专利名称：：一种α-葡萄糖苷酶基因的克隆与表达的利记博彩app
技术领域：
：一种a-葡萄糖苷酶(简称AGLU酶)基因的克隆与表达，本发明属于酶基因工程和酶工程领域。具体地说涉及一种编码黑曲霉(^^^^7/wm'gw)WX-07AGLU酶的DNA序列及其表达。
背景技术：
：a-葡萄糖苷酶(a-glucosidase，简称AGLU酶，EC3.2.1.20)，又名oc-D-葡萄糖苷水解酶，它可以从低聚糖的非还原末端切割a-l，4糖苷键，释放出葡萄糖，并将游离的葡萄糖基以a-l，6糖苷键形式转移到其他糖底物上，形成具有非发酵性的功能性低聚糖——低聚异麦芽糖(简称IMOs，主要包括异麦芽糖，潘糖，异麦芽三糖等)。低聚异麦芽糖是一类含有至少一个a-(1，6)糖苷键的低聚糖，主要是异麦芽糖，潘糖，异麦芽三糖，天然少量存在于酱油，蜂蜜中，它己经慢慢被用来替代传统的蔗糖作为食品添加剂。它被摄入人体后不会被消化道吸收，也不能被有害菌利用，但可以被肠道的益生菌如双歧杆菌作为碳源利用，故其具有良好的双歧因子作用，可以改善人体肠道的功能。此外，由于低聚异麦芽糖的甜度只有普通糖的一半，可以有效防止儿童龋齿，适宜糖尿病人食用，可以作为饮料糖果和保健品的添加剂。在饲料工业中，低聚异麦芽糖被认为可以在提高家禽存活率的同时，又不会存在合成词料带来对人体的副作用，据报道，日本50%左右的饲料中都含有低聚异麦芽糖。目前，低聚异麦芽糖已经在食品、医药和词料加工行业有了很广泛的应用。生产AGLU酶的微生物种类有细菌、曲霉、古细菌等。现在工业上生产环糊精所使用的AGLU酶主要来自黑曲霉。目前，黑曲霉的AGLU酶的编码基因(ag/"基因)得到了克隆，但是成功的都是采用曲霉属作为宿主。由于能分泌AGLU酶的野生菌株的生产能力普遍较低，为了克服野生菌株的低生产能力，国内外研究者通过构建基因工程菌生产重组AGLU酶。在国内，对a-葡萄糖苷酶的研究还主要在a-葡萄糖苷酶的生产菌种选育和酶学性质方面，虽然有通过RT-PCR方法扩增得到A"/^ra-葡萄糖苷酶cDNA，构建重组质粒并尝试在大肠杆菌中表达，但酶表达量偏低，而且重组蛋白是胞内酶，分离纯化的成本相对高。迄今为止，国内生产低聚异麦芽糖用(x-葡萄糖苷酶主要依赖日本进口，为了降低低聚异麦芽糖的商业成本，首先必须降低a-葡萄糖苷酶的生产成本。^^7^gz7/w是最常用的a-葡萄糖苷酶的生产菌株，但同样存在生产能力较低的缺陷。在国内的报道中，重组a-葡萄糖苷酶在大肠杆菌中一般定位于胞内形成包涵体或存在于周质中，不利于重组a-葡萄糖苷酶的回收与使用。因此，构建重组菌大规模生产胞外a-葡萄糖苷酶，对降低a-葡萄糖苷酶的生产成本显得非常重要。
发明内容本发明的一个目的是提供一种a-葡萄糖苷酶，其具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。本发明的另一个目的是提供一种编码该a-葡萄糖苷酶的DNA分子，所述的DNA分子具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。本发明的再一个目的是提供包含本发明基因的表达宿主细胞。本发明的技术方案一种a-葡萄糖苷酶，縮写为AGLU酶，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。所述的(x-葡萄糖苷酶的基因，縮写为基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示。所述的ag/w基因的表达方法由黑曲霉0^/^^'〃^w'ger)WX-07总DNA获得ag/w的cDNASEQIDNO:l，ag/w基因以质粒pPIC9K为表达载体，以毕赤酵母KM71为表达宿主，实现ag/w基因的可溶性表达；(1)黑曲霉G^;erg/〃^WX-07总DNA的提取黑曲霉WX-07菌株在YPD液体培养基中培养2天，菌丝体过滤，再用无菌水冲洗三次，用无菌滤纸吸干水分，将菌丝体转入研钵内，加液氮研磨得菌粉，将菌粉放入事先称重的50mL离心管中，称量lg菌粉，将由8.1816gNaCl、2g十二垸基磺酸钠、lOmL500mmoL/LEDTA、5mLlmol/LTris-HCl缓冲液加水定容到lOOmL组成的抽提缓冲液在65"C水浴中预热，按3mL/g菌粉加入抽提缓冲液，用封口膜封住，65"放置lh，得菌液；吸取1.5mL菌液于灭菌的1.5mL离心管中，平行2管，10000r/min离心5min，吸上清0.75mL至新的1.5mL离心管中，加入0.75mL由50mL10%CTAB、5.844gNaCl、10mL500mmol/LEDTA、25mLlmol/LTris-HCl定容到lOOmL的5xCTAB溶液，然后再每管分成两管，每管取0.6mL，分别加入0.6mL的酚/氯仿/异戊醇体积比25:24:1混合溶液，混匀，10000r/min离心10min;上清液吸入另一批新的离心管中，弃下层油相及中层蛋白；在这批离心管中分别加入等体积，0.4mL氯仿/异戊醇体积比24:l混合溶液，颠倒混匀，10000r/min离心10min，吸取上清，重复以上步骤，直至无蛋白；加入等体积0.3mL异丙醇至上清液中，充分混匀，-20"C过夜，第二天，10000r/min，弃上清；用现配的70%的乙醇洗沉淀2次，倒掉乙醇，用无水乙醇洗沉淀l次，倒掉乙醇，室温干燥20-30min;加50pL无菌水溶解沉淀，-20°<3冻存；(2)a-葡萄糖苷酶编码基因的克隆以黑曲霉WX-07总DNA为模版，由于ag/w基因是有四个外显子和三个内含子，所以通过PCR和over-lapPCR扩增出ag/w基因，以下列八个核苷酸序列作为引物，下划线为酶切位点Mn:弓I物1:5，-ATTAATGCGGCCGCGTCCACCACTGCCCCTTCG-3'引物2:5，-CCGTAGAGGTTTTGGTCAATAGGTGTTC-3'弓(物3:5，-ACCTATTGACCAAAACCTCTACGGCCA画3'引物4:5，-TCAATATCGGTCCAGATATATTCCAAC画3'引物5:5，-GAATATATCTGGACCGATATTGACTACATGCACG-3'引物6:5，-CGTAGCGTAGGCATCAGAGGCATTTTC画3'弓I物7:5，-GCCTCTGATGCCTACGCTACGTATGACA-3'引物8:5，-AGCACTAGCGGCCGCCCATTCCAATACCCAGTTTTCC-3，第一轮PCR:以黑曲霉WX-07总DNA为模板，分别以P1、P2;P3、P4;P5、P6;P7、P8为上下游引物，扩增出exonl，exon2，exon3，exon4;PCR反应在50|aL体系中进行5xPCR缓冲液10|iL，2.5mmol/LdNTPs4^iL，10pmol/L上下游引物各1pL，模板DNAliaL，Taq酶0.5^L，加双蒸水至总体系50|iL;PCR反应条件为在94。