专利名称：以花生种子休眠芽胚轴为外植体的农杆菌介导的遗传转化方法
技术领域：
本发明涉及一种花生遗传转化的方法，特别涉及一种利用农杆菌
"graZ^c^7'wm似me/flde"s)介导的简便、高效地将外源基因转化进入花 生成熟种子的休眠芽胚轴外植体内的转化方法。
背景技术：
花生是重要的油料和经济作物，具有丰富的营养价值。虽然它是农杆 菌的天然宿主之一，但具有和多数豆科作物相同的弱点，即外源基因导入 难度大，遗传转化在花生育种上的工作受到一定限制，进展较慢。
国外从上世纪40年代开始花生组织培养研究，我国则从70年代开始， 已经建立了多种花生营养和生殖器官再生体系。农杆菌介导的外源基因遗 传转化是花生重要的遗传转化手段之一。自1994年Eapen和George首次 报道获得花生转基因植株以来，农杆菌介导途径进行花生基因转化的研究 己有较多成功的报道。
虽然近十几年来，花生的遗传转化随着其体细胞植株再生技术的进步 取得了一定进展。已能够通过农杆菌介导的方法获得转基因花生再生株系。 但转化及再生率过低，而且同样的遗传转化体系在不同基因型的花生中转 化效果差异明显，不能满足现代基因工程进行遗传育种的需要。究其原因， 除了多数豆科作物共同的难以被转化的弱点外及转化过程影响因素较多 外，主要由于没有找到合适的转化外植体，来建立高效的植株再生体系。 目前已成功获得转基因植株的外植体可概括为两大类， 一类是来源于幼苗 或萌动种子的幼叶、胚轴或子叶；另一类是带子叶的成熟胚。但利用这些 外植体进行转化均存在再生周期长、转化及再生率低、在不同基因型花生 品种间不稳定等问题，因此，正确选择转化外植体，建立稳定高效的植株 再生体系的是的解决目前花生中基因转化有效性问题的关键环节
发明内容
为了克服现有的花生遗传转化方法中再生周期长、转化及再生率低、 转化效果不稳定等问题，本发明的目的在于提供一种以花生成熟种子休眠 芽胚轴为转化外植体的农杆菌介导的稳定高效遗传转化方法。本发明采用 花生成熟种子的休眠芽胚轴作为转化外植体，并就遗传转化中涉及的侵染 菌液浓度、侵染时间、共培养时间、植物激素浓度和生根条件等处理因素 对转化和再生效率的影响进行了研究。该方法采用具有活跃分生能力并易 于脱分化的休眠芽胚轴细胞作为遗传转化外植体，只需常规的菌株和培养 基，无须基因枪等贵重仪器，不需要金粉等昂贵的实验载体材料，而且操 作简便易行，实验周期短，转化频率高，在不同基因型花生品种间的转化 效果十分稳定。
本发明的目的通过下述技术方案来实现 一种以花生成熟种子休眠芽 胚轴为外植体的农杆菌介导的遗传转化方法，包括如下步骤
(1) 转化外植体分离消毒后的花生种子浸泡后，在无菌环境中除去 花生种子皮，沿子叶间缝隙切开种子，将完整的胚从子叶中剥离，切除胚 根和胚芽，保留余下的花生成熟种子休眠芽胚轴部分作为待转化的休眠芽 胚轴外植体；将上述休眠芽胚轴外植体在预培养基上于24 28'C预培养 0.5 1天，得到预培养后的休眠芽胚轴外植体。
(2) 侵染液制备将含待转化质粒的农杆菌菌株接种至YEB液体培
养液中，2sx:振荡培养过夜；将培养物离心收集农杆菌菌体，并重悬于预
冷至4"C的含有100mMol/L乙酰丁香酮的液体MS培养基中，使农杆菌重 悬液的浓度在OD6。Q=0.2 1.5，即得到含有农杆菌的液体MS培养基。
(3) 转化将预培养后的休眠芽胚轴外植体浸浮在上述含有农杆菌的 液体MS培养基中，使农杆菌与休眠芽胚轴外植体充分接触5 30分钟进 行转化后，取出休眠芽胚轴外植体，滤干菌液后平铺于共培养培养基于24 28°C， 16小时光照/8小时黑暗的培养条件中，共培养2 4天，得到共培养 后的休眠芽胚轴外植体。 .
