含有高表达分泌胰岛素前体的融合蛋白、编码该融合蛋白的dna和胰岛素的制备方法

专利名称：含有高表达分泌胰岛素前体的融合蛋白、编码该融合蛋白的dna和胰岛素的制备方法
技术领域：
本发明涉及编码含有高表达分泌胰岛素前体的融合蛋白的DNA 、 以及使用该DNA制备胰岛素的方法。其中所述高表达分泌胰岛素前 体用于制备基因重组胰岛素。
背景技术：
胰岛素是使生物体内血糖4直降低的唯 一 的激素。由于某些原因胰 岛素的分泌功能降低，则可能导致胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)。胰岛 素是具有胰岛素分泌功能低下的患者的治疗中所必须的药物。
人的胰岛素是由含有21个氨基酸的A链和含有30个氨基酸的B 链形成的多肽，A链内具有l个、A链和B链之间具有2个二;5危键。 胰岛素首先是在胰脏胰岛的B细胞中，以含有24个氨基酸的信号肽 (SP)、 B链(B)、含有31个氨基酸的C肽(C)、 A链(A)按该顺序串联排 列而成的前胰岛素原(SP-B-C-A)的形式在细胞内的核糖体中合成。前 胰岛素原在进入内质网内时信号肽被切离，形成胰岛素原(B-C-A)。在 内质网内、在胰岛素原的链内生成二硫键，胰岛素原形成立体结构。 然后，通过激素原转化酶PC1/3切断B-C键，通过PC2切断C-A键。 最后，在PCl/3切断时，残留在B链的C末端的2个碱性氨基酸被羧 基肽酶H切除，形成功能性的胰岛素。
治疗用的胰岛素最初是从牛或猪等动物的胰脏中提取的，目前几 乎都是基因重组胰岛素。
一直以来，基因重组胰岛素是用含有编码胰岛素原的DNA的载 体转化微生物，表达胰岛素原，形成二硫键，然后通过转换为胰岛素的操作而生成。上述制备方法目前已经开发有多种。例如EliLilly公 司开发了使用大肠杆菌使胰岛素原表达，体外形成二疏键，用胰蛋白 酶和羧基肽酶B切取C肽，制备胰島素的方法(专利文献1和2)。
Novo Nordisk公司开发了将B链和A链用2个碱性氨基酸连接， 使得到的小胰岛素原(miniproinsulin)在酵母中表达，体外进行胰蛋白 酶处理，从而制备胰岛素的方法(专利文献3-5)。该方法的优点是 表达并分泌已经形成二硫键的胰岛素前体，因此无需体外进行形成二 硫键的操作。并且，胰岛素前体分泌在培养基中，因此容易分离纯化。
基因重组胰岛素的新型制备方法的开发在这之后也取得了积极 进展，Hoechist(专利文献6~12)或BIO-TECHNOLOGY GENERAL CORP(专利文献13)开发了使用大肠杆菌的新型的制备方法。
如上所述，基因重组胰岛素的制备方法已经有多条途径，但从表 达效率、二硫键的形成效率、变换为胰岛素的方法方面还需要进一步 改善。
从操作容易性和适应工业化生产的角度考虑，作为生产基因重组 蛋白的宿主，尤其是微生物最容易被利用。特别是大肠杆菌和酵母是 已经熟知的宿主。近年开发的^f吏用短芽孢杆菌属(BreW&"7/w力的短短 芽孢杆菌(&ev凸ac!7/w ^"ev&)的基因重组蛋白的表达体系中，在功能 性的状态下，具有二>5克键的多肽(人上皮细胞生长因子)以在培养基中 具有活性的状态、即以形成了二碌"定的状态大量分泌表达，因此作为 基因重组蛋白的大量生产体系受到人们的关注(专利文献14和15、非 专利文献1-4)。
尝试在短短芽孢杆菌的基因表达体系中表达胰岛素前体，开发了 胰岛素原(专利文献16)和突变型胰岛素原(专利文献17)的表达分泌方 法。由此显示了以短短芽孢杆菌为宿主的基因重组胰岛素生产的可能 性。
之后，为了使使用该表达体系的胰岛素生产工业化，在通过蛋白 质二硫键异构酶的共表达使表达量增加方面作了很多研究(专利文献
518)。
专利文献1:日本特公平1-48278号公报 专利文献2:日本特许第2634176号公报 专利文献3:日本特公平7-121226号公报 专利文献4:日本特公平8-8871号公才艮 专利文献5:日本特许第2553326号公报 专利文献6:日本特开平2-195896号公报 专利文献7:日本特开平2-225498号公报 专利文献8:日本特开平2-233698号公报 专利文献9:日本特开平3-169895号公报 专利文献10:日本特开平4-2582%号公才艮 专利文献11:日本特开平6-228191号公报 专利文献12:日本特开平7-265092号公报 专利文献13:国际公开第96/20724号小册子 专利文献14:日本特许第2082727号公报 专利文献15:日本特开昭62-201583号公报 专利文献16:日本特许第3313083号公报 专利文献17:日本特许第3406244号公报 专利文献18:国际公开第01/068884号小册子
非专利文献1: Yamagata, H.等人，J. Bacteriol. 169,1239 ~ 1245 (1987) 非专利文献2:鵜高重三，日本农艺化学会志61，669~676(1987) 非专利文献3: Takao， M.等人，Appl. Microbiol. Biotechnol. 30, 75 ~ 80, 1989
非专利文献4: Yamagata, H.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 3589 ~ 3593 (1989)

发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于为了可工业化生产重组胰岛素而特别提供可在使用芽孢杆菌属(^7"'〃W》或短芽孢杆菌属细菌的基因表达体系中进 一步高表达分泌的、最佳的胰岛素前体的序列。
解决课题的手段
因此，本发明人反复进行试差法，在含有胰岛素前体的融合蛋白
中插入含有芽孢杆菌属或短芽孢杆菌属细菌的胞壁蛋白(CWP)的N末 端起的5、 6、 7或12个氨基酸残基的序列(前导肽)、插入前导肽和胰 岛素B链之间的连接肽、使用胰岛素B链(除去C末端的Thr)与A链 的融合体、向胰岛素B链和A链之间插入连接肽等，可以在芽孢杆菌 属或短芽孢杆菌属的表达体系中实现胰岛素前体的高表达分泌，从而 完成了本发明。并且确认了可以以高收量由该前体制备胰岛素。 即，本发明提供以下内容。
(1) DNA，该DNA编码融合蛋白，该融合蛋白是来自芽孢杆菌属 或短芽孢杆菌属细菌的胞壁蛋白(CWP)之一的MWP的信号肽；含有 来自芽孢杆菌属或短芽孢杆菌属细菌的CWP的5 ~ 7或12个氨基酸 的前导肽；具有以下通式(Asp、 Leu或Gly) (Gly、 Asn、 Ser或Leu) (Asp、 Ser或Pro) (Arg或Ala或无)Arg (SEQ ID N0.51或52)所示的 氨基酸序列的连接肽；以及胰岛素前体的氨基酸序列按该顺序连接而 成。
(2) 上迷(l)所述的DNA,其中上述连接肽具有SEQ ID NO.l ~ 6 中任一项表示的氨基酸序列。
(3) 上迷(1)或(2)所述的DNA，其中上述前导肽来自MWP。
(4) 上迷(1)~(3)中任一项所述的DNA，其中上述胰岛素前体具有 SEQ ID NO.8或9表示的氨基酸序列。
(5) 上迷(1)~(4)中任一项所述的DNA,其中上述融合蛋白具有 SEQ IDNO.10~ 18中任一项表示的氨基酸序列。
这里，SEQIDNO.10~ 18的氨基酸序列具有下式的结构。
式MWPsp-MWPmp5-AspGlyAspArgArg-Bchain(desThr)-Achain (SEQ ID NO. 10)
MWPsp-MWPmp6-AspGlyAspArgArg-Bchain(desThr)-Achain (SEQ ID NO. 11)
MWPsp-MWPmp6-LeuAsnSerAlaArg-Bchain(desThr)画Achain (SEQ ID NO. 12)
MWPsp-MWPmp6-GlySerProArg-Bchain(desThr)-Achain (SEQ ID NO. 13)
MWPsp-MWPmp7-AspGlyAspArgArg-Bchain(desThr)-Achain (SEQ ID NO. 14)
