专利名称：用sca1-样基因的rna干扰控制线虫的组合物和方法
用SCAl-样基因的RNA干扰控制线虫的组合物和方法 对相关申请的交叉引用线虫破坏的征兆包括叶的生长迟緩和黄化，以及植物在热周 期中的萎蔫。然而，线虫(包括SCN)可引起显著的产量损失而没有明显 的地上症状。另外，被SCN感染的根是短小的或发育迟緩的。线虫感染可 减少根上固氮根瘤的数量，并可使得根对其他土壤带有的植物病原体的攻 击更加易感。[第6段线虫生活周期有三个主要的阶段卵、幼虫(juvenile)和成虫。 生活周期在线虫物种之间变化。例如，在最适条件下SCN生活周期通常可 在24到30天内完成，而其他物种完成生活周期可耗时长达一年或更久。 在春天温度和湿度水平变得适宜时，从土壤中的卵孵化出蠕虫状的幼虫。 这些幼虫是唯一能够感染大豆根的线虫生命阶段。线虫依赖其自身力量在土壤中每年只能穿行几英寸。然而， 线虫侵染可以以多种方式传播相当远的距离。可以移动受侵染土壤的任何 事物，包括农场机械、车辆和工具、风、水、动物和农场工人，都能够传 播这种侵染。种子大小的土壤颗粒往往污染收获的种子。因此，当来自受 侵染田地的污染种子在非侵染田地中播种时，可以传播线虫侵染。甚至还
6存在某些线虫种类可以通过鸟类传播的证据。仅可以预防这些起因中的某 些起因。
笫10段]防治线虫侵染的常规方法包括在线虫侵染的土地中保持 合适的土壤养分和土壤pH水平；控制其他的植物疾病以及昆虫与杂草病 害；使用消毒措施，如仅在处理完成的非侵染田地后，才翻耕、播种和中 耕线虫侵染的田地；在侵染的田地中工作后用高压水或蒸汽彻底清洁设备； 不使用在侵染田地中生长的种子播种非侵染田地，除非这种种子已经得到 正确地清洁；轮作受侵染田地并且用非宿主作物替换宿主作物；使用杀线 虫剂；和播种抗性植物品种。对于RNAi的作用已提出了许多模型。在哺乳动物系统中， 大于30个核苷酸的dsRNA以一种非序列特异性方式引发诱导干扰素的合成以及蛋白质合成的总体停止。但是，美国专利号6,506,559揭示，在线虫 中，对应于靶基因序列的dsRNA的长度可为至少25、 50、 100、 200、 300 或400碱基，甚至更长的dsRNA也能有效诱导秀丽隐杆线虫中的RNAi。 已知当用包含98~854个核苷酸的双链区的发夹RNA构建体转化许多植物 品种时，能有效沉默粑植物基因。 一般认为在包括线虫和植物的许多生物 中，大片的dsRNA在细胞内被切割成大约19-24个核苷酸的片段(siRNA )， 这些siRNA是RNAi现象的实际介质。图4展示用于二元载体p(R)SA006的499核苷酸片段的序 列(SEQIDNO:ll)，所述二元载体p(R)SA006用于转化大豆细胞，以在大 豆植物中产生本发明的dsRNA，由此抑制文中鉴定的大豆胞嚢线虫seal -样靶基因。本发明可以通过参考以下详细描述的本发明优选实施方案 及本文所包含实施例而更容易地理解。除非另外说明，本文中所用术语将 根据相关领域普通技术人员的习惯用法加以理解。除了下文提供的术语定 义外，分子生物学中常用术语的定义也可以在Rieger等，1991 Glossary of genetics: classical和molecular,第五版,Berlin: Springer-Verlag; 和在 Current protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel等编著，Current Protocols, Greene Publishing Associates, Inc.与John Wiley & Sons, Inc.的 合资企业(1998增刊)中找到。应当理解如本说明书及在权利要求书中所用， "一种(a)"或"一个(an)"可以意指一个或多个，这取决于该冠词所用的上下 文。因此，对"单数细胞"的称谓可以意指可以使用至少一个细胞。还应当 理解本文中使用的术语仅仅旨在描述具体实施方案而并非意味对其限制 性。如此处所用的术语"控制"当用于感染的上下文中时指感染 的降低或预防。减低或预防线虫的感染会使植物具有对线虫增加的抗性； 但是，这种增加的抗性并不意p未着植物必须100%地抗线虫感染。