(4) 芽诱导培养将共培养后的休眠芽胚轴外植体转移至芽诱导培养 基上进行诱导培养。
(5) 筛选培养将芽诱导培养后的休眠芽胚轴外植体转移至筛选培养 基上进行筛选，每隔10天更换一次筛选培养基，共转移2 3次，得到筛 选培养的丛生芽。 '(6) 生根培养将经过筛选培养的丛生芽转移至生根培养基，在生根
培养基上生长2 4周，代根长至4 12厘米长，得到生根的植株。
(7) 移植将步骤(6)中生根的植株移至湿度为70 85%的灭菌砂 土中，培养驯化后；便可将其移入温室生长、开花、结实。
所述预培养基组成为固体MS+3mg/L6-BA(6-苄氨基嘌吟)；所述共培 养培养基组成为MS+3mg/L 6-苄氨基嘌呤+100uM Acetosyringone (乙酰丁 香酮)；所述芽诱导培养基组成为MS+3mg/L 6-苄氨基嘌呤+300mg/L头 孢霉素；所述筛选培养基组成为MS+3mg/L 6-苄氨基嘌呤+300mg/L头 孢霉素+20mg/L潮霉素；所述生根培养基组成为1/2MS+3mg/LIBA(吲哚 丁酸)+0. lmg/L NAA(奈乙酸)。
为了再生和转化效果最为稳定和高效，实验过程中两个步骤十分关键 在步骤(1)中，制备待转化的休眠芽胚轴外植体时，芽原基去除要彻底， 避免产生由芽原基直接发育而成幼芽;使休眠芽胚轴外植体在含有3mg/L 6-苄氨基嘌呤的预培养基上预培养0.5 1天，是提高再生率的关键因素。
所述步骤(1)中消毒是将成熟花生种子经0.1%的升汞溶液表面消毒 IO分钟，再用无菌水清洗3次。所述步骤(1)中浸泡是在50。C的温水中 浸泡3小时。
所述步骤(2)中待转化质粒为植物表达载体pCAMBIA1301-PR10、 pCAMBIA1301-LjCYC或pCAMBIA1301-GmFAD3C。 所述步骤(2)中农杆菌为EHA105菌株。
所述步骤(4)中芽诱导培养条件为24 28°C， 16小时光照/8小时黑 暗，培养时间为5 10天。
本发明原理是休眠芽胚轴部分的细胞层具有高度分化能力，且分裂 速度快，此时是导入外源基因的最佳时期。植物基因工程上较好的器官形 成途径是采用由体细胞直接发生的方式，例如直接诱导外植体分化不定芽。 因为直接发生方式具有获得再生植株周期短，不经过脱分化，体细胞无性 系变异小，能较好保持受体细胞的遗传稳定性以及转化的外源基因也能实 现稳定遗传等优点。花生成熟种子休眠芽的胚轴部分'的细胞具有较强分化 能力，能够在合适的激素组合下通过直接发生方式形成再生芽，从而实现 花生的高效、快速再生。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果1、 以花生成熟种子休眠芽的胚轴部分作为转化外植体，由于被侵染的 组织为具有高度分生能力的活跃分生组织细胞，而且易于脱分化，因此再
生率和转化率更高，再生效率达91.5%。
2、 花生成熟种子休眠芽的胚轴部分细胞具有活跃的高度分生能力且易 于脱分化这是不同基因型花生的共性，因此本发明方法在不同基因型花生 的遗传转化中的效果稳定。
3、 本发明方法中再生芽的发生途径绕开了由愈伤组织离体培养再生植 株的漫长途径，3个月内可形成生根的植株；使转化周期縮短了50%。
4、 外植体来源不受花生种植、发育时间的限制。
图1为本发明中花生成熟种子休眠芽的胚轴外植体的制备图。
