专利名称：一种通过agt基因拷贝数预测高原肺水肿发病风险的试剂盒的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及检测用的试剂盒，具体涉及一种通过AGT基因拷贝数预测高原 肺水肿发病风险的试剂盒，用于评定人体高原肺水肿的易感性。
背景技术：
高原肺水肿(high altitude pulmonary edema,缩写HAPE)是一种特发于高 原低氧环境的肺水肿，起病急，先艮快，危害大，如果救治不及时，可在较短 的时间内发展至呼吸衰竭，甚至死亡，是严重威胁i^v高原人群健康和生命的 急性重症高原病。近年的调查表明，在从平原进入海拔3000米以上高原的汉族 人群中，高原肺水肿的发病率高达0.4X-2X。高原肺水肿发病有明显的家族和个 体易感倾向，环境因素和遗传因素均可以影响高原肺水肿的发生。近年来，遗 传因奮在高原肺水肿发病机制中的作用逐渐受到重视张雪峰，高原施工A^ 急性重型高原病患病率调查，《高原医学杂志》，2005; 15(3): 7-8;陈有，高 原肺水肿发病机制研究逸艮，《高原医学杂志》，2005， 15 ( 2 ): 62-64;高钰琪， 高原肺水肿的发病机制及防治，《人民军医》，2005; 482 ( 2 ): 108-111。
肾素-血管紧张素系统(renin- angiotensin system,缩写为RAS)在血压调 节、电解质平衡及高原肺水肿发病中具有非常重要的作用，它由一系列肽类激素 及相应的酶组成，其中AGT经肾素分解形成血管紧张素I ,再经血管紧张素转换 酶作用形成有生物活性的八肽血管紧张素n ，可引起血管收缩，刺激肾脏对钠重 吸收，最终导致高原肺水肿。人类血管紧张素原(angiotensiiiogen，缩写为AGT)基因位于l号染色体q42 43，全长13kb，包括启动子的5'側翼序列、5个外显 子和4个内含子及第1外显子前端的多个调节片段沈志霞，血管紧张素原基 因多态性与原发性高血压之间的关系，《中国现代医学杂 志》，2008, 18 (06): 722-725。目前有文献报道， 一些基因的拷贝数与疾病的易 感性相关，并是一些疾病的遗传标记Braude I，Large scale copy number variation (CNV) at 14ql2 is associated with the presence of genomic abnormalities in neoplasia,《BMC Genomics》，20067: 138，关于AGT拷贝 数与高原肺水胂易感的相关性尚无报道。
通过SYBR (即SYBR GREEN染料，缩写SYBR )定量PCR(聚合S^反应)的 方法检测AGT拷贝数，发现AGT拷贝数与高原肺水肿易感性之间存在相关性， 具体做法是
(1 )健康对照組标本(25例)在成都采集拟进入高原人员静脉血2ml (EDTA 抗凝)，然后与他们一起乘飞机达到拉萨(海拔3658米)，并观察他们在拉萨一 周内没有发生高原肺水肺；
(2)高原肺水肿病例组标本(25例)为与健康对照组标本年龄匹配，按 高原病诊断标准我国高原病命名、分型及诊断标准，(《高原医学杂 志》，1996: 2-4符合高原肺水肿诊断标准的病例。样本收集过程中遵循"赫 尔辛基"宣言，^9f究得到了收集对象的知情同意，采集静脉血2ml (EDTA抗凝)。
(3 )分别用上海生工生物技术服务有限公司UNIQ-10柱式临床样品基因组 抽提试剂盒(货号SK1342 )提取健康对照组标本和高原肺水肿病例组标本血液 白细胞DNA，然后采用定量PCR ( SYBR染料法)的方法分别扩增^对照组标本 和高原肺水肿病例组标本的AGT基因和核基因编码的看家基因Beta-act in;再分别计算每例标本的AGT拷贝数与Beta-acUn的拷贝数的比值，结果经SPSS 12. 0 ( —种统计軟件)中的独立样本T检验进行检验，以P<0. O5为相差显著， 并通过该软件计算出95%的可信区间，以分别得到健康对照组和高原肺水肿病 例组AGT/Beta-actin拷贝数的参考值，结杲发现在高原肺水肿病例组中 AGT/Beta-actin的拷贝数比值显著升高(表1 ).