MWPsp-MWPmp7-AspLeuAspArgArg-Bchain(desThr)-Achain (SEQ ID NO. 15)
MWPsp-MWPmp7-AspAsnAspArgArg-Bchain(desThr)誦Achain (SEQ ID NO. 16)
MWPsp-MWPmp 12-AspGlyAspArgArg-Bchain(desrhr)-Achain (SEQ ID NO. 17)
MWPsp-MWPmp7-AspGlyAspArg-Bchain-ArgAspGlyAspArg-Ach ain (SEQ ID NO. 18)。
(6) 上述(1) (S)中任一项所述的DNA，其中该DNA具有由SEQ IDN0.19~27中任一项表示的核苷酸序列。
(7) 载体，该载体含有上述(1)~(6)中任一项所述的DNA。
(8) 上述(7)所述的载体，其中上述DNA与来自细菌的启动子序
列的下游功能性连接。
(9) 上述(8)所述的载体，其中上述启动子来自芽孢杆菌属或短芽 孢杆菌属细菌。
(10) 上述(7)~(9)中任一项所述的载体，该载体进一步含有编码 蛋白质二硫键异构酶(PDI)的DNA。
8(11) 宿主细胞，该宿主细胞含有上述(7)~(10)中任一项所述的栽体。
(12) 上述(ll)所述的宿主细胞，其中上述宿主细胞是芽孢杆菌属 或短芽孢杆菌属细菌。
(13) 上述(12)所迷的宿主细胞，其中上述细菌是短短芽孢杆菌。
(14) 胰岛素的制备方法，该制备方法包含以下步骤培养上述 (11)~(13)中任一项所述的宿主细胞的步骤；由宿主细胞表达所需融合 蛋白的步骤；将表达的多肽从细胞或培养基中回收的步骤。
(15) 上述(14)所迷的方法，该方法进一步包含将回收的多肽进行 酶解处理的步骤。
(16) 上述(15)所述的方法，其中上述酶解处理通过胰蛋白酶进行 处理。
(17) 上述(14)~(16)中任一項所迷的方法，该方法是从培养基中 回收上述多肽。
(18) 融合蛋白，该融合蛋白具有SEQIDNO.10 18中任一项表 示的氨基酸序列。
本说明书中使用的"芽孢杆菌属或短芽孢杆菌属细菌"的术语是指 被分类为革兰氏阳性杆菌的芽孢杆菌属或短芽孢杆菌属的任何细菌。 上述细菌有短短芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌(^^7/"^^"/&)、地衣形 芽孢杆菌C6ac〃/us /z'c/ em》rm&)、 多粘芽孑包杆菌C6acz7/ws j: o/ymy;ca)等, 优选短短芽孢杆菌。
本说明书中使用的"MWP，，的术语是指具有含三层的细胞壁的细 菌的胞壁蛋白(CWP)中所含的中壁蛋白(middle wall protein)。
本说明书中使用的"胰岛素前体"的术语是指通过适当的处理(例 如酶解处理)可转换为功能性的胰岛素、至少含有B链或C末端缺失 Thr的B链以及A链的多肽。发明效果
根据本发明，通过使用新型的融合蛋白，可以制备比以往的在芽
孢杆菌属中表达胰岛素前体的例子高1.5-3倍表达分泌量的重组胰 岛素。该重组胰岛素前体可以变换为胰岛素，且在表达分泌时可正确 地形成胰岛素的生物活性所必须的二斩at
附图简述
图l表示MWPsp-MWPmp5-AspGlyAspArgArg-Bchain(desThr)-Achain的核香酸序列(SEQ ID N0.19)。
图2表示MWPsp-MWPmp5-AspGlyAspArgArg-Bchain(desThr)-A chain的氨基酸序列(SEQ ID NO. 10)。
图3表示WPsp画MWPmp6-AspGlyAspArgArg-Bchain(desThr)國 Achain的核苷酸序列(SEQ ID NO.20)。
图4表示WPsp-MWPmp6-AspGlyAsp ArgArg画Bchain(desThr)陽 Achain的氨基,列(SEQ ID NO. 11);
图5表示MWPsp-MWPmp6-LeuAsnSerAlaArg画Bchain(desThr)-Achain的核苷酸序列(SEQ ID NO.21)。
图6表示M曹sp-MWPmp6-LeuAsnSerAlaArg-Bchain(desThr)-Achain的氨基辦列(SEQ ID NO. 12)。
图7表示MWPsp-M曹mp6-GlySerProArg-Bchain(desThr)-Achain 的核苷酸序列(SEQ ID N0.22)。
图8表示MWPsp-MWPmp6画GlySerProArg-Bchain(desThr)-Achain 的氨基酸序列(SEQ ID NO. 13)。
图9表示MWPsp-MWPmp7-AspGlyAspArgArg-Bchain(desThr)-Achain的核苷M"列(SEQIDNO,23)。


图10表示MWPsp隱M曹mp7陽AspGlyAsp ArgArg-Bchain(desThr)-Achain的氨基酸序列(SEQ ID NO. 14)。
图1 l表示M曹sp-M曹mp7-AspLeuAspArgArg-Bchain(desThr)-Achain的核苷酸序列(SEQ ID N0.24)。
图12表示MWPsp-MWPmp7-AspLeuAspArgArg-Bchain(desThr)-Achain的氨基,列(SEQ ID NO. 15)。
图13表示MWPsp-MWPmp7腸AspAsnAspArgArg-Bchain(desThr)-Achain的核苦i^列(SEQ ID N0.25)。
图14表示MWPsp-MWPmp7-AspAsnAspArgArg隱Bchain(desThr)-Achain的氨基酸序列(SEQ ID NO,16)。
图15表示MWPsp-MWPmp 12-AspGlyAspArgArg曙Bchain(desThr)-Achain的核苷酸序列(SEQ ID N0.26)。
图16表示MWPsp-MWPmp 12-AspGlyAspArgArg-Bchain(desThr)-Achain的氨基齡列(SEQ ID NO. 17)。
图17表示MWPsp-MWPmp7-AspGlyAspArg-Bchain誦ArgAspGly AspArg-Achain的核苷酸序列(SEQ IDN0.27)。
图18表示MWPsp-MWPmp7-AspGlyAspArg-Bchain-ArgAspGly AspArg-Achain的氨基崎列(SEQ ID NO. 18)。
图19表示将融合DNA重組短芽孢杆菌的表达载体(pNU211R2L5) 的方法的概略图。
图20表示融合蛋白的表达量。
图21是表示Des-Thr胰岛素的肽图的HPLC洗脱图谱。 图22表示成熟胰岛素的HPLC洗脱图谱。
实施发明的最佳方式
根据本发明，通过使编码上述融合蛋白(以下根据情况可称为"小 胰岛素原，，或"MINIPINS，，)的DNA在芽孢杆菌属或短芽孢杆菌属细菌 中表达，胰岛素前体可以在培养基中高产量分泌。将其分离纯化，通 过胰蛋白酶切断、以及使用Bchain(desThr)时进行Thr的附加，可以 获得具有天然型的所需结构的"夷岛素。
使胰岛素前体高表达分泌的第一条件是在上述融合蛋白中，在分
ii泌所必须的信号肽和胰岛素前体之间配置含有特定氨基酸序列的前 导肽和连接肽。
根据本发明的实施方案，适合胰岛素前体的高表达分泌的前导肽
是芽孢杆菌属或短芽孢杆菌属细菌的胞壁蛋白(CWP)的N末端的5、6、 7或12个氨基酸残基。CWP可使用例如来自短短芽孢杆菌林、47 (FERMP-7224:日本特开昭60-58074号公报、专利文献15)、 HPD31 (FERM BP-1087:日本特开平4-278091号公报)等的CWP，但并不限 于此。前导肽具体可使用以下所例举的序列(将引用了该序列的文献表 示在括号内)
MWPmpl2: AlaGluGluAlaAlaThrThrThrAlaProLysMet (SEQ ID NO.28; Biotechnol" Genet. Eng. Rev" 7: 278 ~ 311, 1989)
OWPmpl2: AlaProLysAspGlylleTyrlleGlyGlyAsnlle (SEQ ID NO: 29; J. Bacteriol., 170: 935 ~ 945, 1988)
