专利名称：与猪免疫与繁殖性状相关的分子标记isg15的利记博彩app
技术领域：
本发明属于猪分子标记制备领域，具体涉及一种作为猪标记辅助选择的与免疫和繁殖性状相关的分子 标记的制备及应用。
背景技术：
一直以来，提高产仔数和增强抗病力是猪育种的主要目标。我国是养猪生产和猪肉消费的第一大国， 养猪业面临的突出问题是疾病的影响。目前为止，由病毒引起的猪的死亡和繁殖效率降低等一系列问题给 养猪生产带来了重大损失。但是传统疾病控制方法存在的病原微生物耐药性增强、药物残留以及不能治本 的问题长期困扰着人们。因此，从长远来看，采用遗传学方法从遗传本质上提高猪对病原的抗性，为抗 病育种提供了新的思路。另一方面，提高抗病力不能以降低繁殖性能为代价，因此明确免疫应答与繁殖性 能间的关系非常重要。在动物繁殖领域中，有许多间题与免疫学有密切关系，如妊娠期免疫、母体免疫球 蛋白传递的途径、免疫对胎儿的影响、免疫性不育等，对畜牧生产有重要意义，因而引起了人们的注意。 也使人们重新重视对免疫和猪的繁殖的研究。
干扰素剌激基因15 (interferonstimulated gene 15, ISG15)基因是首先在鼠的肿瘤细胞中鉴定到的 一种由IFN.剌激表达的蛋白质，通过进一步对人的ISG15基因cDNA序列的分析发现，该基闵编码一个17KDa 的前体蛋白，并迅速加工成为一个15KDa的成熟蛋白(Blomstrom D C然.Molecular characterization of the interferon-induced 15-kDa protein. Molecular cloning and nucleotide and柳i加acid sequence. JBiolChem, 1986, 261 (19) :8811 881S)。然而，当时还没有确定XSV/谨因的功能，直到1987年，Haas 等人利用IFN来诱导人A549和鼠的L929细胞，发现了一种低分子量的蛋白与泛素免疫有关，通过测序发 现该蛋白与"( 15极度相似，由此，他们指出，/5M5蛋G有可能是泛素样修饰因子家族中的一个新的成员
J Biol Chera, 1987， 262 (23): U315 11323) 。 Z5T;i5垂直同源基因已经分别在人、小鼠、大鼠、牛、 羊和鱼里面被发现，并且发现这些同源的/5H5蛋白都含有一个串联的通过脯氨酸残基连接成的泛素样同 源结构域，在人上面，Z5似5蛋白的羧基和氨基端的泛素样区域与泛素的同源性分别达到31X和29%。
随着研究的深入， 一系列的实验间接或者直接的证明了 ISG15基因在先天免疫系统中是一个重要的免 疫调节和抵抗病菌感染的分子。首先，J5W5基因所编码的蛋白主要来源与人的单核细胞和淋巴细胞，这 种生物学性质决定了该基因在宿主对于细胞内病原体免疫起到作用(Tokarz S等.The ISG15 Isop印tidase UBP43 Is Regulated by Proteolysis via the SCFSkp2 IMquitin Ligase. J Biol Chem， 2004, 279(45) :46424-46430)。并且，T淋巴细胞中游离的/5W5蛋白可诱导IFN-Y的产生和剌激NK细胞的增 殖(D， Cunha J等.I鹏unoregulatory properties of ISG15， an interferon-induced cytokine. Proc Natl Acad Sci USA. 1996 Jan 9邻(1) :211-5)。其次'当在体内或体外受到干扰素(IFN〉，脂多糖(LPS) 以及病毒的诱导时，/5tfl5的表达会上调；例如，在体外利用人类巨化细胞病毒感染人成纤维细胞时， 的mRNA的表达水平会增加150倍(Zhu， H等.Cellular gene expression altered by humancytomegalovirus: global monitoring with oligonucleotide arrays. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998， 95:14470 - 14475)，当刚出生的小鼠大脑组织感染辛德比斯病毒的时候，"M5的mRNA表达水平 会上升至lj 100倍以上(Johnston, C W等.Identification of genes involved in the host response to 腦rovirulent alphavirus infection. J Virol, 2001, 75:10431 - 10445);另夕卜，与流感病毒B中的 非结构蛋白NS1B与i^Q5蛋白相结合，抑制其活化酶UBE1L与其发生耦联作用，使得在病毒感染细胞的 时候ZSW5无法与靶蛋白结合，产生抗病毒效应，从另一个角度证明了病毒可以特异的破坏的功能， 来逃逸机体的免疫防御(Yuan,沐等.Influenza B virus NS1 protein inhibits conjugation of the interferon (IFN)-induced ubiquitin-like ISG15 protein. EMB0 J. 2001, 20: 362 - 371)。