在优选 实施方案中，在抗性植物中对线虫感染的抗性比对线虫无抗性的野生型植 物高10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%或95%。 优选所述野生型植物是具有与线虫抗性增加的植物相似或更优选相同的基 因型，但是不包含针对靶基因的dsRNA的植物。植物对线虫感染的抗性 可以是由于当线虫暴露于特异性针对必须基因的dsRNA时，线虫的死亡、 不育、停止发育或移动性受损造成的。此处使用的术语"对线虫感染的抗性" 或"具有线虫抗性的植物"指与野生型植物相比，植物避免线虫感染、杀死 线虫或阻止、减少或停止线虫的发育、生长或增殖的能力。这可以通过主 动过程达到，例如通过产出对线虫有害的物质，或通过^^皮动过程达到，例 如含有降低的线虫所需的营养价值或不形成由线虫采食部位诱导的结构例 如合胞体或巨大细胞。植物的线虫抗性水平可以以多种方法检测，例如， 计数能够在植物上建立寄生的线虫数量，或测量线虫发育时间、雌雄线虫 的比例，或对于胞嚢线虫计数在感染的植物的根部或植物分析系统中产生 的胞嚢数量或线虫卵的数量。[第38段若非上下文中另外说明。术语"植物"涵盖植物发育或成熟 的任何阶段，以及取自任何这样的植物的任何组织或器官(植物部分)。 植物部分包括，但不限于茎、根、花、胚珠、雄蕊、种子、叶、胚、分生 组织区、愈伤組织、花药培养物、配子体、孢子体、花粉、微孢子、原生 质体、毛根培养物等等。本发明还包括用本发明的植物制备的种子。在一 个实施方案中，与植物种子的野生型变体相比，种子确实被育种为有提高 的抗线虫感染的抗性。如此处所用，"植物细胞"包括但不限于，原生质体、 产生配子的细胞和再生为完整植林的细胞。植物多种组织的组织培养物和 从这些组织培养物的植物再生为本领域所公知且已经充分公开。.
第39段如此处使用的术语"转基因"指含有至少一个重组多核苷酸 的全部或部分的任何植物、植物细胞、愈伤组织、植物组织或植物部分。 在许多情况下，重组多核苷酸的所有或部分被稳定整合入染色体中，或是 稳定的染色体外元件，从而能够传递至下一代。出于本发明的目的，术语"重 组多核苷酸"指的是已经由遗传工程改变、重排或修饰的多核苷酸。其实例 包括连接到或加入到异源序列的任何克隆多核苷酸。术语"重组"并非指天 然发生事件所导致的多核苷酸的改变，例如自发突变或通过选择性育种导 致的非自发突变。对应本发明的scal-样靶基因的完整cDNA可以用此处提 供的信息和生物技术领域技术人员已知的技术从寄生线虫而不是大豆胞嚢 线虫中分离。例如，在严格条件下与SEQIDNO: 1、 10或11的核苷^ 列杂交的来自寄生线虫的核酸分子可以从寄生线虫cDNA文库中分离。或 者，可以从寄生线虫细胞中分离mRNA， cDNA可以用反转录酶制备(例如 Moloney MLV反转录酶)。可以基于SEQ ID NO: 1、 10或11所示的核苷 ^列设计用于聚合,式反应扩增的合成寡核苷酸引物。此类引物的实 例由SEQIDNO:2、 3、 4、 5、 6、 7、 8或9给出。对应于本发明寄生线虫 靶基因的核酸分子可以根据标准PCR扩增技术，使用cDNA或备选的基 因组DNA作为才莫板，以及适宜的寡核苷酸引物扩增。这样扩增的核酸分 子可以克隆至合适的载体中，并通过DNA序列分析来表征。在另一实施方案中，本发明提供分离的重组表达载体，其 包含编码如上所述dsRNA的核酸，其中与宿主植物细胞的野生型品种相 比，该载体在宿主植物细胞中的表达导致对寄生线虫的抗性增加。如此处 所用的术语"载体"指能够转运其已经连接的另一个核酸的核酸分子。 一种 类型的载体是"质粒"，指环状双链DNA环，附加的DNA片段可以连接其 中。另一种类型的载体是病毒载体，其中附加的DNA片段可以连接到病 毒基因组中。某些载体能够在它们导入的宿主植物细胞中自主复制。其他 载体在导入宿主细胞时整合入宿主植物细胞的基因组中，从而随着宿主基 因组一起复制。此外，某些载体能够指导其有效连接的基因的表达。这样 的载体在此称为"表达载体"，用于重组DNA技术的表达栽体一般是质粒 的形式。在本说明书中，"质粒"和"载体"可互换使用，因为质粒是载体的 最常用形式。但是，本发明意欲包括具有相同功能的表达载体的其他形式， 例如病毒栽体(例如马铃薯病毒X，烟草rattle病毒和双粒病毒组)。