专利名称：：一种用于检测白血病病毒载量的标准品及其检测方法
技术领域：
：本发明属于分子生物学领域，涉及一种用于检测Friend鼠白血病病毒(Fr.MuLV)载量的标准品以及用该标准品通过实时荧光定量聚合酶链式反应方法(Real-timeRT-PCR法)检测Friend鼠白血病病毒(Fr.MuLV)载量的方法。技术背景白血病病毒(leukemiavirus),是一类肿瘤病毒，它是骨髓性白血病或淋巴性白血病等各种白血病的病因，有许多毒株。在组织培养的细胞体系中，有时可以引起骨髓芽球和淋巴球等特定的靶细胞发生转化，但缺乏普遍性。感染于纤维芽细胞后会发生增殖，但不引起转化。主要有三类(1)禽白血病病毒(Avianleukosisvirus,ALV):为V.Ellerman禾口0.Bang(1908)所分离。(2)鼠白血病病毒(Murineleukosisvirus,MuLV):由L.Gross(1951)分离，后来又从自然产生的及放射线或致癌物诱发的白血病体中分离出来。(3)其他1960年以后自各种实验动物及猿猴中分离的白血病病毒，主要是猫白血病病毒(Felineleukemixvirus，FeLV)。有的毒株不仅能使原来的寄主动物发生白血病，还可引起不同种类的动物发病。同时，它和具有共同寄主的肉瘤病毒关系密切，其中的缺陷毒株(不完全病毒)可作为疱疹病毒起作用，而完全型肉瘤病毒能制备基因重组体。在同种病毒中，也有的以内在病毒的形式，处于整合到正常动物基因中的状态，并通过生殖细胞一代代传递下去。目前国内外尚无检测Friend鼠白血病病毒(Fr.MuLV)载量方法的报道。
发明内容本发明的目的在于提供一种用于检测Friend鼠白血病病毒载量的标准品，本发明的另一个目的在于提供一种用该标准品通过实时荧光定量聚合酶链式反应方法(Real-timeRT-PCR法)检测Friend鼠白血病病毒载量的方法。本发明目的是通过如下技术方案实现的本发明提供的用于检测Friend鼠白血病病毒载量的标准品，其包含用引物对逆转录扩增获得核酸片段，其中所述病毒基因序列的引物对分别是5'-CAACCACCCTCTGTGGACTT-3'和5'-TGTAAACCGGATAGCCAAGG-3';5'-CGTGTTCAACGCTCTCAAAA-3'和5'-CAAGTCCACAGAGGGTGGTT-3';5'-GTGGCCTACCTGTCCAAAAA-3'和5'-GAAGCAGAGCCTGGTAGTGG-3';5'-CTGGAAGCCCTCCTCTTCTT-3'和5'-AAGTAAGCCCTGGGTCCTGT-3';上述引物依次如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8所本发明用上述标准品通过实时荧光定量聚合酶连式反应方法(RT-PCR法)检测Friend鼠白血病病毒载量的方法包括如下步骤(1)制作病毒液将Friend鼠白血病病毒(Fr.MuLV)按I:IO用磷酸盐缓冲溶液(PBS)稀释，给小鼠腹腔注射，每只0.3ml，待发病后，脾脏无菌取出，研磨，用DMEM制成每体积份含O.l重量份脾脏的悬液，在4T下以2X103r/min的速度离心10-15min，取上清液作为病毒液，备用；(2)制作标本取小鼠，用上述病毒液腹腔注射，感染小鼠，解剖取脾组织，冻存于-8(TC，备用；(3)白血病病毒核酸(RNA)的提取及含量测定总RNA提取将上述作为标本的小鼠脾组织放入研钵中，加入液氮，研磨，待组织变软，再加液氮，再研磨；将研碎的小鼠脾组织转入离心管中，每50100mg小鼠脾组织加入lmlTrizol试剂，混合至重悬；水平放置离心管，室温孵育20min，于4。C下以12000rpm的速度离心10min;移上清液入l.5ml离心管中，加入0.2ml氯仿，摇动离心管15s，室温孵育23min;于4"C下以12000rpm的速度离心15min;移上层水相到l.5ml离心管中，加入O.5ml异丙醇，混匀，室温孵育30min，于4。C下以12000rpm的速度离心10min，弃上清液，在沉淀中加入lml75%乙醇，于4。C下以7500rpm的速度离心5min，弃上清液，干燥沉淀，得总RNA;总RNA含量测定总RNA用DEPC处理水(RNase-free水)稀释60倍，用核酸定量仪内置的RNA测定程序读取RNA含量、0D260值、0D260/0D280、蛋白质含量，0D260/0D280比值为1.82.0的RNA保留，备用；(4)逆转录反应将上述提取的RNA用30ul焦碳酸二乙酯处理灭菌，用蒸馏水溶解，进行逆转录反应，用随机引物法合成互补DNA;(5)标准品的制备以互补DNA为模板，加入引物对，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增，其中使用的引物对是5'-CAACCACCCTCTGTGGACTT-3'和5'-TGTAAACCGGATAGCCAAGG-3';5'-CGTGTTCAACGCTCTCAAAA-3'