专利名称：人抗凝血酶Ⅲ的表达方法及其专用表达载体和工程菌的利记博彩app
技术领域：
本发明属于基因工程和微生物发酵工程领域中人抗凝血酶m的发酵表达方法及 其专用表达载体和工程菌。
技术背景人抗凝血酶ni (AT-in)是血浆中重要的生理性抗凝血因子，在维持血液的凝血与抗凝血平衡中起重要作用，承担血浆中70%的生理性抗凝血酶活性，在肝素的作用下 通过与凝血酶和因子Xa的结合发挥抗凝作用，其缺乏将易导致血栓形成。国外在临 床上已经广泛使用，用于多种疾病的治疗，包括弥散性血管内凝血(DIC)、先天 及后天获得性AT-m缺乏症、败血症等(Int Angiol. 2007,26:53-63; Angiology. 2007,58:85-91)。尤其是针对DIC的治疗，效果极为显著。DIC在欧美每年的发病率 约为50万例，死亡率超过50%，仅美国即有20-30亿美元市场，美国GTC公司生产 的转基因AT-III用于DIC在欧盟已进入II期临床(www. gtc-bio.com)。另外，最新研究 结果表明，AT-III可以缓解抗凝常用药肝素形成的耐药性(Ann Thorac Surg. 2008,85:2153-60)，这也预示着其更加广阔的市场前景。AT-m主要由肝脏合成，是一种单链糖蛋白，属于Serpin (丝氨酸蛋白酶)家族， 分子量58200，人抗凝血酶基因位于第1号染色体长臂(lq23-25)，长约16kb，包 括7个外显子和6个内含子，其mRNA长为1.5Kb，编码432个氨基酸的成熟蛋白，有 重要功能的区域如酶结合区(反应位点)、肝素结合位点、构象敏感的色氨酸以及s-s 交联等。AT-III的主要作用机制为羧基端Arg393-Ser394肽键发生断裂，在a羧基 和蛋白酶的活性中心Ser羟基间形成酯键。目前，AT-m已经在多种生物体系中进行 基因重组研究；先后在五coli， CHO、 cos细胞系等系统对AT-in进行了表达。2000 年5月，美国Genzyme公司用乳腺生物反应器生产的基因药物rhAT，已被FDA批准用 于临床，这也是世界上第一个被FDA批准用于临床的由转基因动物生产的基因药物。 2008年，中国青岛淼淼公司成功构建了分泌rhAT的转基因山羊(生物工程学报24: 117-123)，并于2006年申请了专利(CN 1840187A)。但是，国内还未看到用毕赤 酵母进行AT-m表达的研究。 发明内容本发明提供了一种用于表达人抗凝血酶m (AT-in)的巴斯德毕赤酵母表达载体。本发明所提供的用于表达人抗凝血酶III的巴斯德毕赤酵母表达载体，是含有人抗 凝血酶III编码基因的重组毕赤酵母表达载体。为延长mRNA的寿命，防止通读，所述载体中人抗凝血酶III编码基因的终止密码子后还添加有如序列表中序列1所示的核苷酸序列，使之形成稳定的二级结构。此外，为方便操作，还可根据上述经改造的人抗凝血酶III编码基因序列和限制性 内切酶的基因特征序列在所述经改造的人抗凝血酶m编码基因序列中引入若干限制 性内切酶识别位点。所述在终止密码子后添加有序列表中序列1所示核苷酸序列，以及fc0y I和 7fot I两个限制性内切酶识别位点的人抗凝血酶III编码基因可经PCR扩增获得，扩增 引物可具有序列表中序列2和序列3的核苷酸序列。用于构建含有人抗凝血酶III编码基因的毕赤酵母表达载体的出发载体可为任意 一种适于外源基因表达的毕赤酵母表达载体，如pPIC9K、 pPICza A或pPICZA等。以pPIC9K为出发载体，构建的含有上述人抗凝血酶III编码基因及添加序列的重 组毕赤酵母表达载体为9K-AT。上述重组毕赤酵母表达载体可按照生物工程领域中的常规方法构建。本发明的第二个目的是提供一种用于表达人抗凝血酶m的巴斯德毕赤酵母工程菌。本发明所提供的表达人抗凝血酶m的巴斯德毕赤酵母工程菌，是将含有上述人抗 凝血酶m的重组毕赤酵母表达载体导入毕赤酵母中得到的。所述毕赤酵母可为任意适于蛋白表达的毕赤酵母菌株，如毕赤酵母GS115或X-33 菌株等。以毕赤酵母GS115为出发菌株，构建的转化有9K-AT的重组毕赤酵母菌株为GS115 / 9K-AT。将重组毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母的方法优选为电击转化法，但也可以采用 其它生物工程领域中常用的方法，例如电击转化法、乙酸锂转化法、原生质体转化法 等。本发明的另一个目的是提供一种人抗凝血酶III的表达方法。