再次，Osiak 等在基因敲除的小鼠中发现缺失/5M5基因会导致兽疱疹性口炎和淋巴细胞性脉络膜丛脑膜炎病毒的感染 率增力卩(Osiak, A等.ISG15, an interferon-stimulated ubiquitin-like protein, is not essential for STAT1 signaling and responses against vesicular stomatitis and lymphocytic choriomeningitis virus. Mol. Cell Biol. 2005， 25:6338 - 6345.) 。 Lenschow在最近刚刚发表的文章中通过敲除 IFNa PR-/-鼠中的ZSM5基因，直接证明了 对于流感病毒，疱疹病毒以及辛德比斯病毒具有抵抗
作用(Lenschow D J等.IFN-stimulated gene 15 functions as a critical antiviral molecule against influenza, herpes, and Sindbis viruses Proc Natl Acad Sci USA, 2007， 104(4):1371—1376)。
抗病育种不能以降低生产性能为代价，肉此明确免疫应答与生产性能间的关系非常重要。"115在妊 娠早期维持妊娠的作用在许多哺乳动物中已经验证，在妊娠的18天左右，牛子宫内膜中Z5M5可受子宫内 膜IFN-T的诱导与子宫内膜的蛋白结合并调节靶蛋白的作用(Johnson G A等.Pregnancy and interferon-tau induce conjugation of bovine ubiquitin cross-reactive protein to cytosolic uterine proteins. Biol R印rod. 1998， 58(4) :898-904)。细胞内ISG15的表达和与蛋白的结合在17天就 开始出现，在18-23天达到高峰， 一直降低到45天。这充分说明了1SG15由干扰素诱导的表达上调并不仅
仅是抗病毒作用，而且还是哺乳动物的妊娠的识别和建立过程中母胎界面微环境免疫中的一个重要的组成 部分(Margaret M等.Interferon Stimulated Gene 15 Conjugates to Endometrial Cytosolic Proteins and Is Expressed at the Uterine-Placental Interface throughout Pregnancy in Sheep. Endocrinology, 2004， 146 (2) :675 -684)。在鼠的子宫内膜里，J5t!5的inRNA仅能在妊娠建立后检测到，在妊娠的子宫内 膜表达量比未妊娠鼠的子宫内膜高出10倍仅仅在附植位点表达，而在非附植位点是不表达的。另外，牛妊 娠后血清中ISG15的mRNA相对与未妊娠的血清表达量大大增加，因而，可将i5a5的mRNA的表达做为一个 精确的妊娠成功的指示齐(J(Han H等.Low blood ISG15 raRNA and progesterone levels are predictive of non-pregnant dairy cows. J Endocrinol, 2006， 191 (2) :505-512)。然而'T5K15在胚胎植入位点的表达 无限制的增加，会使得植入位点的血管大量减少，胚胎的附植中止'导致胎儿死亡，从而影响妊娠效率 (Rempel L A等-Ubp43 gene expression is required for加皿1 Isgl5 expression and fetal development. R印rod Biol Endocrinol, 2007, 26:5—13,)。
传染病和疾病给养猪业的发生造成了巨大的损失，自1987年在北美首次报道发生以来，猪繁殖与呼 吸综合症几乎席巻全球所有养猪的国家和地区，给全球养猪业造成巨大经济损失。我国在1995年少数猪 场爆发PRRS，随后迅速在全国流行，目前已是我国猪群的重要威胁性传染病，P服SV —方面引起母猪流产、死胎、产木乃伊胎，同时也是猪呼吸道疾病综合征(PKDC)的重要原发性病原，还可造成猪体免疫抑制， 目前尚无特别有效的防控手段。其它传染性疾病和繁殖性疾病所造成损失更是不计其数。目前,猪的抗病 育种已成为猪育种研究的-个重要领域。ISG15基因由于与机体免疫反应，抵抗病毒以及母胎免疫耐受有着 重要的关联，因此，可能是猪抗病育种和繁殖力的重耍候选基因，同时相关的研究也表明猪ISG15对抗病性 状以及繁殖性状存在影响。
发明内容
本发明的目的在于制备一种与猪免疫和繁殖性状相关的分子标记及其作为猪标记辅助选择的应ffl 。 本发明通过以下技术实现-.