和5'-CAAGTCCACAGAGGGTGGTT-3';5'-GTGGCCTACCTGTCCAAAM-3'和5'-GAAGCAGAGCCTGGTAGTGG-3';5'-CTGGAAGCCCTCCTCTTCTT-3'和5'-AAGTAAGCCCTGGGTCCTGT-3';上述引物依次如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8所将扩增完毕的PCR产物进行l.5%的5XTris-硼酸(TBE)琼脂糖凝胶电泳，将PCR产物切下，采用PCR产物纯化柱提取纯化PCR产物，用紫外分光光度法计测260nm处的吸光度值的值(A26Q)，计算每mlPCR产物的拷贝数，公式为拷贝数/ml=6.02X1023XCXA26。/MW"其中C=5X10—5/ml,匿1=PCR产物的分子量二碱基数X6.58X102，用无菌超纯水将PCR产物调整至每ml1.0X1(T拷贝，得标准品，置-20'C保存，备用；(6)实时荧光定量聚合酶连式反应(Real-timePCR)检测反应总体积为25n1，反应体系含10倍系列稀释的标准品的互补DNA或以同法制备的样品的互补DNA2u1，浓度为20pmol/ul的每种引物各ly1，PowerSYBRGREEN12,5ul，用灭菌双蒸水补足到25u1;Real-timePCR反应在实时荧光定量PCR仪上进行，循环条件为95"C预变性10min;95°C，15s变性；60°C，60s退火与延伸，扩增40个循环，在每个循环的第二步结束时进行荧光检测，分别得到标准品和样品的扩增曲线和Ct值；(7)结果计算与分析利用样本扩增后的Ct值在标准曲线上对应其起始拷贝数，数值使用0pticonMonitor3软件得出。本发明属于分子生物
技术领域：
，涉及一种用于检测Friend鼠白血病病毒(Fr.MuLV)载量的标准品以及用该标准品通过实时荧光定量聚合酶连式反应方法(RT-PCR法)检测Friend鼠白血病病毒(Fr.MuLV)载量的方法。本发明检测Friend鼠白血病病毒(Fr.MuLV)载量与常规PCR检测方法相比，具有较好的特异性，所检测的基因扩增产物为欲检测的目的基因产物，并且具有较好的线性关系，适合应用于对Friend鼠白血病病毒(Fr.MuLV)载量的检测。图l:白血病病毒基因Real-timePCR产物溶解曲线图；图2:白血病病毒基因Real-timePCR产物琼脂糖凝胶电泳图；图3:Real-timePCR扩增Fr.MuLV基因的标准曲线图；图4:各组小鼠脾脏病毒载量随时间变化曲线。下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。实验例1实施例1方法得到的基因PCR产物的鉴定由实施例l方法得得基因扩增产物，对此产物进行鉴定，结果如附图l和附图2。从附图1可知，基因扩增产物溶解曲线只有单一峰值，没有明显的引物二聚体和非特异峰出现，说明扩增产物具有特异性，溶解曲线测定显示Fr.MuLV特异性产物的Tm值为88.1°C，结合附图2可知，目的基因产物片断长度与设计长度148bp相吻合，证明所检测的基因扩增产物为欲检测的目的基因产物。实验例2标准曲线的建立用IO倍系列稀释的标准品(1.0X1(^1.0X107拷贝)为模板，在实时荧光定量PCR仪上扩增结束后，用0pticonMonitor3软件进行数据分析，以起始模板数的对数为x轴，Ct值为y轴做回归曲线，即得Fr.MuLV病毒的检测的标准曲线(附图3)。纯化后的Fr.MuLV标准品cDNA的稀释倍数均为103-107拷贝/mL，在此范围内有极好的线性关系。标准曲线的线性范围较广，至少可达5个数量级。梯度浓度互补DNA标准品的Ct值与该标准品浓度的对数呈线形关系方程式为Y=-3.128X+36.708，回归系数为0.9923;扩增效率为102%。实验例3小鼠脾组织病毒载量的检测根据实施例1的方法制得病毒液，分别将病毒液稀释成2.5%、5.0%、10.0%浓度腹腔注射感染小鼠，于感染后第l、2、3、4周在每个感染浓度取IO只小鼠解剖取脾组织，制作标本，根据实施例1的方法提取白血病病毒RNA，进行逆转录反应，制作标准品，利用实时荧光定量聚合酶连式反应(Real-timePCR)检测Friend鼠白血病病毒载量，结果见表1和附图4。表l不同时间点各组病毒载l复的比较(^士sn=10)感染量脾脏病毒载量(脾悬液)i周(xio)2周(X103)3周(X104)4周(X105)10.0%3.96±0.542.54±0.937.85±1.037.96±1.445.0%3.49±0.3812.ll土l.Ol'6.77±0.7316.89±1.7812.5%2.75±0.26121.57±1.22125.91±1.15'26.05±1.96'2与10.0。/o感染量组比较1尸<0.01;与5.0%感染量组比较2尸<0.01。结果表明病毒感染后，各感染量组小鼠脾脏病毒载量均随时间进行性升高。