C变性4min后开始循环，然后94'C变性lmin，55。C退火lmin，72。C分别延伸1min、1min、1min禾n3min，共35个循环后，再于72'C延伸10min，扩增得到PCR片段，分别割胶回收，回收片断与pMD18-Tsimple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109,转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37。C培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，810h后提取质粒，将此质粒进行序列测定；第二轮PCR:以exon2和exon3为模板，以P3、P6为上下游引物，扩增得到exon2-3;PCR反应在50|iL体系中进行5xPCR缓冲液10(iL，2.5mmol/LdNTPs4^L,10,ol/L上下游引物各1(iL，exon2和exon3各1pL，Taq酶0.5nL，加双蒸水至总体系50^L;PCR反应条件为在94。C变性4min后开始循环，然后94。C变性lmin，55。C退火lmin，72。C延伸1min，共35个循环后，再于72。C延伸10min，扩增得到PCR片段，分别割胶回收，回收片断与pMD18-Tsimple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37'C培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，810h后提取质粒，将此质粒进行序列测定；第三轮PCR:以exon2-3和exon4为模板，以P3、P8为上下游引物，扩增得到exon2-3-4;PCR反应在50jiL体系中进行5xPCR缓冲液10^L，2.5mmol/LdNTPs4^L，10pmol/L上下游引物各1pL，exon2-3和exon4各1|止，Taq酶0.5|止，加双蒸水至总体系50(lL;PCR反应条件为在94"变性4min后开始循环，然后94。C变性lmin，55。C退火lmin，72。C延伸3min，共35个循环后，再于72。C延伸10min，扩增得到PCR片段，分别割胶回收，回收片断与pMD18-Tsimple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37。C培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，810h后提取质粒，将此质粒进行序列测定；第四轮PCR:以exon1和exon2-3-4为模板，以P1、P8为上下游引物，扩增得到exon1-2-3-4;PCR反应在50|aL体系中进行5xPCR缓冲液10jxL，2.5mmol/LdNTPs4^L，10pmol/L上下游引物各1pL，exon1和exon2-3-4各1(iL，Taq酶0.5(iL，加双蒸水至总体系50^L;PCR反应条件为在94"C变性4min后开始循环，然后94'C变性lmin，55。C退火lmin，72。C延伸4min，共35个循环后，再于72。C延伸10min，扩增得到全基因exon1-2-3-4片段2880bp，割胶回收，回收片断与pMD18-Tsimple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37。C培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，810h后提取质粒，命名为ag/w/pMD18-Tsimple,将此质粒进行序列测定；(3)ag/w基因在表达载体上的构建用于构建表达载体的质粒是pPIC9K，带有ff-F"ctor信号肽，将pPIC9K质粒和扩增的ag^基因进行iVofl酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶16匸连接过夜，连接产物转化Eco//JM109感受态细胞，经37。C培养过夜，挑选转化子于含100mg/L氨苄青霉素的LB平板进行液体培养，然后抽提质粒，得到富集的ag/w/pPIC9K质粒；(4)毕赤酵母菌KM71转化和筛选重组菌将表达载体ag/w/pPIC9K17|aL，10xHbuffer2，BglIIl(iL，37。C酶切1.5h后回收含有目的基因的条带，溶于20无菌水中，得到线性化的DNA;在80iiL毕赤酵母KM71感受态细胞中加入2pL线性化的DNA，混匀，转入1mm预冷的电转杯中，将电转化仪调至毕赤酵母档，电激，转化物中加入1mLlmol/L的山梨醇，30°C温育lh，取200pL的山梨醇重悬液涂布MD平板，30。C培养72小时；挑取回复突变菌株接种于YPD/G418平板上，3(TC培养48h至长出单菌落，为获得多拷贝的ag/"基因的菌株，G418浓度筛选梯度依次为0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL;pPIC9K空质粒同上处理，所得转化菌作为阴性对照；(5)重组毕赤酵母KM71/pPIC9K-aglu的PCR鉴定选取含4mg/mLG418的YPD/G418上单菌落，以引物1，引物8作为引物，用前述的PCR方法，检验是否能够扩增得到全长exon1-2-3-4片段；重组毕赤酵母KM71/pPIC9K的PCR鉴定作为对照；鉴定后获得正确的重组毕赤酵母KM71/g/w/pPIC9K用于后续实验；(6)重组毕赤酵母的培养将鉴定正确的单菌落KM9K接种至10mLYPD培养基，30°C培养24h，lmL培养液接入50mLBMGY，30。