专利名称：：微生物次级代谢物的诱导的利记博彩app
技术领域：
：本发明涉及由微生物产生次级代谢物。具体地，提供用于诱导从多种微生物快速产生这样的化合物的方法。北旦冃豕当从它们的天然环境中分离并且在浮游生物悬浮摇瓶中培养时，微生物有时可能切断产生次级代谢物的能力。这种在封闭瓶中摇动悬浮培养提供人工生长条件，所述人工生长条件不是天然遭遇的那些中的代表性条先前显示(Yan等,2003)，在两种杆菌属(&"7/w)菌株(短小芽孢杆菌(5./Mmz7w)和地衣芽孢杆菌(及"c/2em/o，&)的情形中，生物膜的形成和直接暴露于空气促进抗生素化合物的产生。在天然环境中，微生物诸如，例如，细菌和真菌，可以生长为附着于表面的生物膜(Lappin-Scott等，1995)。生物膜中的生长条件通常不均匀，例如，可以在包括生物膜的微-菌落周屈形成pH梯度(Wimpenny等,2000)，且对向生物膜运输营养和基底的限制可以导致微生物的分化饥饿(James等，1995,Batchdor等，1997，Li等，2001)。因此，生长为生物膜的微生物内发生的代谢过程可以与相同生物体在生长为例如浮游生物悬浮培养物时体内发生的代谢过程明显不同。次级代谢物诸如以上详述的那些，代表具有广泛多样重要应用的重要化合物类型。特别地，许多次级代谢物具有抗感染特性，且抗生素在治疗许多感染中起巨大作用。多-药物抗性微生物的出现需要进一步研究确定新型抗生素以及开发具有增加活性的己知化合物的变体。因此，由微生物产生的次级代谢物的筛选是获取有价值的生物活性化合物的必由之路。次级代谢物产生的调节是复杂的且大多数次级代谢物的生物合成途径4是没有被完全了解的。已知应激-诱导的网络和许多细胞系统控制通过微生物产生次级代谢物。例如，认为营养的限制或耗尽、诱导物的生物合成和/或降低微生物生长率全都影响次级代谢物的产生。认为所述因素导致产生一系列信号，其影响导致化学分化(次级代谢)和形态分化(形态发生)的调节事件的级联。已知一些初级代谢物增加次级代谢物的产生。例如，亮氨酸影响杆菌属菌株中杆菌肽合成，且甲硫氨酸促进氨基己二酰-L-半胱氨酰-D-纈氨酸(ACV)合成酶。至今，关于生物膜生长对次级代谢物产生的作用仅进行了非常少量的研究，并且存在对开发新抗感染剂的需要，所述抗感染剂有效针对大量对当今的抗生素表现出抗性的病原体。本发明基于这样的观察，即在第一条件设置下构建为强迫固着群落(生物膜)的微生物，可以在随后暴露于改变的条件设置时，产生次级代谢物，包括具有抗感染活性的化合物。发明概述在本发明的第一方面，提供诱导微生物产生次级代谢物的方法，所述方法包括下列步骤(a)通过在第一条件设置下生长，构建包括所述微生物的生物膜；和(b)改变所述第一条件设置，从而诱导所述生物膜中的一种或多种微生物产生次级代谢物。应该理解所述微生物通常不产生所述次级代谢物，除非暴露于所述改变的条件设置。生物膜在所述第一条件设置下生长时，可以产生不同的次级代谢物，但是仅产生有限的或基本上不产生在所述改变的条件设置下产生的次级代谢物。次级代谢物包括许多化合物类型，且可以包括，例如，色素、抗感染化合物诸如抗生素、抗细菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂和抗原生动物剂。另外，次级代谢物还可以包括毒素、生态竞争和共生的效应物、信息素、酶抑制剂、免疫调节剂、受体拮抗剂、杀虫剂、抗肿瘤剂和动物和植物的生长促进剂。在该情形中，特别适宜使用本发明的方法来诱导抗感染化合物诸如以上详述的那些的产生。因此，在优选的实施方案中，本发明提供诱导微生物产生抗感染化合物的方法。生物膜是本领域中公知的，且可以认为包括已经建群表面或基底的微生物群落。微生物诸如细菌、真菌、原生动物和酵母都能够形成生物膜。生物膜可以包括单一微生物物种或，在一些情形中，可以包括多于一种微生物物种。生物膜中的微生物是固着的，即附着于表面或基底，并且同样地，生物膜也可以称为"强迫固着群落"。因此，本文中所述的方法可以对多种微生物使用，且这些可以包括细菌、真菌或原生动物物种。