专利名称：：一种利用微卫星标记技术鉴别肉制品中源性成份的方法
技术领域：
：本发明涉及一种利用微卫星标记技术鉴别肉制品中源性成份的方法，利用微卫星标记技术鉴别肉制品中牛、羊、猪、狗、鸡、鸭源性成份，属于生物高
技术领域：
。在动物饲料、食品、药品检验方面具有非常重要的意义。二
背景技术：
：我国肉制品市场管理虽然出台了很多政策和措施，但大多是关于肉品质、掺水、掺淀粉等其他东西的一些检测，很少有关于肉制品种类的鉴定，然而市场上却有很多假冒羊肉或牛肉等现象，比如有人拿病死猪肉内掺入羊油或牛油，装入塑料袋里冷冻后就变成了"羊肉巻"、"牛肉巻"。尤其是上世纪疯牛病、羊痒病等疾病的发现和流行，使得食品、药品、饲料中的牛源性成份和羊源性成份受到严格限制。我国政府先后颁布了《关于严防牛海绵状脑病传入中国》和《关于禁止用反刍动物源性饲料饲喂反刍动物》等一系列通知。国家药监局发布了《关于进一步加强牛源性及其相关药品监督管理》的公告。此外还涉及到一些民族的宗教信仰问题(如在清真食品中掺入猪肉)。食品、药品、饲料中动物源性成份的鉴别已成为一个特别受人关注的问题，因此，建立一种快速、准确的动物源性成份鉴别的方法具有重大的意义。微卫星DNA又称短串联重复序列或简单重复序列，由16个核苷酸组成，具有高度多态性，广泛存在于原核及真核生物基因组中，尤以二个核苷酸重复最为常见。其主要特点有微卫星DNA在基因组中数目多，且分布均匀，平均3050Kb就存在一个微卫星DNA;微卫星DNA多态性信息含量丰富，稳定性好，突变率低，可在家族中稳定遗传。微卫星DNA—般不大于600bp，非常适用于PCR扩增，结合聚丙烯酰胺凝胶电泳可以将lbp长度差异的片段分辨出来，检测快速方便。因此微卫星标记广泛用于人和动物的遗传研究包括人类在内的各种物种基因作图，构建遗传连锁图谱，疾病诊断、亲子鉴定、定位数量性状遗传位点和功能基因、评估遗传多样性和进行畜禽品种资源分类等。
发明内容技术问题本发明的目的在于针对动物饲料、食品、药品检验方面动物源性成份鉴别困难的问题，提供一种利用微卫星标记技术鉴别肉制品中牛、羊、猪、狗、鸡、鸭源性成份的方法。技术方案本发明提供一种利用微卫星标记技术鉴别肉制品中牛、羊、猪、狗、鸡、鸭源性成份的方法。该方法通过筛选种间特异、种内通用的微卫星标记，设计特异性引物，建立PCR检测方法，根据扩增产物片段大小及有无鉴别肉制品中牛、羊、猪、狗、鸡、鸭源性成份。上述鉴别肉制品中牛、羊、猪、狗、鸡、鸭源性成份的方法为(1)肉制品中基因组DNA的提取使用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取肉制品中基因组DNA;(2)以肉制品中基因组DNA作为模板，进行PCR反应，25^L反应体系2xPCRMixl2.5nL，10(amol/L上、下游引物各lpL，模板DNAlpL，补水至25^L:程序94°C，预变性2min。94。C变性15s，55"C退火30s，68"延伸lmin，重复10个循环；94。C变性15s，50。C退火30s，68'C延伸lmin，重复10个循环;94'C变性15s，45。C退火30s，68'C延伸lmin，重复10个循环；68。C延伸5min;(3)PCR产物的检测取PCR产物7pL，采用质量比2.0%的琼脂糖凝胶(含0.005%的GOLDView)电泳，电泳缓冲液为0.5XTBE,120V恒压电泳40min，紫外灯下观察电泳结果；(4)样品鉴定肉制品中，其牛源性成份所用引物为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2,扩增结果如果不出现322bp条带，说明没有牛源性成份的存在；如果出现322bp条带，再用引物SEQIDNO:3和SEQIDNO:4进行扩增，扩增结果如果不出现679bp条带，则说明有牛源性成份存在；如果出现679bp条带，则说明没有牛源性成份存在；其羊源性成份所用引物为SEQIDNO:3和SEQIDNO:4,扩增结果如果不出现679bp条带，说明没有羊源性成份的存在；如果出现679bp条带，则说明有羊源性成份存在；其猪源性成份所用引物为SEQIDNO:5和SEQIDNO:6，扩增结果如果不出现600bp条带，说明没有猪源性成份的存