专利名称：：一种石斑鱼几丁质酶a基因、含有该基因的表达载体、重组株及其应用的利记博彩app
技术领域：
：本发明属于基因工程
技术领域：
，具体涉及一种石斑鱼几丁质酶A基因、含有该基因的表达载体、重组株以及该石斑鱼几丁质酶A基因在制备融合蛋白、鱼饲料添加剂中的应用。
背景技术：
：几丁质酶(chitinase,CHI)是一种水解多聚糖酶，它切断几丁质的P(l-4)N-乙酰-D-葡萄糖单位，其氨基酸序列特征是含有必备的几个保守区域包括glyco-18区域(含有活性位点)、几丁质结合区域和一个铰链区域。几丁质酶广泛存在于生物界，是自然界中第二丰富的多糖。在细菌、真菌和植物中已经发现多种几丁质酶，并且很多已经用于转基因方面的研究。昆虫、甲壳动物、两栖动物和脊椎动物也发现有几丁质酶，根据其组织分布和分子生物学研究，已经发现的脊椎动物几丁质酶基因分为三类巨嗜细胞特异性几丁质酶，酸性几丁质酶和胰腺特异性几丁质酶。酸性几丁质酶基因含有一个丝氨酸和甘氨酸重复序列；胰腺特异性几丁质酶基因在催化的glyco-18和几丁质结合区之间含有一个苏氨酸重复序列;而巨嗜细胞特异性几丁质酶基因没有明显的重复序列。鱼类自身含有几丁质酶基因，能够合成几丁质酶。目前已获得比目鱼3个几丁质酶全长cDNA序列，以及斑马鱼、虹鳟、黑青斑河豚、棘鱼和青鯰的几丁质酶相关ESTs序列。目前研究结果推断几丁质酶与鱼类的消化生理和非特异性免疫有着密切的关系。石斑鱼是海洋珊瑚礁鱼类,属鯧科(Serranidae),石斑鱼属(Epinephelus),在我国分布有30多种。石斑鱼是一种名贵的海水鱼类,具有极高的经济价值。石斑鱼的'苗种培育是养殖生产持续发展的关键，但目前在石斑鱼人工养殖中还没有一种能有效促进其苗种消化、生长和提高鱼苗免疫功能的饵料添加剂。
发明内容本发明的目的在于提供一种石斑鱼几丁质酶A基因。本发明的另一个目的在于提供含有该基因的表达载体。本发明的另一个目的在于提供上述载体转化的重组株。本发明的另一个目的在于提供上述石斑鱼几丁质酶A基因在制备融合蛋白、鱼饲料添加剂中的应用。本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的一种石斑鱼几丁质酶A基因，其核苷酸序列如SEQIDN0:1所示，长度为1658bp，其中第53—1483位核苷酸是石斑鱼几丁质酶A基因成熟肽序列，编码456个氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示，1484—1486位核苷酸是终止子序列TAA。上述石斑鱼几丁质酶A基因全长序列的获得是采用目前基因工程领域中常用的一种可快速、经济、有效地获得基因全长序列的方法，即先得到基因相关的ESTs(表达序列标签)序列，继而获得基因全长片段。具体步骤如下(1)构建石斑鱼胃cDNA文库，随即挑取大量克隆进行测序获得ESTs序列，通过GenebankBlastx同源检索，得到和几丁质酶基因相关的ESTs序列；这里石斑鱼胃cDNA文库的构建可以采用CloneMinercDNA文库构建试剂盒，如Invitrogen公司的CloneMinercDNALibraryConstructionKit;(2)结合5'RACE方法，对上述得到的几丁质酶基因相关的ESTs序列进行组装、拼接得到石斑鱼几丁质酶基因全长cDNA序列，并将该序列命名为石斑鱼几丁质酶A基因，对该序列进行测序、氨基酸序列分析以及同源比对等。核酸测序结果如SEQIDNO:l所示，长度为1658bp，该核苷酸序列的第53—1483位核苷酸编码456个氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示，氨基酸序列分析表明这456个氨基酸的肽链为石斑鱼几丁质酶A成熟肽，该成熟肽是石斑鱼几丁质酶A前体的一个片段，几丁质酶A前体在加工过程中经切除信号肽后产生这一片段，该成熟肽包括glyco-18区域、活性位点、2型几丁质结合区域和一个铰链区域，具有消化几丁质等生物活性。该成熟肽没有脊椎动物酸性几丁质酶的特征性序列或者胰腺特异性几丁质酶的特征性苏氨酸重复序列，但含有颉氨酸、天冬酰胺和脯氨酸重复序列。结合上述石斑鱼几丁质酶A成熟肽的特点以及同源比对结果，可以得出本发明得到的石斑鱼几丁质酶A基因为一个新基因。本发明还构建了含有上述石斑鱼几丁质酶A基因的表达载体。表达载体的构建方法是常规方法，将石斑鱼几丁质酶A基因经酶切和分离纯化后，接入到已有载体的相应酶切位点之间，即构建成所需的含有石斑鱼几丁质酶A基因的表达载体。上述已有载体可以为任意一种表达载体，优选原核表达载体pET和酵母表达载体pGAPZaA。由石斑鱼几丁质酶A基因和原核表达载体pET构建而得的重组表达载体转化大肠杆菌、感受态细胞即得到重组菌株，所述大肠杆菌感受态细胞可以为任意一种，优选大肠杆菌BL21(DE3)。由石斑鱼几丁质酶A基因和酵母表达载体pGAPZaA构建而得的表达载体转化酵母感受态细胞即得到重组菌株，所述酵母感受态细胞可以为任意一种，优选毕氏酵母GS115。上述原核表达载体pET、酵母表达载体pGAPZaA、大肠杆菌BL21(DE3)和毕氏酵母GS115均为本领域技术人员常用的，可于市场上购买所得。