发育阶段优先的启动子在发育的特定阶段优先表达。组织 个器官优先的启动子包括那些在特定组织和器官优先表达的启动子，例如 叶、根、种子或木质部。组织优先或器官优先启动子的实例包括但不限于 果实优先、胚珠优先、雄性组织优先、种子优先、珠被优先、块茎优先、 柄优先、果皮优先和叶子优先、柱头优先、花粉优先、花药优先、花瓣优 先、萼片优先、花梗优先、长角果优先、根优先、茎优先等等。种子优先 的启动子在种子发育和/或萌发时优先表达。例如，种子优先启动子可以是 胚优先、胚乳优先和种皮优先的。见Thompson等人，1989， BioEssays 10:108。种子优先的启动子包括但不限于纤维素合酶(celA)、 Ciml、 y-玉米 醇溶蛋白、球蛋白-1、玉蜀黍19kD玉米醇溶蛋白(cZ19Bl)等。
第59段
其他适宜的组织优先或器官优先启动子包括但不限于，油 菜籽napin-基因启动子(美国专利号5，608，152)、蚕豆(KZc/"/Wtf ) USP-
启动子(Baeumlein等人，1991， Mol Gen Genet. 225(3):459-67)、拟南芥油质 蛋白启动子(PCT申请No. WO 98/45461)、菜豆(」P/iflMo/"s vw/gfln's )菜豆
素启动子(美国专利号5,504,200)、芸莒Bce4-启动子(PCT申请No. WO 91/13980)、或豆3求蛋白B4启动子(LeB4; Baeumlein等人，1992， Plant Journal, 2(2):233-9),以及在像玉蜀黍、大麦、小麦、黑麦、稻等单子叶植 物中赋予种子特异性表达的启动子。要关注的适宜启动子是大麦的lpt2或 lptl-基因启动子(PCT申请No. WO 95/15389和PCT申请No. WO 95/23230)，或在PCT申请No. WO 99/16890中描述的那些启动子(大麦醇 溶蛋白基因、稻的谷蛋白基因、稻的水稻素基因、稻的醇溶谷蛋白基因、 小麦的麦胶蛋白基因、小麦的谷蛋白基因、燕麦的谷蛋白基因、高粱的 kasirin基因和黑麦的黑麦碱基因)。[第60段]用于本发明的表达盒的其他启动子包括但不限于，主要叶 绿素a/b结合蛋白启动子、组蛋白启动子、Ap3启动子、p-conglycin启动 子、油菜籽蛋白启动子、大豆凝集素启动子、玉蜀黍15kD玉米醇溶蛋白 启动子、22kD玉米醇溶蛋白启动子、27kD玉米醇溶蛋白启动子、g-玉米 醇溶蛋白启动子、蜡质基因(waxy)启动子、超甜基因(shrunken)l启
动子、超甜基因2启动子和bronze基因启动子、Zml3启动子、(美国专利 号5，086，169)、玉蜀黍多聚半乳糖醛酸酶启动子(PG)(美国专利号 5,412,085和5，545，546)和SGB6启动子(美国专利号5,470,359),以及合成 的或其他天然启动子。
第61段根据本发明，所述表达盒包括与核普酸序列有效连接的表 达控制序列，该核苷酸序列是所述dsRNA的一条或两条链的;f莫板。该 dsRNA模板包括(a)具有下述序列的第一链，所述序列与SEQ ID NO:l 的大约19至大约400-500个或至多全长的连续核苷睃基本相同；和(b)具 有与第一链基本互补的序列的第二链。在另一的实施方案中，启动子位于 所述模板核苷酸序列任一端的側翼，其中所述启动子驱动各个单独的DNA 链的表达，进而产生两条互补的RNA，这两条互补的RNA能够杂交并形 成所述dsRNA。在备选的实施方案中，核苷酸序列在一个转录单元上被转 录成dsRNA的两条链，其中，正义链从转录单元的5，端转录，而反义链 从3，端转录，其中这两条链隔开大约3-500个碱基对，并且转录之后，该 RNA转录物自身折叠形成发夹结构。在另一实施方案中，所述载体含有双向启动子，驱动两个 核酸分子的表达，由此一个核酸分子编码与seal-样基因的部分基本相同的 序列，而另一个核酸分子编码与第一链基本上互补的第二序列，并且当两 个序列都转录时能够形成dsRNA。双向启动子是能够在两个方向介导表达 的启动子。在另一实施方案中，所述载体含有两种启动子， 一个介导 与scal-样基因的部分基本相同的序列的转录，另一个启动子介导与第一链基本上互补的第二序列的转录，并且当两个序列都转录时能够形成