HWPmpl2: AlaGluAspThrThrThrAlaProLysMetAspAla (SEQ ID NO: 30; J. Bacteriol.， 172: 1312 ~ 1320, 1990)。
自N末端起的氨基酸残基数只要可高表达该融合蛋白即可，没有 限定，优选5、 6、 7或12个。其它的例子可以是8、 10或11个(专利 文献16)。
在紧邻胰岛素前体的B链或C末端缺失Thr的B链(B链(desThr)) 之前、以及在B链和A链之间任意配置的连接肽具有两种功能。其一 是由胰岛素前体变换为胰岛素时作为被胰蛋白酶切断的部位的功能。 另 一功能是使胰岛素前体高表达分泌。被胰蛋白酶切断的部位是碱性 氨基酸Arg或Lys。因此，优选在紧邻B链或B链(besThr)之前的连 接肽的C末端、B链和A链之间的连接肽的N末端和C末端含有1 个或2个Arg。或者，在C末端缺失Thr的B链直接与A链连接的状 态下，B链的自C末端起第2号Lys为切断部位。
含有1个以上氨基酸残基的连接肽通常存在于蛋白质中的功能域 之间，对各域的功能没有影响地与域连接。本发明中，连接肽在前导肽和B链或B链(desThr)之间、以及在任意B链和A链之间分别经由 胰蛋白酶切断部位配置，且连接肽起到使B链和A链之间和/或A链 内的二硫键形成、胰蛋白酶的切断、以及该融合蛋白的表达容易地进 行的作用。只要满足上述功能，连接肽可以是1个以上的氨基酸，无 需是特定的氨基酸序列。如果上述连接肽位于(i)前导肽和B链之间， 则优选通式(Asp、 Leu或Gly) (Gly、 Asn、 Ser或Leu) (Asp、 Ser或 Pro) (Arg或Ala或无)Arg (SEQ ID NO.51或52)所示的氨基酸序列， 更优选AspGlyAspArgArg (SEQ ID NO. 1)、 LeuAsnSerAlaArg (SEQ ID N0.2)、 GlySerProArg (SEQ ID N0.3)、 AspLeuAspArgArg (SEQ ID N0.4)、 AspAsnAspArgArg (SEQ ID NO,5)或AspGlyAspArg (SEQ ID N0.6);如果位于(ii) B链和A链之间，则是ArgAspGlyAspArg (SEQ ID N0.7)。为B链(desThr)时，B链和A链之间可以不存在连接肽。
本发明的DNA可以结合本领域公知的技术进行制备，例如，通 过化学合成法或克隆法分别制备构成要素的各DNA序列，用连接酶 将这些构成要素依次连接，结合PCR扩增法，可以制备目标DNA。 具体可参照实施例来理解其详细内容，其中的各种技术可采用 Maniatis, T.等人，Molecular Cloning第2版，A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)、 Innis， M. A.等人，PCR Protocols, A guide to methods and applications, Academic Press (1990)等中记载的常 规技术。
编码含有胰岛素的B链、C肽、A链的人胰岛素原的DNA可使 用市售的cDNA First Strand Synthesis Kit等，从市售的人胰脏的mRNA 中获得。并且，如果根据已知的DNA序列(GenBank登记号 NM_000207),使用市售的DNA合成仪可以合成作为引物的短链 DNA,则通过常规的聚合iW反应(PCR)，可以扩增编码B链、A链 等的所需的DNA片段。此时，优选以DNA的变性(94。C、 30秒~ 2 分钟)、与引物的退火(55。C、 30秒-l分钟)、以及伸长反应(72。C、 30 秒 1分钟)作为一个循环，重复20个循环以上。本发明进一步提供含有本发明的上述DNA的载体。可使用的载 体必须至少具有以下的性质具有可以重组本发明的DNA的适当插 入位点(即限制酶切位点)；可以-使该DNA在宿主细胞内表达；并且可 在该宿主细胞内自主复制等。载体可以含有启动子、复制起点、终止 子序列，还可以含有抗药性基因、与营养缺陷型互补的基因等选择标 志。根据本发明的实施方案，编码该融合蛋白的DNA与来自芽孢杆 菌属或短芽孢杆菌属的含有启动子区域的DNA序列的3，末端功能性 连接。本发明中，"功能性连接"是指各功能性核苷酸序列(启动子等) 可发挥其功能地连接。可使用的启动子例如有糖酵解系启动子、组 织特异性启动子、病毒启动子、诱导性启动子等。启动子优选为来自 短短芽孢杆菌47的MWP启动子(日本特公平1-58950号公报、曰本 特公平7-108224号公报)、来自短短芽孢杆菌HPD31的HWP启动子 (曰本特开平4-278091号公报、曰本特开平6-133782号公报)等，但并 不限于此。选择标志的例子例如有氨节青霉素抗性基因、卡那霉素 抗性基因、红霉素抗性基因、四环素抗性基因等抗药性基因。
本发明的载体例如有保持在适合性的原核细胞或真核细胞、例 如细菌细胞、菌类细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物和动物细胞等宿 主细胞中并可表达目标蛋白质的任意的DNA载体。优选本发明的载 体是可在芽孢杆菌属或短芽孢^f干菌属细菌中复制的质粒。例如可使用 pNU200、 pHY500 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 3589 ~ 3593, 1989)、 pHY4831 (J. Bacteriol., 169: 1239 - 1245, 1987)、 pNU100 (Appl. Microbiol. Biotechnol,， 30: 75 ~ 80， 1989)、 pNU211 (J. Biochem.， 112: 488 - 491, 1992)、 pNU211R2L5 (日本特开平7-170984号公报)、 pHY700 (日本特开平4-278091号公报)、pHT210 (日本特开平6-133782 号公报)、pHT110R2L5 (Appl. Microbiol. Biotechnol,， 42: 358 -363, 1994),但并不限于此。本发明的具体例子中，可以按照图19所示的 构建法制备表达载体pNU-MINIPINS~hPDI*。
本发明提供除上述DNA之外，还进一步包含编码蛋白质二硫键异构酶(PDI)的DNA。在上述具体例子中所例举的表达载体 pNU-MIMPINS hPDP担载PDI基因，因此可用于上述载体的构建。 通过上述载体，PDI基因与目标融合蛋白共表达。
使PDI与所需蛋白质共表达的优点如下。例如，来自哺乳动物的 功能性的多肽在细菌表达体系中表达时，细菌表达体系中大多难以正 确的形成为了使该多肽具有功能性的折叠而必须的二硫4建。上述细菌 表达体系中，在不能正确地形成或者难以形成二碌u键的多肽表达时， 通过使PDI共表达，可以构建目标多肽与PDI共存的环境，由此可以 具有正确的二硫键，因而可以*提高具有所需功能的多肽的生产效率。
上述尝试详细记载于国际7>开第WO01/068884号中。
本发明中，编码PDI的DNA可以使用来自以人为代表的哺乳动 物DNA，来自昆虫、酵母等真核生物的DNA。来自哺乳动物的PDI 基因的核苷酸序列例如有人(NM—000918)、小鼠(NMJ)l 1032)、大 鼠(NMJ)12998),均登记于数据库中。另外，来自酵母的PDI例如记 载于WO98/035049等中。
适合使用上述PDI共表达体系的宿主是芽孢杆菌属或短芽孢杆菌 属的细菌，最优选的宿主是短短芽孢杆菌。
本发明进一步提供用上述定义的载体转化的例如细菌细胞、菌类 细胞、酵母细胞、昆虫细胞、纟直物和动物细胞等的宿主细胞。优选该 宿主细胞是芽孢杆菌属或短芽孢杆菌属细菌。作为宿主的芽孢杆菌属 或短芽孢杆菌属细菌例如有短短芽孢杆菌林、47 (FERM P-7224:曰本 特开昭60-58074号公报、专利文献15)、 (日本特开平^"7876 号公报)、31-OK (日本特开平6-296485号公报)和HPD31 (FERM BP-1087，日本特开平4-278091号公报)等，但并不限于此。