表l高原肺水肿病例组和健康对照组中AGT/Beta-actin拷贝数比值 健康对照组(n=25 )高原肺水肿病例组(n=25 ) AGT/Beta—actin 0. 0909 ± 0. 0227 0. 1107 ± 0. 0227A
95%可信区间 0. 0806-0.1012 0.1003—0.1210 '高原肺水钟病例组vs健康对照组P=0. 007
发明内容
本发明的目的是提供一种通过AGT基因拷贝数预测高原肺水肿发病风险的
试剂盒，能用于平原人i4^高原前对高原肺水肿易感者的筛选，指导高原肺水
肿的预防和治疗，减轻急性重症高原病的威胁。
本发明所述的一种通过AGT基因拷贝数预测高原肺水胂发病风险的试剂盒，
包括分离包装的AGT引物混合液，Beta-act in引物混合液，PCR反应液，无菌
去离子水，定值标准品，健康对照DNA,其特征是，
所述的AGT引物混合液中的上游引物(F)和下游引物U)的序列为 F: 5' -GCCGTTTCTCCTTGGTCT-3'和R: 5'~GCAAGACGTTTATTACTAACACAAG-3'; 所述的Beta-actin引物混合液中的上游引物和下游引物的序列为 F: 5，-CGGGAAATCGTGCGTGACAT-3，和R: 5，-GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3，； 所述的PCR反应液，含有PCR緩^液、MgCl2、 dNTPs(脱氧核苷三裤酸)、SYBR染料、Ex Taq酶；
所述的定值标准品是用Beta-actin的上下游引物在PTC-200 PCR仪中进行目 的片段的扩增，得到含有目的片段的PCR产物，然后将目的片段插入克隆栽体 pMD18-T中，并将阳性克隆增菌后测序^;从证实含Beta-actin基因片段的菌 液中提取质粒。
所述的一种通过AGT基因拷贝数预测高原肺水肿发病风险的试剂盒，其所 述的健康对照DNA是采集拟进入高原前的人员的静脉血2ml (EDTA抗凝)，并且 到高原后在一周内没有发生高原肺水肺，然后，提取血液白细胞MA，再将DNA 浓度调为50ng/nl。
所述的通过AGT基因拷贝数预测高原肺水肺发病风险的试剂盒，其所述的 AGT引物混合液为100p 1;其中上游引物和下游引物各50m l，浓度均为10pmo1/ "'
所述的一种通过AGT基因拷贝数预测高原肺水胂发病风险的试剂盒，其所 迷的Beta-actin引物混合液为400m 1;其中上游引物和下游引物各200p 1， 浓度均为10pmol/^il。
所述的一种通过AGT基因拷贝数预测高原肺水肺发病风险的试剂盒，其所 述的定值标准品用无菌去离子水倍比稀释为5管，每管体积200Ml，浓度分別 为lx104、 lx105、 lx106、 lxl07、 lxl(T拷贝/微升。
所述的一种通过AGT基因拷贝数预测高原肺水胂发病风险的试剂盒，其所 述的无菌去离子水为1500m 1。
本发明建立了利用定量PCR ( SYBR染料法)方法检测来AGT拷贝数的方法， 能用于平原人进入高原前对高原肺水肿易感者的筛选，指导高原肺水肿的预防和治疗，减轻急性重症高原病的威胁，有利于进入高原A^健康；该试剂盒使
用简单，操作方便，检测快速。
具体实施例方式
本发明所述的通过AGT基因拷贝数预测高原肺水肿发病风险的试剂盒，包
括分离包装的AGT引物混合液，Beta-actin引物混合液，PCR反应液，无菌去
离子水，定值标准品，健康对照DNA;
试剂盒中的AGT引物混合液中的上游引物和下游引物的序列为 F: -GCCGTTTCTCCTTGGTCT-3'和R: 5'~GCAAGACGTTTATTACTAACAaAG-3, ， 试剂盒的Beta-actin引物混合液中的上游引物和下游引物的序列为 F: 5,-CGGGAAATCGTGCGTGACAT-3，和R: 5，-GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3，； 试剂盒中的PCR反应液，含有PCR援冲液、MgCl2、 dNTPs(脱氧核苷三磷酸)、
SYBR染料、ExTaq酶，均直接购于宝生物工程(大连)有限公司，货号DRR041S。 试剂盒中的定值标准品是用Beta-actin的上下游引物在PTC-200 PCR仪中
进行目的片段的扩增，得到含有目的片段的PCR产物，然后将目的片段插入克隆
栽体pMD18-T中，并将阳性克隆增菌后测序验证；从证实含Beta-actin基因片段