在；如果出现600bp条带，则说明有猪源性成份存在；其狗源性成份所用引物为SEQIDNO:7和SEQIDN0:8，扩增结果如果不出现437bp条带，说明没有狗源性成份的存在；如果出现437bp条带，则说明有狗源性成份存在；其鸡源性成份所用引物为SEQIDNO:9和SEQIDNO:10，扩增结果如果不出现261bp条带，说明没有鸡源性成份的存在；如果出现261bp条带，则说明有鸡源性成份存在；其鸭源性成份所用引物为SEQIDNO:11和SEQIDNO:12，扩增结果如果不出现572bp条带，说明没有鸭源性成份的存在；如果出现572bp条带，则说明有鸭源性成份存在。有益效果本发明提供一种利用微卫星标记技术鉴别肉制品中牛、羊、猪、狗、鸡、鸭源性成份的方法。该方法具有快速、简单、准确、特异性强、灵敏度高的特点。适合在检测大批量样品方面推广使用。对于防止疯牛病传入我国、防止不法商家瞒报商品成份，保证国家的安全和人民的健康，都具有非常重要的意义。四图1为序列表中SEQIDNO:1和SEQIDNO:2引物扩增产物的电泳结果。该引物在扩增牛和羊的样品时出现322bp条带，在扩增猪、狗、鸡、鸭的样品时没有出现322bp条带。其中l-3泳道C为鸡的样品，4-6泳道Y为鸭的样品，7-9泳道G为羊的样品，10-12泳道D为狗的样品，13泳道为DNA分子量标准(600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)，14-16泳道N为牛的样品，17-19泳道P为猪的样品。图2为序列表中SEQIDNO:3和SEQIDNO:4引物扩增产物的电泳结果。该引物在扩增羊的样品时出现679bp条带，在扩增牛、猪、狗、鸡、鸭的样品时没有出现679bp条带。其中l-3泳道Y为鸭的样品，4-6泳道C为鸡的样品，7-9泳道D为狗的样品，10-12泳道P为猪的样品，13-15泳道G为羊的样品，16-18泳道N为牛的样品，19泳道为DNA分子量标准(2000bp、1000bp、750)p、500bp、250bp、100bp)。图3为序列表中SEQIDNO:5和SEQIDNO:6引物扩增产物的电泳结果。该引物在扩增猪的样品时出现600bp条带，在扩增牛、羊、狗、鸡、鸭的样品时没有出现600bP条带。其中l-3泳道N为牛的样品，4-6泳道G为羊的样品，7-9泳道D为狗的样品，10-12泳道C为鸡的样品，13-15泳道Y为鸭的样品，16-18泳道P为猪的样品，19泳道为DNA分子量标准(2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)。图4为序列表中SEQIDNO:7和SEQIDNO:8引物扩增产物的电泳结果。该引物在扩增狗的样品时出现437bp条带，在扩增牛、羊、猪、鸡、鸭的样品时没有出现437bp条带。其中l-4泳道C为鸡的样品，5-8泳道Y为鸭的样品，9-12泳道N为牛的样品，13泳道为DNA分子量标准(600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp),14-17泳道D为狗的样品，18-21泳道G为羊的样品，22-25泳道P为猪的样品。图5为序列表中SEQIDNO:9和SEQIDNO:10引物扩增产物的电泳结果。该引物在扩增鸡的样品时出现261bp条带，在扩增牛、羊、猪、狗、鸭的样品时没有出现261bp条带。其中1-3泳道N为牛的样品，4-6泳道G为羊的样品，7-9泳道P为猪的样品，10-12泳道D为狗的样品，13-15泳道Y为鸭的样品，16-18泳道C为鸡的样品，19泳道为DNA分子量标准(600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)。图6为序列表中SEQIDNO:11和SEQIDNO:!2引物扩增产物的电泳结果。该引物在扩增鸭的样品时出现572bp条带，在扩增牛、羊、猪、狗、鸡、鸭的样品时没有出现572bp条带。其中1-3泳道C为鸡的样品，4-6泳道N为牛的样品，7-9泳道G为羊的样品，10-12泳道P为猪的样品，13泳道为DNA分子量标准(600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp),14-16泳道Y为鸭的样品，17-19泳道D为狗的样品。