱变定点诱变是可用于通过基础(ImderIying)DNA的特异性诱变制备单肽或生物功 能等价的蛋白质或肽的技术。该技术进一步提供了基于前述的一种或多种考虑，通过将一 种或多种核苷酸序列变化引入DNA中而制备和测试序列变异体的现成能力。定点诱变允许 通过使用编码具有所希望突变的DNA序列的特异性寡核苷酸序列以及足够数目的相邻核 苷酸产生突变体，以提供具有足够大小和序列复杂性的引物序列而在所跨越的缺失连接的 两侧形成稳定的双链体。可以使用长度为大约15-30个核苷酸的引物，在所改变的序列的 连接区的两侧具有大约5-10个残基。—般地，定点诱变技术是本领域内公知的。可以理解，该技术经常使用以单链和双 链形式存在的噬菌体载体。可用于定点诱变的典型载体包括如M13噬菌体的载体。这些噬 菌体载体可商购获得，且它们的使用一般是本领域的技术人员公知的。双链质粒也常规地用于定点诱变中，其取消了将目的基因从噬菌体转移到质粒的步骤。一般地，可以通过首先获得单链载体，或是融合在其序列中包括编码需要的蛋白 质的DNA序列的双链载体的两个链，来进行定点诱变。通过合成制备带有需要的突变序 列的寡核苷酸引物。接着为了合成带有突变的链，该引物与单链DNA制剂一起退火，并使 其经受DNA聚合酶(如大肠杆菌聚合酶I克林诺片段)的作用。因此形成异源双链体 (heteroduplex)，其中，一个链编码初始的非突变的序列，而另一个链携带需要的突变。然 后使用该异源双链体载体转化合适的细胞(如大肠杆菌细胞)，并选择包含携带突变序列 排列的重组载体的克隆。提供了使用定点诱变选择的基因的序列变异体制剂作为产生可能有用的种类的 方式，且因为有其它方式可以获得基因的序列变异体，本发明不限于此。例如，可以用诱变 剂(如羟胺)处理编码需要的基因的重组载体，以获得序列变异体。表达的蛋白质或其片段本领域的熟练技术人员已知的表达系统的例子包括细菌(如大肠杆菌)、酵母(如 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))、杆状病毒和哺乳动物表达系统(如Cos或CHO细胞 中的哺乳动物表达系统)。可以表达完整的基因，或可选择地，可以产生编码多肽的部分的 基因片段。在本发明的特定广泛应用中，对编码多肽的基因序列进行分析以检测推定的 跨膜序列。这样的序列通常是高疏水性的，且易于通过使用标准序列分析软件(如Mac Vector(IBI,New Haven,CT))进行检测。当在许多表达系统(尤其是大肠杆菌)中合成重 组蛋白质时，跨膜序列的存在经常是有害的，因为它会导致产生难以复性成蛋白质的天然 构象的不溶性聚集体。跨膜序列的缺失一般不会明显改变剩余的蛋白质结构的构象。为了表达根据本发明的重组体编码的蛋白质或肽，无论是突变的或是野生型的， 技术人员可以根据本发明制备包括受一个或多个启动子的控制或可选择地与一个或多个 启动子连接的核酸序列的表达载体。为了将编码序列“置于启动子的控制之下”，技术人员 可以将转录阅读框的转录起始位置的5'末端大致定位于所选择的启动子的大约1个-大 约50个核苷酸的“下游”(例如，3')。“上游”启动子刺激DNA的转录，并促进编码的重组 蛋白质的表达。为了在多种宿主-表达系统中实现蛋白质或肽的表达，许多标准技术可用来构建 含有合适的核酸和转录/翻译控制序列的表达载体。可用于表达的细胞类型包括，但不限 于用重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(如大肠杆菌和枯草杆菌 (B.subtilis))ο原核宿主的特定例子是大肠杆菌菌株RRl、大肠杆菌LE392、大肠杆菌B、大肠杆 菌 X 1776 (ATCC 第 31537 号)以及大肠杆菌 W3110 (F-、λ-、原养型的(prototrophic)， ATCC第273325号)；杆菌(bacilli)如枯草杆菌(Bacillus subtilis)；和其它肠杆菌 (enterobacteriaceae)如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏杆菌 (Serratia marcescens)禾口 禾中IiM单禾中￥ (Pseudomonas species)。—般地，含有来源于与宿主细胞相容的种类的复制子和控制序列的质粒载体与这 些宿主结合使用。载体通常携带复制位点以及能够提供转化细胞的表型选择的标记序列。 例如，经常使用一种源自大肠杆菌种的质粒PBR322转化大肠杆菌。PBR322含有氨苄西林和四环素抗性基因，因而提供了鉴别转化的细胞的简易的方法。PBR质粒，或其它微生物质 粒或噬菌体，也必须包含，或者经修饰以包含，可以由微生物用于表达其自身蛋白质的启动子。另外，含有与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体可以用作与这些 宿主相关的转化载体。例如，在制备可以用来转化宿主细胞(如大肠杆菌LE392)的重组噬 菌体载体时，可以利用噬菌体λ GEMTM-11。另外的可用载体包括ρΙΝ载体(Inouye等人，1985)和pGEX载体，用于产生随后进 行纯化和分离或切割的谷胱甘肽S转移酶(GST)可溶性融合蛋白质。其它合适的融合蛋白 质是那些与β半乳糖苷酶、泛素等的融合蛋白质。最普遍地用于重组DNA构建的启动子包括 -内酰胺酶(青霉素酶)、乳糖和色氨 酸(trp)启动子系统。尽管最常使用这些启动子，但已经发现并使用了其它微生物启动子， 而且已经公开了涉及它们的核酸序列的细节信息，使得本领域的技术人员能够将它们与质 粒载体功能性地连接。具有转录受生长条件控制的额外优势的其它合适的启动子包括醇脱氢酶2、异细 胞色素(isocytochromeK、酸性磷酸酶、与氮代谢有关的降解性酶，及前述的甘油醛-3-磷 酸脱氢酶和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区域。除了微生物之外，源自多细胞生物体的细胞培养物也可以用作宿主。原则上，任何 这样的细胞培养物是可用的，无论其来自脊椎动物还是无脊椎动物的培养物。分支酸超路径和酪氨酸本发明预期，调节微生物的编码区域的氨基酸可能对于提高微生物的有机酸的产 量或增强其对有机酸的生产的耐受性是重要的。在一种示例性的方法中，为了增强对于微 生物对有机酸的耐受性或提高有机酸的产量，可以操纵编码酪氨酸生物合成酶的基因区域 和编码涉及酪氨酸产生的基因的阻遏物的基因区域。在特定的实施方式中，可以向能够生产3-HP的细菌培养物加入外源性的酪氨酸。 在特定的具体实施方式