C培养24h，至OD为4.0，离心收集菌体，用25mLBMMY培养基重悬培养，甲醇诱导表达，分别于24h、48h、72h禾n96h取样，每次取样200pL，离心收集上清，并补加250nL甲醇至终浓度1%;阴性对照重组毕赤酵母KM71/pPIC9K培养方法同上；(7)重组cx-葡萄糖苷酶的检测SDS-PAGE检测表达产物在98和33kDa有条带，收集毕赤酵母发酵培养的上清液，硫酸铵沉淀，透析，制成粗酶液，测定酶活方法如下用pH5的醋酸钠缓冲液配制10。/。的麦芽糖溶液10mL，50jiL粗制的浓縮酶液，60"C反应24h，然后煮沸2min，微孔过滤，HPLC检测产物，与市售的低聚异麦芽糖产品IMO-900比较各成分组成；液相检测显示有转糖苷产物异麦芽糖、潘糖生成。本发明的有益效果本发明提供了ag/w基因的高效表达方法。提取A"/gwWX-07总DNA，设计引物PCR和overlapPCR得到编码AGLU酶的基因，它具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，全长2S80bp个核苷酸，编码960个氨基酸。以质粒pPIC9K为表达载体整合到表达宿主毕赤酵母KM71，可实现ag/w基因的胞外表达，重组酶具有转糖苷活性。图1PCR和overlap-PCR的过程。图2重组AGLU酶SDS-PAGE图谱。具体实施例方式实施例1本实施例说明黑曲霉(A/e^〃wsWX-07总DNA的提取黑曲霉WX-07菌株在YPD液体培养基中培养2天，菌丝体过滤，再用无菌水冲洗三次，用无菌滤纸吸干水分，将菌丝体转入研钵内，加液氮研磨得菌粉，将菌粉放入事先称重的50mL离心管中，称量lg菌粉，将由8.1816gNaCl、2g十二烷基磺酸钠、10mL500mmoL/LEDTA、5mLlmol/LTris-HCl缓冲液加水定容到lOOmL组成的抽提缓冲液在65'C水浴中预热，按3mL/g菌粉加入抽提缓冲液，用封口膜封住，65'C放置lh，得菌液；吸取1.5mL菌液于灭菌的1.5mL离心管中，平行2管，10000r/min离心5min，吸上清0.75mL至新的1.5mL离心管中，加入0.75mL由50mL10%CTAB、5.844gNaCl、10mL500mmol/LEDTA、25mLlmol/LTris-HCl定容到100mL的5xCTAB溶液，然后再每管分成两管，每管取0.6mL，分别加入0.6mL的酚/氯仿/异戊醇体积比25:24:1混合溶液，混匀，10000r/min离心10min;上清液吸入另一批新的离心管中，弃下层油相及中层蛋白；在这批离心管中分别加入等体积，0.4mL氯仿/异戊醇体积比24:1混合溶液，颠倒混匀，10000r/min离心10min，吸取上清，重复以上步骤，直至无蛋白；加入等体积0.3mL异丙醇至上清液中，充分混匀，-2(TC过夜，第二天，10000r/min，弃上清；用现配的70%的乙醇洗沉淀2次，倒掉乙醇，用无水乙醇洗沉淀l次，倒掉乙醇，室温干燥20-30min;加50pL无菌水溶解沉淀，-20"冻存；实施例2本实施例说明AGLU酶编码基因的克隆程序。以黑曲霉WX-07总DNA为模版，由于基因是有四个外显子和三个内含子，所以通过PCR和over-lapPCR扩增出ag/w基因，以下列八个核苷酸序列作为引物，下划线为酶切位点A^I:引物1:5，-ATTAATGCGGCCGCGTCCACCACTGCCCCTTCG-3'引物2:5，-CCGTAGAGGTTTTGGTCAATAGGTGTTC-3'引物3:5，-ACCTATTGACCAAAACCTCTACGGCCA-3，引物4:5,-TCAATATCGGTCCAGATATATTCCAAC-3'引物5:5，-GAATATATCTGGACCGATATTGACTACATGCACG-3'引物6:5，-CGTAGCGTAGGCATCAGAGGCATTTTC画3'弓I物7:5，-GCCTCTGATGCCTACGCTACGTATGACA-3'引物8:5，-AGCACTAGCGGCCGCCCATTCCAATACCCAGTTTTCC-3'第一轮PCR:以黑曲霉WX-07总DNA为模板，分别以P1、P2;P3、P4;P5、P6;P7、P8为上下游引物，扩增出exonl，exon2，exon3，exon4;PCR反应在50pL体系中进行5xPCR缓冲液10|iL，2.5mmol/LdNTPs4^L，10|iimol/L上下游引物各1iliL，模板DNAljiL，Taq酶0.5jiL，加双蒸水至总体系50pL;PCR反应条件为在94i:变性4min后开始循环，然后94。C变性lmin，55。C退火lmin，72。C分别延伸1min、1min、1min和3min，共35个循环后，再于72。C延伸10min，扩增得到PCR片段，分别割胶回收，回收片断与pMD18-T5simple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37"C培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，810h后提取质粒，将此质粒进行序列测定；第二轮PCR:以exon2和exon3为模板，以P3、P6为上下游引物，扩增得到exon2-3;PCR反应在50jaL体系中进行5xPCR缓冲液102.5mmol/LdNTPs4l止，10jimol/L上下游引物各1^L，exon2和exon3各1pL，Taq酶0.5)iL，加双蒸水至总体系50|lL;PCR反应条件为在94"C变性4min后开始循环，然后94'C变性lmin，55。C退火lmin，72。C延伸1min，共35个循环后，再于72'C延伸10min，扩增得到PCR片段，分别割胶回收，回收片断与pMD18-Tsimple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37'C培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，810h后提取质粒，将此质粒进行序列测定；第三轮PCR:以exon2-3和exon4为模板，以P3、P8为上下游引物，扩增得到exon2-3-4;PCR反应在50|iL体系中进行5xPCR缓冲液10(iL，2.5mmol/LdNTPs4(iL，10pmol/L上下游引物各1(iL，exon2-3禾卩exon4各1(_iL，Taq酶0.5(iL，加双蒸水至总体系50^L;PCR反应条件为在94'C变性4min后开始循环，然后94。