上述转化表达载体获得重组株也是采用本领域常规做法。本发明的石斑鱼几丁质酶A基因、含有该基因的表达载体以及转化后所得重组株，可用于制备融合蛋白，也可用到鱼饲料的添加剂中。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果-1.石斑鱼是一种名贵的海水鱼类，具有极高的经济价值，本发明通过表达序列标签获得石斑鱼几丁质酶A基因的全长序列，不但丰富了石斑鱼的基因库，而且为石斑鱼的消化生理和免疫研究提供了新的理论基础，以及为苗种培育研究提供了新的研究策略；2.本发明的石斑鱼几丁质酶A基因、含有该基因的表达载体以及转化后所得重组株，可用于制备融合蛋白，也可用到鱼词料的添加剂中，能够有效地促进鱼苗生长，同时还能够提高鱼苗免疫功能，具有很高的经济价值；3.本发明的石斑鱼几丁质酶A融合蛋白可以用于降解几丁质，可以高效环保地实现有壳水生动物废物的生物转换，变废为宝，同时保护环境；4.本发明的石斑鱼几丁质酶A融合蛋白降解几丁质可以用于产生几丁寡糖，几丁寡糖可调节动物肠道微生物的代谢活动，改善肠道微生物种群分布，剌激有益于动物健康的微生物的生长，同时作为功能性保健食品具有重要的开发价值；5.本发明的含有石斑鱼几丁质酶A基因的毕氏酵母重组株，可以通过较为廉价的发酵方法大量生产，降低了成本。这些都充分说明该几丁质酶A具有广阔的应用前景。图1为石斑鱼胃cDNA文库随即挑取克隆的PCR扩增产物凝胶电泳图；其中，M为分子量标准，l-24为PCR扩增产物；图2为石斑鱼几丁质酶A基因5'RACE凝胶电泳图；其中，A为第一次PCR凝胶电泳图，B为第二'轮PCR凝胶电泳图，M为分子量标准，1为PCR扩增产物；图3为表达载体pET-chl的构建流程图4为含有单酶切位点Kpnl的sumo片段的PCR扩增片段凝胶电泳图；其中，A为第一轮PCR凝胶电泳图，B为第二轮PCR凝胶电泳图，M为分子量标准，1和2为PCR扩增产物；图5为含有单酶切位点Bpull02I的目的基因chl的PCR扩增片段凝胶电泳图；-其中，A为第一轮PCR凝胶电泳图，B为第二轮PCR凝胶电泳图，M为分子量标准，1为PCR扩增产物；图6为搭桥PCR凝胶电泳其中，M为分子量标准，1为PCR扩增产物；图7重组表达载体pET-chl的双酶切鉴定凝胶电泳图；其中，M为分子量标准，1为重组表达载体pET-chl酶切产物；图8为几丁质酶A基因在大肠杆菌BL21中表达的聚丙烯酰胺凝胶电泳其中，M为分子量标准；NC为诱导前的总蛋白，1-7分别为在37。C经0.4mMIPTG诱导1、2、3、4、5、6和7个小时时得到的总蛋白；图9为纯化的融合蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；其中，M为分子量标准，1-4为纯化的融合蛋白；图10为纯化的融合蛋白经sumo酶酶切后的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；其中，M为分子量标准，l为酶切产物；图11为重组表达载体pGAPZaA-chl的双酶切凝胶电泳图；其中，M为分子量标准，l和3为提取的重组质粒；2和4为酶切产物；图12为几丁质酶A基因在酵母中表达的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；其中，M为分子量标准，NC为不含几丁质酶A基因的GS115分泌蛋白的杂交条带，l-12为含有几丁质酶A基因的重组株分泌蛋白的杂交条带；图13为几丁质酶A基因在酵母中的表达的westernblot结果图；其中，M，为分子量标准，NC为不含几丁质酶A基因的GS115分泌蛋白，1-12为含有几丁质酶A基因的重组株分泌蛋白。具体实施例方式在下面的实施例中进一步说明了本发明，这并不限制本发明的范围。实施例1石斑鱼胃cDNA文库的构建和几丁质酶A基因ESTs的获取按CloneMinercDNAlibraryconstrutionkit(Invitrogen)的使用说明书，构建石斑鱼胃cDNA文库。用上述石斑鱼胃cDNA文库转化大肠杆菌DH10B(市售)中，转化液稀释后在LB(Kan+)平板上涂板，37。C培养过夜，挑取单菌落到LB(Kan+)培养基中37'C培养过夜，用通用引物M13进行菌液PCR鉴定(菌液PCR扩增产物的电泳鉴定如图l所示)后，挑取含插入片段质粒的菌液，测序，获得的ESTs序列通过GenebankBlastx同源检索后，得到/42条与几丁质酶基因相关的ESTs序列。实施例2石斑鱼几丁质酶A基因5'端片段的合成本实施例是对实施例l得到的与几丁质酶基因相关的ESTs序列进行5、RACE从而得到目的基因的5'端片段，具体是采用末端脱氧核糖核酸转移酶(TDT酶)法5'RACE，该试验为本领域常规做法，其操作可参考5'RacerKitProtocol来进行。根据实施例l所得几丁质酶基因相关ESTs序列设计两条下游引物Pl和P2以进行嵌套PCR。引物Pl:5，-GAGCAGGCTTGTCCAGTTC，其核苷酸序列如SEQIDNO:4所示；弓I物P2:5'-GGGGCACCATTGCTCTTC，其核苷酸序列如SEQIDNO:5所示。