dsRNA。第二启动子可以是不同的启动子。或者在一个实施方案中，植物是双子叶植物，优选地是豆科(Fabaceae) 、 科(Solanaceae)、 十字花科(Brassicaceae)、 藜科(Chenopodiaceae)、 菊科(Asteraceae)、 锦蔡科(Malvaceae)、 亚麻科(Linaceae)、 大戟科(Euphorbiaceae)、 旋花科(Convolvulaceae)、 蕃蔽科(Rosaceae)、 葫,科(Cucurbitaceae)、 山茶科(Theaceae)、 萏草科(Rubiaceae)、梧桐科(Sterculiaceae)或牙计橘科(Citrus)的植物。在一个实施方案中，植物是豆科、茄科或十字花科的植物。因此，在一个实施方案中，植物是豆科，优选地是大豆属(Glycine)、豌豆属(Pisum)、落花生属(Arachis)、鹰嘴豆属(Cicer)、蚕豆属(Vicia)、菜豆属(Phaseolus)、羽扇豆属(Lupinus)、苜藉属(Medicago)或兵豆属(Lens)。优选的豆科物种是截形苜蓿(M. truncatula)、紫苜蓿(M， sativa)、大豆(G. max)、豌豆(P. sativum)、花生(A. hypogea)、鹰嘴豆(C. arietin腿)、蚕豆(V. faba)、菜豆(P. vulgaris)、白羽扇豆(Lupinus albus)、黄羽扇豆(Lupinus luteus)、狭叶羽扇豆(Lupinusangustifolius)或兵豆(Lens culinaris)。 更优选的是大豆(G. max)、花生(A.hypogea)和紫苜蓿(M. sativa)物种。最优选的是大豆(G. max)。当植物是茄科(Solanaceae)时，优选的属是痴属(Solanum)、番痴属(Lycopersicon)、烟草属(Nicotiana)或辣椒属(Capsicum)。优选的茄科物种是马铃薯(S.
26tuberosum)、番茄(L. esculentum)、烟草(N. tabaccum)或黄灯笼辣椒(C.chinense)。更优选的是马铃薯(S. tuberosum)。因此，在一个实施方案中，植物是十字花科(Brassicaceae)，优选的是芸苔属(Brassica)或萝卜属(Raphanus)。优选的十字花科(Brassicaceae)物种是欧洲油菜(B. napus)、甘蓝(B. oleracea)、芥菜(B. juncea)或芜青(B. rapa)物种。更优选的是欧洲油菜(B. napus)物种。当植物是藜科(Chenopodiaceae)时，优选的属是甜菜属(Beta),优选的物种是甜菜(B. vulgaris)。当植物是菊科(Asteraceae)时，优选的属是向日葵属(Helianthus),优选的物种是向日葵(H. annuus)。当植物是锦葵科(Malvaceae)时，优选的属是棉属(Gossypium)或秋葵属(Abelmoschus)。当属是棉属(Gossypium)时，优选的物种是陆地棉(G.hirsutum)或海岛棉(G. barbadense)，最优选的物种是陆地棉(G. hirsutum)。秋葵属(Abelmoschus)的优选的物种是咖啡黄葵(A, esculentus)。当植物是亚麻科(Linaceae)时，优选的属是亚麻属(Linum),优选的物种是亚麻(L.usitatissimum)。当才直物是大戟科(Euphorbiaceae)时，优选的属是木薯属(Manihot)、麻风树属(Jatropa)或Rhizinus ,优选的物种是木薯(M.esculenta)、 麻风树(J. curcas)或 R. comunis 。 当植物是旋花科(Convolvulaceae)时，优选的属是番薯属(Ipomea)，优选的物种是I. batatas。当植物是蔷薇科(Rosaceae)时，优选的属是蔷薇属(Rosa)、苹果属(Malus)、梨属(Pyrus)、李属(Prunus)、悬钩子属(Rubus)、茶薦子属(Ribes)、越橘属(Vaccinium)或草莓属(Fragaria)，优选的物种是杂种荷兰草莓(Fragaria xananassa)。当才直物是葫,科(Cucurbitaceae)时，优选的属是香瓜属(Cucumis)、西瓜属(Citrullus)或南瓜属(Cucurbita)，优选的物种是黄瓜(Cucumis sativus)、 西瓜(Citrullus lanatus)或西葫,(Cucurbita pepo)。 当植物是山茶科(Theaceae)时，优选的属是山茶属(Camellia)，优选的物种是茶(C. sinensis)。当植物是茜草科(Rubiaceae)时，优选的属是咖啡属(Coffea)，优选的物种是小果咖啡(C. arabica)或中果咖啡(C. canephora)。当植物是梧桐科(Sterculiaceae)时，优选的属是可可树属(Theobroma)，优选的物种是可可树(T. cacao)。当植物是柑橘属(Citrus)时，优选的物种是甜橙(C. sinensis)、柠檬(C. limon)、桔(C. reticulata)、柚(C， maxima)和才计橘物种的杂种等等。在本发明的一个优选的实施方案中，植物是大豆、马铃薯或玉米植物。
l第68段
转化或转染包括植物细胞的宿主细胞的适当方法在植物生物生物技术领域内已知。任何方法都可以用于将重组表达载体转化入植物细胞中以获得本发明的转基因植物。转化双子叶植物的一般方法公开于例如美国专利号4,940,838和5,464,763等中。转化具体双子叶植物(例如棉花)的方法在美国专利号5，004，863、 5，159，135和5，846，797中列出。大豆转化方法于美国专利号4,992,375、 5,416,011、 5，569，834、 5,824,877和6,384,301中列出，也可以使用EP0301749B1中的方法。转化方法可包括直接或间接转化法。适当的直接方法包括聚乙二醇诱导的DNA摄取、月旨质体介导的转化(US 4,536,475)、用基因枪的生物发射技术(Fromm ME等人，Bio/Technology. 8(9):833画9， 1990; Gordon國Kamm等人Plant Cell2:603,1990)、电穿孔、在含DNA的溶液中孵育干胚和微注入法。在直接转化法的情况下，所用质粒不需要满足任何特殊要求。可以使用简单的质粒，例如pUC系列的质粒、pBR322、 M13mp系列和pACYC184等等。如果要从转化的细胞再生完整的植物，优选在质粒中有一个附加的选择性标记基因。直接转化技术对双子叶和单子叶植物都同等适用。还可以通过利用农杆菌(例如EP0 116"S)的细菌感染、利用病毒载体(EP 0 067 553、 US 4,407,956、 WO 95/34668、 WO 93/03161)的病毒感染来进行转化或借助花粉转化(EP 0 270 356; WO 85/01856; US4,684,611)。农杆菌类转化技术(尤其是对于双子叶植物)为本领域>^知的技术。农杆菌菌林(例如才艮癌农杆菌或毛才艮农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes))包括质粒(Ti或Ri质粒)和用农杆菌感染之后转移入植物的T-DNA元件。该T-DNA(转移DNA)被整合到植物细胞的基因组中。T-DNA可定位在Ri-或Ti-质粒上，或者分开包括在所谓的双元载体中。农杆菌介导的转化方法记栽于例如Horsch RB等人(1985) Science 225:1229中。农杆菌介导的转化最适用于双子叶植物，也已经适用于单子叶植物。用农杆菌的转化记载于下列文献中，例如White FF， Vectors for Gene Transfer inHigher Plants, Transgenic Plants,第1巻，Engineering and Utilization, S.D.Kung和R. Wu编著，Academic Press, 1993，第15 38页、Jenes B等人Techniques for Gene Transfer, Transgenic Plants,第1巻，Engineeringand Utilization, S.D. Kung和R. Wu编著，Academic Press, 1993，第128-143页和Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42:205- 225中。转化可能会导致瞬时或稳定的转化和表达。虽然本发明的核苷酸序列可以插入到属于这些广泛类别的任何植物和植物细胞中，但是它特别适用于作物植物细胞。利用植物育种中的已知方法，本发明的转基因植物可以与相似的转基因植物杂交，或与缺少本发明核酸的转基因植物杂交，或与非转基因植物杂交，来产生种子。此外，本发明的转基因植物可包括、和/或与另一种含有一种或多种核酸的转基因植物杂交，从而在该植物和/或其