C变性lmin，55。C退火lmin，72"C延伸3min，共35个循环后，再于72。C延伸10min，扩增得到PCR片段，分别割胶回收，回收片断与pMD18-Tsimple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37'C培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，810h后提取质粒，将此质粒进行序列测定；第四轮PCR:以exonl和exon2-3-4为模板，以Pl、P8为上下游引物，扩增得到exon1-2-3-4;PCR反应在50(iL体系中进行5xPCR缓冲液10(xL，2.5mmol/LdNTPs4^L，10pmol/L上下游引物各1jiL，exon1和exon2-3-4各1pL，Taq酶0.5|uL，加双蒸水至总体系50^L;PCR反应条件为在94"C变性4min后开始循环，然后94'C变性lmin，55。C退火lmin，72。C延伸4min，共35个循环后，再于72。C延伸10min，扩增得到全基因exon1-2-3-4片段2880bp，割胶回收，回收片断与pMD18-Tsimple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37。C培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，810h后提取质粒，命名为ag/w/pMD18-Tsimple,将此质粒进行序列测定；将此质粒进行序列测定，结果表明插入片段含有一个长2880bp的开放阅读框(ORF)，编码一个由960个氨基酸编码的蛋白质。实施例3本实施例说明ag/"基因在表达载体上的构建程序。用于构建表达载体的质粒是pPIC9K，带有dactor信号肽，将pPIC9K质粒和扩增的"g/w基因进行A^I酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶16。C连接过夜，连接产物转化五.co//JM109感受态细胞，经37'C培养过夜，挑选转化子于含100mg/L氨苄青霉素的LB平板进行液体培养，然后抽提质粒，得到富集的ag/"/pPIC9K质粒；实施例4本实施例说明毕赤酵母宿主转化和筛选重组菌的程序。将表达载体ag/w/pPIC9K17pL，10xHbuffer2(iL，BglII1(iL，37。C酶切1.5h后回收含有目的基因的条带，溶于20pL无菌水中，得到线性化的DNA;在80pL毕赤酵母KM71感受态细胞中加入2|iL线性化的DNA，混匀，转入1mm预冷的电转杯中，将电转化仪调至毕赤酵母档，电激，转化物中加入1mLlmol/L的山梨醇，30°C温育lh，取200的山梨醇重悬液涂布MD平板，30。C培养72小时；挑取回复突变菌株接种于YPD/G418平板上，30。C培养48h至长出单菌落，为获得多拷贝的ag/"基因的菌株，G418浓度筛选梯度依次为0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL;pPIC9K空质粒同上处理，所得转化菌作为阴性对照；实施例5本实施例说明AGLU酶的转糖苷活性。将上述AGLU酶发酵液于4°C、10000rpm离心20min除菌体；上清液中加入70°/。固体硫酸铵盐析过夜，4。C、10000rpm离心20min，取沉淀物用适量pH5的醋酸缓冲液溶解，并在缓冲液中透析过夜，制成粗酶液。SDS-PAGE检验表达产物，结果如图2。用pH5的醋酸缓冲液配制10%的麦芽糖溶液，加入0.5%粗制的浓縮酶液，60。C下反应24h然后煮沸5min，微孔过滤，HPLC检测产物。高效液相色谱分析的条件示差折光检测器，色谱柱(I):钙型强碱性离子交换树脂SugarPakl1300mmX6.5mm;柱温85。C;池温(检测器)30。C;流动相水；流速0.5mL/min;进样量10(iL。色谱柱(II):HypersilNH2，250mmX4.6mm;柱温30°C;池温(检测器)30°C;流动相乙腈/水(75/25V/V);流速lmL/min;进样量10pL。表1重组AGLU酶的转糖苷反应产物<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>1、低聚异麦芽糖(IMO-900);2、重组酶的转糖苷产物；G，M，12，P，I3，I4分别代表葡萄糖、麦芽糖、异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖和四糖以上低聚异麦芽糖。序列表<210〉SEQIDNO:1<211>2880<212〉DNA<213〉黑曲霉(JweA^'〃^WX-07<400>1tccaccactggctgattgccC33ggC11C￡LcetggccatgtggattcggatttggtactttatCCC￡Lg￡LgCccgaaaggcttcaattcatcgcatatcacgtggaacacctctcgcaagstgatactcctcctt.ctactcaattaxcggcccbsctggtegatatstctggtegettttecctatgtatccctacgctacgcctctatattggcggttgactgtgtggtaccctgactctg6Ltatg3ttacgggagcttccgcgg已c已acgtga^cca^gEL已tggtgttgagCC33ggtctgcttcgctggcgtccatgtaxtggtgcggscgcaactgtccggagecttatccccttcgtca^catcgatg認agtgcagcaacgtataxgcgactgaatacttteggaaaggcctttttgaxaggcgacggaatttgtgacaattccgccattgaccaaagataggcagatatatctccceggtctC3a3ggccccgcccatgcagcaatgatctggegg已ccg已tattgtacagtgaggattgttgatgggsgccgtttttctgggctagacatgtctgaacccggcacccagaggcttagtcaggctgcccacgcctgggecatgatcg已gt已tgatgcttgsggtcttactccatct3CCtgtgggtgcattcttcccggtgggcttcgcagtttacatcctcaggcacaattcacggcaxagatgtttcagattctacctggtccctgtcatggtccgcttttcagccgcgctccctccagagaaaacctctacggatgggtcttatctctcatgga.attgatctgeggecgatgt￡lc￡mcactctaegttgttgctacatgeagcgatgaattcggcgctctag3gcggcgg3ggecaggataacgagcttgtaagtttcatcacccatcgtttcaatatcaccagcaaccgcgtgtccgcaatcagtgtccatgcacggtctggtctcataagggcaggecacgcgagccctttMCggaMcattctaccgctgttattgeicattcctgctteegcagstgteggtgegeaGOtgccgacgcgcagtcggtttgtcegggcta120tgggttcactgccagtcttcagetcgeggg180tgagtccttgacactgtctgtggagtacca240ccccactcatgttgactccacaaacgcttc300cagaxecaaggcttccctcaatgcatctgt360aaatgagccgtegttcaatttcaaggtgat420tacagaaggcactgtgctcgtatatgagaa480tgaagaatataacttgtatggccttgggga540tgctaatctgaccatatatcetteggatga600ccaacatcccttctatctggatacaagata660tattcccgtcaaaagcagcgaggctgatgc720cgtgtttctgaggaaxtctcatggacttga780gcggaccctsggtggaggaatcgatctcac840taccaggcaatatcttaccagcactgtggg900tggattccaccaatgtcgttggggctacaa960gaattttgagaagtttgagatcccgttgga1020eggatategeaactttgacaacgatcaaca1080tctcagcaagctaxatgagagtggacgcta1140cattcctaatcccgaaaatgcctctgatgc1200egaegtcttcctcaagaatcccgatggtag1260tacagtcttccccgattggcatcatcccaa1320tatctggtcgaagaaagtggcgttcgatgg1380cttctgtgtcgggagctgtggcacaggtaa1440tcttctccccggtgagcctggtgatatcat1500caaegctatagaggeggegtcagcttcggc1560gaccaccacgtegactteggtatcatatct1620tgttgagcacccaccctatgtgatcaacca1680tgcggtgtcgccgaatgcaacgcatgttga1740ctacggacatcaaggattgaacgctaccta1800gcggcggccatttattattggccgctcaac1860ctggggcggcgacaactattccaaatggtg1920ctccttctcaetttteggeattccgatgtt1980ctccgatgaggagetctgeaaccgatggat2040aaaccacaatgagctctccacaatcccaca2100agcaaccaagtccgccatgagaattcggta2160cgccatccta3atgcgcgcs己ttcatggttc已agggcgtatgcagttgatagttt￡ltgt￡Lagcccggcaagcagctctgtacggcatcgccttgctaatgcaggccgtatgggctgc犯accttacttttctttcctggggggccggccattcccaggaggcgaagcccgcgaggtggaaaccccgtgggctcgatgatgggtcaagccttgacggtgctttcccgggtcacttgacgaaatacgttgtttcatggtggtttggacatgggggtcaacacaxatcttgccctttgctagcgagagagcatgcgctcgtcgcggagtgaactgtcacgtacgggcggcgcatgacctggcctg3cccaax3cccggtattgcgaagtgtggg3CC3tttegg￡LtgCa^g￡lgtgcactaggactactccsatgCtC3agggL3a^ggsgcectaattetaegttgggcgg3犯cEicaccacggttggctgc已ggagectctggtacgattggtgcaccattggceggcattgagccaccctccctgcggtgaccccaggttctactgggtattgctcc&ctgt2220ttgagactca2280teaataeggt2340acacccaggc2400gccacatccc2460ccactcgtga2520ccgcgtcggg2580atgtggactc2640gaggaacccg2700cctg已atgga2760ctttgttggg2820gga^tggt已g2880<210〉SEQIDNO:2<211>960<212>PRT<213>黑曲霉(y^;^^///^m;^r)WX-07<400>2SerThrThrAlaAlaAspValGlyAlaAlaAspAlaValGinHisAsnGlyArgProCysLeuSerValGluLeuProThrHisSerGluAsnLeuValSerGinSerPro5Ala20Gin35Ser50Asn65Tyr80Val95Val110Gly125SerGinProGinGinLeulieAlaSerValCysProArgGlyPheThrValTyrGlyThrGinAspSerAspAspSerThrAsnProArgProLysLeuPheValSerPheThrlieProAlaSer1015AsnlieAspAspProGin2530GlyTyrLysAlaSerLys4045AlaSerL>euGinLeuAla5560AspValGluSerLeuThr7075ArgLeuAsnlieGinlie8590AlaSerTrpTyrPheLeu100105AlaSer!