其中，la 、消毒后的完整花生种子材料；lb、花生胚与子叶分离开来； lc、胚从上至下被切为三部分，分别是芽原基、休眠芽的胚轴、胚根；ld、 用作外植体的休眠芽胚轴。
图2为本发明中花生成熟种子休眠芽胚轴外植体上再生芽的形成过程 图，其中2d已有明显可见的丛生的再生芽。
其中，2a、在芽诱导培养基上5天以后的休眠芽胚轴外植体；2b、在 芽诱导培养基上IO天以后的休眠芽胚轴外植体；2c、耷芽诱导培养基上15 天以后的休眠芽胚轴外植体；2d、在芽诱导培养基上25天以后的休眠芽胚 轴外植体，已出现绿色丛生芽。
图3为本发明中的转化方法转化AhPR10基因的转基因植株图。
其中，3a、用本发明中转化方法转化AhPRlO基因的花生转基因丛生 芽；3b、用本发明中的转化方法转化AhPR10基因的转基因植株。
图4为采用PCR方法对实施例 一 中转PR10基因的转基因植株进行PCR 鉴定的PCR鉴定电泳图。
图5为采用PCR方法对实施例二中转LjCYC基因的转基因植株进行鉴 定的PCR鉴定电泳图。
图6为采用PCR方法对实施例三中转GmFAD3C'基因的转基因植株进 行鉴定的PCR鉴定电泳图。
具体实施例方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实 施方式不限于此。
实施例一以花生成熟种子休眠芽胚轴为外植体的农杆菌介导的遗传 转化方法用于AhPRlO基因的转化
(1) 选取成熟饱满的花生种子，在超淨工作台的无菌环境中，将花生
种子经0.1% (W/V)的升汞溶液表面消毒10分钟，再用无菌水清洗3次。 用5(TC的温水浸泡3小时后，除去种皮，用无菌解剖刀沿子叶间缝隙切开 种子，用解剖刀将完整的胚从子叶中剥离，切除胚根和芽原基，保留余下 的花生成熟种子休眠芽胚轴部分作为待转化的休眠芽胚轴外植体，并在预 培养基(固体MS+3mg/ L 6-苄氨基嘌呤)上预培养0.5天。如图1所示， 为花生成熟种子胚休眠芽胚轴外植体的制备图。图2为本发明中花生成熟 种子休眠芽胚轴外植体上再生芽的形成过程图，其中2d已有明显可见的丛 生的再生芽。
(2) 以花生AhPR10基因为待转基因，将花生AhPR10基因两端分别 连上Ncol和Spel酶切位点，用Ncol和Spel双酶切后连入用Ncol和Spel 双酶切的pCAMBIA1301载体，构建包含花生AhPRlO基因的植物表达载 体pCAMBIA1301-AhPR10。将该载体导入农杆菌EHA105菌株，将经鉴定 为阳性的克隆按照l : 100的体积比接种至200mlYEB液体培养液中(含有 50mg/L庆大霉素，50mg/L卡那霉素，100mMol/L乙酰丁香酮)中，28°C 振荡培养过夜。将培养物于2800转/分钟，离心10分钟收集菌体，重悬于 4。C预冷的液体MS培养基，并添加100mMol/L乙酰丁香酮，使OD6(X)=0.2， 得到重悬的菌液。
(3) 将预培养的休眠芽胚轴外植体浸浮在OD,二0.2的上述步骤(2) 中重悬的菌液中，使农杆菌与花生休眠芽胚轴外植体充分接触进行转化后， 间或轻轻摇动，接触(转化)时间为30分钟，然后用镊子轻轻夹起休眠芽 胚轴外植体，稍滤干菌液，平铺于共培养基上，于24'C, 16小时光照/8小 时黑暗的培养条件中进行共培养3天。
(4) 将共培养后的休眠芽胚轴外植体转移至芽诱导培养基(MS+3mg/L 6-苄氨基嘌呤+300mg/L头孢霉素)上诱导丛生芽，培养条件24°C， 16 小时光照/8小时黑暗，培养时间为5天。(5) 将芽诱导培养后的休眠芽胚轴外植体转移至筛选培养基