后代中形成转基因的"垛叠"。然后种植种子来得到杂交的能育的含有本发明核酸的转基因植物。该杂交能育的转基因植物可以具有特定的通过母本或通过父本遗传的表达盒。第二代植物可以是近交植物。杂交的能育转基因植物可以是杂交种。本发明还包括任何这些杂交能育转基因植物的种子。本发明种子可从能育转基因植物收获，并用于生长包括含有所述DNA构建体的杂交植物系的本发明转化植物的后代。3'cDNA端使用GeneRacer试剂盒(Invitrogen， Carlsbad,CA，目录号L1500-01)扩增。cDNA的第一链使用总RNA和GeneRacerOligo dT引物(SEQ ID NO:12)通过反转录产生。3， RACE PCR使用GeneRacer 3，引物(SEQ ID NO:5)和基因特异性正向引物(SEQ ID NO:4)进行。巢式PCR反应随后使用GeneRacer 3， Nested引物(SEQ ID NO:7)和基因特异性正向引物(SEQ ID NO:6)进行。PCR产物克隆入pCR4-TOPO (Invitrogen， Carlsbad, CA)并测序。使用PCR引物(图2中的SEQ ID NO: 8和9)和秀丽隐杆线虫基因组DNA作为模板从秀丽隐杆线虫分离实施例l中鉴定的SCN靼基因的同源物。(参见K11D9.2, Genbank， National Center forBiotechnology Information, Bethesda， MD)此PCR产物(长度大约1 kb)克隆进入pLitmus28i (New England Biolabs， Beverly, MA)的多克隆位点，由此秀丽隐杆线虫基因片段以头对头构型侧接两个T7启动子。用于RNAi测试中的秀丽隐杆线虫基因片段的DNA序列示于图3 (SEQ ID NO: 10)。选择和根诱导后2到3周，在外植体的切开末端上形成转化的根。将外植体转移至相同的选择培养基(S-BS,0S培养基)中进行进一步选择。在该培养基中， 一周内转基因根良好增殖并适合进行继代培养。将强壮的白色大豆根从生根的外植体上切下，并培养于六孔平板中的补充有200 mg/l特美汀的根生长培养基(S-MS-606培养基)中。暗处室温维持培养物。S-MS-606培养基包括0.2 x MS盐和维生素B5， 2%的蔗糖和200mg/l特美汀，pH为5.8。本领域技术人员会知晓，或仅仅通过常规的实验就能够确定此处描述的本发明具体实施方案的许多等同方案。所附权利要求书意在涵盖这些等同物。
权利要求
1.dsRNA分子，其包含i)包含下述序列的第一链，所述序列与寄生线虫sca1-样靶基因的部分基本相同；和ii)包含与第一链基本互补的序列的第二链，其中所述靶基因是寄生线虫sca1-样基因。
2，权利要求1的dsRNA分子，其中所述靼基因的部分是选自以下的 序列a)包含SEQIDNO:l、 10或11所示的序列的多核苷酸；(b)包含与 SEQIDNO:l、 10或11具有至少80%序列同一性的序列的多核苷酸；和 (c)来自线虫的多核苷酸，其在严格条件下与包含SEQIDNO:l、 10或11 所示的序列的多核苷酸杂交。
3，包含多个RNA分子的dsRNA分子库，每个所述RNA分子包含具 有约19到24个核苷酸长度的双链区，其中所述RNA分子衍生自选自以 下的多核苷酸a)包含SEQIDNO:l、 10或11所示的序列的多核苷酸； (b)包含与SEQ ID NO:l、 10或11具有至少80%序列同一性的序列的多 核苷酸；和(c)来自线虫的多核苷酸，其在严格条件下与包含SEQ ID NO:l、 10或11所示的序列的多核苷酸杂交。