第一轮PCR:PCR扩增实施例1所得几丁质酶基因相关ESTs序列第689位至5'端的核苷酸序列。PCR反应体系用5'RaceKit对石斑鱼胃cDNA进行末端加尾，得到的TdT加尾产物即作为模板，上游引物和聚合酶采用5'RaceKit提供的常用试剂，下游引物采用引物P1。PCR反应条件为先94°C预变性3分钟，然后94°C变性15秒，56°C退火15秒，72。C延伸70秒，进行35个循环，最后72°C延伸5分钟，得到PCR产物，并进行凝胶电泳鉴定，结果如图2(A)所示。第二轮PCR:PCR扩增实施例1所得几丁质酶基因相关ESTs序列第278位至5'端的核苷酸序列。PCR反应体系以第一轮PCR产物为模板，上游引物和聚合酶均采用5'RacerKit提供的常用试剂，下游引物采用引物P2。PCR反应条件为先94°C预变性3分钟，然后94°C变性15秒，58°C退火15秒，72。C延伸70秒，进行35个循环，最后72°C延伸5分钟，得到PCR产物，并进行凝胶电泳鉴定，结果如图2(B)所示。第二轮PCR反应结束后得到的扩增产物进行T载体连接、转染感受态细胞、菌液PCR鉴定和酶切鉴定等本领域常规实验后，将重组质粒的菌株送去测试，结果显示该扩增产物长度为750bp，通过与Genebank的序列进行比较后，得出结论嵌套PCR得到的750bp产物是石斑鱼几丁质酶的5、端序列。实施例3石斑鱼几丁质酶A基因全长序列通过生物学软件分析，将实施例1得到的已测序的42条几丁质酶相关ESTs序列和实施例2得到的5、端序列片段进行拼接，最终得到石斑鱼几丁质酶基因的全长序列，其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示，长度为1658bp，并命名为石斑鱼几丁质酶A基因。对该石斑鱼几丁质酶A基因进行氨基酸序列分析，推测出该核苷酸序列的第53_1483位核苷酸编码456个氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示，1484—1486位核苷酸是终止子序列TAA。氨基酸序列分析表明这456个氨基酸的肽链为石斑鱼几丁质酶A成熟肽，该成熟肽是石斑鱼几丁质酶A前体的一个片段，几丁质酶A前体在加工过程中经切除信号肽后产生这一片段，该成熟肽包括glyco-18区域、活性位点、2型几丁质结合区域和一个铰链区域，具有消化几丁质等生物活性。该成熟肽没有脊椎动t/酸性几丁质酶的特征性序列或者胰腺特异性几丁质酶的特征性苏氨酸重复序列，但含有颉氨酸、天冬酰胺和脯氨酸重复序列。结合上述石斑鱼几丁质酶A成熟肽的特点以及同源比对结果，可以得出该石斑鱼几丁质酶A基因为一个新基因。实施例4重组表达载体pET-chl的构建、表达与纯化重组表达载体pET-chl的构建流程如图3所示。(一)含有单酶切位点Kpnl的sumo片段的PCR扩增为了便于'所得融合蛋白的纯化，在进行表达载体构建时选择一些标签蛋白序列，如sumo、His等，本实施例选择sumo标签蛋白序列。sumo蛋白酶识别完整的sumo(SmallUbiquitin-likeModifier)标签蛋白序列，并能高效地把sumo从融合蛋白上切割下来，sumo蛋白酶的识别序列长，酶切反应特异性高，便于融合蛋白切割后的亲和层析纯化。弓l物根据表达载体pET-SUMO以及实施例2获得的几丁质酶A基因的5'端序列设计而成。弓l物S誦Fl:5、-CGGGGTACCCATCATCATCATCATCACG-3、，其核苷酸序列如SEQIDNO:6所示；引物SumoRl:5，-ACCACCAATCTGTTCTCTGTG-3'，其核苷酸序列如SEQIDNO:7所示；引物SumochlR:5，-TTAGTGAAATAACAGGAGAGGATGTAACCACCAATCTG-3，，其核苷酸序列如SEQIDNO:8所示。第一轮PCR:PCR反应体系以表达载体pET-SUMO(可以在市场上购买获得)为模板，以上述SumoFl和SumoRl为引物。PCR反应条件先94。C预变性3分钟，然后94。C变性15秒，55"C退火15秒，68"C延伸30秒，进行35个循环，最后68。C延伸IO分钟。PCR扩增产物电泳鉴定结果如图4(A)所示，扩增产物片段长度为324bp。第二轮PCR:PCR反应伴系以第一轮PCR产物为模板，以上述SumoFl和SumochlR为引物。PCR反应条件先94。C预变性3分钟，然后94'C变性15秒，55"C退火15秒，68"C延伸30秒，进行35个循环，最后68'C延伸IO分钟。PCR扩增产物电泳鉴定结果如图4(B)所示，扩增产物片段长度为350bp。(二)含有单酶切位点Bpull02I的目的基因chl的PCR扩增引物根据实施例3所得几丁质酶A基因全长序列的5'和3、端序列，以及表达载体pET-SUMO设计而成。引物SChlFl:5、-TACATCCTCTCCTGTTATTTCAC-3、，其核苷酸序列如SEQIDNO:9所示；引物SChlRl:5、-GCTCTAGAGCTCAGCTTAAGCCCAGTTGCAG-3、，其12核苷酸序列如SEQIDNO:10所示；引物SumochlF:5、-CAGATTGGTGGTTACATCCTCTCCTGTTATTTCACTAA-3'，其核苷酸序列如SEQIDNO:ll所示。