的菌液中提取质粒。
试剂盒中的^Li:对照DNA是采集拟进入高原前的人员的静脉血2ml (EDTA抗
凝)，并且到高原后在一周内没有发生高原肺水肿，然后，提取血液白细胞DM，
再将DM浓度调为50ng/nl。
试剂盒中的AGT引物混合液为100ji 1;其中上游引物和下游引物各50p 1，
浓度均为10Pmol/nla
试剂盒中的Beta-actin引物混合液为400p 1;其中上游引物和下游引物各200 ^1，浓度均为10pmol/p 1,
试剂盒中的定值标准品用无菌去离子水倍比稀释为5管，每管体积200p 1， 浓度分别为lx104、 lx105、 lx106、 lx107、 lxi()8拷贝/ul。
试剂盒中的无菌去离子水为1500 ml,
试剂盒中的定值标准品用Beta-actin上下游引物，在PTC-200 PCR仪中进行 扩增，条件为94TC预变性5min， 94X:变性30s， 60C退火30s, 721C延伸45s, 94 t:变性30s， 601C退火30s， 72TC延伸45s……其中94"变性30s， 60"C退火30s， 72 1C延伸45s循环29次，721C终末延伸8fflin， PCR产物经电泳检测后用将目的片段 (扩增产物)插入克隆栽体pMD18-T (购于宝生物工程有限公司)中，并将阳性 克隆增菌后测序發江；
从证实含有Beta-actin基因片段的菌液中提取质粒，采用分光光度仪测得 质粒浓度，再算出摩尔浓度Ct量除以碱基数+ 324. 5 + 10)，再乘以阿拂加的罗 常数(6. 02x1023)，得到质粒的浓度为1 x 108拷贝/^ 1 将质粒进行倍比稀释(共 稀释五个梯度).稀^^将标准品(即上述质粒)分別装在200 m 1小管内，于 -20TC的水箱内^M!"，避免质粒反复冻融导致降解；
健康对照DNA，在成都采集拟进入高原人员静脉血2ml，然后与他们一起乘 飞机达到拉萨，并观察他们一周且在这周内没有发生高原肺水肿，抽取静脉血 2ml (EPTA抗凝)并提^jk液白细胞DM。
该试剂盒的使用说明
第一步,待測个体样品准备，采用上海生工生物技术服务有限公司 ,临床样品基因组抽提试剂盒(货号SK1342 )提取待讲 胞基因组总DNA，然后用紫外分光M仪对DNA进行定量；第二步，PCR反应体系配制，共配制十管； 第一管到第五管为定值标准品，共5管，浓度分別为 取10 n 1浓度为1 x 108拷贝/ y 1的质粒；
取10yl浓度为lxlO-拷贝/jiil的质粒，加入90nl无菌去离子水，混匀
得到浓度为lxl(r拷贝/p 1的质粒；
取IOH 1浓度为1 x 10'拷贝/jii 1的质粒，加入90p 1无菌去离子水，混匀
得到浓度为lxl(^拷贝/M 1的质粒;
取10pl浓度为lxl()6拷贝/yi的质粒，加入90y l无菌去离子水，混匀
得到浓度为lxl()5拷贝/ial的质粒；
取10pl浓度为1 x 105拷贝/^1 1的质粒，加入90p 1无菌去离子水，混匀 得到浓度为lxl()4拷贝/y 1的质粒；
各取0.5pl浓度从"104至lxl()8拷贝/iil的标准品，然后，每管, 次加入Beta-actin引物混合液lnl， PCR反应液12. 5 n 1，无菌去离子水11 pl，混匀；
第六管为待测个体AGT的扩增，取待测个体的DM 0. 5nl，然后依次加入 AGT引物混合液lpl, PCR反应液12.5^1，无菌去离子水llnl,混匀；
第七管为待測个体看家基因Beta-act in的扩增，取待測个体的DNA 0.5p 1，然后依次加入Beta-actin引物混合液lpl， PCR反应液12. 5 ji 1，无菌去 离子水llMl，混匀；
第八管为空白对照，分別取Beta-acUn引物混合液lpl, PCR反应液12. 5 Ul，无菌去离子水11.5nl，混匀；
第九管为M对照样本AGT的扩增，取对照DM 0. 5 ji 1，然后依次加入AGT引物混合液lMl, PCR反应液12.5jil，无菌去离子水llpl，混匀；
第十管为健康对照样本看家基因Beta-actin的扩增，^照DM 0. 5pl， 然后依次加入Beta-act in引物混合液l卩l， PCR反应液12. 5 y 1，无菌去离子 水llpl，混匀；
第三步，PCR扩增条件，将第二步的十管已经混匀的物质分別放入Opt icon monitor 1定量PCR仪中，均按以下糾进行PCR反应95*0预变性10s; 95 1C变性5s，60X:退火延伸20s，读板，重复39个循环；