通过举例的方式，微生物诸如假交替单胞菌属(尸化M(io/afera腳"as)、链霉菌属(5V，to哼ce^)(方夂线菌属(Actinomycetes))、Ser柳(i/脂was1、迪茨氏菌属(D/ete/a)、红球菌属(i/zo(iococcz^)、微球菌属(A/z'crococciw)、假单胞菌属(i^ewdomawas)、沙雷氏菌属(5^ra"a)、黄杆菌属(F/avo6a"en'a)、弧菌属(J^)n'o)和交替单胞菌属(」//^^^"^)物种可以，按照本文中所述的方法，被诱导产生次级代谢物。微生物的生长通常包括4个阶段，称为滞后期、生长(指数)期、稳定期和死亡期。滞后期是初始阶段，其中微生物准备开始生长。在该时期过程中，许多微生物将不存活，并且可生存的微生物的总数下降，因此称为"滞后"。短期后，那些存留或存活的微生物增殖并且这开始生长(指数)期。该阶段观察到微生物数量的快速增加，且当可获得的营养和生长空间开始耗尽时，生长进入稳定期。通常，在稳定期过程中，生长开始减慢，并且出现微生物数量的很少或不进一步增加。可以将微生物保持在该阶段，但是，在这样的条件下改变，即营养耗尽，毒性物质累积等，可以导致微生物开始死亡并由此生长进入死亡期。生物膜中的微生物可以认为处于稳定期，其之前已经经历滞后和生长期。因此，有利地，本发明的第一条件可以取作这样的条件，即其允许所述微生物初始生长和进展到稳定期和构建生物膜。因此，术语"第一条件"可以指生长参数，例如生长培养基的选择，或生长、培养或维持微生物时的温度和/或压力。通常，为了构建微生物的群落或生物膜，适宜使用液体、半固体或固体培养基，其富含营养，并且适合于特定微生物的生长。在本发明的一个实施方案中，微生物可以在表面或基底上生长或培养，所述表面或基底的一部分与生长培养基相接触。熟悉微生物培养技术的那些人应该知道可以使用的培养基类型，且应该注意到，出于简洁目的，本文中仅提到有限数量的培养基。例如，从海洋环境中分离的微生物可以在指定的"海洋"培养基上培养，而从例如哺乳动物肠道分离的那些生物体可以在选择性允许所述生物体生长的培养基，诸如麦氏琼脂或培养液上培养。这样的培养基可以包括，例如NaCl、胆汁盐和意欲复制在所讨论生物体的天然环境中存在的条件的其他化合物和成分。其他培养基可以具有更一般的用途，并可以用于培养分离自不同环境的许多不同生物体。这样的培养基可以称为"一般目的培养基"，并可以包括，例如血液、巧克力、哥伦比亚(columbia)、LB、营养和马铃薯-葡萄糖(PD)琼脂和培养液。这些培养基还可以增补任何选择的试剂、化合物或物质，从而促进特定微生物的生长或对培养基赋予一定程度的特异性。例如，马铃薯葡萄糖培养基还可以增补，例如，酵母提取物(PDY培养基)。例如，该培养基可以增补约0.1-1%(w/v)的酵母提取物，更优选约0.2%(w/v)。另外，术语"第一条件"可以包括化合物，例如蛋白质或肽、氨基酸、营养例如微生物、核酸或其他小有机分子。所述化合物可以，例如，添加到选择的生长培养基中，或另外地，或备选地，直接添加到微生物中。有利地，所述"第一条件"在约1-约IO天内促进构建生物膜。优选，生物膜应该在约2天-约5天内，更优选在约3-约4天内构建成。优选地，生物膜构建在特定的表面或基底上。有利地，在其上构建生物膜的表面或基底(下文中称为"基底")，不能被生物膜的微生物代谢，且可以因此称为"惰性"材料或基底。因此，在本发明的优选实施方案中，包括一种或多种特定微生物的生物膜构建在"惰性基底"上。优选，除是惰性的外，所述基底是半渗透材料或物质。其上可以构建生物膜的合适惰性半渗透基底包括，但不仅限于，玻璃纤维、尼龙和玻璃纸膜。备选地，生物膜可以构建在包括再生纤维素或纤维素酯材料的基底上，例如适合于渗析程序的材料诸如Visking渗析管。7应该注意到在其上构建生物膜的基底的选择可以取决于生物膜的微生物，因为一些基底，尽管不能被某些微生物代谢，但是可以被其他微生物代谢。例如，细菌诸如放线菌可以导致包括尼龙的基底的降解。