申请人克隆得到一个与猪免疫和繁殖性状相关基因ISG15的cDNA序列，序列全长为690bp,它具有如 序列表SEQ ID NO: l所述的核苷酸序列，在序列表SEQ ID恥1的第390bp处有一个A390-G390的碱基 突变，导致HindUI-RFLP多态性。这个碱基突变位于ISG15基闲的编码区，但并不改变其所翻译的氨基酸 序列。
本发明所述的分子标记的^!备方法是
用人ISG15基因m柳A (GenBank收录号NM一005101. 2)为信息探针，作同源序列蹄选，获得同源性 70%以上的表达序列标签；然后拼接猪表达序列标签-重叠群；与人同源比对，根据表达序列标签-重叠群 设计引物；以成年通城猪脾组织提取总肪A为模板，作RT-PCR扩增、PCR产物纯化和克隆测序，进行序列 分析，获得如序列表SEQ If) NO: i所述的c训A序列。其中检测A390G碱基处碱基突变的正、反向引物的 DNA序列也如序列表SEQ ID NO: 1所示。
应用常规的PCR-RFtP的方法对序列表SEQ ID NO: i所示的第390位碱基突变进行了检测，并初步迸 行其基S型与猪的部分免疫性状和繁殖之间的关联分析的应用，为猪的分子标记辅助选择提供了一个新的 分子标记。
更详细的技术方案请参见说明书的《
》及《具体实施方式
》中的实施例。
序列表SEQ ID M): 1是本发明克隆的猪免疫和繁殖性状相关基因ISG巧的部分d)NA序列； 图l:是本发明技术流程图2:是本发明中猪J5说5基因基因组扩增电泳结果，M: DL2000;
图3:是本发明中猪i5d5基因外显子的历/w01-KFLP的三种基因型(M AG GG)电泳结果，M: DL2000; 图4:是本发明中猪基S测序发现的A-G突变。
具体实施例方式
实施例h
(一)猪ii7715基因的CDS克隆
用人ZSM5基因础船(GraBank收录号；NM—005101. 2)为信息探针，利用NCBI网站中的BLAST工具扫描 GenBank猪表达序列标签数据库，将同源性大于70%、片段长度大于100bp的猪的表达序列标签全部下载到 电脑上，然后用生物学软件加AStar中的S印Man程序将猪ffa5基因的表达序列标签拼接成表达序列标签-重叠群。根据与人/5^5基因威NA的同源比对初步确定起始及终止密码子位置，利用生物学引物设计软件Primer Premier 5.0,以拼接的表达序列标签-重叠群作为引物设计的模板序列设计引物，引物序列如下 ISG15正向引物ATGGGTAGGGAACTGAAGGTG (该引物对用来克隆/S615基因的完整编码区序列) ISG15反向引物 AATTTTGCCACAGCTTTATTACTAG ISG15引物扩增的片段长度为525bp。
(2) 反转录PCR扩增反应
利用TRIzoL试剂盒(购自美国invitrogen公司)从成年"通城猪"(一种具有中国地方猪血缘的地 方猪种)脾脏组织中提取总RNA,具体操作方法参照TRlzoL试剂盒说明书进行。
cDNA第一链的的合成反应总体积为50u 1,首先将总RNA2 n g与oligo d(T) 4u 1,随机引物lu 1， DEPC水9 1混合于一离心管中，7(TC变性5 min以解除RNA的二级结构，立即置于冰上冷却以避免二级 结构的重新生成，经短暂离心后加入M-MLV 1. 5u 1， 5Xbuffer 10lU， dNTP2. 5ul， RNASE抑制剂lul 和DEPC水20ti 1 (上述试剂均购自Toyobo公司)，于42。C温育1 h后将温度升至95'C灭活反转录酶， 置于-2(TC保存备用。
PCR反应反应总体积为10ul，其中猪cDNA模板O. 5u 1，双蒸水7. 6ul， buffer lul， ， lOraM正 向引物和反向引物各O. 3u 1， dNTP0.2ul， Taq酶O. lul (5U/ul) 。 PCR反应条件为:94。C预变性5min 后，循环35次94。C变性30s、 64。C退火30s、 72'C延伸25s，最后72'C延伸5min。 PCR产物经1%琼脂糖 凝胶电泳检测。
(3) PCR产物的纯化、克隆和测序