(MS+3mg/L 6-节氨基嘌呤+300mg/L头孢霉素+20mg/L潮霉素)上进行筛 选，每隔10天更换一次筛选培养基，共转移2次。
(6) 将经过筛选培养的丛生芽转移至生根培养基(1/2MS +3mg/L吲 哚丁酸+0.1mg/L奈乙酸)， 一周后即可生根。生根培养基上生长两周后， 代根长至4 12厘米长。
(7) 将生根的植株移至高湿度(湿度为70 85%)的灭菌砂土中，用 透明的保鲜膜封好以保持湿度，于23 27"C下、相对湿度为75%、光照 强度为15Opmolm々s"、光周期为18 h的培养室培养1 2周。2 7d内 逐渐揭去保鲜膜使苗驯化。然后便可将其移入温室生长、开花、结实。
图3为本发明中的转化方法转化AhPR10基因的转基因植株图。如图4 所示，为采用PCR方法对本实施例转AhPR10基因的转基因植株进行PCR 鉴定的PCR鉴定电泳图。其中，Marker: DL2000; 1-5:不同转化植株的
PCR鉴定结果。6:以非转化植株为摸板的阴性对照；7:以PR10基因质粒
为模板的阳性对照；PCR引物为筛选标记基因hpt基因的特异性引物。
实施例二花生成熟种子休眠芽胚轴为外植体的农杆菌介导的遗传转 化方法用于百脉根LjCYC基因的转化
(1) 选取成熟饱满的花生种子，在超淨工作台的无菌环境中，将花生 种子经0.1% (W/V)的升汞溶液表面消毒10分钟，再用无菌水清洗3次。 用5(TC的温水浸泡3小时后，除去种皮，用无菌解剖刀沿子叶间缝隙切开 种子，用解剖刀将完整的胚从子叶中剥离，切除胚根和芽原基，保留余下 的花生成熟种子休眠芽胚轴部分作为待转化的休眠芽胚轴外植体，并在预 培养基(固体MS+3mg/L6-苄氨基嘌呤)上预培养1天。
(2) 以百脉根LjCYC基因为待转基因，采用实施例一相同的方法， 将LjCYC基因序列连入pCAMBIA1301载体，构建包含LjCYC基因的植 物表达载体pCAMBIA1301-LjCYC。将该载体导入农杆菌EHA105菌株， 将经鉴定为阳性的克隆按照l : 100的体积比接种至200ml YEB液体培养 液中(含有50 ug/ml庆大霉素，50ug/ml卡那霉素，100mMol/L乙酰丁香 酮)中，28"C振荡培养过夜。将培养物于2800转/分钟，离心10分钟收集 菌体，重悬于4。C预冷的液体MS+100mMol/L乙酰丁香酮培养基中，使OD600 =1.0。(3) 将预培养的休眠芽胚轴休眠芽胚轴浸浮在OD6()()=1.0的上述(2) 重悬好的菌液中，使农杆菌与花生休眠芽胚轴外植体充分接触进行转化后， 间或轻轻摇动，接触(转化)时间为15分钟，然后用镊子轻轻夹起休眠芽 胚轴外植体，稍滤干菌液，平铺于共培养基上，于28-C， 16小时光照/8小 时黑暗的培养条件中进行共培养2天。
(4) 将共培养后的休眠芽胚轴外植体转移至芽诱导培养基(MS+3mg/L 6-苄氨基嘌呤+300mg/L头孢霉素)上诱导丛生芽，培养条件28°C， 16 小时光照/8小时黑暗，培养时间为10天。
(5) 将芽诱导培养后的休眠芽胚轴外植体转移至筛选培养基 (MS+3mg/L 6-苄氨基嘌呤+300mg/L头孢霉素+20mg/L潮霉素)上进行筛 选，每隔10天更换一次筛选培养基，共转移2次。