中，酪氨酸浓度可以是大约0. 05mM-大约0. 5mM。在一个实施例中， 向培养物加入0. 2mM的酪氨酸，因而3-HP的产量提高大约35%。本发明的具体的实施方式涉及包含至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39 或 40 个连续的核 苷酸的寡核苷酸，其具有选自 SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5 和 SEQ ID NO 6 的序列。TyrA(该序列包括用于引物设计的50bp的上游和下游):SEQ ID NO 1 TCAGGATCTG AACGGGCAGC TGACGGCTCGCGTGGCTTAA GAGGTTTSEQ ID NO 2 =TTATG GTT GCT GAA TTG ACC GCA TTA CGCGAT CAA ATT GAT GAA GTC GAT AAA GCG CTG CTG AAT TTATTA GCG AAG CGT CTG GAA CTG GTT GCT GAA GTG GGC GAGGTG AAA AGC CGC TTT GGA CTG CCT ATT TAT GTT CCG GAGCGC GAG GCA TCT ATG TTG GCC TCG CGT CGT GCA GAG GCGGM GCT CTG GGT GTA CCG CCA GAT CTG ATT GAG GAT GTTTTG CGT CGG GTG ATG CGT GAA TCT TAC TCC AGT GAA AACGAC AAA GGA TTT AAA ACA CTT TGT CCG TCA CTG CGT CCGGTG GTT ATC GTC GGC GGT GGC GGT CAG ATG GGA CGC CTGTTC GAG AAG ATG CTG ACC CTC TCG GGT TAT CAG GTG CGGATT CTG GAG CAA CAT GAC TGG GAT CGAGCG GCT GAT ATTGTT GCC GAT GCC GGA ATG GTG ATT GTT AGT GTG CCA ATCCAC GTT ACT GAG CAA GTT ATT GGC AM TTA CCG CCT TTACCG AAA GAT TGT ATT CTG GTC GAT CTG GCA TCA GTG AAAAAT GGG CCA TTA CAG GCC ATG CTG GTG GCG CAT GAT GGTCCG GTG CTG GGG CTA CAC CCG ATG TTC GGT CCG GAC AGCGGT AGC CTG GCA AAG CAA GTT GTG GTC TGG TGT GAT GGACGT AAA CCG GAA GCA TAC CAA TGG TTT CTG GAG CAA ATTCAG GTC TGG GGC GCT CGG CTG CAT CGT ATT AGC GCC GTCGAG CAC GAT CAG AAT ATG GCG TTT ATT CAG GCA CTG CGCCAC TTT GCT ACT TTT GCT TAC GGG CTG CAC CTG GCA GMGM MT GTT CAG CTT GAG CM CTT CTG GCG CTC TCT TCGCCG ATT TAC CGC CTT GAG CTG GCG ATG GTC GGG CGA CTGTTT GCT CAG GAT CCG CAG CTT TAT GCC GAC ATC ATT ATGTCG TCA GAG CGT AAT CTG GCG TTA ATC AAA CGT TAC TATAAG CGT TTC GGC GAG GCG ATT GAG TTG CTG GAG CAG GGCGAT AAG CAG GCG TTT ATT GAC AGT TTC CGC AAG GTG GAGCAC TGG TTC GGC GAT TAC GCA CAG CGT TTT CAG AGT GAAAGC CGC GTG TTA TTG CGT CAG GCG AAT GAC AAT CGC CAGTAASEQ ID NO 3 TAATCCAGTG CCGGATGATT CACATCATCCGGCACCTTTT CATCAGGTTGSEQ ID NO 4 TCAGGATCTG AACGGGCAGC TGACGGCTCGCGTGGCTTAA GAGGTTTTTA TGGTT GCT GAA TTG ACC GCA TTACGC GAT CAA ATT GAT GAA GTC GAT AAA GCG CTG CTG MTTTA TTA GCG MG OGT CTG GM CTG GTT GCT GM GTG GGCGAG GTG AM AGC CGC TTT GGA CTG CCT ATT TAT GTT CCGGAG CGC GAG GCA TCT ATG TTG GCC TCG CGT CGT GCA GAGGCG GAA GCT CTG GGT GTA CCG CCA GAT CTG ATT GAG GATGTT TTG CGT CGG GTG ATG CGT GAA TCT TAC TCC AGT GAAAAC GAC AAA GGA TTT AAA ACA CTT TGT CCG TCA CTG CGTCCG GTG GTT ATC GTC GGC GGT GGC GGT CAG ATG GGA CGCCTG TTC GAG AAG ATG CTG ACC CTC TCG GGT TAT CAG GTGCGG ATT CTG GAG CAA CAT GAC TGG GAT CGA GCG GCT GATATT GTT GCC GAT GCC GGA ATG GTG ATT GTT AGT GTG CCAATC CAC GTT ACT GAG CAA GTT ATT GGC AAA TTA CCG CCTTTA CCG AAA GAT TGT ATT CTG GTC GAT CTG GCA TCA GTGAAA AAT GGG CCA TTA CAG GCC ATG CTG GTG GCG CAT GATGGT CCG GTG CTG GGG CTA CAC CCG ATG TTC GGT CCG GACAGC GGT AGC CTG GCA AAG CAA GTT GTG GTC TGG TGT GATGGA CGT AAA CCG GAA GCA TAC CAA TGG TTT CTG GAG CAAATT CAG GTC TGG GGC GCT CGG CTG CAT CGT ATT AGC GCCGTC GAG CAC GAT CAG MT ATG GCG TTT ATT CAG GCA CTGCGC CAC TTT GCT ACT TTT GCT TAC GGG CTG CAC CTG GCAGAA GAA AAT GTT CAG CTT GAG CAA CTT CTG GCG CTC TCTTCG CCG ATT TAC CGC CTT GAG CTG GCG ATG GTC GGG CGACTG TTT GCT CAG GAT CCG CAG CTT TAT GCC GAC ATC ATTATG TCG TCA GAG CGT AAT CTG GCG TTA ATC AAA CGT TACTAT AAG CGT TTC GGC GAG GCG ATT GAG TTG CTG GAG CAGGGC GAT AAG CAG GCG TTT ATT GAC AGT TTC CGC AAG GTGGAG CAC TGG TTC GGC GAT TAC GCA CAG CGT TTT CAG AGTGAA AGC CGC GTG TTA TTG CGT CAG GCG AAT GAC AAT CGCCAG TAA TAATCCAGTG CCGGATGATT CACATCATCCGGCACCTTTT CATCAGGTTGSEQ ID NO 5 TyrR和SEQ ID NO 6具有在任一末端带有两个引物的TyrR。