PCR产物的纯化在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5ml离心管屮，然 后用PCR产物纯化试剂盒(购自北京百泰克公司)纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤是按照 100mg胶块加入400u 1 GS Buffer的比例加入GS Buffer,置50。C温肓10min，使琼脂糖胶块完全溶化，每 两分钟颠倒混匀一次；将溶化的胶液转入到离心吸附柱，并将离心吸附柱置于废液收集管中，10000rpm离 心30s，弃去废液；将离心吸附柱置回废液收集管中，加入500u 1 Wash Buffer于离心吸附柱中，lOOOOrpm 离心30s，弃滤液。以同样的方法再用500ul Wash Buffer溶液洗涤一次；将离心吸附杵置会废液收集管 中，最高速度离心lmin;小心取出离心吸附柱，将其套入一个无菌的1.5inl离心管中，在吸附膜中央加入 30ul双蒸水，室温静置2-10min后，最高速度离心lmin;取出离心吸附柱，将l. 5ml离心管(DNA溶液)置 于-2(TC保存备用。
连接反应将纯化PCR产物与pMD18-T载体(购自Takara公司)连接，连接反应总体积是5ul，其 中包括Solution I 2. 5ul, pMD18-T 0. 5ul，纯化PCR产物2nl， 4'C过夜。
感受态细胞的制备从37'C培养了 16-20h的新鲜平板上挑取一个DH5 a单菌落接种于2ml LB中，于 37'C振荡培养3h，转接lml菌液于含有30ml LB的盐水瓶中，继续在37'C振荡培养约4h，待0D,达到0. 3-0. 4 时将盐水瓶从摇床取出，冰浴冷却10-15min，然后将菌液转入离心管中于4°C 4000rpm离心10min ，弃 去培养液，用10ml冰预冷的0. 1 mo1/1的CaCL重悬沉淀，冰浴30min,重复4°C 4000rpm离心10min， 用4ml冰预冷的0. lmo1/1的CaCls重悬沉淀，置4'C保存备用。
转化无菌状态下取100-120 li 1感受态细胞于1. 5ml离心管中，将5 u 1的连接产物加入混匀，在冰 上放置30min， 42。C热激90s，其间不要摇动离心管，取出后冰浴3-4min，加入400 w 1无抗生素的LB液体培养基，37'C振荡培养站min。取100u l涂布于已提前4h涂布了 IPTG(Isopropylthio-P -D-galactoside: 异丙基硫代-0 -D-平-乳糖苷)和X-gal的琼脂平板上，37'C平放1 h后倒置培养。
序列测定策略是采用克隆测序方法(参见J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉 玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版)，克隆测序是挑取单个阳性克隆子用于测 序，序列测定由北京奥科生物技术有限公司完成，每个基因片段至少测两个克隆子。
(4) DNA序列同源性检索鉴定
通过美国国家生物技术信息中心(NCBI， National Center for Biotechnology Information, http:〃雨.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)软件，将测序后 获得的DM序列与GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA 序列的功能信息。
(二) PCR-RFLP诊断方法建立
(1〉引物序列
ISG15的SNP分型引物正向引物5' ATGGGTAGGGAACTGMGGTC 3'
反向引物5' GCACATAGGCTTCAGGTCATACT 3' 该引物扩增片段长度435 bp。
(2) PCR扩增条件
PCR反应总体积其中猪基因组DNA模板lul,双蒸水7.0jx1, 10Xbuffer 1 y 1, IO函正向 引物和反向引物各0.3n 1，藩P0.2" , Taq酶O. lul (5U/") 。 PCR反应条件为:94。C预变性5min 后，循环34次94。C变性30s、 60。C退火30s、 72'C延伸20s;最后72。C延伸5min。 PCR产物经1X琼脂糖 凝胶电泳检测。
(3) RFLP检测