(6) 将经过筛选培养的丛生芽转移至生根培养基(1/2MS +3mg/L吲 哚丁酸+0.1mg/L奈乙酸)， 一周后即可生根。生根培养基上生长四周后， 代根长至4 12厘米长。
(7) 将生根的植株移至高湿度(湿度为70 85%)的灭菌砂土中，用 透明的保鲜膜封好以保持湿度，于23 27"C下、相对湿度为75%、光照 强度为150Mmolm々s"、光周期为18 h的培养室培养1 2周。2 7 d内 逐渐揭去保鲜膜使苗驯化。然后便可将其移入温室生长、开花、结实。
如图5所示，为采用PCR方法对本实施例中转LjCYC基因的转基因植 株进行鉴定的PCR鉴定电泳图。其中，Marker: DL2000; 1-3:不同转化 植株的PCR鉴定结果。4:以非转化植株为摸板的阴性对照；5:以LjCYC 基因质粒为模板的阳性对照；PCR引物为筛选标记基因hpt基因的特异性 引物。
实施例三以花生成熟种子休眠芽胚轴为外植体的农杆菌介导的遗传 转化方法用于大豆GmFAD3C基因的转化
(1)选取成熟饱满的花生种子，在超淨工作台的无菌环境中，将花生 种子经0.1% (W/V)的升汞溶液表面消毒10分钟，再用无菌水清洗3次。 用50'C的温水浸泡3小时后，除去种皮，用无菌解剖刀沿子叶间缝隙切开 种子，用解剖刀将完整的胚从子叶中剥离，切除胚根和芽原基，保留余下 的花生成熟种子休眠芽胚轴部分作为待转化的休眠芽胚轴外植体，并在预培养基(固体MS+3mg/L6-苄氨基嘌呤)上预培养0.5 1天。
(2) 以大豆GmFAD3C基因为待转基因，采用实施例一相同的方法， 将大豆GmFAD3C基因序列连入pCAMBIA1301载体，构建包含GmFAD3C 基因的植物表达载体pCAMBIA1301-GmFAD3C。将该载体导入农杆菌 EHA105菌株，将经鉴定为阳性的克隆按照1 : 100的体积比接种至200ml YEB液体培养液中(含有50 ug/ml庆大霉素，50 ug/ml卡那霉素，100mMol/L 乙酰丁香酮)中，28"振荡培养过夜。将培养物于2800转/分钟，离心IO 分钟收集菌体，重悬于4。C预冷的液体MS+100mMol/L乙酰丁香酮培养基 中，使OD6oo二1.5。
(3) 将预培养的休眠芽胚轴外植体浸浮在OD6。。=1.5的上述(2)重悬好 的菌液中，使农杆菌与花生休眠芽胚轴外植体充分接触进行转化后，间或 轻轻摇动，接触(转化)时间为5分钟，然后用镊子轻轻夹起休眠芽胚轴 外植体，稍滤干菌液，平铺于共培养基上，于26'C， 16小时光照/8小时黑 暗的培养条件中进行共培养4天。
(4) 将共培养后的休眠芽胚轴外植体转移至芽诱导培养基(MS+3mg/L 6-苄氨基嘌呤+300mg/L头孢霉素)上诱导丛生芽，培养条件26°C， 16 小时光照/8小时黑暗，培养时间为10天。
(5) 将芽诱导培养后的休眠芽胚轴外植体转移至筛选培养基 (MS+3mg/L 6-节氨基嘌呤+300mg/L头孢霉素+20mg/L潮霉素)上进行筛 选，每隔10天更换一次筛选培养基，共转移3次。
(6) 将经过筛选培养的丛生芽转移至生根培养基(1/2MS +3mg/L吲 哚丁酸+0.1mg/L奈乙酸)， 一周后即可生根。生根培养基上生长三周，代 根长至4 12厘米长。