其中，AGT引物扩增产物长度为444bp，序列如下
gccgtttctccUggtctaagtgtgctgcatggagtgagcagtagaagcctgcagcggcacaaa
tcaagttgagaacaaaaattgggtUtaaaattaaagtatacatttttgcattgccttcggtttgtat Uagtgtcttgaatgtaagaacitgacctccgtgtagtgtctgtaataccttagttttttccacagat gcttgtgatuttgaacaatacgtgaaagatgcaagcacctgaatttctgtttgaatgcggaaccata gctggttatttctcccttgtgttagtaataaacgtcttgcj
Beta-actin引物扩增产物长度为180bp，序列如下
ccatggtggccyccagctcctccctggagaagagctacaagctgctcgatggccaggtcatcaccatc ggcaacgagcggttccactgccccg8ggcgctcttccagccttccttc。
第四步，数据分析，PCR反应结束后，定量PCR仪通过比较待测标本的Ct 值与标准曲线Ct值，自动生成每例样本AGT和Beta-act in的拷贝数，然后， 用AGT拷贝数除以Beta-actin拷贝数，分別求得待测个体和对照的AGT/Beta-actin拷贝数比值，如果对照的AGT/Beta-actin (第九管/第十管) 拷贝数比值位于0. 0806-0. 1012之间时，提示我们实验准确性和灵敏度可信， 当此时待测个体AGT/Beta-act in (第六管/第七管)的拷贝数比值位于高原肺水 肿易感者的该基因拷贝数(0. 1003-0. 1210)之间时，提示我们该个体有可能就 是高原肺水肿的易感个体。
第一至第五管为定值标准品的扩增，以获得标准曲线；
第六、七管是为了获得待测个体的AGT基因和Beta-actin基因的拷贝；
第八管为空白对照管，以检测整个PCR过程中是否有污染；
第九、十管是为了获得健康对照的AGT基因和Beta-actin基因的拷贝数。序列表
<110>中国人民解放军第三军医大学
<120> —种通过AGT基因拷贝数预测高原肺水肺发病风险的试剂盒 <130〉
<140>200810232915.X <141>2008-10-24 <160> 6
<170> Patentln 3. 3
<210> 1 <211> 18 <212> DM <213>人工合成 <221> AGT上游引物 <糊> 1
gccgtttctc cttggtct 18
<210> 2 <21〗)25 <212> DM <213>人工合成 <221> AGT下游引物 <400> 2
gcaagacgtt tattactaac acaag 25
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213>人工合成
<221> Beta-actin上游引物
<400> 3
cgggaa"cg tgcgtgacat 20
<210> 4
<211> 20
<212>腿
<213>人工合成
<221> Beta-actin下游引物
<400> 4
gaaggaaggc tggaagagtg 20<210> 5
<211> 444
<212〉 DM
<213> AGT核酸序列
<221> AGT PCR扩增产物
<400> 5
gccgtttctccttggtctaa gtgtgctgcatggagtgagc agt柳agcc tgcagcggca60
caaatgcacctccc汪gtttg ctgggttUttttagagaat gggggtgggg aggcaagaac120
cagtgtttagcgcgggacU ctgttccaaaa汪gaattcca accgaccagc ttgtttgtga180
tgttcccttt tcaagttgagaacaaaaatt gggttttaaa attaaagtat240
acatttttgcattgccttcg gtttgtatttagtgtcttga atgtaagaac atgacctccg300
tgtagtgtctgtaatacctt agttttttccacagatgctt gtgatttttg aacaatacgt360