PCR产物酶切反应体积是IOiU ,其中PCR产物3u，双蒸水5. 8u 1， iXbuffer lw 1，限制性内 切酶为0. 2 w 1 (10U/til),将样品混匀后离心，37'C培养箱放置8h,用2. 5%琼脂糖凝胶电泳检 测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。
用引物扩增猪基W组DNA得到了 435bp特异性扩增片段，如图2所示，反向测序结果发现该片段在第 225位发现一个A-G转换(如图4所示)，造成一个HindUI酶切位点(A'AGCTT)。酶切产生三种基因型， GG基因型只有435bp—条带，M基因型有225bp和210bp两条带，杂合子AG基因型有435bp, 225bp和 210bp的三条带，如图3所述。
实施例2:本发明制备的分子标记在不同猪群体多态性中的检测应用
利用PCR-ftTKiU -RFLP检测了 6个不同中外血缘的猪群品种，其中具有国外猪血缘的猪种分别是大白 猪和杜洛克猪，具有中国地方猪血缘的猪种分别是清平猪、梅山猪、大花白猪和通城猪。该突变位点在不 同猪种中的基図型和基因频率如表1所示，检测结果显示，J5W5基因各基因型在大白猪、通城猪和杜洛 克猪中都有分布。大花白猪中没有检测到GG和AG两种基因型的分布，梅山猪和清平猪中没有检测到GG 基因型的分布，呈现基因单态。此结果表明/5W5基因在中国猪品种中等位基因A占优势，在清平猪、大 花白和梅山猪、通城猪中等位基因的频率分别为95%、 100%、 94%、 81%。在杜洛克猪和大白猪在国外品种中，等位基因A与G没有很大的区别。x 2检验7个不同中外猪品种间基因型频率差异如表2所示。 表1.6个猪品种中Z^M基因历'/^///多态性的基因型和基因频率
基因型个体数基因频率品种样本含量
GGAGAAGA
杜洛克3411202575
大白猪3061594555
淸平猪29032695
大花白3400340100
梅山猪380434694
腿^49215321981
表2不同猪品种中Z^历基因ffi/^/Z^多态性基因频率的卡方检验结果品种杜洛克大白猪清平猪大花白梅山猪
大白猪5.55952
清平猪8.0076522.2466*
大花白17.629635.4233"3柳1
梅山猪9.7040226.32650.0005793.78947
通城猪0.90327410.96725.8790114.83437.15257
注* <0. 05，林<0. 01。
x2o.(fi (df=10) =18.03704， x 20.0I (df=10)=23. 20925。 实施例3:本发明制备的分子标记与免疫性状的关联分析
本实施例的猪群来自中国广东华农温氏畜牧股份有限公司水台原种猪场的长白猪群，父母代及子一代
全部进行了基因型检测，子代在O、 17、 32日龄采集抗凝血和非抗凝血，用于血常规和抗体水平检测。
所分析的性状主要是免疫性状，包括子一代猪分别在O、 17、 32三个日龄的猪繁殖与呼吸综合征(蓝 耳病)病毒抗体水平、猪瘟病毒抗体水平、伪狂犬抗体水平及血常规18项指标。根据采集样品的群体结 构，申请人运用混合模型来统计分析ISG15基因SNP位点的基因型效应及其与免疫指标的关系 Y=X P +Z Y +e
其中Y为免疫性状测定值向量；X为固定效应关联矩阵；为固定效应参数向量，包括性别效应、胎 次效应、线别效应、候选基因的基因型效应；Z为混合模型中的随机效应的关联矩阵；Y为所有随机效应 参数向量，包括公畜效应、公畜内母畜效应；e为随机残差效应；采用SAS (Version 8. O)软件中MHEDMODELS 程序进行数据处理与统计分析。
对猪ISG15基因仏77^ZZ-RFLP多态性位点与部分免疫性状进行关眹分析，由表2知在358个个体 中GG基因型有165个，AG基因型有142个，AA基因型有41个。所得到相关的性状是初生重、17日龄血 小板值、32日龄平均HGB浓度(MCHC)、与32日龄淋巴细胞百分数(%) (LYM)和32日龄淋巴细胞绝对值(LY) 相关。