五具体实施例方式实施例l:微卫星标记的选取及引物设计通过査阅大量相关资料和文献，根据微卫星标记的核心序列碱基数越少、突变率越低及有较髙的遗传稳定性、可在家族中稳定遗传的特性，筛选种间特异、种内通用的微卫星标记。共选取了29个微卫星标记，牛5个、羊5个、猪6个、狗5个、鸡4个、鸭4个。根据其侧翼保守序列，用PrimerPrimer5.0软件设计引物。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。实施例2:样品采集在市场上随机采集牛、羊、猪、狗、鸡、鸭肉制品。每种动物釆集48个样品，总共288个样品。实施例3:样品中基因组DNA的提取按照血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)说明提取肉制品中基因组DNA。实施例4:建立PCR反应25pLPCR反应体系为2xPCRMixl2.5nL，10pmol/L上、下游引物各1^L，模板DNAlnL，补水至25pL。循环参数为94°C，2预变性min。94。C变性15s，55"退火30s，68。C延伸lmin,重复10个循环；94。C变性15s，5(TC退火30s,68。C延伸lmin，重复10个循环；94'C变性15s，45。C退火30s，68。C延伸lmin，重复10个循环；68。C延伸5min。实施例5:PCR产物的鉴定取PCR产物7pL，采用质量比2.0%的琼脂糖凝胶(含0.005%的GOLDView)，0.5xTBE电泳缓冲液，120V恒压电泳40min，紫外灯下观察电泳结果。根据扩增产物片段大小及有无鉴别肉制品中牛、羊、猪、狗、鸡、鸭源性成份。实施例6:特异性微卫星标记及引物的确定图1为序列表中SEQIDNO:1和SEQIDNO.2引物扩增产物的电泳结果。该引物在扩增牛和羊的样品时出现322bp条带，在扩增猪、狗、鸡、鸭的样品时没有出现322bp条带。其中l-3泳道C为鸡的样品，4-6泳道Y为鸭的样品，7-9泳道G为羊的样品，10-12泳道D为狗的样品，13泳道为DNA分子量标准(600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp),14-16泳道N为牛的样品，17-19泳道P为猪的样品。图2为序列表中SEQIDNO:3和SEQIDNO:4引物扩增产物的电泳结果。该引物在扩增羊的样品时出现679bp条带，在扩增牛、猪、狗、鸡、鸭的样品时没有出现679bp条带。其中l-3泳道Y为鸭的样品，4-6泳道C为鸡的样品，7-9泳道D为狗的样品，10-12泳道P为猪的样品，13-15泳道G为羊的样品，16-18泳道N为牛的样品，19泳道为DNA分子量标准Q000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)。图3为序列表中SEQIDNO:5和SEQIDNO:6引物扩增产物的电泳结果。该引物在扩增猪的样品时出现600bp条带，在扩增牛、羊、狗、鸡、鸭的样品时没有出现600bp条带。其中l-3泳道N为牛的样品，4-6泳道G为羊的样品，7-9泳道D为狗的样品，10-12泳道C为鸡的样品，13-15泳道Y为鸭的样品，16-18泳道P为猪的样品，19泳道为DNA分子量标准(2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)。图4为序列表中SEQIDNO:7和SEQIDNO:8引物扩增产物的电泳结果。该引物在扩增狗的样品时出现437bp条带，在扩增牛、羊、猪、鸡、鸭的样品时没有出现437bp条带。其中l-4泳道C为鸡的样品，5-8泳道Y为鸭的样品，9-12泳道N为牛的样品，13泳道为DNA分子量标准(600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)，14-17泳道D为狗的样品，18-21泳道G为羊的样品，22-25泳道P为猪的样品。图5为序列表中SEQIDNO:9和SEQIDNO:10引物扩增产物的电泳结果。该引物在扩增鸡的样品时出现261bp条带，在扩增牛、羊、猪、狗、鸭的样品时没有出现261bp条带。