上述所得的表达载体导入感受态的宿主细胞中，在可表达的条件 下、在适当的培养基中培养该细胞，在细胞外或细胞内、优选在细胞 外生产目标重组多肽。接着按照常规方法回收并纯化多肽。
载体的导入方法可例举畴酸钙法、电穿孔法(Methods in Enzymol.,217:23 -33,1993)、原生质球融合法、原生质体融合法、显微注射法、 农杆菌法、基因枪法等。
关于具有表达载体的上述细胞的培养，本领域技术人员可以根据 细胞的种类选择公知的适当的培养基和培养条件。例如，宿主细胞为 芽孢杆菌属或短芽孢杆菌属细菌时，宿主细胞的培养可以在T2培养 基中、在37。C下培养一天，然后将T2培养基中的菌悬浮液的一部分 转移至M-5YC培养基中，将该培养基在30。C下振荡培养4天。
由细胞外回收多肽，例如可从培养细胞的培养基中进行。由细胞 内回收多肽，例如可通过离心回收细胞，破坏该细胞，回收该多肽来 进行。
另外，所得多肽的纯化例如可将凝胶过滤色谱、离子交换色谱、 亲和层析、疏水性相互作用色谱、电泳、等电点电泳等方法单独或组 合实施。
接着，可将上述得到的多肽通过胰蛋白酶处理制成desThr-胰岛 素，再在叔丁基-Thr的存在下实施胰蛋白酶处理，由此可获得胰岛素。 因此，本发明进一步提供胰岛素的制备方法，该制备方法包含将上述 转化的芽孢杆菌属或短芽孢杆菌属细菌在培养基中培养，使含有胰岛 素序列的多肽在菌体外蓄积，对回收的多肽进行胰蛋白酶处理，获得 胰岛素。
上述得到的重组胰岛素具有与天然型胰岛素完全相同的二硫键、 HPLC洗脱图谱，可用作胰岛素依赖型糖尿病的治疗用药物。
实施例
以下通过实施例，更具体地说明本发明，但本发明并不受这些实 施例的限定。
在制备编码融合蛋白的DNA时，采用了通过使用DNA连接酶的 连接反应，将PCR反应(聚合酶链反应)扩增的DNA片段连接的方法。 本说明书中，MWPsp是指MWP蛋白质的信号肽，MWPmp是指MWP成熟蛋白质的N末端肽,之后接续的数字表示自N末端起的氨基酸数 目。
实施例I
1.各种DNA片段的获得
(1) DNA片段MWPsp-MWPmp5的获得
a. 模板DNA
按照公知的方法(Molecular Cloning第2版，A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)),由短短芽孢杆菌(47-5Q林)提取 的基因组DNA(840 ng)
b. 引物
正向引物5，-ACACGCGCTTGCAGGATTCG-3， (SEQ ID NO.31) 反向引物5，-TGCTGCTTCTTCTGCTGC-3， (SEQ ID NO.32) 引物是以由Yamagata， H.等人(J. Bacteriol.， 169, 1239 ~ 1245, 1987) 和Tsuboi， A,等人(J. Bacteriol., 170, 935 ~ 945, 1988)确定的MWP蛋白 质的核苦酸序列为基础进行有4几化学合成而获得的，以其在反应液的 终浓度为0.1 ;wmol/L加入。
c. TaqDNA聚合酶
每一反应加入5U市售的产品(GIBCO BRL公司制备)。
d. 其它
加入Tris-HCl (终浓度20 mmol/L， pH8)、 MgCl2 (终浓度2.5 mmol/L)、 dNTPs (dATP、 dGTP、 dCTP和dTTP:终浓度分别为50 戶ol/L)。
将a ~ d以反应液量100 〃L加入到0.5 mL管中，通过公知的方法 (Innis, M. A.等人，PCR Protocols, A guide to methods and applications, Academic Press, (1990))进行PCR反应(变性94°C 1分钟，退火50°C 1分钟，DNA链延伸72°C 1分钟，以此作为1个循环，共进行30 个循环)。PCR反应结束后，将反应液用苯酚浓缩，然后应用于0.8%的琼脂糖凝胶上，在常规条件下进行电泳，使用MilliporeUltrafree-C3H 从琼脂糖凝胶中回收PCR产物，即DNA片段MWPsp-MWPmp5。回 收的PCR产物用苯酚提取，然后用乙醇沉淀，真空干燥，溶解于适量 的蒸馏水中。使用DNA平端试剂盒(DNA blunting kit)(宝酒造公司制 备)，按照使用说明书进行平端化反应。
(2) DNA片段MWPsp-MWPmp6的获得
除以下几点之外，按照与(l)同样的顺序获得平端的DNA片段 MWPsp-MWPmp6。
使用反向引物5'画AGTTGCTGCTTCTTCTGC-3， (SEQ ID N0.33)。
-PCR的反应条件是，变性94°C l分钟，退火50°C 1分钟， DNA链延伸72。C30秒，以此作为1个循环，共进行25个循环。
(3) DNA片段MWPsp-MWPmp7的获得
除以下几点之外，按照与(l)同样的顺序获得平端的DNA片段 M，sp-MWPmp7。
.使用反向引物5，-AGTAGTTGCTGCTTCTTC-3， (SEQ ID NO,34)。
.PCR的反应条件是，变性温度94°C l分钟，退火50°C l分 钟，DNA链延伸72°C 30秒，以此作为1个循环，共进行25个循环。
(4) DNA片段MWPsp-MWPmp12的获得
除以下几点之外，按照与(l)同样的顺序获得平端的DNA片段 MWPsp-MWPmp 12。
.使用反向引物5，-CATTTTTGGAGCTGTAGT-3， (SEQ ID NO,35)。
.PCR的反应条件是，变性温度94°C l分钟，退火50°C l分 钟，DNA链延伸72°C 30秒，以此作为1个循环，共进行25个循环。
(5) DNA片段胰岛素原的获得
除以下几点之外，按照与(l)同样的顺序获得平端的DNA片段胰岛素原。
'模板DNA使用10 ng重组了人前胰岛素原DNA的质粒载体。重 组了人前胰岛素原DNA的质粒载体的获得如下进行。使用First Strand cDNA Synthesis Kit (Pharmacia 司)，按照使用说明书，由市售的人 胰脏mRNA (CLONTECH公司制备)合成人胰脏cDNA。以该cDNA 为模版，使用以Bell. G. I等人(Nature， 282， 525 ~ 527, (1979))确定的人 前胰岛素原基因的核苷酸序列为基础合成的正向引物5，-ATGGCCC TGTGGATGCGCC-3， (SEQ ID N0.36)和反向引物5，-CTAGTTG CAGTAGTTCTCC-3，(SEQIDN0.37)，进行PCR反应(条件以94°C l分钟，60°C l分钟、72°C l分钟为l个循环，进行35个循环)，将 所得PCR产物、即人前胰岛素原DNA克隆到pGEM-T载体(Promega 公司制备)中。
-引物使用正向引物5，-TTTGTGAACCAACACCTG-3， (SEQ ID NO,38)和反向引物5，-CTAGTTGCAGTAGTTCTCC-3， (SEQ ID NO,37)。
-PCR的反应条件是，变性94°C l分钟，退火47°C 1分钟， DNA链延伸72。C30秒，以此作为1个循环，共进行25个循环。
(6) DNA片段DGDR-Bchain-R的获得
除以下几点之外，按照与(l)同样的顺序获得平端的DNA片段 DGDR-Bchain-R。
'模板DNA使用10ng由(5)得到的胰岛素原PCR产物。
引物使用正向引物5，-GACGGTGATCGCTTTGTGAACCAACA CCTG-3， (SEQ ID NO,39)和反向引物5，-GCGGGTCTTGGGTGTG TAGAA-3， (SEQ ID NO.40)。
-PCR的反应条件是，变性94°C l分钟，退火52°C 1分钟， DNA链延伸72。C30秒，以此作为1个循环，共进行25个循环。
(7) DNA片段DGDRR-Bchain(desThr)的获得
除以下几点之外，按照与(l)同样的顺序获得平端的DNA片段DGDRR-Bchain(desThr)，再进行磷酸化反应(使用T4多核普酸激酶