本实施例采用SAS (视窗V8版)软件中的广义线性模型对猪ISG15基因的A/G突变位点的多态在广东 血液指标群体中与部分血液指标进行了初步的关联分析。初步分析结果见表1-3。统计分析发现该基因的A/G突变基因型，与初生重显著相关(P=0.0366)，与17日齡血小板(PLT)呈显著的相关(P=0.0134)，与 32日龄平均恥B浓度(MCHC)呈显著相关(P=0.0208)，与32日龄淋巴细胞百分数(%) (LYM)接近显著相关 (P=0.0573)，与32日龄淋巴细胞绝对值(LY)接近显著相关(P=0.0810)。另外，虽然基因的A/G突变 基因型与中间白细胞以及中间白细胞绝对值极显著相关(P<0.001)，但是由于数据分析发现这两个性状所 对应的个体的数据比较少，数据没有测定完全，因此认为，这两个性状不可靠，不考虑进结果里面。通过 最小—乘均数对基因型为AA、 GG、 AG的个体进行两两比较，结果表明GG基因型17日龄血小板(PLT)值高 于AG和M型基因型个体，AA基因型个体初生重(服)，32日龄淋巴细胞百分数tt)(LYM), 32日龄淋巴细 胞绝对值(LY),32日龄平均血细胞血红蛋白浓度(MCHC)，高于AG基因型和GG基因型个体，达到显著和接 近水平(P=0. 0366， P=0. 0134, P=0. 208, P=0. 0810)。
表3 /SQ5基因外显子多态性位点基因型与0日龄部分免疫性状的关联分析检测
免疫性状 (o日龄)p-值免疫性状 (0曰龄)P-值免疫性状 (O日龄)P-值
猪繁殖与呼吸综合征病毒抗 体水平0.7734平均红细胞体积0.6768淋巴细胞绝对值0.6854
猪瘟病毒抗体水平0.9227平均血红蛋A量0細2中间fl细胞绝对值0—0006**
伪狂犬抗体水平0.4652平均血红蛋白浓度0.2284中性粒细胞绝对值0.2204
白细胞0.1523血小板0.22S4红细胞分布宽度a關
红细胞0.9564淋巴细胞0.7612血小板分布宽度0.4394
血红蛋白0.8504巾间白细胞0頻1血小板体积0.3042
红细胞压积0.9557中性粒细胞0.0555大血小板比率0.2941
注粉表示P〈0. 01，'表示P〈0.05。
表4 /"15基肉外显子多态性位点基因型与17日龄部分免疫性状的关联分析检测
免疫性状(17日龄)P-值免疫性状(17日龄)P-值免疫性状(17日龄)P-值
猪繁殖与呼吸综合征病毒抗 体水平0.9992平均红细胞休积0.6642淋巴细胞绝对值0频7
猪瘟病毒抗体水平0.9525平均血红蛋白量0.7033中间白细胞绝对值
伪狂犬抗体水平0.6258平均血红蛋白浓度0.1978中性粒细胞绝对值
白细胞0.1825血小板0.0126*红细胞分布宽度0.3341
红细胞0.5129淋巴细胞0.1151血小板分布宽度0.7294
血红蛋白0.5305中间白细胞血小板体积0.8191
红细胞压积，0.6239中性粒细胞大血小板比率0.7400表5 ZS^^基因外显子多态性位点基因型与32日龄部分免疫性状的关联分析检测
免疫性状(32日龄〕P-值免疫性状(32曰龄)P-值免疫性状 (32日龄) P-值
猪繁殖与呼吸综合征病毒抗 体水平0.7345平均红细胞体积0.1812淋巴细胞绝对值 0.0810
猪瘟病毐抗体水平0攝0平均血红蛋白量0.3848中间白细胞绝对值
伪狂犬抗体水平0.5656平均血红蛋白浓度0.0210*中性粒细胞绝对值
白细胞0.9570血小板0.3499红细胞分布宽度 0.3037
红细胞0.6005淋巴细胞0,0573血小板分布宽度 0.1809
血红蛋白0.7182中间白细胞血小板体积 0.1017
红细胞压积0.5236中性粒细胞大血小板比率 0.3082
注"表示P〈0. 01， ^表示P〈0. 05。 表6 SNP位点(J567力基因型与初生重、17日龄血小板值和32日龄淋巴细胞百分数、 32日龄淋巴细胞绝对值、32日龄血细胞血红蛋白浓度的关联分析结果基因型(个体初生重(SE)17曰龄lk小板32曰龄淋巴细胞百32日龄淋巴细胞絶32日龄lfli细胞lllL红蛋数)值(SE)分数(SE)对倌(SE)白浓度(SE)
AA(41)174a (0.076)363.44ae (35.69)111.27a(15.83)20.29a (3.39) 346.74ac (31.85)AG(152) 1.664a(0.053)439.57b (25.74)77.14b(11.2S)13.59b (2.41) 264.16d (21.84)GG(165) 1.574b(0.阔462.60f(3.27)79.58b (10.06)13.83a (2.16) 265.50b (18.07)P-、'alue: 0.0366*0.0134*0.05730.08100細8*