其中1_3泳道N为牛的样品，4-6泳道G为羊的样品，7-9泳道P为猪的样品，10-12泳道D为狗的样品，13-15泳道Y为鸭的样品，16-18泳道C为鸡的样品，19泳道为DNA分子量标准(600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)。图6为序列表中SEQIDNO:11和SEQIDNO:12引物扩增产物的电泳结果。该引物在扩增鸭的样品时出现572bp条带，在扩增牛、羊、猪、狗、鸡、鸭的样品时没有出现572bp条带。其中l-3泳道C为鸡的样品，4-6泳道N为牛的样品，7-9泳道G为羊的样品，10-12泳道P为猪的样品，13泳道为DNA分子量标准(600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp),14-16泳道Y为鸭的样品，17-19泳道D为狗的样品。根据上述微卫星标记结果，选择出特异性微卫星标记及引物，具体信息见表l表i特异性微卫星标记及引物信息<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例7:样品鉴定，采集肉制品，其牛源性成份所用引物为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2，扩增结果如果不出现322bp条带，说明没有牛源性成份的存在；如果出现322bp条带，再用引物SEQIDNO:3和SEQIDNO:4进行扩增，扩增结果如果不出现679bp条带，则说明有牛源性成份存在；如果出现679bp条带，则说明没有牛源性成份存在；(图l)其羊源性成份所用引物为SEQIDNO:3和SEQIDNO:4,扩增结果如果不出现679bp条带，说明没有羊源性成份的存在；如果出现679bp条带，则说明有羊源性成份存在；(图2)其猪源性成份所用引物为SEQIDNO:5和SEQIDNO:6，扩增结果如果不出现600bp条带，说明没有猪源性成份的存在；如果出现600bp条带，则说明有猪源性成份存在；(图3)其狗源性成份所用引物为SEQIDNO:7和SEQIDNO:8，扩增结果如果不出现437bp条带，说明没有狗源性成份的存在；如果出现437bp条带，则说明有狗源性成份存在；(图4)其鸡源性成份所用引物为SEQIDNO:9和SEQIDNO:10，扩增结果如果不出现261bp条带，说明没有鸡源性成份的存在；如果出现261bp条带，则说明有鸡源性成份存在；(图5)其鸭源性成份所用引物为SEQIDNO:11和SEQIDNO:12，扩增结果如果不出现572bp条带，说明没有鸭源性成份的存在；如果出现572bp条带，则说明有鸭源性成份存在。(图6)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula><400>3tccgtygggtgcctagaaagtgtg<210>4<211>22<212>DNA<213>人工合成<220><221>primer_bind<222>(1)..(22)<223><400>4cctctgggagtgtggggatgca<210>5<211>25<212>DNA<213>人工合成<220><221>primer—bind<222>(1)"(25)<223><400>5tgtcttcttcctcagtggtcgtgct<210>6<211>24<212>DNA<213>人工合成<220><221>primer_bind<222>(1)..(24)<223><400>6ccaatcagcaggctcatggtacaa<210>7<211>2524222524<212>DNA<213>人工合成<220><221>primer—bind<222>(1)..(25)<223><400>7aataatgaatgtctactttcgatgt<210>8<211>23<212>DNA<213>人工合成<220><221>primer一bind<222>(1)..(23)<223><400>8actgtgatttttgagaagagggt<210>9<211>22<212>DNA<213>人工合成<220><221>primer—bind<222>G)-.