l周、2周、3周、4周各个感染量组间小鼠脾脏病毒载量均呈极显著性差异(尸<0.01)。下述实施例均能实现上述实验例的效果具体实施例方式实施例l:检测Friend鼠白血病病毒(Fr.MuLV)载量的方法(1)制作病毒液将Friend鼠白血病病毒(Fr.MuLV)按I:IO用磷酸盐缓冲溶液(PBS)稀释，给小鼠腹腔注射，每只0.3ml，待发病后，脾脏无菌取出，研磨，用DMEM制成每体积份含O.l重量份脾脏的悬液，在4。C下以2X103r/min的速度离心10-15min，取上清液作为病毒液，备用；(2)制作标本取BALB/c小鼠，120只，雌雄各半，体重18-22g，将上述病毒液稀释成2.5%、5.0%、10.0%浓度腹腔注射感染小鼠，分别于感染后第l、2、3、4周在每个感染浓度取10只小鼠解剖取脾组织，冻存于-8(TC，备用；(3)白血病病毒核酸(RNA)的提取及含量测定总RNA提取将上述作为标本的小鼠脾组织放入研钵中，加入液氮，研磨，待组织变软，再加液氮，再研磨；将研碎的小鼠脾组织转入离心管中，每50100mg小鼠脾组织加入lmlTrizol试剂，混合至重悬；水平放置离心管，室温孵育20min，于4。C下以12000rpm的速度离心10min;移上清液入l.5ml离心管中，加入0.2ml氯仿，摇动离心管15s，室温孵育23min;于4°。下以12000rpm的速度离心15min;移上层水相到l.5ml离心管中，加入O.5ml异丙醇，混匀，室温孵育30min，于4'C下以12000rpm的速度离心10min，弃上清液，在沉淀中加入lml75%乙醇，于4。C下以7500rpm的速度离心5min，弃上清液，干燥沉淀，得总RNA;总RNA含量测定总RNA用DEPC处理水(RNase-free水)稀释60倍，用核酸定量仪内置的RNA测定程序读取RNA含量、0D260值、0D260/0D280、蛋白质含量，0D260/0D280比值为1.82.0的RNA保留，备用；(4)逆转录反应将上述提取的RNA用30"1焦碳酸二乙酯处理灭菌，用蒸馏水溶解，进行逆转录反应，用随机引物法合成互补DNA;(5)标准品的制备以互补DNA为模板，加入引物对，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增，其中使用的引物对是5'-CAACCACCCTCTGTGGACTT-3'和5'-TGTAAACCGGATAGCCAAGG-3';上述引物依次如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示;将扩增完毕的PCR产物进行l.5%的5XTris-硼酸(TBE)琼脂糖凝胶电泳，将PCR产物切下，采用PCR产物纯化柱提取纯化PCR产物，用紫外分光光度法计测260nm处的吸光度值的值(A26。)，计算每mlPCR产物的拷贝数，公式为拷贝数/ml=6.02X1023XCXA26。/丽"其中C=5X10—5/ml,丽产PCR产物的分子量二碱基数X6.58X102，用无菌超纯水将PCR产物调整至每ml1.0X10，考贝，得标准品，置-2CTC保存，备用；(6)实时荧光定量聚合酶连式反应(Real-timePCR)检测反应总体积为25u1，反应体系含10倍系列稀释的标准品的互补DNA或以同法制备的样品的互补DNA2u1，浓度为20pmol/ul的每种引物各lu1，PowerSYBRGREEN12.5n1，用灭菌双蒸水补足到25u1;Real-timePCR反应在实时荧光定量PCR仪上进行，循环条件为95。C预变性10min;95°C，15s变性；60°C，60s退火与延伸，扩增40个循环，在每个循环的第二步结束时进行荧光检测，分别得到标准品和样品的扩增曲线和Ct值；(7)结果计算与分析利用样本扩增后的Ct值在标准曲线上对应其起始拷贝数，数值使用OpticonMonitor3软件得出，12批Friend鼠白血病病毒(Fr.MuLV)的载量，见表2:表2不同时间点各组病毒载量的比较(^土S，n二10)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>与10.0%感染量组比较01;与5.0%感染量组比较2尸<0.01。实施例2:检测Friend鼠白血病病毒(Fr.MuLV)载量的方法(1)制作病毒液将Friend鼠白血病病毒(Fr.MuLV)按1:10用磷酸盐缓冲溶液(PBS)稀释，给小鼠腹腔注射，每只0.3ml，待发病后，脾脏无菌取出，研磨，用DMEM制成每体积份含O.l重量份脾脏的悬液，在4。C下以2X103r/min的速度离心10-15min，取上清液作为病毒液，备用；(2)制作标本取BALB/c小鼠，120只，雌雄各半，体重18-22g，将上述病毒液稀释成2.5%、5.0%、10.0%浓度腹腔注射感染小鼠，分别于感染后第l、2、3、4周在每个感染浓度取10只小鼠解剖取脾组织，冻存于-80°C，备用；(3)白血病病毒核酸(RNA)的提取及含量测定总RNA提取将上述作为标本的小鼠脾组织放入研钵中，加入液氮，研磨，待组织变软，再加液氮，再研磨；将研碎的小鼠脾组织转入离心管中，每50100mg小鼠脾组织加入lmlTrizol试剂，混合至重悬；水平放置离心管，室温孵育20min，于4。