因此，包括放线菌的生物膜应该在不包括尼龙的基底上培养。另外，当需要基底是半渗透的时候，其不应该是如此可渗透的以至于生物膜的微生物穿过所述基底。例如，某些细菌可能能够穿过包括例如诸如玻璃纤维的材料的基底中存在的孔。技术人员可以根据用于形成生物膜的微生物，容易地选择半渗透基底或合适的孔尺寸。按照本发明，在第一条件设置下维持惰性半渗透基底，从而构建生物膜。例如，可以将基底置于无菌生长培养基表面上。有利地，基底可以通过表面张力保持在无菌培养基表面上的适当位置。另外地，或备选地，所述材料或基底可以通过一些其他方式，例如通过一些支持结构的形式保持在适当的位置。备选地，所述基底可以通过表面张力和一些其他方式例如支持结构的组合保持在适当的位置。这样，所述基底的一个表面与无菌生长培养基相接触，而其相反表面与空气相接触。在其上构建生物膜的基底可以通过任何合适的方式例如，通过棉拭(swab)的方式，在暴露于所述第一条件设置之前或之后，接种选择的微生物。所述基底可以形成任何特定形状，例如，所述基底可以采用盘形式或其他基本二维形状。备选地，所述基底可以采用三维形式，且可以，例如，包括许多中空管、折叠或腔，其可以起增加在其上可以构建生物膜的表面积的作用。示范性生物膜培养系统详述在Yan等，2003的论文中。其中所述的系统提供空气-膜表面(AMS)反应器，所述反应器允许在选择的基底上构建强迫固着微生物群落(生物膜)。简言之，将选择的基底首先置于一定体积的无菌液体半固体生长培养基的表面上，在该处其通过表面张力保持在适当的位置。这样，所述基底只有一个表面与无菌生长培养基相接触，而相反表面暴露于空气。然后对暴露于空气的基底表面接种用于形成生物膜的微生物。"自由"生长培养基的有限的可用性促进生物膜或强迫固着群落的构建。特定微生物产生次级代谢物的条件可以与构建包括所述微生物的生物膜所需的那些不同。因此，按照本发明的方法，为了诱导产生次级代谢物，使包括生物膜的微生物遭受第二或改变的条件设置。例如，诱导产生次级代谢物所需的改变的条件可以包括(include)或包括(comprise)毒性/破坏性试剂或可以抑制、限制或防止微生物生长或存活的条件或化合物。通常，诱导产生次级代谢物的改变的条件可以认为是将生物膜的微生物置于应激下。然而，至关重要的是，已经在例如上述第一条件下构建生物膜的微生物耐受所述改变的条件。因此，所述"第一条件"在滞后和生长期过程中支持微生物并允许维持构建的生物膜，而所述"第二"或"改变的条件"可能不适合于支持微生物的生长，但是是至少一部分构建生物膜的微生物所能耐受的。这样，通过本发明的方法，所述方法提供两种条件设置，第一种设置促进快速构建生物膜，且第二种或改变的设置诱导产生次级代谢物，可以诱导微生物容易地形式生物膜，否则所述微生物将不能在诱导产生次级代谢物所需的条件下容易地构建生物膜。本文中所述的方法提供用于诱导微生物产生次级代谢物的两步法，其中第一步包括基本如上所述构建生物膜，并且第二步包括改变条件从而诱导所述微生物产生次级代谢物。诱导次级代谢物产生的"改变的条件"可以包括使用调节微生物初级和/或次级代谢的特殊生长条件或化合物。例如，这样的化合物可以包括能够调节微生物应激-诱导的网络途径的那些。因此，例如，生物膜一旦构建成，则该生物膜可以在诱导次级代谢物产生的条件或化合物的存在下维持。本发明的改变的条件可以包括使用诱导产生次级代谢物的化合物诸如初级代谢物或营养。应该理解术语"初级代谢物"或"营养"可以认为包括，例如，维生素，例如，维生素K或其合成等价物，甲萘醌(维生素K3)，碳水化合物，蛋白质或肽，氨基酸和其他类似化合物。另外，"初级代谢物"或"营养"还可以指，例如，核酸、矿物质和金属离子，例如，铁、锰和/或铜离子。金属离子可以以，例如，任何有机或无机金属盐，例如柠檬酸铁或氯化铁的形式加入。有利地，可以加入金属离子直到最终浓度为约1_约10mM，优选l-5mM和更优选l-2mM。另外地，或备选地，改变的条件可以包括改变的生长培养基。营养限制和/或耗尽可以对微生物的初级和/或次级代谢有影响，并且同样地可以诱导次级代谢物的产生。