本发明所提供的人抗凝血酶ni的表达方法，是发酵上述用于表达人抗凝血酶m的 巴斯德毕赤酵母工程菌，得到人抗凝血酶m。发酵上述重组毕赤酵母时需加入甲醇诱导剂，所加入甲醇的浓度为0. 5-1%。为补偿甲醇的损失，每24小时还要补加甲醇，使菌液中的甲醇浓度保持在0.5-1 %，诱导温度为28'C。所述百分浓度均为体积百分浓度。用上述方法获得的人抗凝血酶III也属于本发明的保护范围。本发明提供了一种人抗凝血酶m的表达方法及其专用表达载体与工程菌。用本发 明的巴斯德毕赤酵母表达载体及工程菌进行人抗凝血酶m的表达，弥补了传统人抗凝 血酶ni制备方法以及原核表达系统表达方式的不足；此外，若将本发明应用于工业化 人抗凝血酶in的生产，可获得高水平表达且纯度较高的人抗凝血酶m，并具有操作简 单，原料生物体生长周期短，生产规模大(可以高密度发酵)，提取成本低，酶活性 高的优点，具有重要的工业应用前景和实际意义。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图i为经改构设计的人抗凝血酶in基因的pcR扩增图谱图2为重组巴斯德毕赤酵母表达载体9K-AT的酶切鉴定图谱 图3为重组巴斯德毕赤酵母表达载体9K-AT的结构示意图 图4为重组人抗凝血酶III表达产物的Western blot鉴定图谱具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。下面列举具体实施例对本发 明进行说明，以下具体实施例只用于对本发明作进一步说明，不代表对本发明保护范 围的限制。其他人根据本发明做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。实施例i、人抗凝血酶m在巴斯德毕赤酵母中的表达一、重组巴斯德毕赤酵母表达载体9K-AT的构建和鉴定(1) 人抗凝血酶III基因的改构设计根据GenBank中人抗凝血酶III (AT-III)的基 因序列(GenBank号P01008)，在终止密码子后引入如序列表中序列1所示的一段 核苷酸序列，使之形成稳定的二级结构，以延长mRNA的寿命，防止通读。再根据设 计改构的序列和限制性内切酶的基因特征序列引入限制性内切酶&^ I和7fetl的识 别位点。根据上述基因序列设计的PCR扩增引物序列为正向引物5'-CGGAATTCCACGGGAGCCCTGTGGACATCTGC-3，(序列表中序列2)，反向引物5， -TTTATAGCGGCCGCAGGAAGAGGTGCAAAGAATAAGAAC-3，(序列表中序列3)。(2) 人抗凝血酶III基因的扩增以携带人抗凝血酶ni全长cDNA的质粒PC-AT (中 国生物制品学杂志，2002， 15:161-163)为模板，利用上述引物PCR扩增人抗凝血酶III 基因，PCR扩增条件为94°C 30s， 55°C 45s， 72°C 150s， 40个循环。通过PCR切 除编码32个氨基酸信号肽的96个碱基。反应结束后，对PCR扩增产物进行1X琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图l所示(泳道l: DL2000分子量标准；泳道2: PCR扩增去除信号肽序列的AT-III cDNA)，回收长度约1300bp的目的片段并对其进行纯 化。(3) 序列测定将纯化后的PCR扩增产物克隆进pGEM-T载体(购自Promega公司) 中，将重组载体转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，筛选出阳性克隆，提取质粒DNA， 用限制性内切酶^coWI和I进行双酶切鉴定，经酶切获得了 1300bp和3000bp左 右的DNA片段，与预期结果相符。再对其进行测序，测序结果表明经PCR扩增获得了 序列正确的目的片段，长度约为1300bp。(4) 重组巴斯德毕赤酵母表达载体9K-AT的构建将测序正确的目的基因克隆至 穿梭质粒pPIC9K (Invitrogen)中构建重组质粒，再将重组质粒转化大肠杆菌DH5a 感受态细胞，利用含100 mg/L氨苄青霉素的LB抗性平板筛选阳性克隆，提取质粒DNA， 以步骤(1)所用引物进行PCR鉴定，经PCR扩增可获得1300bp左右目的条带的为阳 性克隆质粒，再对阳性克隆质粒用EcoRl和/或Notl进行酶切鉴定，结果如图2所 示(泳道l: 9K-AT;泳道2: DNA分子量标准DL2000;泳道3: 9K-AT/EcoRI+Not I; 泳道4: 9K-AT/EcoR I;泳道5: 9K-AT/Not I)，经^cot I和淑I酶切获得了约1300bp 的目的片段，与预期结果相符，证明获得了序列及插入位置均正确的携带经改构设计 的人抗凝血酶III基因的重组巴斯德毕赤酵母表达载体，命名为9K-AT，其结构示意图 如图3所示。