C下以12000rpm的速度离心10min;移上清液入l.5ml离心管中，加入0.2ml氯仿，摇动离心管15s，室温孵育23min;于4。C下以12000rpm的速度离心15min;移上层水相到l.5ml离心管中，加入O.5ml异丙醇，混匀，室温孵育30min，于4。C下以12000rpm的速度离心10min，弃上清液，在沉淀中加入lml75%乙醇，于4。C下以7500rpm的速度离心5min，弃上清液，干燥沉淀，得总RNA;总RNA含量测定总RNA用DEPC处理水(RNase-free水)稀释60倍，用核酸定量仪内置的RNA测定程序读取RNA含量、0D260值、0D260/0D280、蛋白质含量，0D260/0D280比值为1.82.O的RNA保留，备用；(4)逆转录反应将上述提取的RNA用30ul焦碳酸二乙酯处理灭菌，用蒸馏水溶解，进行逆转录反应，用随机引物法合成互补DNA;(5)标准品的制备以互补DNA为模板，加入引物对，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增，其中使用的引物对是<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>上述引物依次如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示;将扩增完毕的PCR产物进行l.5%的5XTris-硼酸(TBE)琼脂糖凝胶电泳，将PCR产物切下，采用PCR产物纯化柱提取纯化PCR产物，用紫外分光光度法计测260nm处的吸光度值的值(A26。)，计算每mlPCR产物的拷贝数，公式为..拷贝数/ml=6.02X1023XCXA测/MW"其中C=5X10—5/ml，丽pPCR产物的分子量二碱基数X6.58X102，用无菌超纯水将PCR产物调整至每ml1.0X1(T拷贝，得标准品，置-2(TC保存，备用；(6)实时荧光定量聚合酶连式反应(Real-timePCR)检测反应总体积为25u1，反应体系含10倍系列稀释的标准品的互补DNA或以同法制备的样品的互补DNA2ul，浓度为20pmol/ul的每种引物各lixl，PowerSYBRGREEN12.5ul，用灭菌双蒸水补足到25u1;Real-timePCR反应在实时荧光定量PCR仪上进行，循环条件为95。C预变性10min;95°C,15s变性；60°C，60s退火与延伸，扩增40个循环，在每个循环的第二步结束时进行荧光检测，分别得到标准品和样品的扩增曲线和Ct值；(7)结果计算与分析利用样本扩增后的Ct值在标准曲线上对应其起始拷贝数，数值使用OpticonMonitor3软件得出，12批Friend鼠白血病病毒(Fr.MuLV)的载量，见表3:表3不同时间点各组病毒载量的比较(^士S，n=10)感染量(脾悬液)脾脏病毒载量I周(XIO)2周(X103)3周(X1(T)4周(X105)10.0%2.90±0.313.88±0.938.57±1.839.67±1.645.0%2.09±0.1813.35土1.21'7.76±0.90'8.69±1,89'2.5%1.57±0.14122.46±1.38'26.19±1.51127.21±1.83'2与10.0%感染量组比较t/^O.01;与5,0%感染量组比较2尸<0.01。实施例3:检测Friend鼠白血病病毒(Fr.MuLV)载量的方法(1)制作病毒液将Friend鼠白血病病毒(Fr.MuLV)按1:10用磷酸盐缓冲溶液(PBS)稀释，给小鼠腹腔注射，每只0.3ml，待发病后，脾脏无菌取出，研磨，用DMEM制成每体积份含O.l重量份脾脏的悬液，在4'C下以2X103r/min的速度离心10-15min，取上清液作为病毒液，备用；(2)制作标本取BALB/c小鼠，120只，雌雄各半，体重18-22g，将上述病毒液稀释成2.5%、5.0%、10.0%浓度腹腔注射感染小鼠，分别于感染后第l、2、3、4周在每个感染浓度取10只小鼠解剖取脾组织，冻存于-8(TC，备用；(3)白血病病毒核酸(RNA)的提取及含量测定总RNA提取将上述作为标本的小鼠脾组织放入研钵中，加入液氮，研磨，待组织变软，再加液氮，再研磨；将研碎的小鼠脾组织转入离心管中，每50100mg小鼠脾组织加入lmlTrizol试剂，混合至重悬；水平放置离心管，室温孵育20min，于4。C下以12000rpm的速度离心10min;移上清液入l.5ml离心管中，加入0.2ml氯仿，摇动离心管15s，室温孵育23min;于4。C下以12000rpm的速度离心15min;移上层水相到l.5ml离心管中，加入O.5ml异丙醇，混匀，室温孵育30min，于4。C下以12000rpm的速度离心10min，弃上清液，在沉淀中加入lml75%乙醇，于4。