SEQ ID NO 5 ATGCGTCTGG AAGTCTTTTG TGAAGACCGACTCGGTCTGA CCCGCGAATT ACTCGATCTA CTCGTGCTMGAGGCATTGA TTTACGCGGT ATTGAGATTG ATCCCATTGGGCGAATCTAC CTCAATTTTG CTGAACTGGA GTTTGAGAGTTTCAGCAGTC TGATGGCCGA AATACGCCGT ATTGCGGGTGTTACCGATGT GCGTACTGTC CCGTGGATGC CTTCCGAACGTGAGCATCTG GCGTTGAGCGCGTTACTGGA GGCGTTGCCTGAACCTGTGC TCTCTGTCGA TATGMAAGC AAAGTGGATATGGCGAACCC GGCGAGCTGT CAGCTTTTTG GGCAAAAATTGGATCGCCTG CGCAACCATA CCGCCGCACA ATTGATTAACGGCTTTAATT TTTTACGTTG GCTGGAAAGC GAACCGCAAGATTCGCATAA CGAGCATGTC GTTATTMTG GGCAGAATTTCCTGATGGAG ATTACGCCTG TTTATCTTCA GGATGAAAATGATCAACACG TCCTGACCGG TGCGGTGGTG ATGTTGCGATCAACGATTCG TATGGGCCGC CAGTTGCAAA ATGTCGCCGCCCAGGACGTC AGCGCCTTCA GTCAAATTGT CGCCGTCAGCCCGAAAATGA AGCATGTTGT CGAACAGGCG CAGAAACTGGCGATGCTAAG CGCGCCGCTG CTGATTACGG GTGACACAGGTACAGGTAAA GATCTCTTTG CCTACGCCTG CCATCAGGCAAGCCCCAGAG CGGGCAAACC TTACCTGGCG CTGAACTGTGCGTCTATACC GGAAGATGCG GTCGAGAGTG AACTGTTTGGTCATGCTCCG GMGGGAAGA AAGGATTCTT TGAGCAGGCGAACGGTGGTT CGGTGCTGTT GGATGMATA GGGGAAATGTCACCACGGAT GCAGGCGAAA TTACTGCGTT TCCTTAATGATGGCACTTTC CGTCGGGTTG GCGAAGACCA TGAGGTGCATGTCGATGTGC GGGTGATTTG CGCTACGCAG AAGMTCTGGTCGAACTGGT GCMAAAGGC ATGTTCCGTG AAGATCTCTATTATCGTCTG AACGTGTTGA CGCTCAATCT GCCGCCGCTACGTGACTGTC CGCAGGACAT CATGCCGTTA ACTGAGCTGTTCGTCGCCCG CTTTGCCGAC GAGCAGGGCG TGCCGCGTCCGAMCTGGCC GCTGACCTGA ATACTGTACT TACGCGTTATGCGTGGCCGG GAAATGTGCG GCAGTTAAAG AACGCTATCTATCGCGCACT GACACMCTG GACGGTTATG AGCTGCGTCCACAGGATATT TTGTTGCCGG ATTATGACGC CGCAACGGTAGCCGTGGGCG AAGATGCGAT GGAAGGTTCG CTGGACGMATCACCAGCCG TTTTGMCGC TCGGTATTAA CCCAGCTTTATCGCAATTAT CCCAGCACGC GCAMCTGGC AAAACGTCTCGGCGTTTCAC ATACCGCGAT TGCCAATAAG TTGCGGGAATATGGTCTGAG TCAGAAGAAG AACGAAGAGTAAAroF 序列是SEQ ID NO 6 ATGCAAAAAG ACGCGCTGAA TAACGTACATATTACCGACG AACAGGTTTT AATGACTCCG GAACAACTGMGGCCGCTTT TCCATTGAGC CTGCAACAAG AAGCCCAGATTGCTGACTCG CGTAAAAGCA TTTCAGATAT TATCGCCGGGCGCGATCCTC GTCTGCTGGT AGTATGTGGT CCTTGTTCCATTCATGATCC GGAAACTGCT CTGGAATATG CTCGTCGATTTAMGCCCTT GCCGCAGAGG TCAGCGATAG CCTCTATCTGGTAATGCGCG TCTATTTTGA AMACCCCGT ACCACTGTCGGCTGGAAAGG GTTAATTAAC GATCCCCATA TGGATGGCTCTTTTGATGTA GAAGCCGGGC TGCAGATCGC GCGTAAATTGCTGCTTGAGC TGGTGAATAT GGGACTGCCA CTGGCGACGGAAGCGTTAGA TCCGAATAGC CCGCAATACC TGGGCGATCTGTTTAGCTGG TCAGCAATTG GTGCTCGTAC AACGGAATCGCAAACTCACC GTGAAATGGC CTCCGGGCTT TCCATGCCGGTTGGTTTTAA AAACGGCACC GACGGCAGTC TGGCAACAGCMTTAACGCT ATGCGCGCCG CCGCCCAGCC GCACCGTTTTGTTGGCATTA ACCAGGCAGG GCAGGTTGCG TTGCTACAMCTCAGGGGAA TCCGGACGGC CATGTGATCC TGCGCGGTGGTMAGCGCCG AACTATAGCC CTGCGGATGT TGCGCAATGTGAAAAAGAGA TGGAACAGGC GGGACTGCGC CCGTCTCTGATGGTAGATTG CAGCCACGGT AATTCCAATA AAGATTATCGCCGTCAGCCT GCGGTGGCAG AATCCGTGGT TGCTCAMTCAAAGATGGCA ATCGCTCAAT TATTGGTCTG ATGATCGAAAGTAATATCCA CGAGGGCAAT CAGTCTTCCG AGCAACCGCGCAGTGAAATG AAATACGGTG TATCCGTAAC CGATGCCTGCATTAGCTGGG AAATGACCGA TGCCTTGCTG CGTGAAATTCATCAGGATCT GAACGGGCAG CTGACGGCTC GCGTGGCTTAA实施例下面的实施例用于说明某些实施方式。