第一轮PCR:PCR反应体系以石斑鱼几丁质酶A基因全长序列为模板，上述SChlFl和SChlRl为引物。PCR反应条件先94"C预变性3分钟，然后94'C变性15秒，55"C退火15秒，68。C延伸卯秒，进行35个循环，最后68。C延伸IO分钟。PCR扩增产物的电泳鉴定结果如图5(A)所示，扩增产物长度为1386bp。第二轮PCR:PCR反率体系以第一轮PCR扩增产物为模板，以上述SumochlF和SChlRl为引物。PCR反应条件先94"C预变性3分钟，然后94。C变性15秒，55"退火15秒，68"C延伸2分钟，进行35个循环，最后68"C延伸IO分钟。PCR扩增产物的电泳鉴定结果如图5(B)所示，扩增产物长度为1398bp。(三)搭桥PCR本实施例中的搭桥PCR为本领域的常规技术。搭桥PCR反应体系以上述含有单酶切位点Kpnl的sumo片段的第二轮PCR扩增产物，和上述含有单酶切位点Bpul1021的目的基因chl的第二轮PCR产物为模板，以SumoFl和SChlRl为引物。搭桥PCR反应条件先94'C预变性3分钟，然后94"变性15秒，55°C退火15秒，68。C延伸2分钟，进行35个循环，最后68"C延伸IO分钟。搭桥PCR扩增产物的电泳鉴定结果如图6所示，扩增产物的长度为1717bp。(四)重组表达载体pET-chl将上述搭桥PCR扩增产物和原核表达载体pET-SUMO都进行Kpnl和Bpul1021双酶切，回收后连接，用连接产物转化CaCl2法制备的DH5a感受态细胞，转化产物涂布在含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上筛选重组子，37°C培养，挑选菌落，提取质粒，用双酶切Kpnl和Bpull02I鉴定重组子，双酶切电泳鉴定结果如图7所示，结果显示重组表达载体pET-chl己构建成功。(五)重组株及融合蛋白的表达与纯化将重组表达载体pET-chl转化CaCl2法制备的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，转化产物涂布在含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上筛选重组子，得到能高效表达融合蛋白的重组株，该重组株受T7启动子控制，在37。C加IPTG(异丙基-b-d-硫代半乳糖苷)诱导表达。挑单个菌落接种于5mlLB培养基中，置摇床37"C过夜活化，然后以1:100的体积比稀释到新鲜的LB培养基中，37。C培养至对数中期A6QQ=0.6，立即添加IPTG至终浓度为0.4mmol/L，分别诱导1、2、3、4、5、6、7个小时后，离心收集菌体，用1XSDS裂解液裂解，采用SDS-PAGE法鉴定表达产物，电泳鉴定结果如图8所示。将上述表达的融合蛋白进行SDS-PAGE电泳，通过切胶方法将目的条带切出，加入蛋白裂解液于4。C研磨，静置过夜后离心，取上清，采用SDS-PAGE法鉴定纯化的目的蛋白，鉴定结果如图9所示。将上述纯化的融合蛋白经SUMO酶切，得到成熟态蛋白，采用SDS-PAGE鉴定酶切结果，鉴定结果如图10所示。实施例5重组表达载体pGAPZaA-chl的构建与表达(一)重组表达载体pGAPZaA-chl的构建PCR扩增引物根据实施例3得到的石斑鱼几丁质酶A基因的全长序列设计而得，分别带有Xhol和Notl酶切位点。弓l物chlYS-Fl:5、-GCGCTCGAGAAGAGATACATCCTCTCCTGTTATTTCAC-3、，其核苷酸序列如SEQIDN0:12所示；引物chlYS-Rh5、-GAGCGGCCGCAGCCCAGTTGCAGCAC-3、，其核苷酸序列如SEQIDNO:13所示。PCR反应体系以实施例4构建所得的表达载体pET-chl为模板，以上述chlYS-Fl和chlYS-Rl为引物。PCR反应条件先94'C预变性3分钟，然后94。C变性15秒，55°〇退火15秒，68。C延伸90秒，进行35个循环，最后68。C延伸5分钟。PCR扩增产物的长度为1392bp。将上述PCR扩增产物和酵母表达载体pGAPZaA(市售)都进行XhoI和NotI双酶切，回收后连接，用连接产物转化CaCl2法制备的DH5a感受态细胞，转化产物涂布在含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上筛选重组子，37"C培养，挑选菌落，提取质粒，用双酶切XhoI和NotI鉴定重组子。双酶切的电泳鉴定如图11所示，结果显示重组表达载体pGAPZciA-chl构建成功。(二)重组株及蛋白表达将重组表达载体pGAPZaA-chl经AvrII酶切后，通过电转(2kV，5ms)转入毕氏酵母GS115中，得到的转化液涂布于含有500ug/mlzeocin(市售)的YPDS平板上，3(TC培养3天，挑取单菌划线于另一新的含有500ug/mlzeocin的YPDS平板上，3(TC培养直至单克隆生长。