C下以7500rpm的速度离心5min，弃上清液，干燥沉淀，得总RNA;总RNA含量测定总RNA用DEPC处理水(RNase-free水)稀释60倍，用核酸定量仪内置的RNA测定程序读取RNA含量、0D260值、0D260/0D280、蛋白质含量，0D260/0D280比值为1.82.O的RNA保留，备用；(4)逆转录反应将上述提取的RNA用30ul焦碳酸二乙酯处理灭菌，用蒸馏水溶解，进行逆转录反应，用随机引物法合成互补DNA;(5)标准品的制备以互补DNA为模板，加入引物对，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增，其中使用的引物对是-5'-GTGGCCTACCTGTCCAAAAA-3'和5'-GAAGCAGAGCCTGGTAGTGG-3';上述引物依次如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示;将扩增完毕的PCR产物进行l.5%的5XTris-硼酸(TBE)琼脂糖凝胶电泳，将PCR产物切下，采用PCR产物纯化柱提取纯化PCR产物，用紫外分光光度法计测260nm处的吸光度值的值(A26Q)，计算每mlPCR产物的拷贝数，公式为拷贝数/ml=6.02X1023XCXA柳/MW"其中C=5X10—5/ml,MW^PCR产物的分子量4咸基数X6.58X102，用无菌超纯水将PCR产物调整至每ml1.0X1(T拷贝，得标准品，置-20"C保存，备用；(6)实时荧光定量聚合酶连式反应(Real-timePCR)检测反应总体积为25u1，反应体系含10倍系列稀释的标准品的互补DNA或以同法制备的样品的互补DNA2ul，浓度为20pmol/ul的每种引物各lul，PowerSYBRGREEN12.5ul，用灭菌双蒸水补足到25u1;Real-timePCR反应在实时荧光定量PCR仪上进行，循环条件为95。C预变性10min;95°C，15s变性；60°C，60s退火与延伸，扩增40个循环，在每个循环的第二步结束时进行荧光检测，分别得到标准品和样品的扩增曲线和Ct值；(7)结果计算与分析利用样本扩增后的Ct值在标准曲线上对应其起始拷贝数，数值使用OpticonMonitor3软件得出，12批Friend鼠白血病病毒(Fr.MuLV)的载量，见表4:表4不同时间点各组病毒载量的比较(^士sn=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>与10.0%感染量组比较1尸<0.01;与5.0%感染量组比较2尸<0.01。实施例4:用于检测Friend鼠白血病病毒载量的标准品的制备(1)制作病毒液将Friend鼠白血病病毒(Fr.MuLV)按1:10用磷酸盐缓冲溶液(PBS)稀释，给小鼠腹腔注射，每只0.3ml，待发病后，脾脏无菌取出，研磨，用DMEM制成每体积份含O.l重量份脾脏的悬液，在4'C下以2X103r/min的速度离心10-15min,取上清液作为病毒液，备用；(2)制作标本取BALB/c小鼠，120只，雌雄各半，体重18-22g，将上述病毒液稀释成2.5%、5.0%、10.0%浓度腹腔注射感染小鼠，分别于感染后第l、2、3、4周在每个感染浓度取10只小鼠解剖取脾组织，冻存于-8(TC，备用；(3)白血病病毒核酸(RNA)的提取及含量测定总RNA提取将上述作为标本的小鼠脾组织放入研钵中，加入液氮，研磨，待组织变软，再加液氮，再研磨；将研碎的小鼠脾组织转入离心管中，每50100mg小鼠脾组织加入lmlTrizol试剂，混合至重悬；水平放置离心管，室温孵育20min，于4。C下以12000rpm的速度离心10min;移上清液入l.5ml离心管中，加入0.2ml第仿，摇动离心管15s，室温孵育23min;于4。C下以12000rpm的速度离心15min;移上层水相到l.5ml离心管中，加入O.5ml异丙醇，混匀，室温孵育30min，于4。C下以12000rpm的速度离心10min，弃上清液，在沉淀中加入lml75%乙醇，于4。C下以7500rpm的速度离心5min，弃上清液，干燥沉淀，得总RNA;总RNA含量测定总RNA用DEPC处理水(RNase-free水)稀释60倍，用核酸定量仪内置的RNA测定程序读取RNA含量、0D260值、0D260/0D280、蛋白质含量，0D260/0D280比值为1.82.0的RNA保留，备用；(4)逆转录反应将上述提取的RNA用30u1焦碳酸二乙酯处理灭菌，用蒸馏水溶解，进行逆转录反应，用随机引物法合成互补DNA;(5)标准品的制备以互补DNA为模板，加入引物对，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增，其中使用的引物对是5'-CTGGAAGCCCTCCTCTTCTT-3'禾口5'-AAGTAAGCCCTGGGTCCTGT-3';上述引物依次如SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示;将扩增完毕的PCR产物进行1.5%的5XTris-硼酸(TBE)琼脂糖凝胶电泳，将PCR产物切下，采用PCR产物纯化柱提取纯化PCR产物，用紫外分光光度法计测260nm处的吸光度值的值(A26。)