本领域的技术人员应该理解下面的实施 例中公开的技术表示本发明人发现在实践本文公开的实施方式中良好地发挥作用的技术， 因而可以被认为构成了用于实践本发明的示例性的模式。但是，本领域的技术人员根据本 发明的公开应该理解在公开的特定实施方式中可以进行许多变化且可以在不背离本发明 的精神和范围的情况下仍然获得同样的或类似的结果。材料和方法细菌、质粒和培养基某些方法涉及用于制备基因组DNA的野生型大肠杆菌K12(ATCC#29425)。使 用pSMART-LCKAN(Lucigen，Middleton，WI)构建基因组文库。将文库引入大肠杆菌菌株 Machl-TlE(Invitrogen, Carlsbad, CA.)以按照先前详述的进行选择。含有 pSMART-LCKAN 空载体的于所有的对照研究。在MOPS最小必须培养基中完成生长曲线。在 该实施例中，抗生素浓度是20ug卡那霉素/毫升。基因组文库的构建在37°C下，大肠杆菌K12的培养物在500ml的LB中培养过夜，至按600nm处的吸 光度(0D_)测量达到1.0的光密度。根据生产商的说明，使用基因组DNA纯化试剂盒(例 如，Qiagen)提取DNA。使用两种钝切割器(blunt-cutter)限制性内切酶(AluI和RsaI (例 如，Invitrogen))消化含有50ug的纯化基因组DNA的5个样品。两种酶都具有4个碱基 对识别序列，且串联使用以确保基因组DNA的随机消化。用50uL的总体积进行消化反应。 反应物含有 1 单位的 Rsal、l 单位 Alul、50mM Tris-HCl (pH8. 0)和 IOmM MgCl2,并在 37°C 下分别孵育1、2、5、10和15分钟。立即混合部分消化的DNA，并使用琼脂糖凝胶电泳基于大 小进行分离。从凝胶切除0.5、1、2、4和大于8kb的DNA片段，并用凝胶提取试剂盒(例如， Qiagen)进行纯化。DNA片段的纯度使用紫外吸收进行定量，其各具有> 1. 7的A260/A280吸光度比 值。根据生产商的说明用CloneSMART Kit (Lucigen)将纯化的、片段化的DNA与pSMART_Kan 载体连接。接着将连接产物通过电穿孔(electroporate)转入大肠杆菌IOGF' Elite感 受态细胞(Electrocompetent Cells) (Lucigen)中，接种在LB+卡那霉素上，并在37°C孵 育24小时。将初始转化体积的1/1000的稀释培养物一式三份地接种在LB+卡那霉素上， 以确定转化效率和转化体数目。一式三份地进行稀释接种以确定转化体数目的精确计数， 从而确保代表性的基因组文库。通过轻轻地将平板刮入TB培养基中收获菌落。通过旋转立即再悬浮培养物，并以 15% v/w的甘油终浓度分配成15-lmL冷冻器存贮培养。通过以3000rpm离心15分钟使培 养物的剩余物沉淀。提取质粒DNA。为了证实插入片段的大小和阳性转化体数目，使用例如 来自Qiagen (Valencia，CA)的Qiapr印Spin MiniPr印试剂盒对于各种库大小从随机克隆 中分离质粒。然后通过PCR或限制性消化分析纯化的质粒。在来自0. 5、1和2kbp的插入片 段库的 8 个克隆上进行使用 SLl (SEQ ID NO 7 5' -CAG TCC AGT TAC GCT GGA GTC-3‘) 和 SR2(SEQ ID NO 8 5' -GGT CAG GTA TGA TTT AAA TGG TCA GT)引物的 PCR。对来自 2、4和Skbp的插入片段库的8个克隆进行酶EcorV的限制性消化。通过电泳的检查证明 需要数目的菌落含有对于适当表示具有预期大小的插入片段，不存在嵌合体。
库DNA的转化通过电穿孔(electroporation)将来自各库的纯化的质粒DNA引入 MACHItm-TIe (Invitrogen)。在冰上通过标准甘油洗涤程序使MACHItm-TIR培养物成为感受 态(electrocompetent)，至终浓度IO11细胞/毫升(Sanbrook等人)。将1/1000的初始转 化物一式三份地接种在LB+卡那霉素上以确定转化效率和足够的转化体数目。合并初始的 培养物并用MOPS最小必需培养基(minimal media) +卡那霉素稀释到100ml，且在37°C孵 育6小时或直至达到0. 20的0D_。选择在一种示例性的方法中，从具有规定的1、2、4和8kb的插入片段大小的大肠杆菌 K12基因组DNA建立4种代表性的基因组文库。将转化的库混合物等分成为两个15mL的 螺帽管中，具有用10 M NaOH中和到pH7的20g/L的3-HP (TCI America)终浓度。监测选 择培养物的细胞密度，随之它们接近0. 3-0. 4的终OD6tltl值。初始选择培养物随后用来接种 (innoculate)另一轮的15mL的MOPS最小必需培养基+卡那霉素+3-HP，作为重复的批选 择策略的部分。监测含有3-HP的重复批培养物，并接种超过60小时的时间，以提高在3-HP 存在下显示生长增加的克隆的浓度。通过将ImL的所选择群体接种到各批的选择平板上来 采集样品。从各个样品提取质粒DNA，然后，杂交到Affymetrix大肠杆菌反义GeneChip 阵列(Affymetrix, Santa Clara, CA)上。数据分析通过使用软件包，SCALE软件包(2005年9月20日提交的美国专利申请第 11/231，018号，完整引入本文作为参考)，完成数据分析。如以前所述的(Lynch，Μ.， Warnecke, TE, Gill, RT, SCALEs :multiscale analysis oflibrary enrichment. Nature Methods，2007，4 (87-93)，完整引入本文作为参考)，从作为所选择群体的一部分的各区域 的富集计算特定的基因组元件的适应度贡献。然后基于EcoCyc分类(ecocyc.org)按代谢 路径分离遗传元件及其相应的适应度。这一适应度矩阵用来计算路径适应度(W)和在所选 择群体中发现的富集频率。