因此，特定生长培养基可以适合于限制某些营养对微生物的可用性。这可以通过提供缺乏对于微生物的生物学系统是必需的某种或某些成分的培养基而实现。例如，所述培养基可以缺乏某些营养，以使得其上维持的微生物极度缺乏或缺少所述营养。诱导次级代谢物产生的改变的条件还可以包括(comprise)或包括(include)添加可以诱导微生物中应激反应的试剂或化合物诸如，例如，抗生素、抗真菌剂、抗病毒剂等。可以以这种方式起作用的抗生素的实例包括喹诺酮类，例如环丙沙星。此外，能够改变渗透条件的化合物和氧化性化合物或分子也被认可为能够诱导次级代谢物产生。氧化性化合物的实例包括，例如，过氧化氢或活性氧发生剂诸如甲萘醌或百草枯。在甲萘醌的情形中，奎宁结构提供一个电子给氧分子，并被氧化为半醌，且半醌可以进一步提供另一个电子给另一个双氧，并被氧化为氢醌。因此，在醌氧化为氢醌的过程中，将形成2分子的超氧化物。所述超氧化物使生物膜的微生物处于应激下，并诱导次级代谢物的产生。另外地或备选地，能够诱导次级代谢物产生的化合物可以向微生物直接加入或作为在其上培养它们的基底的成分加入。.改变的条件还可以包括某些具有诱导产生次级代谢物效果的环境条件或因素。例如，改变的条件可以包括使所述微生物受到辐射，例如电离辐射和/或电-磁辐射，温度和/或压力变化的影响。在暴露于电-辐射的情形中，可以使微生物经受约100-约400nm，优选200-300nm和更优选254nm的短波长电磁辐射或紫外辐射。关于电离辐射，可以使微生物经受例如ou卩、Y和/或x-射线辐射。因此，在本发明的第二方面，提供诱导微生物产生次级代谢物的方法，所述方法包括下列步骤(a)通过在第一条件设置下生长，构建包括所述微生物的生物膜；和(b)改变所述第一条件设置，从而诱导所述生物膜中的一种或多种微生物产生次级代谢物；其中所述改变的条件包括使所述微生物暴露于辐射。一种或多种微生物可以暴露于辐射的时间长度可以根据使用的微生物而变化。然而，通过举例的方式，在约l-约6天，优选2-5天和更优选地4天的时期内使微生物重复地暴露于辐射可能是理想的。此外，每次暴露于辐射的持续时间可以变化，举例来说，微生物可以暴露于辐射约4-约20小时，优选6-约15小时和更优选12小时。应该注意到，任一种上述条件、化合物或试剂可以单独或与任何其他条件、化合物或试剂组合使用，从而形成诱导次级代谢物产生的改变的条件。例如，在本发明的一个实施方案中，用于诱导次级代谢物产生的改变的条件可以包括与铁、锰和/或铜离子组合使用甲萘醌。备选地，在本发明的另一个实施方案中，所述改变可以包括与铁、锰或铜离子一起使用营养物诸如甲萘醌和化合物诸如过氧化氢。详细描述现将详细地并参考下列附图描述本发明，所述附图显示图l:用于在按照本发明的方法中使用的空气-膜表面生物反应器系统，如Yan等，2003所述，总的由参考数字10指示。生物反应器10包括容纳生长培养基4和通过表面张力支持生长基底6的室2。基底6包括惰性、半渗透材料，其部分地浸没在生长培养基4中并部分地暴露于空气并由此提供由参考数字8所示的空气/表面界面。在所示实施方案中，生物膜12已经构建在暴露于空气的基底6的表面上。通过盖子14封闭室2，这防止生长基底6的污染。生物膜12—旦构建成，将生长培养基4替换为改变的培养基4b，这诱导次级代谢物的产生。次级代谢物通过惰性、半渗透基底并积聚在改变的培养基4a中。图2:氧化应激对激发由链霉菌(浙印tomyc^)种AQP274产生的抗微生物化合物的作用。该附图提示过氧化氢在一些培养系统中能够激发抗微生物化合物的产生。相反，按照本发明，甲萘醌的诱导作用更稳定且更优选，这归因于较小的标准偏差。简言之，甲萘醌和过氧化氢均能够在放线菌属中，更优选在链霉菌种中激发抗微生物化合物的产生。培养基配方如下"PDY"，具有酵母提取物的马铃薯葡萄糖；"NG",具有1%(v/v)甘油的营养培养液；"NGF",包含l。/。(v/v)甘油和lmM柠檬酸铁的营养培养液；"H202",过氧化氢；"MD"，甲萘醌。在不同培养基中的微生物培养一式四份地进行，由误差柱表示标准偏差。