，计算每mlPCR产物的拷贝数，公式为拷贝数/ml=6.02X1023XCXA26。/MW"其中C=5X10—5/ml,丽产PCR产物的分子量^碱基数X6.58X102，用无菌超纯水将PCR产物调整至每ml1.0Xl(^拷贝，得标准品。SEQIDNO:1:5'-CAACCACCCTCTGTGGACTT--3'SEQIDNO:2:5'-TGTAAACCGGATAGCCAAGG--3'SEQIDNO:3:5'-CGTGTTCAACGCTCTCAAAA--3'SEQIDNO:4:5,-CAAGTCCACAGAGGGTGGTT画-3'SEQIDNO:5:5'-GTGGCCTACCTGTCCAAAAA--3'SEQIDNO:6:5'-GAAGCAGAGCCTGGTAGTGG--3'SEQIDNO-7:5'-CTGGAAGCCCTCCTCTTCTT--3'SEQIDNO:8:5'一AAGTAAGCCCTGGGTCCTGT--3'Untitledl.ST25.txtSEQUENCELISTING〈110〉崔，晓兰<120〉一种用于检测白血病病毒载量的标准品及其检测方法〈130〉000〈160〉8〈170〉Patentlnversion3.3<210〉1〈211〉20〈212〉DNA<213〉人工序列〈400〉1caaccaccctctgtggactt20〈210〉2〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈■〉2tgtaaaccggatagccaagg20<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>Untitledl.ST25.txt<210〉6<211〉20〈212〉腿<213>人工序列〈400〉6g卿c聊gcctggtegtgg20〈210〉7<211〉20〈212〉DNA<213〉人工序列〈400>7ctggaagccctcctcttctt20〈210〉8〈211〉20〈212〉腿〈213〉人工序列〈400〉8aagtaagccctgggtcctgt权利要求1、一种用于检测Friend鼠白血病病毒载量的标准品，是用引物对逆转录扩增获得核酸片段，其特征在于所述病毒基因序列的引物对分别是5′-CAACCACCCTCTGTGGACTT-3′和5′-TGTAAACCGGATAGCCAAGG-3′；5′-CGTGTTCAACGCTCTCAAAA-3′和5′-CAAGTCCACAGAGGGTGGTT-3′；5′-GTGGCCTACCTGTCCAAAAA-3′和5′-GAAGCAGAGCCTGGTAGTGG-3′；5′-CTGGAAGCCCTCCTCTTCTT-3′和5′-AAGTAAGCCCTGGGTCCTGT-3′；上述引物依次如SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4、SEQIDNO5、SEQIDNO6、SEQIDNO7、SEQIDNO8所示。2、如权利要求l所述的标准品，其特征在于该标准品由如下方法制成(1)制作病毒液将Friend鼠白血病病毒按I:IO用磷酸盐缓冲溶液稀释，给小鼠腹腔注射，每只0.3ml，待发病后，脾脏无菌取出，研磨，用DMEM制成每体积份含O.l重量份脾脏的悬液，在4。C下以2X103r/min的速度离心10-15min，取上清液作为病毒液，备用；(2)制作标本取小鼠，用上述病毒液腹腔注射，感染小鼠，解剖取脾组织，冻存于-8(TC，备用；(3)白血病病毒核酸的提取及含量测定总RNA提取将上述作为标本的小鼠脾组织放入研钵中，加入液氮，研磨，待组织变软，再加液氮，再研磨；将研碎的小鼠脾组织转入离心管中，每50100mg小鼠脾组织加入lmlTrizol试剂，混合至重悬；水平放置离心管，室温孵育20min，于4。C下以12000rpm的速度离心10min;移上清液入l.5ml离心管中，加入0.2ml氯仿，摇动离心管15s，室温孵育23min;于4'C下以12000rpm的速度离心15min;移上层水相到l.5ml离心管中，加入O.5ml异丙醇，混匀，室温孵育30min，于4。