(Nippon Gene公司制备)，方法是4姿照使用说明书),得到磷酸化的DNA
片段DGDRR-Bchain(desThr)。
'模板DNA使用10 ng由(5)得到的胰岛素原PCR产物。
引物使用正向引物5 ，-GACGGTGATCGTCGCTTTGTGAACCA
ACAC-3， (SEQ ID NO: 41)和反向引物5，-CTTGGGTGTGTAGAAG
AA-3，(SEQ ID NO: 42)。
'PCR的反应条件是，变性温度94°C l分钟，退火52°C l分
钟，DNA链延伸72°C 30秒，以此作为1个循环，共进行25个循环。
(8) DNA片段DLDRR-Bchain(desThr)的获得
除以下几点之外，按照与(l)同样的顺序获得平端的DNA片段 DLDRR-Bchain(desThr)。
'模板DNA使用10 ng由(5)得到的胰岛素原PCR产物。
引物使用正向引物5'-GACTTGGATCGTCGCTTTGTGAAC CAACACCTG-3， (SEQ ID NO,43)和反向引物5'-CTTGGGTGTG TAGAAGAA画3， (SEQ ID N0.42)。
'PCR的反应条件是，变性94°C l分钟，退火52°C 1分钟， DNA链延伸72。C30秒，以此作为1个循环，共进行25个循环。
(9) DNA片段DNDRR-Bchain(desThr)的获得
除以下几点之外，按照与(l)同样的顺序获得平端的DNA片段 DNDRR-Bchain(desThr)。
.模板DNA使用10ng由(5)得到的胰岛素原PCR产物。
引物使用正向引物5，-GACAATGATCGTCGCTTTGTGAA CCAACACCTG-3， (SEQ ID NO,44)和反向引物5，-CTTGGGTGTGTA GAAGAA-3， (SEQ ID N0.42)。
'PCR的反应条件是，变性温度94°C l分钟，退火52°C l分 钟，DNA链延伸72°C 30秒，以此作为1个循环，共进行25个循环。
(10) DNA片段LNSAR-Bchain(desThr)的获得除以下几点之外，按照与(l)同样的顺序获得平端的DNA片段 LNSAR-Bchain(desThr)。
.模板DNA使用10ng由(S)得到的胰岛素原PCR产物。
引物使用正向引物5'-CTGAACAGCGCTCGCTTTGTGAA CCAACACCTG-3， (SEQ ID N0.45)和反向引物5'-CTTGGGTGT GTAGAAGAA-3， (SEQ ID NO: 42)。
'PCR的反应条件是，变性94°C l分钟，退火52°C 1分钟， DNA链延伸72。C30秒，以此作为1个循环，共进行25个循环。
(11) DNA片段GSPR-Bchain(desThr)的获得
除以下几点之外，按照与(l)同样的顺序获得平端的DNA片段 GSPR-Bchain(desThr)。
'模板DNA使用10 ng由(5)得到的胰岛素原PCR产物。
.引物使用正向引物 5'画GGTTCTCCTCGCTTTGTGAACC AACACCTG-3， (SEQ ID N0.46)和反向引物5'画CTTGGGTGTGTA GAAGAA-3 (SEQ ID NO: 42)。
'PCR的反应条件是，变性94°C l分钟，退火52°C 1分钟， DNA链延伸72。C30秒，以此作为1个循环，共进行25个循环。
(12) DNA片段Achain的获得
除以下几点之外，按照与(l)同样的顺序获得平端的DNA片段 Achain,再进行磷酸化反应(使用T4多核苷酸激酶(Nippon Gene公司 制备)，方法是按照使用说明书)，得到磷酸化的DNA片段Achain。
.模板DNA使用10 ng由(5)得到的胰岛素原PCR产物。
'引物使用正向引物5 ，匿GGCATTGTGGAACAATGCTGT-3 ， (SEQ ID N0.47)和反向引物5'-CTAGTTGCAGTAGTTCTCCAGCTGGTA-3， (SEQ ID NO,48)。
-PCR的反应条件是，变性94°C l分钟，退火55°C 1分钟， DNA链延伸72。C30秒，以止M乍为1个循环，共进行25个循环。
(13) DNA片段DGDR-Achain的获得除以下几点之外，按照与(l)同样的顺序获得平端的DNA片段 DGDR-Achain，再进行磷酸化反应(使用T4多核苷酸激酶(Nippon Gene 公司制备)，方法是按照使用i^明书)，得到磷酸化的DNA片段 DGDR-Achain 。
'模板DNA使用10 ng由(12)得到的DNA片断Achain的PCR产物。
引物使用正向引物5，-GATGGCGACCGTGGCATTGTGG AACAATGCTGT-3， (SEQ ID NO,49)。
'PCR的反应条件是，变性94°C l分钟，退火55°C 1分钟， DNA链延伸72。C30秒，以此作为1个循环，共进行25个循环。
2. MWPsp-MWPmp5、 6、 7或12与各种Bchain的DNA片段之间的 融合DNA的获得
(1) MWPsp-MWPmp7-DGDR-Bchain-R融合DNA的获得
除以下几点之外，均按照与l(l)同样的顺序获得平端的融合 DNA—MWPsp-MWPmp7-DGDR-Bchain-R。
.模板DNA使用将1(3)中得到的DNA片段MWPsp-MWPmp7与 1(6)中得到的DNA片段DGDR-Bchain-R各适量混合，使用DNA连 接试剂盒(宝酒造公司制备)，在16。C下反应30分钟获得的产物。
'使用反向引物5'画GCGGGTCTTGGGTGTGTAGAA-3， (SEQ ID NO.40)。
接着，进行平端化的PCR产物的磷酸化反应(使用T4多核苷酸激 酶(Nippon Gene公司制备)，方法按照使用说明书)。将生成物重组到 用Hindi切断的Blue Script质粒载体(Stratagene)中，然后确定DNA 核苷酸序列，确认形成了适当的融合DNA。
(2) MWPsp-MWPmp5画DGDRR-Bchain(desThr)融合DNA的获得
除以下几点之外，均按照与l(l)同样的顺序获得平端的融合 DNA—M曹sp-MWPmp5-DGDRR-Bchain(desThr)。'模板DNA使用将l(l)中得到的DNA片段MWPsp-MWPmp5与 1(7)中得到的DNA片段DGDRR-Bchain(desThr)各适量混合，使用 DNA连接试剂盒(宝酒造公司制备)，在16。C下反应30分钟获得的产 物。
-使用反向引物5'-CTTGGGTGTGTAGAAGAA陽3， (SEQ ID N0.42)。
与2(1)同样，确认形成了适当的融合DNA
(3) MWPsp-MWPmp6-DGDRR-Bchain(desThr)融合DNA的获得
除以下几点之外，均按照与l(l)同样的顺序获得平端的融合 DNA—MWPsp-MWPmp6-DGDRR-Bchain(desThr)。
.模板DNA使用将1(2)中得到的DNA片段MWPsp-MWPmp6与 1(7)中得到的DNA片段DGDRR-Bchain(desThr)各适量混合，使用 DNA连接试剂盒(宝酒造公司制备)，在16'C下反应30分钟获得的产 物。
.使用反向引物5'-CTTGGGTGTGTAGAAGAA-3， (SEQ ID N0.42)。
与2(1)同样，确认形成了适当的融合DNA
(4) WPsp-MWPmp7-DGDRR-Bchain(desThr)融合DNA的获得
除以下几点之外，均按照与l(l)同样的顺序获得平端的融合 DNA—MWPsp-MWPmp7-DGDRR-Bchain(desThr)。
'模板DNA使用将1(3)中得到的DNA片段MWPsp-MWPmp7与 1(7)中得到的DNA片段DGDRR-Bchain(desThr)各适量混合，使用 DNA连接试剂盒(宝酒造公司制备)，在16。C下反应30分钟获得的产 物。
.使用反向引物5，-CTTGGGTGTGTAGAAGAA-3， (SEQ ID NO,42)。
与2(1)同样，确认形成了适当的融合DNA