挑取单菌落于5mlYPD培养基中，3(TC培养过夜，以hIOO体积比稀释到新鲜的YPD培养基中，30。C分别培养2、3、4、5天，取上清经DOC-TCA(脱氧胆酸-三氯醋酸)法浓縮后，进行SDS-PAGE鉴定，Westernblot鉴定，蛋白含量检测和几丁质酶活检测，SDS-PAGE鉴定结果如图12所示，Westernblot鉴定结果如图13所示。几丁质酶活性检测方法以不同浓度的GlnAc乙酰葡萄糖胺制备标准曲线；取400ul表达上清，加入100ullX可溶性几丁质，37。C培养l小时后，加入500ulDNS，煮沸10分钟，离心冷至室温，测A540。上清蛋白含量用Bradford方法检测，以BSA作标准曲线。结果上清总蛋白浓约度为0.03mg/ml，其中几丁质酶浓度约为0.003mg/ml，A540值为0.675，几丁质酶酶活性为每小时产生lumol的GlnAc需要0.285ug的几丁质酶。结果显示重组表达载体pGAPZclA-chl能够高效表达几丁质酶，可用于制作鱼词料添加剂，促进鱼苗鱼类生长和提高鱼苗免疫抵抗力。木发明的具体实施例中所涉及的各种PCR反应，其反应体系除了模板和引物外，其余组分以及整个反应体系的浓度均为本领域技术人员所共知的，操作时可参考市售的各类PCR试剂盒说明书。本发明的具体实施例中所涉及的载体构建，双酶切，转化，融合蛋白诱导表达，DOC-TCA法和Bradford法等试验均为本领域常规技术，试验中涉及的各类LB平板，YPDS平板和YPD培养基等，以及其他试剂也均为本领域技术人员试验时所通用的。一种石斑鱼几丁质酶A基因、含有该基因的表达载体、重组株及其应用序列表SEQUENCELISTING〈110〉中山大学<120>—种石斑鱼几丁质酶A基因、含有该基因的表达载体、重组株及其应用<130><160>13<170〉Patentlnversion3.5<210〉1〈211〉1658<212>腿<213>石斑鱼(Epin印helus)<400〉1catctagattggccacgcgtcgactagtacggggggggggtacag犯gcaacatgggcaa60gctactcatctgcgtcggactggctctcctgctgcacgtgcagctaggatcatcctacat120cctctcctgttatttcactaactggggacagtaccgtcctggagcaggtaagtatttccc180caccaacattgacccatgtctctgtgaccacctcatctatgcctttgctggaatggacgg240aagacctacgagtgggacgatgagaaactctacgcacagttccaggccct300gaagaacgacaacagcaacttgaaaactctgctggccattggtggatggaactttggtac360"tgctaagttcactgctatggtttcctcttccgccaatxgtcagactttcatcaacagtgt420gatcaagttcctgcgtcagtatgagtttgatggtctagatatcgactgggagtaccctgg480ctxtcgtggctccccacctgccgataaggagcgttacaccgtcctggtccaggagatgat540gagcgccttl:gtggaggagggcaagaagaccaaccgtccccgtctgttgctgactgctgc600tgtctctgcl:ggaaagggaaccattgagtc"tggataccagatcgccgctattggagctgt660gctggactacttccacgtca"tgacctacgacttcaacggtccttgggagcacaacgtcgg720agagaacagccctctgtacaagggccccgctgaccagggatccatgatctacttc犯tgt780ggactatgccatgaactactgga卿gcaatggtgccccagctg卿agctgctggttgg840tttccccaccta/tggtcacaccttccgcctggcttcctctaacacagctgtgggagctcc900cgccagtggacctggacctgctggacctttcactcgT:caggctggcttctgggcctacta960tgagatctgcactttcctgaagcaaggagccactcaggcttgggacgccccccaggaagt1020gccatatgcct"tcaatgcgcaaacctgggttggatatgacaatgttaagagcttcaacat1080caagcttgactggttgaagc卿gtggtttcggtggagccatggtgtggagtttggatct1140ggatgacttcagtggcactttctgcggccagggaccataccccctgatcagcaccatcaa1200ggcagcgctgggaactggacaagcctgctc"taggcgttctcaccctgtgcctccagtcac1260acc犯cccagcaccctgtgcctcagcctggccataatgtcaacccacctgtcaacccaaa1320tgtcaacccaggatctggcttctgcgctggcaaggctaacggagtctaccctgacccaac1380caacaagaaccacttctatgagtgc犯ccagggacaaacctatctccagcactgtgctgt1440cggcctggtgttcgatgacagctgcaagtgctgcaactgggcttaaaacatccatggttg1500aactttttactggttgttctgcggggtc犯gtatcatgtaacgtatgacc1560ggcccattcaa_gaaca_gctctgtaacatctttcattgttc1620gaatatcacattt犯agc犯&aaa&a&aaa1658—种石斑鱼几丁质酶A基因、含有该基因的表达载体、重组株及其应用序列表<210>2<211>1658<212>DNA〈213〉石斑鱼(Epin印helus)〈220〉<221>CDS<222〉(53)..(1483)<糊〉2catctagattggccacgcgtcgactagtacggggggggggtacagaagcaacatgggc58MetGly1aagctaetcatetgcgtcggactggetetcctgctgcacgtgcagcta106LysLeuLeulieCysValGlyLeuAlaLeuLeuLeuHisValGinLeu51015gga"teatectacateetctectgttatttcactaactggggacagtac154GlySerSerTyrlieLeuSerCysTyrPheThrAsnTrpGlyGinTyr202530cgtcctggagcaggtaagtatttccccaccaacattgacccatgtetc202ArgProGlyAlaGlyLysTyrPheProThrAsnlieAspProCysLeu35404550tgtgaccacetcatetatgcct1:tgetggaatggacggcaacatgate250CysAspHisLeulieTyrAlaPheAlaGlyMetAspGlyAsnMetlie556065aagacctacgagtgggacgatgagaaaetctacgcacagttccaggcc298LysThrTyrGluTrpAspAspGluLysLeuTyrAlaGinPheGinAla707580ctgaagaacgacaacageaacttgaaaactctgctggccattggtgga346LeuLysAsnAspAsnSerAsnLeuLysThrLeuLeuAlalieGlyGly859095tggaactttggtactgetaagttcactgetatggtt"tectcttecgcc394TrpAsnPheGlyThrAlaLysPheThrAlaMetValSerSerSerAla100105110aatcgtcagact"ttcateaacag"tgtgateaagttcctgcgtcagtat442AsnArgGinThrPhelieAsnSerVallieLysPheLeuArgGinTyr115120125130gagtttgatggtctagatategactgggagtaccctggctctcgtggc490GluPheAspGlyLeuAsplieAspTrpGluTyrProGlySerArgGly135140145txcccacctgccgataaggagcgttacaccgtcctggtccaggagatg538SerProProAlaAspLysGluArgTyrThrValLeuValGinGluMet150155160atgagegcctttgtggaggagggcaagaagaccaaccgtccccgtctg586MetSerAlaPheValGluGluGlyLysLysThrAsnArgProArgLeu165170175ttgctgactgetgetgtctctgetggaaagggaaccattgagtctgga634LeuThrAlaAlaValSerAlaGlyLysGlyThrlieGluSerGly180185190taccagategccgetattggagetgtgctggactacttccacgtcatg682TyrGinlieAlaAlalieGlyAlaValLeuAspTyrPheHisValMet195200205210acctacgacttcaacggtccttgggagcacaacgtcggagagaacage730ThrTyrAspPheAsnGlyProTrpGluHisAsnValGlyGluAsnSer215220225cctctgtacaagggccccgetgaccagggatecatgatetacttcaat778ProLeuTyrLysGlyProAlaAspGinGlySerMetlieTyrPheAsn230235240一种石斑鱼几丁质酶A基因、含有该基因的表达载体、重组株及其应用序列表gtggacta_tgccatgaactactgg犯gageaatggtgccccagetgag826ValAspTyrAlaMetAsnTyrTrpLysSer*AsnGlyAlaProAlaGlu245250255aagctgctggttggtttccccacctatggtcacaccttccgcctgget874LysLeuLeuValGlyPheProThrTyrGlyHisThrPheArgLeuAla260265270tectctaacacagetgtgggagetcccgccagtggacctggacctget922SerSerAsnThrAlaValGlyAlaProAlaSerGlyProGlyProAla275280285290ggacctttcactcgtcaggetggcttctgggcctactatgagatetgc970ProPheThrArgGinGlyPheTrpAl_aTyrTyrGlulieCys295300305actttcctgaagcaaggagccactcaggettgggacgccccccaggaa1018ThrPheLeuLysGinGlvAlaThrGinAlaTrpAspAlaProGinGlu310315320gtgccatatgccttcaatgcgcaaacctgggttggatatgacaatgtt1066ValProTyrAla.PheAsnAlaGinThrT卬ValG]yTyrAspAsnVal325330335aagagettcaacateaagcttgactggttgaagcagagtggtttcggt1114LvsSerPheAsnlieLvsLeuAspTrpLeuLvsGinSerGlyPheGly340'345'350ggagccatggtgtggagtttggatctggatgacttcagtggcactttc1162G]yAlaMetValTrpSerLeuAspLeuAspAspPheSerGlyThrPhe355360365370tgcggccagggaccataccccctgateageaccateaaggcagcgctg1210CysGlyGinGlyProTyrProLeulieSerThrlieLysAlaAlaLeu375380385ggaactggacaagcctgctctaggcgttctcaccctgtgcctccagtc1258G]yThrGlyGinAlaCysSerArgArgSerHisProValProProVal390395400acaccaacccagcaccctgtgcctcagcctggccataatgtcaaccca1306ThrProThrGinHisProValProGinProGlyHisAsnValAsnPro405410415cctgtcaacccaaatgtcaacccaggatctggcttctgcgetggcaag1354ProValAsnProAsnValAsnProGlySerGlyPheCysAlaGlvLys420425430getaacggagtctaccctgacccaaccaacaagaaccacttctatgag1402AlaAsnGlyValTvtProAspProThrAsnLysAsnHisPheTyrGlu435440445450tgcaaccagggacaaacctatetccagcactgtgetgtcggcctggtg1450CysAsnGinGlyGinThrTyrLeuGinHisCysAlaValGlyLeuVal455460465ttcgatgacagetgcaagtgc"tgcaactgggettaaaacatccatggttgaac1503PheAspAspSerCvsLysCysCysAsnTrpAla470475tttttactggttgttcttaagttaggagcggggtcaagtatcatgtaacgtatgaccatc1563caactaaggcccattcaagaacagctctgtaacatctttcattgttctaacctaaatgaa1623tatcacatttaaagcaaaaaaaaasaaaaaaaaaa1658<210〉3<211〉477〈212〉PRT<213〉石斑鱼(Epin印helus)<400〉3MetGlyLysLeuLeulieCysVal-GlyLeuAlaLeuLeuLeuHis--Val一种石斑鱼几丁质酶A基因、含有该基因的表达载体、重组株及其应用序列表<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>一种石斑鱼几丁质酶A基因、含有该基因的表达载体、重组株及其应用序列表lieCysThrPheLeuLysGinGlyAlaThrGinAlaTrpAspAlaPro305310315320GinGluValProTyrAlaPheAsnAlaGinThrTrpValGlyTyrAsp325330335AsnValLysSerPheAsnlieLysLeuAspTrpLeuLysGinSerGly340345350PheGlyGlyAlaMetValTrpSerLeuAspLeuAspAspPheSerGly355360365ThrPheCysGlyGinGlyProTyrProLeulieSerThrlieLysAla.370375380AlaLeuGlyThrGlyGinAlaCysSerArg'ArgSerHisProValPro385390395400ProValThrProThrGinHisProValProGinProGlyHisAsnVal405410415AsnProProValAsnProAsnValAsnProGlySerGlyPheCysAla420425430GlyLysAlaAsnGlyValTyrProAspProThrAsnLysAsnHisPhe435440445TyrGluCysAsnGinGlyGinThrTyrLeuGinHisCysAlaValGly450455460LeuValPheAspAspSerCysLysCysCysAsnTrpAla465470475<210>4<211〉19<212〉脆<213〉人工序列<400〉4gagcaggcttgtccagttc19<210>5《211〉18<212〉腿<213〉人工序列<400〉5ggggcaccattgctcttc18<210〉6〈211>28〈212〉DNA<213〉人工序列<400〉6cggggtacccatcatcatcatcatcacg2821DNA人工序列Z\>>1232222一种石斑鱼几丁质酶A基因、含有该基因的表达载体、重组株及其应用序列表<400>7accaccaatctgttctctgtg21<210>8<211〉38<212〉腿<213>人工序列〈400〉8ttagtgaaataacaggagaggatgtaaccaccaatctg38〈210〉9<211>23<212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉9tacatcctctcctgttatttcac23<210〉10<211>31<212〉DNA<213〉人工序列<400>10gctctagagctcagcttaagcccagttgcag31<210〉11〈211〉38<212>DNA〈213>人工序列<400>11cagattggtggttacatcctctcctgttatttcactaa38<210〉12<211>38<212〉腿<213〉人工序列<400〉12gcgctcgagaagagatacatcctctcctgttatttcac38<210>13〈211〉26<212>DNA<213>人工序列<400>13gagcggccgcagcccagttgcagcac2权利要求1、一种石斑鱼几丁质酶A基因，其核苷酸序列如SEQIDNO1所示。2、根据权利要求1所述石斑鱼几丁质酶A基因，其特征在于所述核苷酸序列中的53—1483位核苷酸是石斑鱼几丁质酶A基因成熟肽序列，编码456个氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示，1484_1486位核苷酸是终止子序列TAA。3、一种表达载体，其特征在于该表达载体含有权利要求1所述的石斑鱼几丁质酶A基因。4、根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于该表达载体是由权利要求1所述石斑鱼几丁质酶A基因和原核表达载体pET构建而得。5、一种重组株，其特征在于该重组株是由权利要求4所述表达载体转化大肠杆菌感受态细胞制备而得。6、根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于该表达载体是由权利要求1所述石斑鱼几丁质酶A基因和酵母表达载体pGAPZaA构建而得。7、一种重组株，其特征在于该重组株是由权利要求6所述表达载体转化酵母感受态细胞制备而得。8、根据权利要求5所述重组株，其特征在于所述大肠杆菌感受态细胞为大肠杆菌BL21。9、根据权利要求7所述重组株，其特征在于所述酵母感受态细胞为毕氏酵母GS115。10、权利要求1所述石斑鱼几丁质酶A基因在制备融合蛋白、鱼类词料添加剂中的应用。全文摘要本发明公开一种石斑鱼几丁质酶A基因、含有该基因的表达载体、重组株以及该基因在制备融合蛋白、鱼饲料添加剂中的应用。本发明石斑鱼几丁质酶A基因的核苷酸序列如SEQIDNO1所示，其序列中的53-1483位核苷酸编码456个氨基酸，是石斑鱼几丁质酶A基因成熟肽序列，其氨基酸序列如SEQIDNO3所示。本发明石斑鱼几丁质酶A基因不但丰富了石斑鱼的基因库，而且为石斑鱼的苗种培育研究提供了新的研究策略。本发明的石斑鱼几丁质酶A基因、含有该基因的表达载体以及转化后所得重组株，可用于制备融合蛋白，也可用到鱼饲料的添加剂中，能够有效地促进鱼苗生长，同时还能够提高鱼苗免疫功能，具有很高的经济价值。文档编号C12N9/42GK101423839SQ200810219820公开日2009年5月6日申请日期2008年12月9日优先权日2008年12月9日发明者冯少珍,李文笙,林浩然申请人:中山大学