C下以12000rpm的速度离心10min，弃上清液，在沉淀中加入lml75%乙醇，于4-C下以7500rpm的速度离心5min，弃上清液，干燥沉淀，得总RNA;总RNA含量测定总RNA用DEPC处理水稀释60倍，用核酸定量仪内置的RNA测定程序读取RNA含量、0D260值、OD260/OD280、蛋白质含量，0D260/0D280比值为1.82.0的RNA保留，备用；(4)逆转录反应将上述提取的RNA用30ul焦碳酸二乙酯处理灭菌，用蒸馏水溶解，进行逆转录反应，用随机引物法合成互补DNA;(5)标准品的制备以互补DNA为模板，加入引物对，通过聚合酶链式反应扩增，其中使用的引物对是5'-CAACCACCCTCTGTGGACTT-3'和5'-TGTAAACCGGATAGCCAAGG-3';5'-CGTGTTCAACGCTCTCAAAA-3'和5'-CAAGTCCACAGAGGGTGGTT-3';5'-GTGGCCTACCTGTCCAAAAA-3'和5'-GAAGCAGAGCCTGGTAGTGG-3';5'-CTGGAAGCCCTCCTCTTCTT-3'和5'-AAGTAAGCCCTGGGTCCTGT-3';上述引物依次如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8所示；将扩增完毕的PCR产物进行1.5y。的5XTris-硼酸琼脂糖凝胶电泳，将PCR产物切下，采用PCR产物纯化柱提取纯化PCR产物，用紫外分光光度法计测260nm处的吸光度值的值，计算每mlPCR产物的拷贝数，公式为拷贝数/ml=6.02X1023XCXA26。/MW"其中C=5X10—5/ml，MW产PCR产物的分子量^碱基数X6.58X102，用无菌超纯水将PCR产物调整至每ml1.0X10"拷贝，得标准品。3、如权利要求1或2任一所述的标准品的制备方法，是用引物对逆转录扩增获得核酸片段，其特征在于该方法中所述病毒基因序列的引物对分别是5'-CAACCACCCTCTGTGGACTT-3'和5'-TGTAAACCGGATAGCCAAGG-3';5'-CGTGTTCAACGCTCTCAAAA-3'和5,-CAAGTCCACAGAGGGTGGTT-3';5,-GTGGCCTACCTGTCCAAAAA-3'和5,-GAAGCAGAGCCTGGTAGTGG-3';5'-CTGGAAGCCCTCCTCTTCTT-3'和5'-AAGTAAGCCCTGGGTCCTGT-3';上述引物依次如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8所4、如权利要求1或2任一所述的标准品制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)制作病毒液将Friend鼠白血病病毒按I:IO用磷酸盐缓冲溶液稀释，给小鼠腹腔注射，每只0.3ml，待发病后，脾脏无菌取出，研磨，用DMEM制成每体积份含O.l重量份脾脏的悬液，在4"C下以2X103r/min的速度离心10-15min，取上清液作为病毒液，备用；(2)制作标本取小鼠，用上述病毒液腹腔注射，感染小鼠，解剖取脾组织，冻存于-80°C，备用；(3)白血病病毒核酸的提取及含量测定总RNA提取将上述作为标本的小鼠脾组织放入研钵中，加入液氮，研磨，待组织变软，再加液氮，再研磨；将研碎的小鼠脾组织转入离心管中，每50100mg小鼠脾组织加入lmlTrizol试剂，混合至重悬；水平放置离心管，室温孵育20min，于4。C下以12000rpm的速度离心10min;移上清液入l.5ml离心管中，加入0.2ml氯仿，摇动离心管15s，室温孵育23min;于4°。下以12000rpm的速度离心15min;移上层水相到l.5ml离心管中，加入O.5ml异丙醇，混匀，室温孵育30min，于4t:下以12000rpm的速度离心10min，弃上清液，在沉淀中加入lml75%乙醇，于4。C下以7500rpm的速度离心5min，弃上清液，干燥沉淀，得总RNA;总RNA含量测定总RNA用DEPC处理水稀释60倍，用核酸定量仪内置的RNA测定程序读取RNA含量、0D260值、0D260/0D280、蛋白质含量，0D260/0D280比值为1.82.0的RNA保留，备用；(4)逆转录反应将上述提取的RNA用30p1焦碳酸二乙酯处理灭菌，用蒸馏水溶解，进行逆转录反应，用随机引物法合成互补DNA;(5)标准品的制备以互补DNA为模板，加入引物对，通过聚合酶链式反应扩增，其中使用的引物对是5'—CAACCACCCTCTGTGGACTT—3'和5'—TGTMACCGGATAGCCAAGG—3';5'-CGTGTTCAACGCTCTCAAM-3'和5'-CAAGTCCACAGAGGGTGGTT-3';5'-GTGGCCTACCTGTCCAAAAA-3'和5'-GAAGCAGAGCCTGGTAGTGG-3';5'-CTGGAAGCCCTCCTCTTCTT-3'和5'-AAGTAAGCCCTGGGTCCTGT-3';上述引物依次如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8所将扩增完毕的PCR产物进行1.5Q/。的5XTris-硼酸琼脂糖凝胶电泳，将PCR产物切下，采用PCR产物纯化柱提取纯化PCR产物，用紫外分光光度法计测260nm处的吸光度值的值，计算每mlPCR产物的拷贝数，公式为拷贝数/ml=6.02X1023XCXA26。