>euAsnAlaSer115120TrpSerAsnGluProSer130135PheAsnPheLysVal140SerThrGluGlyThr155PheValThrAlaLeu170GluHislieThrGin185lieTyrProSerAsp200GlyGinHisProPhe215ArgGinAsnGlySer230AlaSerGinAspTyr245AsnSerHisGlyLeu260TrpArgThrLeuGly275ProAlaProAlaAsp290GlyLeuProAlaMet305CysArgTrpGlyTyr320AlaAsnPheGluLys335AsplieAspTyrMet350HisArgPheSerTyr365HisGluSerGlyArg380lieArgLysAlaThr145ValLeuValTyrGlu160ProGluGluTyrAsn175PheArgLeuGinArg190AspGlyThrProlie205TyrLeuAspThrArg220TyrlieProValLys235lieSerLeuSerHis250GlulieLeuLeuArg265GlyGlylieAspLeu280ValThrArgGinTyr295GinGinTyrAsnThr310AsnAsnTrpSerAsp325PheGlulieProLeu340HisGlyTyrArgAsn355SerGluGlyAspGlu370TyrTyrValSerlie385GlyAspAlaLeuPhe150AsnGinPhelieGlu165LeuTyrGlyLeuGly180AsnAlaAsnLeuThr195AspGinAsnLeuTyr210TyrTyrLysGlyAsp225SerSerGluAlaAsp240GlyValPheLeuArg255SerGinLysLeulie270ThrPheTyrSerGly285LeuThrSerThrVal300LeuGlyPheHisGin315LeuAlaAspValVal330GluTyrlieTrpThr345PheAspAsnAspGin360PheLeuSerLysLeu375ValAspAlaAlaLeu390TyrlieProAsnPro395AspArgGlyAlaAla410SerLeuTyrlieGly425AspTrpHisHisPro440VallieTrpSerLys455MetSerGluValSer470AsnLeuThrLeuAsn485GluProGlyAsplie500ThrAsnAlalieGlu515GinAlaAlaAlaThr530LeuArgThrThrPro545ProTyrVallieAsn560HisAlaValSerPro575TyrAspValHisGly590TyrGinGlyLeuLeu605lielieGlyArgSer620HisTrpGlyGlyAsp,635GluAsnAlaSerAsp400AspAspValPheLeu415AlaValTrpProGly430LysAlaValAspPhe445LysValAlaPheAsp460SerPheCysValGly475ProAlaHisProSer490lieTyrAspTyrPro505AlaAlaSerAlaSer520AlaThrThrThrSer535ThrProGlyValArg550HisAspGinGluGly565AsnAlaThrHisVal580LeuTyrGlyHisGin595GluValTrpSerHis610ThrPheAlaGlySer625AsnTyrSerLysTrp640AlaTyrAlaThrTyr405LysAsnProAspGly420TyrThrVslPhePro435TrpAlaAsnGluLeu450GlyValTrpTyrAsp465SerCysGlyThrGly480PheLeuLeuProGly495GluAlaPheAsnlie510AlaGlyAlaSerSer525ThrSerValSerTyr540AsnValGluHisPro555HisAspLeuSerVal570AspGlyValGluGlu585GlyLeuAsnAlaThr600LysArgArgProPhe615GlyLysTrpAlaGly630TrpSerMetTyrTyr645SerlieSerArgAla650PheGlyAlaAspThr665LeuCysAsnArgTrp680ArgAsnHisAsnGlu695TrpAlaSerVallie710TyrAlalieLeuPro725ThrThrGlySerThr740AsnAspProThrLeu755ProAlalieMetVal770ValLysGlyValPhe785AspTrpTyrThrGin■ThrThrlieSerAla815GlyGlyAsnlieLeu830GluAlaArgGinThr845AsnGlyThrAlaSer860lieTyrSerAsnAla875SerSerLeuArgSer890LeuSerPheSerLeu655CysGlyPheAsnGly670MetGinLeuSerAla685LeuSerThrliePro700GluAlaThrLysSer715TyrPheTyrThrLeu730ValMetArgAlaLeu745AlaAlaValGluThr760ValProValLeuGlu775ProGlyValGlyHis790AlaAlaValAspAla805ProLeuGlyHislie820ProMetGinGluPro835ProTrpAlsLeuLeu850GlyGinLeuCysLeu865ThrLeuHisValAsp880SerAlaGinGlyArg895PheGlylieProMet660AsnSerAspGluGlu675PhePheProPheTyr690GinGluProTyrArg705AlaMetArglieArg720PheAspLeuAlaHis735SerTrpGluPhePro750GinPheMetValGly765ProLeuValAsnThr780GlyGluValTrpTyr795LysProGlyValAsn810ProValTyrVaJArg825AlaLeuThrThrArg840AlaAlaLeuGlySer855AspAspGlyGluSer870PheThrAlaSerArg885TrpLysGluArgAsn900ProLeuAlaAsnValThrValLeuGlyValAsnLysGluProSer905910915AlaValThrLeuAsnGlyGinAlaValPheProGlySerValThr920925930TyrAsnSerThrSerGinValLeuPheValGlyGlyLeuGinAsn935940945LeuThrLysGlyGlyAlaTrpAlaGluAsnTrpValLeuGluTrp950955960权利要求1、一种α-葡萄糖苷酶，缩写为AGLU酶，其氨基酸序列如SEQIDNO2所示。2、一种编码权利要求1所述的ct-葡萄糖苷酶的基因，縮写为ag/"基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示。3、一种如权利要求2所述的a-葡萄糖苷酶基因的表达方法，其特征是由黑曲霉WX-07总DNA获得ag/w的cDNASEQIDNO:1，ag/w基因以质粒pPIC9K为表达载体，以毕赤酵母KM71为表达宿主，实现"g/w基因的可溶性表达；(1)黑曲霉WX-07总DNA的提取黑曲霉WX-07菌株在YPD液体培养基中培养2天，菌丝体过滤，再用无菌水冲洗三次，用无菌滤纸吸干水分，将菌丝体转入研钵内，加液氮研磨得菌粉，将菌粉放入事先称重的50mL离心管中，称量lg菌粉，将由8.1816gNaCl、2g十二烷基磺酸钠、10mL500mmoL/LEDTA、5mLlmol/LTris-HCl缓冲液加水定容到100mL组成的抽提缓冲液在65'C水浴中预热，按3mL/g菌粉加入抽提缓冲液，用封口膜封住，65r放置lh，得菌液；吸取1.5mL菌液于灭菌的1.5mL离心管中，平行2管，10000r/min离心5min，吸上清0.75mL至新的1.5mL离心管中，加入0.75mL由50mL10%CTAB、5.844gNaCl、10mL500mmol/LEDTA、25mLlmol/LTris-HCl定容到100mL的5xCTAB溶液，然后再每管分成两管，每管取0.6mL，分别加入0.6mL的酚/氯仿/异戊醇体积比25:24:1混合溶液，混匀，10000r/min离心10min;上清液吸入另一批新的离心管中，弃下层油相及中层蛋白；在这批离心管中分别加入等体积、0.4mL氯仿/异戊醇体积比24:l混合溶液，颠倒混匀，10000r/min离心10min，吸取上清，重复以上步骤，直至无蛋白；加入等体积0.3mL异丙醇至上清液中，充分混匀，-20。C过夜，第二天，10000r/min，弃上清；用现配的70%的乙醇洗沉淀2次，倒掉乙醇，用无水乙醇洗沉淀l次，倒掉乙醇，室温干燥20-30min;加50^L无菌水溶解沉淀，-20"冻存；(2)a-葡萄糖苷酶编码基因的克隆以黑曲霉WX-07总DNA为模版，由于"g/w基因是有四个外显子和三个内含子，所以通过PCR和over-lapPCR扩增出ag/w基因，以下列八个核苷酸序列作为引物，下划线为酶切位点A^I:引物1:5，-ATTAATGCGGCCGCGTCCACCACTGCCCCTTCG-3'引物2:5，-CCGTAGAGGTTTTGGTCAATAGGTGTTC-3'弓I物3:5,-ACCTATTGACCAAAACCTCTACGGCCA隱3'引物4:5，-TCAATATCGGTCCAGATATATTCCAAC-3，引物5:5，誦GAATATATCTGGACCGATATTGACTACATGCACG-3'引物6:5，-CGTAGCGTAGGCATCAGAGGCATTTTC-3'弓I物75，-GCCTCTGATGCCTACGCTACGTATGACA-3'引物8:5，-AGCACTAGCGGCCGCCCATTCCAATACCCAGTTT丁CC-3'第一轮PCR:以黑曲霉WX-07总DNA为模板，分另I似P1、P2;P3、P4;P5、P6;P7、P8为上下游引物，扩增出exonl，exon2，exon3，exon4;PCR反应在50pL体系中进行5xPCR缓冲液10(iL，2.5mmol/LdNTPs4^L，lO^mol/L上下游引物各1iiL，模板DNAlpL，Taq酶0.5^tL，加双蒸水至总体系50iiL;PCR反应条件为在94。C变性4min后开始循环，然后94。C变性lmin，55°。退火lmin，72。C分别延伸1min、1min、1min和3min，共35个循环后，再于72。C延伸10min，扩增得到PCR片段，分别割胶回收，回收片断与pMD18-Tsimple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37。C培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，810h后提取质粒，将此质粒进行序列测定；第二轮PCR:以exon2和exon3为模板，以P3、P6为上下游引物，扩增得到exon2-3;PCR反应在50[iL体系中进行5xPCR缓冲液10[iL,2.5mmol/LdNTPs4)iL，10jdmol/L上下游引物各1jiL，exon2禾卩exon3各1|iL，Taq酶0.5(iL，加双蒸水至总体系50JlL;PCR反应条件为在94"C变性4min后开始循环，然后94。C变性lmin，55。C退火lmin，72。C延伸1min，共35个循环后，再于72。