二、携带人抗凝血酶III基因的重组毕赤酵母工程菌的构建(1) GS115酵母感受态细胞的制备取10-20 p 1冻存的GS115酵母细胞接种于5mL YPD培养液(1% Yeast Extract, 2% p印tone，高压灭菌后，加入除菌的溶液至如下 终浓度2% glucose)中，过夜(12-16小时)培养后取0. 1-0. 5mL至500mL新鲜YPD 培养液中，培养过夜至OD,为1.3-1.5，然后4。C、 1500g离心5分钟收集菌体，用冰 冷无菌的去离子水洗涤细胞，以1/25体积冰浴的无菌1M山梨醇洗涤，离心后以1/500体积冰浴的无菌山梨醇重悬，备用。(2) 重组巴斯德毕赤酵母表达载体9K-AT转化酵母细胞GS115:将鉴定正确的阳性 质粒9K-AT，用5"W I酶切线性化，以Wizard DNAClean-Up system (购自Promega公 司)回收线性化载体。然后，将5nl线性化的质粒DNA与65y 1 GS115酵母感受态 细胞混合，进行电转化，电击条件1500V， 25uF， 200 Q。以MG (1.34% YNB， 1 % glycerol, 1.5%琼脂，高压灭菌后，加入除菌的溶液至如下终浓度4X10-5% biotin， ±0.004% histidine， 2. 0mg/ml G418)和丽(1. 34% YNB， 0. 5% methanol, 1. 5%琼脂，高压灭菌后，加入除菌的溶液至如下终浓度4X 10-5% biotin， ±0. 004% histidine， 2.0rag/ml G418)平板筛选高拷贝G418阳性转化子。提取重组酵母菌 的全基因组DNA，在步骤(1)所用引物的引导下进行菌落PCR鉴定，经PCR扩增可获 得约1300bp目的条带，与预期结构相符，证明获得了携带人抗凝血酶III基因的重组 毕赤酵母工程菌，命名为GS115/9K-AT。三、重组毕赤酵母工程菌GS115 / 9K-AT的表达及表达产物鉴定 (1)重组毕赤酵母工程菌GS115 / 9K-AT的表达及鉴定挑取阳性克隆单菌落于BMGY 培养基(1% Yeast Extract, 2% p印tone， lOOraM磷酸钾缓冲液pH6.0， 1.34% YNB， 1% glycerol,高压灭菌后，加入除菌的溶液至如下终浓度，4X10-5% biotin) 中，在28。C下培养至OD,为2-6时，3000g离心收集细胞，重悬于B腿Y(1X Yeast Extract, 2% p印tone， lOOraM磷酸钾缓冲液pH6. 0， 1.34% YNB， 0.5% methanol, 高压灭菌后，加入除菌的溶液至如下终浓度，4X10-5% biotin)培养基中继续培 养，每天补充甲醇进行诱导表达，使其终浓度为0.5-1%，不同时间取样，离心取上 清，进行10% SDS-PAGE检测，经检测可获得58KD目的条带，与预期结构相符，再 在一抗兔抗人AT-III单克隆抗体(购自上海生物制品研究所)和二抗辣根酶标记山羊 抗兔IgG(H+L)(购自中山公司)的作用下对表达作进一步的Western blot鉴定，鉴 定结果如图4所示(泳道l:阴性对照；泳道2:阳性对照；泳道3:表达产物)，鉴定结果表明用本发明的工程菌及表达方法可获得高水平表达的人抗凝血酶m。(2 )重组蛋白的纯化发酵液离心取上清，用0. 45 u m滤膜过滤后上H印arin-hyperD 柱(购自BioS印ra⑧公司)，流速为20cm/h，用0, 02M pH7. 5磷酸缓冲液+0. 12MNaCl 洗脱未结合杂蛋白；用0. 02M pH7. 5磷酸缓冲液+0. 27M NaCl洗脱弱结合蛋白；以磷 酸缓冲液+2MNaCl洗脱结合蛋白。对纯化蛋白进行10% SDS-PAGE检测，经检测可获 得约58KD目的条带，与预期结果相符，再在一抗兔抗人AT-III单克隆抗体和二抗辣根 酶标记山羊抗兔IgG(H+L)的作用下对表达作进一步的Western blot鉴定，鉴定结果 表明用本发明的工程菌及表达方法获得了高水平表达且纯度较高的人抗凝血酶III。