gaaagatgcaagcacctgaa tttctgtttgaatgcggaac catagctggt tatttctccc420
ttgtgtUgtaataaacgtc ttgc444
<210> 6
<211> 180
<212> DM
<213> Beta-
<221〉 Beta-actin PCR扩增片段
<400〉 6
cggg,tcgtgcgtgacat caagaagctgtgctacgtcg ccctggactt cgagcgggag60
atggccatggtggccyccag ctcctccctggagaagagct acaagctgct cgatggccag120
gtcatcaccatcggcaacga gcggttccactgccccgagg cgctcttcca gccttccttc180
权利要求
1、一种通过AGT基因拷贝数预测高原肺水肿发病风险的试剂盒，包括分离包装的AGT引物混合液，Beta-actin引物混合液，PCR反应液，无菌去离子水，定值标准品，健康对照DNA，其特征是，所述的AGT引物混合液中的上游引物和下游引物的序列为F5’-ATACAACTACGCAAAGGCCCCA-3’和R5’-AATAGGAGGCCTAGGTTGAGGT-3’；所述的Beta-actin引物混合液中的上游引物和下游引物的序列为F5’-CGGGAAATCGTGCGTGACAT-3’和R5’-GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3’；所述的PCR反应液，含有PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、SYBR染料、Ex Taq酶；所述的定值标准品是用Beta-actin的上下游引物在PTC-200PCR仪中进行目的片段的扩增，得到含有目的片段的PCR产物，然后将目的片段插入克隆载体pMD18-T中，并将阳性克隆增菌后测序验证；从证实含Beta-actin基因片段的菌液中提取质粒。
2、 根据权利要求1所述的一种通过AGT基因拷贝数预测高原肺水肿发病风 险的试剂盒，其特征是，所述的健康对照DNA是釆集拟进入高原前的人员的静 脉血2ml)，并且到高原后在一周内没有发生高原肺水肿，然后，提取血液白细 胞DNA，再将DNA浓度调为50ng/n 1。
3、 根据权利要求1所述的一种通过AGT基因拷贝数预测高原肺水肿发病风 险的试剂盒，其特征是，所述的AGT引物混合液为100jLil;其中上游引物和下 游引物各50pl，浓度均为10pmol/y 1。
4、 根据权利要求1所述的一种通过AGT基因拷贝数预测高原肺水肿发病风 险的试剂盒，其特征是，所述的Beta-actin引物混合液为400 pl;其中上游 引物和下游引物各200 u 1,浓度均为10pmol/" 1。
5、 根据权利要求1所述的一种通过AGT基因拷贝数预测高原肺水肿发病风 险的试剂盒，其特征是，所述的定值标准品用无菌去离子水倍比稀释为5管，每 管体积200 m 1，浓度分別为1 x 104、 1 x 105、 1 x 106、 1 x 107、 1 x 108拷贝/^ 1。
6、 根据权利要求1所述的一种通过AGT基因拷贝数预测高原肺水肿发病风 险的试剂盒，其特征是，所述的无菌去离子水为！500)i 1。
全文摘要
本发明涉及一种通过AGT基因拷贝数预测高原肺水肿发病风险的试剂盒，包括分离包装的AGT引物混合液，Beta-actin引物混合液，PCR反应液，无菌去离子水，定值标准品，健康对照DNA，其特征是，所述的AGT引物混合液中的上游引物和下游引物的序列为F5’-ATACAACTACGCAAAGGCCCCA-3’和R5’-AATAGGAGGCCTAGGTTGAGGT-3’；所述的Beta-actin引物混合液中的上游引物和下游引物的序列为F5’-CGGGAAATCGTGCGTGACAT-3’和R5’-GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3’。本发明能用于平原人进入高原前对高原肺水肿易感者的筛选，指导高原肺水肿的预防和治疗，有利于进入高原人群健康；该试剂盒使用简单，操作方便，检测快速。
文档编号C12Q1/68GK101418344SQ20081023291
公开日2009年4月29日 申请日期2008年10月24日 优先权日2008年10月24日
发明者刘福玉, 罗勇军, 高文祥, 高钰琪 申请人:中国人民解放军第三军医大学