C延伸10min，扩增得到PCR片段，分别割胶回收，回收片断与pMD18-Tsimple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109,转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37"C培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，810h后提取质粒，将此质粒进行序列测定；第三轮PCR:以exon2-3和exon4为模板，以P3、P8为上下游引物，扩增得到exon2-3-4;PCR反应在50jiL体系中进行5xPCR缓冲液10(xL，2.5mmol/LdNTPs4|iL，10|imol/L上下游引物各1nL，exon2-3和exon4各1joL，Taq酶0.5)iL，加双蒸水至总体系50^L;PCR反应条件为在94。C变性4min后开始循环，然后94。C变性lmin，55"C退火lmin，72。C延伸3min，共35个循环后，再于72。C延伸10min，扩增得到PCR片段，分别割胶回收，回收片断与pMD18-Tsimple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37。C培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，810h后提取质粒，将此质粒进行序列测定；第四轮PCR:以exon1和exon2-3-4为模板，以Pl、P8为上下游引物，扩增得到exon1-2-3-4;PCR反应在50fiL体系中进行5xPCR缓冲液10pL，2.5mmol/LdNTPs4|iL，10pmol/L上下游引物各1|iL，exon1和exon2-3-4各1jiL，Taq酶0.5|iL，加双蒸水至总体系50^L;PCR反应条件为在94"变性4min后开始循环，然后94"C变性lmin，55。C退火lmin，72。C延伸4min，共35个循环后，再于72。C延伸10min，扩增得到全基因exon1-2-3-4片段2880bp，割胶回收，回收片断与pMD18-Tsimple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37r培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，810h后提取质粒，命名为ag/w/pMD18-Tsimple,将此质粒进行序列测定；(3)ag/w基因在表达载体上的构建用于构建表达载体的质粒是pPIC9K，带有"-i^"w信号肽，将pPIC9K质粒和扩增的ag/"基因进行M^I酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶16"连接过夜，连接产物转化Eco//JM109感受态细胞，经37。C培养过夜，挑选转化子于含100mg/L氨苄青霉素的LB平板进行液体培养，然后抽提质粒，得到富集的ag/w/pPIC9K质粒；(4)毕赤酵母菌KM71转化和筛选重组菌将表达载体ag/w/pPIC9K17fiL，10xHbuffer2^L，BglII1(iL，37。C酶切1.5h后回收含有目的基因的条带，溶于20pL无菌水中，得到线性化的DNA;在80pL毕赤酵母KM71感受态细胞中加入2线性化的DNA，混匀，转入lmm预冷的电转杯中，将电转化仪调至毕赤酵母档，电激，转化物中加入lmLlmol/L的山梨醇，30°C温育lh，取200pL的山梨醇重悬液涂布MD平板，30。C培养72小时；挑取回复突变菌株接种于YPD/G418平板上，30。C培养48h至长出单菌落，为获得多拷贝的"g/"基因的菌株，G418浓度筛选梯度依次为0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL;pPIC9K空质粒同上处理，所得转化菌作为阴性对照；(5)重组毕赤酵母KM71/ag/w/pPIC9K的PCR鉴定选取含4mg/mLG418的YPD/G418上单菌落，以引物1，引物8作为引物，用前述的PCR方法，检验是否能够扩增得到全长exon1-2-3-4片段；重组毕赤酵母KM71/pPIC9K的PCR鉴定作为对照；鉴定后获得正确的重组毕赤酵母KM71/ag/w/pPIC9K用于后续实验；(6)重组毕赤酵母的培养将鉴定正确的单菌落KM71/ag/w/pPIC9K接种至10mLYPD培养基，30。C培养24h，lmL培养液接入50mLBMGY，30T培养24h，至OD为4.0，离心收集菌体，用25mLBMMY培养基重悬培养，甲醇诱导表达，分别于24h、48h、72h和96h取样，每次取样200iaL，离心收集上清，并补加250甲醇至终浓度1%;阴性对照重组毕赤酵母KM71/pPIC9K培养方法同上；(7)重组(x-葡萄糖苷酶的检测SDS-PAGE检测表达产物在98kDa和33kDa有条带，收集毕赤酵母发酵培养的上清液，硫酸铵沉淀，透析，制成粗酶液，测定酶活方法如下用pH5的醋酸钠缓冲液配制10%的麦芽糖溶液10mL，加50)iL粗制的浓縮酶液，60°C反应24h，然后煮沸2min，微孔过滤，HPLC检测产物，与市售的低聚异麦芽糖产品IMO-900比较各成分组成；液相检测显示有转糖苷产物异麦芽糖、潘糖生成。全文摘要α-葡萄糖苷酶(简称AGLU酶)基因的克隆与表达，属于酶基因工程和酶工程领域。本发明由黑曲霉(A.niger)WX-07总DNA获得aglu基因SEQIDNO1，aglu的cDNA以质粒pPIC9K为表达载体，以毕赤酵母(P.pastoris)为表达宿主，实现aglu基因在胞外的可溶性表达；该aglu的cDNA全长2880个核苷酸，编码960个氨基酸，构建了真核表达质粒，转化PichiapastorisKM71表达AGLU酶。重组酶具有转苷活性，能将麦芽糖转糖苷生成低聚异麦芽糖。此酶适合食品、饲料、医药等工业应用的需要，能用于低聚异麦芽糖的工业生产。文档编号C12N1/19GK101434943SQ20081024446公开日2009年5月20日申请日期2008年12月5日优先权日2008年12月5日发明者敬吴,星童,坚陈申请人:江南大学