(3)鉴定正确后转入发酵罐中生长重组人抗凝血酶m:挑取阳性单菌落，接入YPD 培养基，摇床培养过夜，然后转接入发酵罐生长，每24小时流加补充甲醇。对发酵 产物进行纯化，并对纯化蛋白进行10% SDS-PAGE检测，经检测可获得约58KD目的 条带，与预期结果相符，再在一抗兔抗人AT-III单克隆抗体和二抗辣根酶标记山羊抗 兔lgG(H+L)的作用下对表达作进一步的Western blot鉴定，鉴定结果表明用本发明 的工程菌及表达方法可获得高水平表达且纯度较高的人抗凝血酶III，并可进行大规模 工业化生产。序列表<160〉 3<210> 1<211〉 45〈212〉 腿 <213〉人工序列<220> 〈223〉<■〉 1taaaatgttc ttattctttg cacctcttcc tgcggccgct ataaa 化<210〉 2<211〉 32<212> DNA〈213〉 人工序列<220〉 〈223〉〈400〉 2cggaattcca cgggagccct gtggacatct gc 32<210> 3〈211> 39<212> 薩 〈213〉人工序列〈220>〈223〉 〈400〉 3tttatagcgg ccgcaggaag aggtgcaaag aataagaac 39
权利要求
1、用于表达人抗凝血酶III的巴斯德毕赤酵母表达载体，是含有人抗凝血酶III编码基因的重组毕赤酵母表达载体。
2、 根据权利要求i所述的巴斯德毕赤酵母表达载体，其特征在于所述载体中 人抗凝血酶ni编码基因的终止密码子后添加有如序列表中序列i所示的核苷酸序列。
3、 根据权利要求2所述的巴斯德毕赤酵母表达载体，其特征在于还可在所述经改造的人抗凝血酶m编码基因序列中引入若干限制性内切酶识别位点。
4、 根据权利要求3所述的巴斯德毕赤酵母表达载体，其特征在于所述在终止密码子后添加有序列表中序列1所示核苷酸序列，以及fcoi I和I两个限制性内切酶识别位点的人抗凝血酶m编码基因可经pcr扩增获得，扩增引物具有序列表中序列2和序列3的核苷酸序列。
5、 根据权利要求l-4任一项所述的巴斯德毕赤酵母表达载体，其特征在于用 于构建含有人抗凝血酶III编码基因的毕赤酵母表达载体的出发载体为pPIC9K、 pPICz a A或pPICZA;以pPIC9K为出发载体，构建的含有所述人抗凝血酶III编码基因 及添加序列的重组毕赤酵母表达载体为9K-AT。
6、 用于表达人抗凝血酶III的巴斯德毕赤酵母工程菌，是将权利要求1-5任一项所述的含有人抗凝血酶in的重组毕赤酵母表达载体导入毕赤酵母中得到的。
7、 根据权利要求6所述的巴斯德毕赤酵母工程菌，其特征在于所述毕赤酵母 为毕赤酵母GS115或X-33菌株；以毕赤酵母GS115为出发菌株，构建的转化有9K-AT 的重组毕赤酵母菌株为GS115 / 9K-AT。
8、 一种人抗凝血酶III的表达方法，是发酵权利要求6或7所述的用于表达人抗 凝血酶III的巴斯德毕赤酵母工程菌，得到人抗凝血酶III。
9、 根据权利要求8所述的表达方法，其特征在于发酵所述重组毕赤酵母时需 加入甲醇诱导剂，所加入甲醇的浓度为0. 5-1%。
10、 用权利要求8或9所述方法获得的人抗凝血酶III。
全文摘要
本发明公开了一种人抗凝血酶III的发酵表达方法及其专用表达载体和工程菌。用于表达人抗凝血酶III的巴斯德毕赤酵母表达载体，是含有人抗凝血酶III编码基因的重组毕赤酵母表达载体。用于表达人抗凝血酶III的巴斯德毕赤酵母工程菌，是将所述含有人抗凝血酶III的重组毕赤酵母表达载体导入毕赤酵母中得到的。用本发明的巴斯德毕赤酵母表达载体及工程菌进行人抗凝血酶III的表达，弥补了传统人抗凝血酶III制备方法以及原核表达系统表达方式的不足；此外，若将本发明应用于工业化人抗凝血酶III的生产，则具有操作简单，原料生物体生长周期短，生产规模大(可以高密度发酵)，提取成本低，酶活性高的优点，具有重要的工业应用前景和实际意义。
文档编号C12R1/84GK101402968SQ20081022650
公开日2009年4月8日 申请日期2008年11月13日 优先权日2008年11月13日
发明者乔志新, 群 于, 鹏 任, 宋丽雅, 李伟静, 谢冰洁, 敏 贺 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所