通过路径适应度的初始等级排序，接着特异性分配对于与多重路径相关的遗传元 件到第一级确认的初始路径中，和随后从第二路径除去基因特异性的适应度值来确认路径 分配的冗余度。生长证实将Machl-TlVpSMART LC-KAN的过夜培养物接种到5mL LB+卡那霉素中。通过接 种到含有补充物(表1)和15mL来自过夜培养物的MOPS最小培养基+卡那霉素+3-HP的 15mL螺帽管中来构建生长曲线。在37°C下孵育培养物，并监测光密度至OD6tltl >0.2。然后 将培养物稀释至恰好OD6tltl = 0.2,并且用来接种含有15mL的MOPS最小必需培养基+卡那霉素+3-HP(pH = 7. 0)至0. 4的初始光密度以在静止期中最小化生长效应。监测并记录在 最小必需培养基中的微需氧生长的整个范围上监测并记录光密度或直至0. 5-0. 6的最终 0D_。在比生长、生长期(大约14小时)顶点的OD6tltl及最大生长期结束时的0D_和最终 0D_(24小时)方面，评估生长参数。为了解决特定的中间体限制，添加相关的分支酸路径 补充物至表1列出的终浓度。克隆构建PCR采用设计为包括上游的aroFp启动子和rho依赖性转录终止子的引物来扩增 对应于aroF-tyrA区域的大肠杆菌K12基因组DNA。根据生产商的说明，用CloneSMART试剂 盒(Lucigen，Middleton，WI)进行纯化的、片段化的DNA与pSMART-卡那霉素载体的连接。 接着将连接产物转化到化学感受态(chemically competant)的MACHl_TlR(Invitrogen， Carlsbad,CA)中，接种在LB+卡那霉素上，并在37°C孵育24小时。为了证实阳性转化体的 插入，使用来自Qiagen(Valencia，CA)的Qiapr印Spin MiniPr印试剂盒从克隆分离质粒 并测序(Macrogen, South Korea)。实施例1在一种示例性的方法中，在60小时内用递减梯度的3-HP在8个系列转移批次 (serial transfer batches)上进行选择。初始群体由5个代表性的大肠杆菌K12基因组 文库组成，所述K12基因组文库被转化到MACHl-TR中并培养至相应于微需氧条件的中间指 数生长期(0D_ 0. 2)。保持批次转移数作为按需要调整的可变参数以避免营养限制的选 择环境。如上所述，在选择中各个批次的顶点进行采样，并用SCALEs软件更进一步地进行 分析，以将微阵列信号分解成为相应的库克隆并计算特定区域随时间的相对富集。以这种 方法，在工业上关注的有机酸(3-HP)的存在下基于用于选择的区域特异性的富集模式测 量全基因组的适应度(In (XiAitl)。图1代表3-HP选择的全基因组多尺度分析的图。各个峰描述了由相应的基因组 区域代表的信号(所选择群体的部分)。由于大肠杆菌是环状染色体，图表示为圆环，基因 组位置围绕各个圆环顺时针增加，基因组的第一个和最后一个碱基对在12点钟位置。各个 图A、B、C和D分别代表与1000bp、2000bp、4000bp和8000bp尺度相关的信号。围绕圆环的 数字对应于编码分支酸超路径成分的基因。这些基因在3-HP选择中显示出显著富集的基 因组区域上。SCALE途径的一个优势是在选择的整个过程上定量追踪克隆群体的适应度的能 力。然后单个克隆的适应度可以按基因分段，并进一步按路径分类，从而产生对整个3-HP 耐受性作出贡献的途径适应度的全基因组谱。使用这种方法，已经确认几种关键的代谢路 径包括对系统的适应度作出贡献的大部分克隆(图2)。图2代表对总适应度作出贡献的 前7个路径的路径适应度结果。分支酸超路径已经公认为对总的适应度作出最大贡献以及 在所选择群体中包含的遗传元件的最高频率，19个遗传元件确认为在表现出提高的适应度 的前10%的群体中(图3A)。图3A代表大肠杆菌的分支酸超路径。突出显示在克隆的前 10%中发现的基因的富集水平。另外，涉及分支酸超路径的33个基因显示出明显的适应度 增益，全部57个基因在整个选择中显示出某些程度的富集。因此，含有编码分支酸下游的 必需酶的遗传元件的克隆在抑制水平的3-HP存在下显示出明显的适应度增加。这一发现 表明，3-HP存在下观察到的与培养物有关的生长抑制是分支酸生物合成路径中断的结果。
图3A代表分支酸超路径的示意图。中间体被标记，或者另外以箭头连接表明。紧 接相应的箭头写明编码酶功能(箭头)的基因名称。路径中产物或中间体的负反馈抑制显 示为灰色箭头。分支酸路径抑制为了证实这些发现，用分支酸下游合成的产物补充培养介质。各种产物的加入单 独地刺激生长，进一步证实抑制发生于分支酸合成之时或之前(图3B)。图3B代表生长确 认分支酸下游产物的加入部分地缓解生长抑制，由比生长(黑色)提高和在生长期顶点的 0D_(灰色)提高证实。但是，增加几种下游产物(酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)的补充量导 致分支酸超路径的第一关键步骤的反馈抑制，因而减少包括泛醌、甲基萘醌和四氢叶酸的 其它下游产物的形成，并限制相关的生长益处。这里，在缺乏3-HP的情况下，向生长培养基 加入分支酸衍生物对于比生长或最终的细胞密度具有很少或没有有益效果，进一步证实补 充是3-HP依赖的。为了进一步研究所观察到的抑制，细胞外提供中央分支酸路径中间体一 莽草酸，并导致比生长的20%的增加(图3B)。图3B代表用于说明与分支酸超路径中基因的拷贝增加相关的适应度(在3-HP的 存在情况下提高生长速度)的示例性的方法。更进一步，在分支酸路径的第一步中，赤藓糖-4-磷酸(E-4-P)与磷酸烯醇丙酮酸 (phosphorenolpyruvate) (PEP)反应形成3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸。几条关 键路径需要E-4-P，包括戊糖磷酸途径的非氧化支路和吡哆醛(pyrid0Xal)-5'-磷酸(维 生素B6)的生物合成。一项发现暗示E-4-P池没有受到限制，且抑制最可能发生在E-4-P 和莽草酸的形成之间。在另一项实验中，向生长培养基单独地加入核糖、组氨酸和核苷酸。 这些分子是组氨酸、嘌呤和嘧啶生物合成超路径(PRPP)的副产物，其也对路径分析的显著 适应度作出贡献(图3B)。中断反馈抑制通过使用SCALEs方法，已经确认了许多用于缓解在3_HP存在下的生长抑制的基 因靶标。具体地，如图2所示，tyrA-aroF操纵子拷贝的增加导致在整个选择过程中明显的 富集，从而使得该遗传区域成为有吸引力的靶标。构建含有tyrA-aroF操纵子的克隆，并在 20g/L 3-HP的存在下进行培养。该区域拷贝的增加部分地缓解了生长抑制，从而赋予比生 长15%的增加。尽管该区域显示明显的适应度增益，在酪氨酸和苯丙氨酸生产的相关增加 抑制了分支酸路径的第一步。一种绕过这一固有控制的方法是获得可诱导的抗反馈aroH 突变体，其增加了 E-4-P的转化且同时在下游产物池增加的情况下保持活性，因而缓解由 于分支酸路径的必需副产物的合成受损而导致的生长抑制。在20g/L 3-HP的存在下aroH 突变体的生长导致比生长的明显增加。另外，M9最小必需培养基中3-HP的24小时最小抑 制浓度(24小时时阻止可见生长的最小浓度)从对于载体对照的25g/L增加到对于表达该 aroH突变体的大肠杆菌克隆的40g/L。在本发明的特定实施方式中，预期aroH突变体可以 单独使用，或与其它遗传操纵或选择联合使用，以增强微生物中对3-HP生产的耐受性。上述的这种生长抑制可以影响下游的芳香酸，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。根据这 种生长抑制，这些氨基酸池的增长降低了对应于分支酸超路径的第一关键步骤的DAHPS同 工酶的活性。本实施例表明，增强的耐受性不是对于增加各中间体池特异性的，而是可以通 过池的调节来实现。在一种示例性的方法中，以苯丙氨酸补充生长培养基对于3-HP的存在下的比生长具有有害效应，而添加酪氨酸具有有益效果。