(22)<223><400>9tggacttaacactgctattgcc<210>10<21I>21<212>DNA<213>人工合成<220><221>primer一bind<222>(1)..(21)<223><400>10ctctctaccttggagggctga<210>11<211>20<212>DNA<213>人工合成<220><221>primer—bind<222>(1)..(20)<223><400>11tgatggcgtggtcctgaagt<210>12<211>23<212>DNA<213>人工合成<220>〈221>primer—bind<222>(1)..(23)<223><400>12attgaatgagcagggacacatgi权利要求1.一种利用微卫星标记技术鉴别肉制品中源性成份的方法，其特征在于(1)肉制品中基因组DNA的提取使用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取肉制品中基因组DNA；(2)以肉制品中基因组DNA作为模板，进行PCR反应，25μL反应体系2×PCRMix12.5μL，10μmol/L上、下游引物各1μL，模板DNA1μL，补水至25μL；程序94℃，预变性2min。94℃变性15s，55℃退火30s，68℃延伸1min，重复10个循环；94℃变性15s，50℃退火30s，68℃延伸1min，重复10个循环；94℃变性15s，45℃退火30s，68℃延伸1min，重复10个循环；68℃延伸5min；(3)PCR产物的检测取PCR产物7μL，采用质量比2.0％的琼脂糖凝胶(含0.005％的GOLDView)电泳，电泳缓冲液为0.5×TBE，120V恒压电泳40min，紫外灯下观察电泳结果；(4)样品鉴定肉制品中，其牛源性成份所用引物为SEQIDNO1和SEQIDNO2，扩增结果如果不出现322bp条带，说明没有牛源性成份的存在；如果出现322bp条带，再用引物SEQIDNO3和SEQIDNO4进行扩增，扩增结果如果不出现679bp条带，则说明有牛源性成份存在；如果出现679bp条带，则说明没有牛源性成份存在；其羊源性成份所用引物为SEQIDNO3和SEQIDNO4，扩增结果如果不出现679bp条带，说明没有羊源性成份的存在；如果出现679bp条带，则说明有羊源性成份存在；其猪源性成份所用引物为SEQIDNO5和SEQIDNO6，扩增结果如果不出现600bp条带，说明没有猪源性成份的存在；如果出现600bp条带，则说明有猪源性成份存在；其狗源性成份所用引物为SEQIDNO7和SEQIDNO8，扩增结果如果不出现437bp条带，说明没有狗源性成份的存在；如果出现437bp条带，则说明有狗源性成份存在；其鸡源性成份所用引物为SEQIDNO9和SEQIDNO10，扩增结果如果不出现261bp条带，说明没有鸡源性成份的存在；如果出现261bp条带，则说明有鸡源性成份存在；其鸭源性成份所用引物为SEQIDNO11和SEQIDNO12，扩增结果如果不出现572bp条带，说明没有鸭源性成份的存在；如果出现572bp条带，则说明有鸭源性成份存在。全文摘要本发明涉及一种利用微卫星标记技术鉴别肉制品中动物源性成份的方法，属于生物高
技术领域：
。利用微卫星标记技术鉴别肉制品中牛、羊、猪、狗、鸡、鸭源性成份，包括肉制品中基因组DNA的提取，进行PCR反应，PCR产物的检测以及引物筛选、样品鉴定。该方法筛选种间特异、种内通用的微卫星标记，设计特异性引物，建立PCR检测方法，根据扩增产物片段大小及有无鉴别肉制品中牛、羊、猪、狗、鸡、鸭源性成份。该方法具有快速、简单、准确、特异性强、灵敏度高的特点。适合在检测大批量样品方面推广使用。对于防止疯牛病传入我国、防止不法商家瞒报商品成份，保证国家的安全和人民的健康，都具有非常重要的意义。文档编号C12Q1/68GK101435001SQ20081024397公开日2009年5月20日申请日期2008年12月18日优先权日2008年12月18日公开号200810243974.发明者周光宏,姚大伟,徐幸莲,杨德吉,杨静静,许家荣,新郑申请人:南京农业大学被以下专利引用(2),