实施例4:本发明制备的分子标记与繁殖性状的关联分析
试验猪来自温氏猪场的纯种大白猪，总计165头。繁殖性状取自温氏猪场1997 2001年的繁殖记录资 料，记录项目包括耳号、品种、胎次等。记录的的繁殖性状包括产活仔数(NBA)、总产仔数(TNB)、初 生重(BW)等。胎次的划分按照初产和经产划分，第一胎做为一个胎次，后面的所有胎次做为一个胎次组。 2.基因效应的统计分析
基因型数据ISG15 ( GG、 AG、 M)、繁殖性状总产仔数、产活仔数、初生重；
(1)模型I (基因的独立效应模型) yi =u +a i + pk+ ei
其中yi为性状值，u为总体平均数，Qi为基闵型效应值(i = GG, AG, M) , pk为第k个胎次的同定效 应，ei为随机误差；
ISG15基因对大白猪总产仔数、产活仔数和初生重的效应
在初产母猪中，ISG15各基因型之间产活仔数、总产仔数和初生重的差异不显著(P>0.05) 。 ISG15 基因对大白母猪经产胎次产活仔数、总产仔数和初生重影响显著(P < 0.05),其中，M基因型母猪的产活仔数、总产仔数为最多。GG基因型母猪比AG和AA基因型母猪所产的初生母仔重都高。 表7. SNP位点(Z9W5)基因型与繁殖相关性状的关联分析结果
初产 经产
基因型个体总产仔数产活仔数初生重(冊)总产仔数产活仔数初生重(WB)
数(N)(TNB) (SE)(NBA) (SE)(SE)(，)(SE)(隨)(SE)(SE)
GG5310. 358(0. 329)9. 094(0. 363)11. 700(0. 320)11.949(0. 339)10. 991(0. 337)14. 685(0. 389)
AG749. 973(0.278)8. 730(0. 307)11.007(0. 271)11.707(0.305)10. 846(0. 303)14. 072(0. 349)
AA3810.211(0. 388)8. 974(0. 429)11.650(0. 377)12. 842(0. 337)11.820(0. 335)13. 839(0. 389)
P-value:0. 6610, 7390. 1850.000010. 0010. 028
本发明制备的分子(遗传)标记,通过标记辅助育种，有助于縮短猪育种的选择时间,提高育种效率。_序列表_
<110>华中农业大学
〈120〉与猪免疫与繁殖性状相关的分子标记ISG15 <130>
〈141> 2008-12-19 <歸2
〈170> Patentln version 3. 1
〈210〉 1
<211> 690
<212> DNA
<213〉 猪(Sus scrofa) <220>
<221> gene
<222> (1)..(690) 〈223〉 <220>
<221〉 primer—bind
<222〉 (578), . (600) <223〉
〈220〉
〈221> primer— bind
<222> (166),. (186) 〈223〉 <220〉
<221〉 mutation
<222〉 (390).. (390) 〈223〉 〈220〉
<221> CDS
<222> (166).. (669)
〈223〉
<400〉 1
cattctagaa atgccccctt gccctctcca gtgcccgggg tccccctcct ggagggtggg gagggt鄉g鄉agggeigc 3gceictcctg ggctct鄉a gcttttgccc ceictstgtggtggccctggg sctggtgaca gggtctctga gcctgtgtga
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Ser
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ctg Leu
acg Thr 100 gtg Val
Asp
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etc Leu
225
273
321
369
417
465
513
561
609
657
690165
<210> 2
<211> 167
<212> PRT
<213〉 猪(Sus scrofa)
<400> 2
Met Gly 1
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Leu 5
Lys Val Lys Met
Leu 10
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lie Leu 15
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Ala Arg Glu 35
Asn Val Leu Gin
Cys Met Met Ala Ser Asp Leu Lys Gin Gin lie
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Gly Pro Gly Ser Met 65
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Gly Val Pro Leu
Asp 55
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Leu 45
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Arg Asn Asp Lys
Val 60
Ser Phe Arg Asp
Val 85
Gin Thr Val Ala
Gin 75
Arg Ser Asn Ala
Val Trp Leu Thr 100
Leu Glu Gly Val Gin Ala Asp 115
Glu Asp Glu His
Gly 90
Leu Lys Gin Gin
Glu 105
Phe Trp Leu Thr
Tyr 95 Cys
Pro
80
Glu
Gin
Pro Met Glu Asp Glu His Gin 130 135 Cys Thr Val Tyr Met Asn Leu Arg Leu 145 150 Gly Glu His Leu Thr Glu Cys 165
His 120
Leu Gly Glu Tyr
Val 110
Phe Glu Gly Lys 125
Leu Lys Pro Met
Arg Gly 155
Asp 140
Gly Gly Thr Gly
Pro 160
1权利要求
1、一种与猪免疫与繁殖性状相关的分子标记，其特征在于，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示，并且在序列表SEQ ID NO1的第390bp处有一个A390-G390的碱基突变，导致HindIII-RFLP多态性。
2、 一种筛选猪免疫性状的分子标记的方法，按照以下步骤用人ISG15基因mRNA为信息探针，作同源序列筛选，获得同源性70%以上的表达序列 标签；然后拼接猪表达序列标签-重叠群；与人同源比对，根据表达序列标签-重叠群设计 引物；以成年通城猪脾组织提取总RNA为模板，作RT-PCR扩增、PCR产物纯化和克隆测 序，进行序列分析，获得如序列表SEQ ID NO: l所述的cDNA序列。
3、根据权利要求2所述的方法，其中检测A390G碱基处碱基突变的正、反向引物的 DNA序列如序列表SEQ ID NO: 1所示。
4、权利要求1所述的分子标记在在猪标记辅助选择中的应用。
全文摘要
本发明属于家畜基因工程技术领域，具体涉及一种作为猪标记辅助选择应用的与免疫和繁殖性状相关的分子标记及应用。所述的分子标记由ISG15基因克隆得到，它的cDNA序列如序列表SEQ ID NO1所述。在序列表SEQ ID NO1的第390bp处有一个A390-G390的碱基突变，导致HindIII-RFLP多态性。本发明还公开了HindIII-RFLP多态性所用的引物以及用于多态性检测方法，为猪的标记辅助选择提供了一个新的分子标记。
文档编号C12N15/10GK101434998SQ20081023696
公开日2009年5月20日 申请日期2008年12月23日 优先权日2008年12月23日
发明者梅 余, 朱猛进, 李新云, 李长春, 赵书红, 黄江南 申请人:华中农业大学