这证明了以下这一观点通过降低 苯丙氨酸池而同时增加酪氨酸池以使得DAHPS酶具有最佳活性，这样可以通过调节产物浓 度实现最佳的3-HP耐受性。一种示例性的实施方式涉及通过降低苯丙氨酸并结合增加酪 氨酸的水平以使得DAHPS酶达到最佳活性来调节分支酸超路径的产物浓度。图4代表使用用于减少生长抑制的分支酸超路径分支酸下游的示例性成分而进 行的生长确认。以黑色表示增加的比生长，而以灰色表示生长期顶点的增加的0D·。本发 明预期分支酸超路径的一种或多种下游产物可以用来增强微生物的3-HP耐受性。根据这 些用途，可以向微生物的培养物补充一种或多种下游产物。用于初始的库选择和随后的生长确认的例如从TCI America获得的3_HP组合物 可以包含可变量的丙烯酸杂质。对于最小必需培养基中生长的大肠杆菌Machl的丙烯酸最 小抑制浓度确定为大约0. 6g/L。为证实对于分支酸超路径特异性的耐受性机制是3-HP毒 性专有的，对于在补充有另外的莽草酸或高半胱氨酸的最小必需培养基中生长的大肠杆菌 Machl，丙烯酸的最小抑制浓度确定为0. 6g/L。另外，对于最小必需培养基中生长的抗反馈 aroH突变体的最小抑制浓度确定为0. 6g/L。该数据证实，提高参与分支酸超路径的任何中 间体的浓度增强了 3-HP毒性特异性的耐受性，且不受3-HP组合物的丙烯酸杂质的影响。在本文所述的实施例中，向生长培养基添加分支酸的下游产物提高了比生长，从 而证实有机酸生产的抑制或生长的抑制是由于分支酸相关的氨基酸和必需维生素的限制。 补充的莽草酸也导致生长的急剧提高，从而表明抑制发生于分支酸生物合成路径中莽草酸 之前。进一步的研究表明抑制存在于赤藓糖-4-磷酸和莽草酸的形成之间。上述的发现极 大地有利于克服在产生作为重组体宿主的3-HP耐受性菌株中存在的挑战。在本文所述的实施例中，表达的改变或含有分支酸超路径的基因的遗传元件的加 入显示在3-HP存在下比生长的增加，因而增强了对于3-HP生产的耐受性。表1 培养基补充和与空白载体对照比较的相关生长效应 *组合包括上述浓度的酪氨酸、苯丙氨酸、对羟基苯甲酸、对氨基苯甲酸和2， 3-二羟基苯甲酸。[0178J ************************* 按照本公开，可以完成并实施本文公开的和要求保护的所有组合物和/或方法和 /或装置而不需要过度实验。尽管参照优选的实施方式描述了本发明的组合物和方法，但对 于本领域的技术人员显而易见的，可以在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下对所 述的组合物和/或方法和/或装置及在本文所述方法的步骤或步骤顺序中应用各种变型。 更具体地，可以用化学和生理相关的特定试剂取代本文所述的试剂而实现同样的或类似的 结果，这也是显而易见的。对于本领域的技术人员是显而易见的所有这样的类似取代和修 饰被认为在所附的权利要求所规定的精神、范围和概念之内。
权利要求
一种增强微生物对3 羟基丙酸(3 HP)的耐受性的组合物，包含一种或多种能够调节微生物的分支酸超路径的化合物，其中分支酸超路径的调节增强对3 HP的耐受性。
2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物包括分支酸超路径的中间体。
3.如权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物包括分支酸超路径的前体。
4.如权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物包括调节通过分支酸超路径的通量。
5.如权利要求1所述的组合物，进一步包括选自分支酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、叶 酸、泛醌、甲基萘醌、3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸合酶(DAHPS)同工酶、莽草酸或 其混合物中的一种或多种化合物。
6.如权利要求1所述的组合物，其中，所述化合物诱导微生物的分支酸超路径的酶。
7.如权利要求1所述的组合物，其中，所述化合物包括具有能够调节分支酸超路径的 遗传元件的载体。
8.如权利要求2所述的组合物，其中，所述组合物包括一种或多种选自以下物质的分 支酸超路径的中间体D-赤藓糖-4-磷酸、3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸、3-脱 氢奎尼酸、3-脱氢-莽草酸、莽草酸、莽草酸-3-磷酸、5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷 酸、分支酸、异分支酸、预苯酸、苯丙酮酸、对羟基苯丙酮酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、2，3- 二 氢-2，3- 二羟基苯甲酸、2，3- 二羟基苯甲酸、肠杆菌素、2-琥珀酰基-6-羟基-2，4-环己二 烯-1-羧酸、邻琥珀酰基苯甲酸、邻琥珀酰基苯甲酰-coA、1，4- 二羟基-2-萘甲酸、甲基萘 醌、邻氨基苯甲酸、N-(5'-磷酸核糖基)_邻氨基苯甲酸、1-(邻羧基苯氨基)_1' _脱氧核 酮糖-5 ‘-磷酸、吲哚-3-甘油-磷酸、吲哚、L-色氨酸、4-氨基-4-脱氧分支酸、对氨基苯 甲酸、7，8_ 二氢蝶酸、7，8_ 二氢叶酸、四氢叶酸、4-羟基苯甲酸、3-八异戊二烯基-4-羟基 苯甲酸、2-八异戊二烯基苯酚、2，2-八异戊二烯基-6-羟基苯酚、2-八异戊二烯基-6-甲氧 基苯酚、2-八异戊二烯基-6-甲氧基-1，4-苯醌、2-八异戊二烯基-3-甲基-6-甲氧基-1， 4-苯醌、3-去甲基泛醌-8、泛醌-8或其两种或多种的组合或混合物。
9.如权利要求3所述的组合物，其中，所述组合物包括一种或多种选自以下物质的分 支酸超路径的前体D-赤藓糖-4-磷酸、3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸、3-脱氢 奎尼酸、3-脱氢-莽草酸、莽草酸、莽草酸-3-磷酸、5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸、 分支酸、异分支酸、预苯酸、苯丙酮酸、对羟基苯丙酮酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、2，3_ 二 氢-2，3- 二羟基苯甲酸、2，3- 二羟基苯甲酸、肠杆菌素、2-琥珀酰基-6-羟基-2，4-环己二 烯-1-羧酸、邻琥珀酰基苯甲酸、邻琥珀酰基苯甲酰-coA、l，4- 二羟基-2-萘甲酸、甲基萘 醌、邻氨基苯甲酸、N-(5'-磷酸核糖基)_邻氨基苯甲酸、1-(邻羧基苯氨基)_1' _脱氧核 酮糖-5 ‘-磷酸、吲哚-3-甘油-磷酸、吲哚、L-色氨酸、4-氨基-4-脱氧分支酸、对氨基苯 甲酸、7，8- 二氢蝶酸、7，8- 二氢叶酸、四氢叶酸、4-羟基苯甲酸、3-八异戊二烯基-4-羟基 苯甲酸、2-八异戊二烯基苯酚、2，2-八异戊二烯基-6-羟基苯酚、2-八异戊二烯基-6-甲氧 基苯酚、2-八异戊二烯基-6-甲氧基-1，4-苯醌、2-八异戊二烯基-3-甲基-6-甲氧基-1， 4-苯醌、3-去甲基泛醌-8、泛醌-8或其两种或多种的组合或混合物。