(5) MWPsp-MWPmpl2-DGDRR-Bchain(desThr)融合DNA的获得除以下几点之外，均按照与l(l)同样的顺序获得平端的融合
DNA—MWPsp-MWPmpl2-DGDRR-Bchain(desThr)。
'模板DNA使用将1(4)中得到的DNA片段MWPsp-MWPmp12与 1(7)中得到的DNA片段DGDRR-Bchain(desThr)各适量混合，使用 DNA连接试剂盒(宝酒造公司制备)，在16。C下反应30分钟获得的产 物。
'使用反向引物5'-CTTGGGTGTGTAGAAGAA-3， (SEQ ID N0.42)。
与2(l)同才"f，确认形成了适当的融合DNA
除以下几点之外，均按照与l(l)同样的顺序获得平端的融合 DNA—MWPsp-MWPmp6誦LNSAR-Behain(desThr)。
.模板DNA使用将1(2)中得到的DNA片段MWPsp-MWPmp6与 I(IO)中得到的DNA片段LNSAR-Bchain(desThr)各适量混合，使用 DNA连接试剂盒(宝酒造公司制备)，在16。C下反应30分钟获得的产 物。
'使用反向引物5'-CTTGGGTGTGTAGAAGAA-3， (SEQ ID N0.42)。
与2(1)同样，确认形成了适当的融合DNA (7) MWPsp-MWPmp6-GSPR-Bchain(desThr)融合DNA的获得
除以下几点之外，均按照与l(l)同样的顺序获得平端的融合 DNA—MWPsp-MWPmp6-GSPR-Bchain(desThr)。
.模板DNA使用将1(2)中得到的DNA片段MWPsp-MWPmp6与 l(ll)中得到的DNA片段GSPR-Bchain(desThr)各适量混合，使用DNA 连接试剂盒(宝酒造公司制备)，在16。C下反应30分钟获得的产物。
'使用反向引物5'-CTTGGGTGTGTAGAAGAA-3， (SEQ ID N0.42)。
与2(1)同样，确认形成了适当的融合DNA
24(8) MWPsp-MWPmp7-DLDRR-Bchain(desThr)融合DNA的获得
除以下几点之外，均按照与l(l)同样的顺序获得平端的融合 DNA~~MWPsp-MWPmp7-DLDRR-Bchain(desThr)。
'模板DNA使用将1(3)中得到的DNA片段MWPsp-MWPmp7与 1(8)中得到的DNA片段DLDRR-Bchain(desThr)各适量混合，使用 DNA连接试剂盒(宝酒造公司制备)，在16。C下反应30分钟获得的产 物。
-使用反向引物5，-CTTGGGTGTGTAGAAGAA-3， (SEQ ID N0.42)。
与2(1)同样，确认形成了适当的融合DNA
(9) MWPsp-MWPmp7-DNDRR-Bchain(desThr)融合DNA的获得
除以下几点之外，均按照与l(l)同样的顺序获得平端的融合 DNA—MWPsp-MWPmp7-DNDRR-Bchain(desThr)。
'模板DNA使用将1(3)中得到的DNA片段MWPsp-MWPmp7与 1(9)中得到的DNA片段DNDRR-Bchaift(desThr)各适量混合，使用 DNA连接试剂盒(宝酒造公司制备)，在16。C下反应30分钟获得的产 物。
.使用反向引物5'-CTTGGGTGTGTAGAAGAA-3， (SEQ ID N0.42)。
与2(1)同样，确认形成了适当的融合DNA
3. MWPsp-MWPmp5、 6、 7或12与各种Bchain的DNA片段、各种
Achain的DNA片段之间的融合DNA (MINIPINS)的获得
(1) MWPsp-MWPmp7-DGDR-Bchain-RDGDR-Achain融合DNA的获
《曰
付
除以下几点之外，均按照与l(l)同样的顺序获得平端的融合 DNA""MWPsp-MWPmp7-DGDR画Bchain-RDGDR画Achain。
.模板DNA使用将2(1)中得到的DNA片段MWPsp-MWPmp7-DGDR-Bchain-R与1 (13)中得到的DNA片段DGDR-Achain 各适量混合，使用DNA连接试剂盒(宝酒造公司制备)，在16。C下反 应30分钟获得的产物。
与2(1)同样，确认形成了适当的融合DNA。
(2) MWPsp-M曹mp5-DGDRR-Bchain(desThr)-Achain融合DNA的获 得
除以下几点之外，均按照与l(l)同样的顺序获得平端的融合 DNA—MWPsp-MWPmp5-DGDRR画Bchain(desThr)-Achain。
.模板DNA使用将2(2)中得到的DNA片段MWPsp-MWPmp5-DGDRR-Bchain(desThr)与1(12)中得到的DNA片段Achain 各适量混合，使用DNA连接试剂盒(宝酒造公司制备)，在16。C下反 应30分钟获得的产物。
与2(1)同样，确认形成了适当的融合DNA。
(3) MWPsp-MWPmp6-DGDRR-Bchain(desThr)-Achain融合DNA的获
得
除以下几点之外，均按照与l(l)同样的顺序获得平端的融合 DNA—M，sp-M曹mp6-DGDRR-Bchain(desThr)-Achain。
.模板DNA使用将2(3)中得到的DNA片段MWPsp-MWPmp6-DGDRR-Bchain(desThr)与1(12)中得到的DNA片段Achain 各适量混合，使用DNA连接试剂盒(宝酒造公司制备)，在16t)下反 应30分钟获得的产物。
与2(1)同样，确认形成了适当的融合DNA。
(4) MWPsp-MWPmp7-DGDRR-Bchain(desThr)-Achain
除以下几点之外，均按照与l(l)同样的顺序获得平端的融合 DNA—M，sp-MWPmp7-DGDRR-Bchain(desThr)-Achain。
模板DNA使用将2(4)中得到的DNA片段MWPsp-MWPmp7-DGDRR-Bchain(desThr)与1(12)中得到的DNA片段Achain 各适量混合，使用DNA连接试剂盒(宝酒造公司制备)，在16""C下反与2(1)同样，确认形成了适当的融合DNA。
(5) MWPsp-MWPmpl2國DGDRR-Bchain(desThr)-Achain融合DNA的获
《曰
付
除以下几点之外，均按照与l(l)同样的顺序获得平端的融合 DNA—MWPsp-M曹mp 12-DGDRR-Bchain(desThr)-Achain。
模板DNA使用将2(5)中得到的DNA片段MWPsp-MWPmp 12-DGDRR-Bchain(desThr)与1 (12)中得到的DNA片段Achain 各适量混合，使用DNA连接试剂盒(宝酒造公司制备)，在16-C下反 应30分钟获得的产物。
与2(1)同样，确认形成了适当的融合DNA。
(6) MWPsp-MWPmp6-LNSAR-Bchain(desThr)-Achain融合DNA的获 得
除以下几点之外，均按照与l(l)同样的顺序获得平端的融合 DNA~~]Vn^Psp-MWPmp6-LNSAR-Bchain(desThr)-Achain。
.模板DNA使用将2(6)中得到的DNA片段MWPsp-MWPmp6-LNSAR-Bchain(desThr)与1(12)中得到的DNA片段Achain 各适量混合，使用DNA连接试剂盒(宝酒造公司制备)，在16'C下反 应30分钟获得的产物。
与2(1)同样，确认形成了适当的融合DNA。
(7) MWPsp-MWPmp6-GSPR-Bchain(desThr)-Achain融合DNA的获得
除以下几点之外，均按照与l(l)同样的顺序获得平端的融合 DNA—MWPsp-MWPmp6-GSPR-Bchain(desThr)画Achain。
.模板DNA使用将2(7)中得到的DNA片段MWPsp-MWPmp6-GSPR-Bchain(desThr)与1(12)中得到的DNA片#殳Achain各 适量混合，使用DNA连接试剂盒(宝酒造公司制备)，在16。C下反应 30分钟获得的产物。
与2(1)同样，确认形成了适当的融合DNA。(8) MWPsp-MWPmp7-DLDRR-Bchain(desThr)-Achain融合DNA的获