图3:通过甲萘醌中醌基团的自氧化还原产生设想的超氧化物。甲萘醌中的醌结构提供一个电子给氧并被氧化为半醌，且半醌可以进一步提供另一个电子给另一个双氧并被氧化为氢醌。因此，在醌氧化为氢醌的过程中，将形成2分子的超氧化物。图4A通过海洋假交替单胞菌CP"z^oa/ferawo"oy)菌株AQP816激发色素产生。当利用尼龙膜培养系统生长AQP816时，甲萘醌对产生深色色素的作用。当将甲萘醌加入到培养基中时，观察到深色色素的显著产生。图4B.尼龙膜表面培养系统对由相同培养基(包含10(Hig/ml甲萘醌的海洋培养液)中的AQP816产生深色色素的作用。仅可能在利用膜表面培养系统生长AQP816时，产生色素。实施例实施例1用于生长微-生物体的两步培养法用于生长某些细菌的培养基不必然对产生次级代谢物是理想的。因此，应用两步培养法，所述方法激发细菌，更优选地放线菌属中次级代谢物的产生，所述细菌在先前正常摇瓶培养条件下不产生次级代谢物。利用任一浮游生物摇瓶，更优选地，玻璃纤维膜生物-膜培养系统，将合适的微-生物体接种到生长培养基中，直至构建适当的微生物群落。此时，将生物量或生物膜转移到另一种适合于产生次级代谢物的生长培养基中。更优选地，放线菌属链霉菌菌株AQP274在接种到玻璃纤维膜上时，能够在包含具有0.2%(w/v)酵母提取物(PDY)的马铃薯葡萄糖琼脂的培养基上生长4天内产生充足的生物量，然而，在筛选抗微生物化合物的产生时，该菌株在该培养基中培养时针对MRSA筛选时，没有显示出可检测的抗生素活性。同时，使用相同的培养方法，AQP274在包含营养琼脂(28g/L)，甘油(1%v/v)，lmM柠檬酸铁和甲萘醌(0.15g/L)的培养基，称为培养基NGFM中生长非常缓慢，然而，在室温培养21-24天后，可以容易地检测到针对MRSA菌株和针对白念珠菌(Camfe/aa/6/cara)菌株的抗微生物活性。更优选地，为了加速该次级代谢物产生的过程并因此利用该系统改善生物-过程最优化，从而由该菌株快速激发抗感染化合物，首先将AQP274接种到培养基PDY中，然后转移到NGFM培养基中。结果显示由该菌株产生针对上述测试菌株的抗微生物活性，并可以在产生抗生素的微生物生长4天时被检测到。此外，可检测的活性所需的粗培养基提取物的量减少2倍。实施例2复合物-构建微生物的强迫固着群落(生物膜)该两步培养法还可以通过在惰性玻璃纤维膜上构建产生抗感染的微生物的强迫固着群落，更优选放线菌属的强迫固着群落，得到进一步改进。据报道，与在杆菌中抗生素产生相关的基因可以受到环境应激的调节(Yan等,2003)。另外，在生物膜或固着群落中生长的细胞已经发展出复杂机制，所述机制对多种环境应激类型显示出更多抗性；因此，与它们的浮游悬浮负体相反，它们适合于更广泛的物理和化学环境。然而，当利用浮游悬浮培养法生长时，许多物种不会自动地在惰性支持物表面上堆积固着微生物基质；因此，强迫固着微生物基质构建在空气-固体/液体界面处。将纯的或混合的微生物菌株，例如细菌或真菌，更优选地放线菌接种在半渗透的惰性支持物的表面，诸如尼龙膜或玻璃纤维滤器上。随后将惰性支持物置于培养基的顶上，这容许所述惰性支持物将微生物生物量与生长培养基分开。生物量在惰性支持物的一侧堆积，且生长培养基位于另一侧。由于缺乏自由的液体，微生物生物量将采用该支持物系统表面上的强迫固着微生物基质(生物膜)形式生长。该方法可以将任何微生物，更优选放线菌的强迫固着基质，构建在更优选地半渗透惰性支持物系统表面上。实施例3利用氧化应激激发抗微生物化合物产生利用实施例2中所述的培养系统，可以使用多种应激，通过构建的生物量，更优选地，在强迫固着微生物群落中，激发次级代谢物的产生。13本发明使用由受活性氧物种(ROS)施加的氧化应激，其可以利用过氧化物化合物包括过氧化氢，或超氧化物发生剂诸如甲萘醌或百草枯，并增补了过渡金属离子诸如铁、锰或铜离子，在作为强迫固着微生物群落培养的细菌中实现。更优选地，利用该系统以两步法培养链霉菌菌株AQP274，从而诱导抗微生物化合物的产生。