10.如权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物能够改变一种或多种选自以下的分 支酸超路径中间体的细胞内水平D-赤藓糖-4-磷酸、3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷 酸、3-脱氢奎尼酸、3-脱氢-莽草酸、莽草酸、莽草酸-3-磷酸、5-烯醇式丙酮酰_莽草 酸-3-磷酸、分支酸、异分支酸、预苯酸、苯丙酮酸、对羟基苯丙酮酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、2，3-二氢-2，3-二羟基苯甲酸、2，3-二羟基苯甲酸、肠杆菌素、2-琥珀酰基-6-羟基-2， 4-环己二烯-1-羧酸、邻琥珀酰基苯甲酸酯、邻琥珀酰基苯甲酰-coA、l，4- 二羟基-2-萘 甲酸、甲基萘醌、邻氨基苯甲酸、N-(5'-磷酸核糖基)_邻氨基苯甲酸、1-(邻羧基苯氨 基)_1'-脱氧核酮糖-5'-磷酸、吲哚-3-甘油-磷酸、吲哚、L-色氨酸、4-氨基-4-脱 氧分支酸、对氨基苯甲酸、7，8_ 二氢蝶酸、7，8_ 二氢叶酸、四氢叶酸、4-羟基苯甲酸、3-八异 戊二烯基-4-羟基苯甲酸、2-八异戊二烯基苯酚、2，2_八异戊二烯基-6-羟基苯酚、2-八异 戊二烯基-6-甲氧基苯酚、2-八异戊二烯基-6-甲氧基-1，4-苯醌、2-八异戊二烯基-3-甲 基-6-甲氧基-1，4-苯醌、3-去甲基泛醌-8、泛醌-8或其两种或多种的组合或混合物。
11.如权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物能够改变一种或多种选自以下的分 支酸超路径的前体的细胞内水平D-赤藓糖-4-磷酸、3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷 酸、3-脱氢奎尼酸、3-脱氢-莽草酸、莽草酸、莽草酸-3-磷酸、5-烯醇式丙酮酰-莽草 酸-3-磷酸、分支酸、异分支酸、预苯酸、苯丙酮酸、对羟基苯丙酮酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨 酸、2，3-二氢-2，3-二羟基苯甲酸、2，3-二羟基苯甲酸、肠杆菌素、2-琥珀酰基-6-羟基-2， 4-环己二烯-1-羧酸、邻琥珀酰基苯甲酸、邻琥珀酰基苯甲酰-coA、l，4-二羟基-2-萘 甲酸、甲基萘醌、邻氨基苯甲酸、N-(5'-磷酸核糖基)_邻氨基苯甲酸、1-(邻羧基苯氨 基)_1'-脱氧核酮糖-5'-磷酸、吲哚-3-甘油-磷酸、吲哚、L-色氨酸、4-氨基-4-脱 氧分支酸、对氨基苯甲酸、7，8_ 二氢蝶酸、7，8_ 二氢叶酸、四氢叶酸、4-羟基苯甲酸、3-八异 戊二烯基-4-羟基苯甲酸、2-八异戊二烯基苯酚、2，2_八异戊二烯基-6-羟基苯酚、2-八异 戊二烯基-6-甲氧基苯酚、2-八异戊二烯基-6-甲氧基-1，4-苯醌、2-八异戊二烯基-3-甲 基-6-甲氧基-1，4-苯醌、3-去甲基泛醌-8、泛醌-8或其两种或多种的组合或混合物。
12.如权利要求1所述的组合物，进一步包括选自分支酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、 叶酸、泛醌、维生素K2、3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸合酶(DAHPS)同工酶、莽 草酸、D-赤藓糖-4-磷酸、3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸、3-脱氢奎尼酸、3-脱 氢-莽草酸、莽草酸、莽草酸-3-磷酸、5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸、分支酸、异分支 酸、预苯酸、苯丙酮酸、对羟基苯丙酮酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、2，3- 二氢-2，3- 二羟基苯 甲酸、2，3- 二羟基苯甲酸、肠杆菌素、2-琥珀酰基-6-羟基-2，4-环己二烯-1-羧酸、邻琥 珀酰基苯甲酸、邻琥珀酰基苯甲酰-coA、l，4-二羟基-2-萘甲酸、甲基萘醌、邻氨基苯甲酸、 N-(5'-磷酸核糖基)_邻氨基苯甲酸、1-(邻羧基苯氨基)_1'-脱氧核酮糖-5'-磷酸、 吲哚-3-甘油-磷酸、吲哚、L-色氨酸、4-氨基-4-脱氧分支酸、对氨基苯甲酸、7，8- 二氢 蝶酸、7，8- 二氢叶酸、四氢叶酸、4-羟基苯甲酸、3-八异戊二烯基-4-羟基苯甲酸、2-八异 戊二烯基苯酚、2，2-八异戊二烯基-6-羟基苯酚、2-八异戊二烯基-6-甲氧基苯酚、2-八异 戊二烯基-6-甲氧基-1，4-苯醌、2-八异戊二烯基-3-甲基-6-甲氧基-1，4-苯醌、3-去 甲基泛醌_8或泛醌-8或其混合物或组合中的一种或多种的化合物。
13.如权利要求1所述的组合物，其中，所述化合物调节微生物的分支酸超路径的酶。
14.如权利要求1所述的组合物，其中，所述化合物包括具有一种或多种能够改变分支 酸超路径的代谢物的遗传元件的载体。
15.如权利要求1所述的组合物，其中，所述化合物诱导能够改变分支酸超路径的代谢 物的遗传改变。
16.一种用于提高微生物产生3-羟基丙酸(3-HP)的产量的组合物，包括一种或多种能够增强微生物对于3-HP的耐受性的化合物，其中，该组合物诱导对于至少30g/L的耐受性。
17.一种提高微生物产生有机酸的产量或增强其对于有机酸的生产的耐受性的方法， 包括调节微生物的分支酸超路径。
18.如权利要求17所述的方法，其中，所述调节微生物的分支酸超路径包括向微生物 弓丨入能够调节分支酸超路径的化合物。
19.一种增强微生物对有机酸生产的耐受性的方法，包括a)获得一种或多种能够调节微生物的分支酸超路径的中间体的化合物，其中，分支酸 超路径的诱导提高微生物产生有机酸的产量和/或增强微生物对于有机酸的耐受性；和b)向微生物的培养物引入所述化合物。
20.如权利要求19所述的方法，其中，所述有机酸包括3-HP和任选的3，3-二氧丙酸和 丙烯酸中的一种或多种的混合物。