/MW"其中C=5X10—5/ml，MW产PCR产物的分子量二碱基数X6.58X102，用无菌超纯水将PCR产物调整至每ml1.0X1(T拷贝，得标准品。5、如权利要求1或2任一所述的标准品在检测Friend鼠白血病病毒载量中的应用。6、一种检测Friend鼠白血病病毒载量的方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)制作病毒液将Friend鼠白血病病毒按I:IO用磷酸盐缓冲溶液稀释，给小鼠腹腔注射，每只0.3ml,待发病后，脾脏无菌取出，研磨，用DMEM制成每体积份含O.l重量份脾脏的悬液，在4'C下以2X103r/min的速度离心10-15min，取上清液作为病毒液，备用；(2)制作标本取小鼠，用上述病毒液腹腔注射，感染小鼠，解剖取脾组织，冻存于_80°C，备用；(3)白血病病毒核酸的提取及含量测定总RNA提取将上述作为标本的小鼠脾组织放入研钵中，加入液氮，研磨，待组织变软，再加液氮，再研磨；将研碎的小鼠脾组织转入离心管中，每50100mg小鼠脾组织加入lmlTrizol试剂，混合至重悬；水平放置离心管，室温孵育20min，于4。C下以12000rpm的速度离心10min;移上清液入l,5ml离心管中，加入0.2ml氯仿，摇动离心管15s，室温孵育23min;于4'C下以12000rpm的速度离心15min;移上层水相到l.5ml离心管中，加入O.5ml异丙醇，混匀，室温孵育30min，于4。C下以12000rpm的速度离心10min，弃上清液，在沉淀中加入lml75。％乙醇，于4。C下以7500rpm的速度离心5min，弃上清液，干燥沉淀，得总RNA;总RNA含量测定总RNA用DEPC处理水稀释60倍，用核酸定量仪内置的RNA测定程序读取RNA含量、0D260值、0D260/0D280、蛋白质含量，0D260/0D280比值为1.82.0的RNA保留，备用；(4)逆转录反应将上述提取的RNA用30ul焦碳酸二乙酯处理灭菌，用蒸馏水溶解，进行逆转录反应，用随机引物法合成互补DNA;(5)标准品的制备以互补DNA为模板，加入引物对，通过聚合酶链式反应扩增，其中使用的引物对是5'-CAACCACCCTCTGTGGACTT-3'和5'-TGTAMCCGGATAGCCAAGG-3';5'-CGTGTTCMCGCTCTCAAAA-3'和5'-CMGTCCACAGAGGGTGGTT-3';5'-GTGGCCTACCTGTCCAAAAA-3'和5'-GAAGCAGAGCCTGGTAGTGG-3';5'-CTGGAAGCCCTCCTCTTCTT-3'和5'-AAGTAAGCCCTGGGTCCTGT-3';上述引物依次如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8所示；将扩增完毕的PCR产物进行1.59()的5XTris-硼酸琼脂糖凝胶电泳，将PCR产物切下，采用PCR产物纯化柱提取纯化PCR产物，用紫外分光光度法计测260nm处的吸光度值的值，计算每mlPCR产物的拷贝数，公式为拷贝数/ml二6.02X1023XCXA26。/MW"其中C=5X10—5/ml，MW!=PCR产物的分子量二碱基数X6.58X102，用无菌超纯水将PCR产物调整至每mll.OXl(T拷贝，得标准品，置-2(TC保存，备用；(6)实时荧光定量聚合酶连式反应检测反应总体积为25p1，反应体系含10倍系列稀释的标准品的互补DNA或以同法制备的样品的互补DNA2nl，浓度为20pmol/ul的每种引物各lul，PowerSYBRGREEN12.5y1，用灭菌双蒸水补足到25u1;Real-timePCR反应在实时荧光定量PCR仪上进行，循环条件为95。C预变性10min;95°C，15s变性；60°C，60s退火与延伸，扩增40个循环，在每个循环的第二步结束时进行荧光检测，分别得到标准品和样品的扩增曲线和Ct值；(7)结果计算与分析利用样本扩增后的Ct值在标准曲线上对应其起始拷贝数，数值使用OpticonMonitor3软件得出。全文摘要本发明公开了一种用于检测Friend鼠白血病病毒载量的标准品，以及用该标准品通过实时荧光定量聚合酶链式反应方法(Real-timeRT-PCR法)检测Friend鼠白血病病毒载量的方法。在检测过程中包括白血病病毒核酸(RNA)的提取及含量测定、用引物对逆转录扩增获得核酸片段、实时荧光定量聚合酶连式反应(Real-timePCR)检测等步骤，本发明检测Friend鼠白血病病毒载量与常规PCR检测方法相比，具有较好的特异性，所检测的基因扩增产物为欲检测的目的基因产物，并且具有较好的线性关系，适合应用于对Friend鼠白血病病毒(Fr.MuLV)载量的检测。文档编号C12Q1/68GK101403015SQ20081022498公开日2009年4月8日申请日期2008年10月29日优先权日2008年10月29日发明者崔晓兰,时宇静,郭姗姗申请人:崔晓兰