初始强迫固着基质(生物膜)构建在PDY培养基中的一块玻璃纤维滤器上。然后微生物基质构建在该滤器上，随后将其转移到受氧化应激影响的另一种培养基中，其中如上所述在铁和或铜离子的存在下利用活性氧发生剂(ROS)，更优选11202，或甲萘醌。在具有不同培养基配方的多种培养物之间分析利用该所述系统进行的抗微生物化合物的产生(图2)。更优选地，用0.3M(w/v)琼脂粉末固化所有培养基(No.3)，这辅助支持玻璃纤维滤器。更优选地，在冷却至约37。C时，向培养基中加入过滤-灭菌的甲萘醒和减^02。更优选地，结果显示甲萘醌和过氧化氢都可以将抗生素和抗真菌化合物激发到培养基中，并且铁和或铜离子增加这些次级代谢物的产生。过氧化氢能够在细菌和真菌中并且更优选地在菌株AQP274中激发抗生素产生。更优选地，提供低浓度过氧化氢(低于0.5%)与频繁(多于3次/曰)增补策略一起使用更好地激发抗微生物化合物。这显示出是比以单批处理方式提供高浓度过氧化氢更好的系统。另外，甲萘醌在由细菌，更优选放线菌(actinomyctes)激发次级代谢物中是更优选的。甲萘醌(维生素K3，2-甲基-l,4-萘醌)'广泛用作氧化还原循环奎宁的模型，以研究原核和真核生物体中的超氧化物应激(Femandes和Mannarino,2007;Goldberg和Stern，1976)。醌氧化还原循环意味着醌还原产物的自氧化。在自氧化过程中，两个单电子转移步骤伴随着半醌中间产物和超氧化物的形成(图3)。实施例4利用UV光激发抗微生物化合物产生UV光可以引起多种应激，并且公知UV引起对DNA的损伤并在微-生物体中进行了充分研究。另外，UV还可以引起单线态氧物种，即另一种ROS的产生。使用实施例2中所述的培养系统用于在细菌中，优选在放线菌中产生抗微生物化合物。利用GFMS生物反应器系统培养链霉菌菌株AQP1159，以在处于包含1。/。(v/v)甘油和lmM柠檬酸铁的营养培养液(NGF)中的空气-玻璃纤维膜界面处构建固着群落基质。基质堆积后，使生物反应器暴露于UV25436小时，即每天12小时，连续3天。然后更新玻璃纤维膜下面的NGF培养基，并且随后在室温下温育培养物4天。然后去除玻璃纤维膜下面的液体培养基，以进行抗微生物测定。在不暴露于UV254的条件下，AQP1159不产生可检测的针对白念珠菌和MRSA的抗微生物化合物，然而，受到UV254处理和培养基更新后，AQP1159产生针对白念珠菌和MRSA的抗微生物化合物。利用相同的培养基，新鲜接种的、没有在玻璃纤维膜上积聚足够生物量的AQP1159在暴露于UV254后不再生长。NGF培养基的更新对产生抗微生物化合物也是关键的。实施例5利用为了使细菌生长为强迫固着微生物基质(生物膜)而设计的生物-发酵器，由一定范围的y-蛋白菌(y-proteobacteria)激发次级代谢物的产生。利用所述用于在固着微生物群落中培养细菌的方法，利用生成自由基的培养基诱导应激反应，对一定范围的真细菌测试次级代谢物的诱导。例如，将假交替单胞菌菌株AQP816接种在尼龙膜的表面上，随后将所述尼龙膜置于充满海洋培养液的浅培养皿中。当在空气/膜界面处的尼龙膜的表面上构建了适当的AQP816生物膜时，用多种培养基更新膜下的海洋培养液，所述多种培养基包括新鲜海洋培养液、包含100)ig/ml甲萘醌的海洋培养液、包含3%v/vh202的海洋培养液、包含1%(v/v)甘油的海洋培养液和包含lmM柠檬酸铁的海洋培养液。获得的结果显示，利用该表面方法，与在相应的摇瓶培养物中无色素产生相比，添加甲萘醌可以显著激发某些深色着色的化合物的产生(图4)。在放线菌，链霉菌，y-蛋白菌，包括短波单胞菌(brevundimonads)，迪茨氏菌(dietzia)，红球菌(rhodococci)，假单胞菌(pseudomonads)，沙雷氏菌(serratia)，黄杆菌(flavobacteriacea)，弧菌(vibrio)和假交替单胞菌(pseudoalteromonads)的培养物中，在存在甲萘醌的条件下在膜上生长时，可以激发次级代谢物的产生。