21.如权利要求19所述的方法，其中，所述化合物选自分支酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨 酸、叶酸、泛醌、维生素K2、3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸合酶(DAHPS)同工酶、莽 草酸、D-赤藓糖-4-磷酸、3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸、3-脱氢奎尼酸、3-脱 氢-莽草酸、莽草酸、莽草酸-3-磷酸、5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸、分支酸、异分支 酸、预苯酸、苯丙酮酸、对羟基苯丙酮酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、2，3- 二氢-2，3- 二羟基苯 甲酸、2，3- 二羟基苯甲酸、肠杆菌素、2-琥珀酰基-6-羟基-2，4-环己二烯-1-羧酸、邻琥 珀酰基苯甲酸、邻琥珀酰基苯甲酰-coA、l，4-二羟基-2-萘甲酸、甲基萘醌、邻氨基苯甲酸、 N-(5'-磷酸核糖基)_邻氨基苯甲酸、1-(邻羧基苯氨基)_1'-脱氧核酮糖-5'-磷酸、 吲哚-3-甘油-磷酸、吲哚、L-色氨酸、4-氨基-4-脱氧分支酸、对氨基苯甲酸、7，8- 二氢 蝶酸、7，8- 二氢叶酸、四氢叶酸、4-羟基苯甲酸、3-八异戊二烯基-4-羟基苯甲酸、2-八异 戊二烯基苯酚、2，2-八异戊二烯基-6-羟基苯酚、2-八异戊二烯基-6-甲氧基苯酚、2-八异 戊二烯基-6-甲氧基-1，4-苯醌、2-八异戊二烯基-3-甲基-6-甲氧基-1，4-苯醌、3-去 甲基泛醌_8、泛醌-8或其两种或多种的组合或混合物中的一种或多种。
22.如权利要求19所述的方法，其中，所述有机酸包括3-HP和任选的3，3-二氧丙酸和 丙烯酸中的一种或多种的混合物。
23.一种增强微生物对有机酸生产的耐受性的方法，包括a)获得一种或多种能够调节微生物的分支酸超路径的前体的化合物，其中，分支酸超 路径的诱导增强微生物对于有机酸的耐受性；和b)向微生物的培养物引入所述化合物。
24.如权利要求23所述的方法，其中，所述有机酸包括3-HP和任选的3，3-二氧丙酸和 丙烯酸中的一种或多种的混合物。
25.一种提高微生物产生3-羟基丙酸(3-HP)的产量的方法，包括将微生物的培养物 与包含一种或多种分支酸超路径的化合物或能够调节分支酸超路径的化合物的组合物接 触。
26.如权利要求25所述的方法，其中，所述化合物包括具有一种或多种能够调节分支 酸超路径的遗传元件的载体。
27.一种提高微生物产生3-羟基丙酸(3-HP)的产量和/或增强微生物对于3-羟基丙 酸的耐受性的方法，包括遗传操纵微生物的分支酸超路径。
28.如权利要求27所述的方法，其中，所述微生物分支酸超路径的遗传操纵选自通过 以下方式改变微生物的分支酸超路径涉及的一种或多种基因的基因表达通过添加载体以 引入新的遗传物质；现有遗传物质的遗传插入、破坏或除去；遗传物质的突变或其中两种 或多种方式的组合。
29.如权利要求27所述的方法，其中，所述遗传插入包括调节分支酸、酪氨酸、苯丙氨 酸、色氨酸、叶酸、泛醌、维生素K2、3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸合酶(DAHPS)同 工酶、莽草酸、D-赤藓糖-4-磷酸、3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸、3-脱氢奎尼酸、3-脱氢-莽草酸、莽草酸、莽草酸-3-磷酸、5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸、分支酸、异 分支酸、预苯酸、苯丙酮酸、对羟基苯丙酮酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、2，3- 二氢-2，3- 二羟 基苯甲酸、2，3_ 二羟基苯甲酸、肠杆菌素、2-琥珀酰基-6-羟基-2，4-环己二烯-1-羧酸、邻 琥珀酰基苯甲酸、邻琥珀酰基苯甲酰-coA、1，4- 二羟基-2-萘甲酸、甲基萘醌、邻氨基苯甲 酸、N-(5'-磷酸核糖基)_邻氨基苯甲酸、1-(邻羧基苯氨基)_1'-脱氧核酮糖-5'-磷 酸、吲哚-3-甘油-磷酸、吲哚、L-色氨酸、4-氨基-4-脱氧分支酸、对氨基苯甲酸、7，8- 二 氢蝶酸、7，8- 二氢叶酸、四氢叶酸、4-羟基苯甲酸、3-八异戊二烯基-4-羟基苯甲酸、2-八 异戊二烯基苯酚、2，2-八异戊二烯基-6-羟基苯酚、2-八异戊二烯基-6-甲氧基苯酚、2-八 异戊二烯基-6-甲氧基-1，4-苯醌、2-八异戊二烯基-3-甲基-6-甲氧基-1，4-苯醌、3-去 甲基泛醌_8、泛醌-8或其两种或多种的组合或混合物中的一种或多种物质的细胞内水平。
30.一种用于增强微生物对有机酸生产的耐受性的试剂盒，包括一种或多种能够调 节微生物的分支酸超路径的化合物和一个或多个容器，所述一种或多种化合物能够增强对 于有机酸的耐受性。
31.如权利要求30所述的试剂盒，其中，所述一种或多种化合物选自分支酸、酪氨酸、 苯丙氨酸、色氨酸、叶酸、泛醌、维生素K2、3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸合酶 (DAHPS)同工酶、莽草酸、D-赤藓糖-4-磷酸、3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸_7_磷酸、3-脱 氢奎尼酸、3-脱氢-莽草酸、莽草酸、莽草酸-3-磷酸、5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷 酸、分支酸、异分支酸、预苯酸、苯丙酮酸、对羟基苯丙酮酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、2，3- 二 氢-2，3- 二羟基苯甲酸、2，3- 二羟基苯甲酸、肠杆菌素、2-琥珀酰基-6-羟基-2，4-环己二 烯-1-羧酸、邻琥珀酰基苯甲酸、邻琥珀酰基苯甲酰-coA、l，4- 二羟基-2-萘甲酸、甲基萘 醌、邻氨基苯甲酸、N-(5'-磷酸核糖基)_邻氨基苯甲酸、1-(邻羧基苯氨基)_1' _脱氧核 酮糖-5 ‘-磷酸、吲哚-3-甘油-磷酸、吲哚、L-色氨酸、4-氨基-4-脱氧分支酸、对氨基苯 甲酸、7，8- 二氢蝶酸、7，8- 二氢叶酸、四氢叶酸、4-羟基苯甲酸、3-八异戊二烯基-4-羟基 苯甲酸、2-八异戊二烯基苯酚、2，2-八异戊二烯基-6-羟基苯酚、2-八异戊二烯基-6-甲氧 基苯酚、2-八异戊二烯基-6-甲氧基-1，4-苯醌、2-八异戊二烯基-3-甲基-6-甲氧基-1，4-苯醌、3-去甲基泛醌-8、泛醌-8或其两种或多种的组合或混合物。
全文摘要
本发明实施方式一般地涉及增强微生物对有机酸和醇生产的耐受性的方法、组合物和用途。本申请一般还涉及具有一种或多种增强微生物的有机酸或醇耐受性的遗传元件的载体的方法、组合物和用途。特定的实施方式涉及增强细菌对3-羟基丙酸(3-HP)生产的耐受性的组合物和方法。在某些实施方式中，组合物和方法涉及对待增强基因的抑制性分子的表达进行调节，以提高细菌产生有机酸的产量。
文档编号C12N1/00GK101903513SQ200880005500
公开日2010年12月1日 申请日期2008年1月11日 优先权日2007年1月12日
发明者坦雅·E·利普斯科姆, 瑞安·T·吉尔, 迈克尔·D·林奇 申请人:科罗拉多大学董事会法人