得
除以下几点之外，均按照与l(l)同样的顺序获得平端的融合 DNA~~MWPsp-MWPmp7-DLDRR-Bchain(desThr)-Achain。
模板DNA使用将2(8)中得到的DNA片段MWPsp-MWPmp7-DLDRR-Bchain(desThr)与1(12)中得到的DNA片段Achain 各适量混合，使用DNA连接试剂盒(宝酒造公司制备)，在16。C下反 应30分钟获得的产物。
与2(1)同样，确认形成了适当的融合DNA。
(9) MWPsp-MWPmp7-DNDRR-Bchain(desThr)-Achain融合DNA的获
《曰
付
除以下几点之外，均按照与l(l)同样的顺序获得平端的融合 DNA—MWPsp-MWPmp7-DNDRR-Bchain(desThr)-Achain。
.模板DNA使用将2(9)中得到的DNA片段MWPsp國 MWPmp7-DNDRR-Bchain(desThr)与1(12)中得到的DNA片段Achain 各适量混合，使用DNA连接试剂盒(宝酒造公司制备)，在16。C下反 应30分钟获得的产物。
与2(1)同样，确认形成了适当的融合DNA。各融合体的氨基酸序 列和DNA核苷酸序列如图1 ~ 18所示。
4.上述3的融合DNA与MWPsp* - hPDI*的融合DNA的获得
除以下几点之外，均按照与l(l)同样的顺序获得重組了下述融合 DNA的载体。
.模板DNA使用将3(1) ~ (9)中得到的各DNA片段和与专利文献 18中记载的同样的DNA片断MWPsp* - hPDP各适量混合，使用DNA 连接试剂盒(宝酒造公司制备)，在16r下反应30分钟获得的产物。
'使用反向引物5，-TTACAGTTCATCTTTCACAGCTTTCTG-3， (SEQ ID NO.50)。'PCR的反应条件是，变性94°C l分钟，退火55°C 1分钟， DNA链延伸72°C 2分30秒，以此作为1个循环，共进行25个循环。
与2(1)同样，确认形成了适当的融合DNA。
这样，得到了重组有各种融合DNA的pMINIPINS~hPDI*。这 些载体中除上述3所得的融合DNA (MINIPINS)之外，还担载编码PDI 的DNA。上述DNA片段MWPsp* - hPD"的MWPsp的5'—侧附加 有SD (Shine-Dalgarno)序列(核糖体结合位点)。从这些载体 pMINIPINS ~ hPDI*中切取分别编码MINIPINS和PDI的DNA的融合 物，将其重组到适当的表达载体中，再用该表达载体转化宿主细胞。 可以预想，导入了这些表达载体的宿主细胞中，插入到该表达载体中 的一个启动子的下游的目标融合蛋白与PDI的融合DNA以一个 mRNA的形式转录。接着，通过分别存在于融合蛋白和PDI的各基因 5，一侧的SD序列的功能，分别翻译成两种基因，结果，在该宿主中 发生目标融合蛋白与PDI的共表达。
以下例举所得融合DNA (MINIPINS)所编码的融合蛋白的结构。
001: M曹sp-M，mp5-AspGlyAspArgArg-Bchain(desThr)-Achain (SEQ ID NO. 19)
002: MWPsp-MWPmp6-AspGlyAspArgArg-Bchain(desThr)-Achain (SEQ ID NO.20)
003: MWPsp-M曹mp6-LeuAsnSerAlaArg-Bchain(desThr)-Achain (SEQ ID N0.21)
004 : M，sp-MWPmp6画GlySerProArg-Bchain(desThr)-Achain (SEQ ID N0.22)
005: MWPsp-MWPmp7-AspGlyAspArgArg國Bchain(desThr)-Achain (SEQ ID NO.23)
006: MWPsp-MWPmp7-AspLeuAspArgArg-Bchain(desThr)-Achain (SEQ ID NO.24)
007: M曹sp-M，mp7-AspAsnAspArgArg画Bchain(desThr)-Achain (SEQ ID NO.25)008 : MWPsp-M曹mpl2-AspGlyAspArgArg-Bchain(desThr)画 Achain (SEQ IDNO.26)
009 : MWPsp画MWPmp7-AspGlyAspArg匿Bchain-ArgAspGlyAsp Arg-Achain (SEQ ID N0.27)。
在以下的实施例II中，除了 No.001 ~009之外，对于具有其它结 构的各种融合蛋白作为比较例也进行了表达实验。编码这些其它融合 蛋白的融合DNA按照与上述同样的方法制备。这些其它融合蛋白的 例子有以下
000: M曹mp9-GlySerLeuGlnProArg-Bchain-ArgGlyHisArgPro-C 肽-ProArg-Achain;
010: MWPsp-MWPmp6-GluLeuLeuArg-Bchain(desThr)-Achain;
011 : MWPsp-MWPmp7-AspGlyAspArgArg-Bchain-ArgAspGly AspArg-Achain
012: MWPsp-MWPmpO-Bchain(desThr)-Achain。
实施例II
融合DNA的表达分泌
1.融合蛋白的表达量的测定
进行由实施例I所得的融合DNA编码的融合蛋白的表达。将融 合DNA重组到表达载体中的方式如图19所示。
即，将重组了上述融合DNA的载体pMINIPINS hPDP用限制 酶ApaLI和HindIII处理，进行0.8%琼脂糖电泳，接着，将含有各融 合DNA的DNA片段从凝胶中切取出来。将切取的融合DNA和用 ApaLI和Hindlll消化的短短芽孢杆菌用表达载体pNU211R2L5(日本 特开平7-170984号公报)各适量混合，使用DNA连接试剂盒(宝酒造 公司制备)，在16。C下反应30分钟，由此将融合DNA重组到表达载 体中。如上所述，获得了分别重组了融合DNA的表达载体、 pNU-MINIPINS~hPDI*。 4安照^^知的方法(Methods in Enzymol.， 217: 23 -33， 1993),用这些表达载体转化短短芽孢杆菌的47-5林(FERMBP-1664),在T2琼脂培养基[l。/。聚胨、0.5%肉膏、0.2°/。酵母提取物、 0.1 mg/mL尿嘧啶、1%葡萄糖、10;t/g/mL红霉素、1.5%琼脂、pH7] 上进行平板培养，获得转化体。
将转化体在T2培养基(组成除不含琼脂之外与T2琼脂培养基相 同)上、在37。C下培养一天，然后用公知的方法(Molecular Cloning第 2版，A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989))纯4匕 质粒DNA。将该质粒DNA用ApaLI和Hindlll消化，确认有目标融 合DNA重组。对于确认有融合DNA重组的转化体，尝试由重组的融 合DNA所编码的融合蛋白的表达分泌。即，将50^L在T2培养基中、 在37。C下培养一天的菌悬浮液添加到50 mL的M-5YC培养基[2.050/0 聚胨、0.27。/。酵母提取物、3。/。葡萄糖、0.009% MgS04'7H20、 0.0009% MnS04.4H20、 27 〃g/mL尿嘧啶、10 〃g/mL红霉素，pH8]中，用500 mL 三角烧瓶、在30。C下振荡培养4天。
培养后，将1 mL培养基加入到1.5 mL的微管中，以15,000 rpm 离心20分钟。在194pL所得培养上清中加入6^L的6N盐酸，用膜 滤器(Millipore,孔径0.22/mi，产品编号SLGVR04NL)过滤。将100 滤液供给采用HPLC柱(Waters， Symmetry300TMC185〃m， 4.6x250 mm) 的HPLC (Waters LC-Module 1),由此求出融合蛋白的表达量。洗脱以 及检测条件如下。
A液0.1。/。TFA水溶液
B液含有0.1。/。TFA的乙腈
时间(分钟)流量%A%B
起始0.87228
5.000.87228