实施例6利用多种试剂施加应激，由一定范围的微生物激发次级代谢物基本如实施例2中所述，许多另外的细菌和真菌隔离群生长为生物膜，并且施加多种应激以试图激发次级代谢物的产生。利用多种施加应激的方法表现出显著次级代谢物改变的多种菌株的实例总结在表l中。所有菌株生长在生物膜内，其中真菌能够形成天然生物膜。对与任何给定菌株正常产生的次级代谢物不同的任何次级代谢物产生的检测，在应用应激条件后7天时进行。0.5mMNaN03显示出显著延迟测试的隔离群中大多数微生物的生长。另外，许多菌株在包含0.5mMNaN03的培养基中生长时，还展示出改变的形态学以及次级代谢物的产生。链霉菌菌株AQP4511在增补了0.5mMNaN03的PDY培养基中产生橘红色化合物，所述化合物具有萘醌结构。所述化合物显示出非常强的针对大多数革兰士-阳性细菌菌株的活性。重金属诸如Cu,Fe,Mn也用于对许多微-生物体施加应激。Cu用在油漆中，以防止海洋环境中的生物积垢过程；Fe和Mn可以影响许多细胞的呼吸链。在一个实例中，确定为地衣芽孢杆菌(S。"7/w//c/zew/onm')的AQP1148不产生杆菌肽或红色色素，可能是普切明，除非它生长在与空气直接接触并且在包含铁离子和碳水化合物的培养基中构建的强迫生物膜内。当菌株生长在生物膜中时，Mr^+也激发杆菌肽的产生。Fe"的最佳浓度是lmM，且Mi^+的是0.5mM。高于这些浓度导致生长的显著减慢，这说明所述金属施加的应激。表1由Aquapharm中的一些隔离群在应激条件下激发次级代谢物的产生<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>参考文献Batchelor,S.E.,M.Cooper,等.(199".细胞密度-调节恢复氨-氧化细菌的tTL饿生物月莫群(Celldensity-regulatedrecoveryofstarvedbiofilmpopulationsofammonia-oxidizingbacteria).应用禾口环境微生物学(ApplEnvironMicrobiol)63(6):2281-6.Costerton,J.W.,Z.Lewandowski,等.(1995).微生物生物膜(Microbialbiofilms),微生物学年度综述(A腿RevMicrobiol)49:711-45.Femandes，RN.,S.C.Mannarino,等.(2007).真核细胞中的氧化应激反应谷胱甘肽、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶对在酿酒酵母中针对过氧化物和甲萘酉昆应激的适应性的作用(Oxidativestressresponseineukaryotes:effectofglutathione,superoxidedismutaseandcatalaseonadaptationtoperoxideandmenadionestressesinSaccharomycescerevisiae).氧化还原报告(RedoxRep)12(5):236-44,Goldberg,B.和A.Stem(1976).在由甲萘醌氧化血红蛋白过程中产生超氧化物阴离子(Productionofsuperoxideanionduringtheoxidationofhemoglobinbymenadione).BiochimBiophysActa437(2):628-32.James,G.A.,D.R.Korber,等.(1995).表面-建群的不动杆菌菌株的生长和饥饿反应的数字图像分析(Digitalimageanalysisofgrowthandstarvationresponsesofasurface-colonizingAcinetobactersp).细菌学杂志(JBacteriol)177(4):907-15.Li,Y.H.，M.N.Hanna，等.(2001).