4. 能够表达下述dsRNA的转基因植物，所述dsRNA与寄生线虫scal-样靶基因的部分基本相同。
5. 权利要求4的转基因植物，其中所述耙基因包含选自以下的序列 a)包含SEQIDNO:1、10或11所示的序列的多核苷酸；(b)包含与SEQ ID NO:l、 10或11具有至少80%序列同一性的序列的多核苷酸；和(c)来 自寄生线虫的多核普酸，其在严格条件下与包含SEQ ID NO:l、 10或11 所示的序列的多核苷酸杂交。
6. 权利要求4的转基因植物，其中所述dsRNA包含大量RNA分子， 每个所述RNA分子包含具有大约19-24个核苷酸长度的双链区，其中所述 RNA分子衍生自选自以下的多核苷酸'.a)包含SEQ ID NO:l、 10或11 所示的序列的多核苷酸；(b)包含与SEQIDNO:1、10或11具有至少80% 序列同一性的序列的多核苷酸；和(c)来自寄生线虫的多核苷酸，其在严格条件下与包含SEQIDNO:l、 10或11所示的序列的多核普酸杂交。
7. 权利要求4的转基因植物，其中所述植物选自大豆、马铃薯、番 茄、花生、棉花、木薯、咖啡、椰子、凤梨、柑橘树、香蕉、玉米、油菜、 甜菜、向日葵、高粱、小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、四季豆(green bean)、 利马豆、豌豆和烟草。
8. 权利要求4的转基因植物，其中所述植物是大豆植物。
9，控制寄生线虫对植物的感染的方法，其包括将线虫暴露于下述 dsRNA分子的步骤，所述dsRNA分子与线虫必需的耙基因的部分基^目 同，由此控制线虫对植物的感染，其中所述粑基因是寄生线虫scal-样基因。
10.权利要求9的方法，其中所迷耙基因包含选自以下的序列a)包 含SEQ ID NO:l、 10或11所示的序列的多核苷酸；(b)包含与SEQ ID NO:l、 10或11具有至少80%序列同一性的序列的多核苷酸；和(c)来 自寄生线虫的多核苦酸，其在严格条件下与包含SEQ ID NO:l、 10或11 所示的序列的多核苦酸杂交。
11，制备能够表达scal-样dsRNA的转基因植物的方法，所述scal-样 dsRNA与寄生线虫中耙基因的部分基本相同，所述方法包括步骤a)制备 具有下述区域的核酸序列，所述区域与寄生线虫seal-样靶基因的部分基本 相同，其中所述核酸在植物中表达时能够形成scal-样双链转录物；b)用所 述核酸转化受体植物；c)产生所述受体植物的一个或多个转基因子代；和 d)选择表达所述转录物的子代。
12. 权利要求11的方法，其中所述耙基因包含选自以下的序列a)包 含SEQ ID NO:l、 10或11所示的序列的多核苷酸；(b)包含与SEQ ID NO:l、 10或11具有至少80%序列同一性的序列的多核苷酸；和(c)来 自寄生线虫的多核苷酸，其在严格条件下与包含SEQ ID NO:l、 10或11 所示的序列的多核苷酸杂交。
13. 权利要求ll的方法，其中所述靶基因的部分是选自以下的序列的 大约19至大约400个核苷酸a)包含SEQIDNO:l、 10或11所示的序 列的多核普酸；和(b)来自寄生线虫的多核苷酸，其在严格条件下与包含SEQIDNO:l、 10或11所示的序列的多核苷酸杂交。
14. 权利要求ll的方法，其中所述植物选自大豆、马铃薯、番茄、 花生、棉花、木薯、咖啡、椰子、凤梨、柑橘树、香蕉、玉米、油菜、甜 菜、向日葵、高粱、小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、四季豆、利马豆、豌 豆和烟草。
15. 权利要求ll的方法，其中所述植物是大豆植物。
全文摘要
本发明涉及能够抑制寄生线虫中必需基因表达的双链RNA组合物和转基因植物，以及与之相关的方法。具体地，本发明涉及RNA干扰在抑制线虫必需靶基因表达中的用途，所述线虫必需靶基因为线虫sca1-样基因，并且涉及对寄生线虫具有增加的抗性的植物的产生。
文档编号C12N15/82GK101605897SQ200880004547
公开日2009年12月16日 申请日期2008年2月7日 优先权日2007年2月9日
发明者S·希尔 申请人:巴斯福植物科学有限公司