30.000.86436
32.000.86436
33.000.81090
TEMP: 35。C SPRG: 30mL/分钟波长220 nm
将胰岛素原(Sigma，产品编号P-4672)溶解于0.001 N的盐酸中， 将lmg/mL所得溶液在相同条件下应用于HPLC，制备校正曲线，根 据该校正曲线求出融合蛋白的相对量。
图20表示各融合蛋白的相对表达量。与含有在WO01/068884中 公开的突变型胰岛素原序列的融合蛋白、 MWPmp9画GlySerLeuGlnProArg-Bchain画ArgGlyHisArgPro曙C 肽 -ProArg-Achain (No.000)的表达量(102.8mg/L)相比，具有上述001-009结构的含胰岛素序列的各种融合蛋白的表达量高1.5 ~ 3倍，另夕卜， 与具有其它结构的融合蛋白(No.010-012)相比显著高。
实施例III 变换为胰岛素
(1) 融合蛋白、MWPmp6-AspGlyAspArgArg-Bchain(desThr)-Achain的
分离纯化
将用pMINIPINS转化的细菌在37。C下培养1天，将1.1 mL该细 菌悬浮液添加到1.1 L的培养基(3。/。聚胨、0.4%酵母提取物、3%葡萄 糖、0.01% MgS04.7H20、 0.001% MnS04.4H20、 10pg/mL红霉素，pH8) 中，在小型发酵罐中、在30。C下以200 rpm、 1.1 vvm通气下培养4 天。将培养基用9,500 rpm离心20分钟，用HC1将所得上清的pH调 节为3，在4。C下静置1小时。再以9,500 rpm离心20分钟，将所得 上清应用于用50 mM乙酸平衡的阳离子交换树脂中，用50 mM乙酸 钠(pH5.5)洗脱融合蛋白。洗脱后，用NaOH将pH调节至7.5。然后 将洗脱液用20mMTris-HCl(pH8)进行緩冲液交换，同时浓缩。
(2) 由融合蛋白转换为胰岛素
在含有胰蛋白酶的50 mM Tris-HCl (pH8)中，将浓缩的融合蛋白 在12。C下处理过夜，由此转化为des-Thr胰岛素(IOO mg融合蛋白， 2.4 mg TPCK胰蛋白酶/440 mL溶液)。添加10%TFA,中止反应，应用于用18%乙腈/0.05%曱酸平衡的树脂(MCI GEL CHP2MGY, Mitsubishi Chemicals Japan)中，用27%乙腈/0.05%甲酸洗脱des-Thr胰 岛素，然后用旋转蒸发仪干燥固化。
接着，在反应液中(10 mM des-Thr胰岛素、0.8 M Thr-OBut-HCl 、 50。/oDMF/乙醇〈l:l〉、 20 /^M月夷蛋白酶、用氨水调节为pH6.1),对 des-Thr胰岛素在15。C下处理8小时，在des-Thr胰岛素上附加Thr， 制成胰岛素酯。用TFA中止反应，应用于用22.5°/。乙腈/0.05%曱酸平 衡的树脂中(MCI GEL CHP55Y， Mitsubishi Chemicals Japan),用29.3 %乙腈/0.05%甲酸洗脱胰岛素酯。
最后，将洗脱的胰岛素酯干燥固化，用茴香醚/TFA〈l:9〉进行处 理，获得胰岛素。
(3) des-Thr胰岛素的肽图谱
将市售的胰岛素(Intergen)用羧基肽酶A处理(25。C, 1小时，0.2 N NH4HC03， pH8.4，羧基肽酶A<0.3 U/mg胰岛素〉)，得到des-Thr胰 岛素(以下标记为STD des-Thr胰岛素)。将上述(2)所得的各5 nmole des-Thr胰岛素(以下称为ITOHAM des-Thr胰岛素)和STD des-Thr胰 岛素溶解于50//L0.1 M碳酸氢铵、2mMEDTA溶液(pH7.8)中，加入 1.35mLV8蛋白酶(和光纯药公司制备，2^g/mL)水溶液，在25。C下反 应24小时。接着加入1。/。TFA，制成pH2，由此中止反应。接着，将 反应液应用于Vydac218TP54 (4.6x250 mm, <:18柱)中，用5%乙腈、 0.1%TFA溶液平衡，然后通过最高至35%乙腈、0.1%TFA溶液的梯 度洗脱，洗脱图谱如图21所示。ITOHAM des-Thr胰岛素与STD des-Thr胰岛素显示同样的图谱。由此得出两者的des-Thr胰岛素的二 硫键方式同等的结论。
(4) 胰岛素的HPLC洗脱图谱
将上述(3)所得的胰岛素(以下标记为ITOHAM胰岛素)与市售的 胰岛素(Intergen,以下标记为STD胰岛素)应用于YMC的C4柱 (4.6x250 mm)，用25 ~ 35。/o乙腈/0.1。/。TFA洗脱。如图22所示，两者均有相同的洗脱图谱。
即显示，由在短短芽孢杆菌的表达体系中可见高表达的融合蛋白
之一可以由MWPmp6-AspGlyAspArgArg-Bchain(desThr)-Achain形成 具有适当的二硫键的胰岛素。
产业实用性
根据本发明，可以以工业化可接受的效率获得可在糖尿病等疾病 的治疗中使用的功能性胰岛素的方法。
序列表自由文本
SEQIDN0.1~7:接头 SEQIDN0.8、 9:胰岛素前体 SEQIDNO.10 27:融合蛋白 SEQIDNO.28-30:前导肽 SEQIDN0.31—50:引物 SEQIDN0.51、 52:接头
权利要求
1.DNA，该DNA编码融合蛋白，该融合蛋白是来自芽孢杆菌属(Bacillus)或短芽孢杆菌属(Brevibacillus)细菌的胞壁蛋白CWP之一的MWP的信号肽；含有来自芽孢杆菌属或短芽孢杆菌属细菌的CWP的5～7或12个氨基酸的前导肽；具有以下通式(Asp、Leu或Gly)(Gly、Asn、Ser或Leu)(Asp、Ser或Pro)(Arg或Ala或无)Arg(SEQ ID NO.51或52)所示的氨基酸序列的连接肽；以及胰岛素前体的氨基酸序列按该顺序连接而成。
2. 权利要求1所述的DNA，其中上述连接肽具有SEQ ID NO. 1 ~ 6中任一项表示的氨基酸序列。
3. 权利要求1或2所述的DNA，其中上述前导肽来自MWP。
4. 权利要求1-3中任一项所述的DNA,其中上述胰岛素前体具 有SEQ ID NO.8或9表示的氨基酸序列。
5. 权利要求1 ~4中任一项所述的DNA，其中上述融合蛋白具有 SEQ ID NO. 10- 18中任一项表示的氨基酸序列。
6. 权利要求1~5中任一项所述的DNA，其中该DNA具有SEQ IDNO.19-27中任一项表示的冲亥苷酸序列。
7. 载体，该载体含有权利要求1 ~ 6中任一项所述的DNA。
8. 权利要求7所述的载体，其中上述DNA与来自细菌的启动子 序列的下游功能性连接。
9. 权利要求8所述的载体，其中上述启动子来自芽孢杆菌属或 短芽孢杆菌属细菌。
10. 权利要求7~9中任一项所述的载体，该载体进一步含有编 码蛋白质二硫键异构酶简称为PDI的DNA。
11. 宿主细胞，该宿主细胞含有权利要求7~10中任一项所述的 载体。
12. 权利要求11所述的宿主细胞，其中上述宿主细胞是芽孢杆菌属或短芽孢杆菌属细菌。
13. 权利要求12所述的宿主细胞，其中上述细菌是短短芽孢杆
14. 胰岛素的制备方法，该制备方法包含以下步骤培养权利要 求11~13中任一项所述的宿主细胞的步骤；由宿主细胞表达所需融 合蛋白的步骤；将表达的多肽从细胞或培养基中回收的步骤。
15. 权利要求14所述的方法，该方法进一步包含将回收的多肽 进行酶解处理的步骤。
16. 权利要求15所述的方法，其中上述酶解处理是通过胰蛋白 酶进^f于的处理。
17. 权利要求14-16中4t一项所述的方法，该方法是从培养基 中回收上述多肽。
18. 融合蛋白，该融合蛋白具有SEQ ID NO.10-18中任一项表 示的氨基酸序列。
全文摘要
本发明涉及编码含有用于制备基因重组胰岛素的高表达分泌胰岛素前体的融合蛋白的DNA、以及使用该DNA制备胰岛素的方法。
文档编号C12P21/02GK101605889SQ20088000014
公开日2009年12月16日 申请日期2008年2月12日 优先权日2008年2月12日
发明者佐藤静治, 工藤季之, 近藤雅昭, 远藤广介 申请人:伊藤火腿株式会社;鹈高重三