细胞密度在变异链球菌调节酸适应性意味着存活在生物膜中(CelldensitymodulatesacidadaptationinStreptococcusmutans:implicationsforsurvivalinbiofilms).细菌学杂志(JBacteriol)183(23):6875-84.Wimpenny,J"W.Manz,等.(2000).生物膜的异质性(Heterogeneityinbiofilms).FEMS微生物学综述(FEMSMicrobiolRev)24(5):661-71.Yan,L.，K.G.Boyd,等.(2003).杆菌中抗微生物化合物的生物膜-特异性交叉-物禾中诱导(Biofilm-specificcross-speciesinductionofantimicrobialcompoundsinbacilli).应用和环境微生物学(ApplEnvironMicrobiol)69(7):3719-27.权利要求1.诱导微生物产生次级代谢物的方法，所述方法包括下列步骤(a)通过在第一条件设置下生长，构建包括所述微生物的生物膜；和(b)改变所述第一条件设置，从而诱导所述生物膜中的一种或多种微生物产生次级代谢物。2.按照权利要求1的方法，其中所述次级代谢物选自色素、抗感染化合物诸如抗生素、抗细菌剂、抗病毒剂、抗真菌剂、抗原生动物剂、毒素、生态竞争和共生的效应物、信息素、酶抑制剂、免疫调节剂、受体拮抗剂、杀虫剂、抗肿瘤剂和动物和植物的生长促进剂。3.按照权利要求1或2中任一项的方法，其中所述微生物包括细菌、真菌、原生动物或其混合物中的至少一种。4.按照权利要求3的方法，其中所述至少一种微生物包括假交替单胞菌属(P化M(io/她ra附。"as)、链霉菌属(浙一o，ceto)(方夂线菌属(Actinomycetes))、^raw(ifmoMay、迪茨氏菌属(Z)/efe/a)、红球菌属(//z(9<iococ%w)、微球菌属(M/cracoccwj)、假单胞菌属(/^ewt/cwfl/7os0、沙雷氏菌属(&簡"a)、黄杆菌属(F/,&Ca)、弧菌属和交替单胞菌属"/^ramo^w)物种。5.按照以上权利要求中任一项的方法，其中当在所述第一条件设置下培养时，所述微生物是在表面或基底上培养的，所述表面或基底的一部分与生长培养基相接触。6.按照权利要求5的方法，其中所述表面或基底是惰性的。7.按照以上权利要求中任一项的方法，其中在1-10天的时期内构建所述生物膜。8.按照权利要求5-7中任一项的方法，其中所述表面或基底是半渗透的。9.按照权利要求8的方法，其中所述半渗透表面或基底通过表面张力或支持结构保持在无菌生长培养基的表面上。10.按照以上权利要求中任一项的方法，其中为诱导次级代谢物的产生而设计的改变的条件设置包括毒性或破坏性试剂或条件，或抑制、限制、或防止所述生物膜内微生物生长或存活的化合物。11.按照权利要求io的方法，其中所述改变的条件包括添加或施用下列各项中的至少一种维生素或合成等价物、碳水化合物、蛋白质或肽、氨基酸、核酸、矿物质、金属或金属离子、营养限制、抗生素、抗真菌剂、抗病毒剂，能够改变渗透条件的化合物、电离辐射、电磁辐射、改变的温度或改变的压力。12.按照权利要求ll的方法，其中所述改变的条件包括添加或施用下列各项中的至少一种金属或金属离子、能够改变渗透条件的化合物、和/或电磁辐射。13.按照权利要求12的方法，其中所述电磁辐射是UV光。14.按照权利要求12的方法，其中所述金属离子是Mn、Cu和/或Fe。15.按照权利要求12的方法，其中所述能够改变渗透条件的化合物是甲萘醌、&02和/或硝酸盐。16.按照权利要求11-15中任一项的方法，其中所述改变的条件保持约1至6天的时期。全文摘要本发明涉及由微生物产生次级代谢物。具体地，提供用于诱导由多种微生物快速产生这样的化合物的方法。文档编号C12N1/20GK101636487SQ200880002523公开日2010年1月27日申请日期2008年1月18日优先权日2007年1月19日发明者严立明,凯伦·朱克斯,安德鲁·默恩斯斯普拉格申请人:艾克沃制药生物发明有限公司