(7) 将生根的植株移至高湿度(湿度为70 85%)的灭菌砂土中，用 透明的保鲜膜封好以保持湿度，于23 27"C下、相对湿度为75%、光照 强度为150Mmolm々s'1、光周期为18 h的培养室培养1 2周。2 7 d内 逐渐揭去保鲜膜使苗驯化。然后便可将其移入温室生长、开花、结实。经 检测，转化效率达80%以上。
如图6所示，为采用PCR方法对本实施例转GmFAD3C基因的转基因 植株进行鉴定的PCR鉴定电泳图。其中，Marker: DL2000; 1-4:不同转 化植株的PCR鉴定结果；PCR引物为筛选标记基因hpt基因的特异性引物,阳性对照和阴性对照结果未显示。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上 述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改 变、修—饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明 的保护范围之内。
权利要求
1、一种以花生成熟种子休眠芽胚轴为外植体的农杆菌介导的遗传转化方法，其特征在于包括如下步骤(1)转化外植体分离消毒后的花生种子浸泡后，在无菌环境中除去花生种子皮，沿子叶间缝隙切开种子，将完整的胚从子叶中剥离，切除胚根和芽原基，保留余下的花生成熟种子休眠芽胚轴部分作为待转化的休眠芽胚轴外植体；将上述休眠芽胚轴外植体在预培养基上于24～28℃预培养0.5～1天，得到预培养后的休眠芽胚轴外植体；(2)侵染液制备将含待转化质粒的农杆菌菌株接种至YEB液体培养液中，28℃振荡培养过夜；将培养物离心收集农杆菌菌体，并重悬于预冷至4℃的含有100mMol/L乙酰丁香酮的液体MS培养基中，使农杆菌重悬液的浓度在OD600＝0.2～1.5，即得到含有农杆菌的液体MS培养基；(3)转化将预培养后的休眠芽胚轴外植体浸浮在上述含有农杆菌的液体MS培养基中，使农杆菌与休眠芽胚轴外植体充分接触5～30分钟进行转化后，取出休眠芽胚轴外植体，滤干菌液后平铺于共培养培养基于24～28℃，16小时光照/8小时黑暗的培养条件中，共培养2～4天，得到共培养后的休眠芽胚轴外植体；(4)芽诱导培养将共培养后的休眠芽胚轴外植体转移至芽诱导培养基上诱导丛生芽；(5)筛选培养将芽诱导培养后的休眠芽胚轴外植体转移至筛选培养基上进行筛选，每隔10天更换一次筛选培养基，共转移2～3次，得到筛选培养的丛生芽；(6)生根培养将经过筛选培养的丛生芽转移至生根培养基，在生根培养基上生长2～4周，代根长至4～12厘米长，得到生根的植株；(7)移植将步骤(6)中生根的植株移至湿度为70～85％的灭菌砂土中，培养驯化后；便可将其移入温室生长、开花、结实；所述预培养基组成为固体MS+3mg/L 6-苄氨基嘌呤；所述共培养培养基组成为MS+3mg/L 6-苄氨基嘌呤+100uM乙酰丁香酮；所述芽诱导培养基组成为MS+3mg/L 6-苄氨基嘌呤+300mg/L头孢霉素；所述筛选培养基组成为MS+3mg/L 6-苄氨基嘌呤+300mg/L头孢霉素+20mg/L潮霉素；所述生根培养基组成为1/2MS+3mg/L吲哚丁酸+0.1mg/L奈乙酸。
2、 根据权利要求1所述的一种以花生成熟种子休眠芽胚轴为外植体的农杆 菌介导的遗传转化方法，其特征在于所述步骤(1)中消毒是将成熟花生种子 经0.1%的升汞溶液表面消毒10分钟，再用无菌水清洗3次。
3、 根据权利要求1所述的一种以花生成熟种子休眠芽胚轴为外植体的农杆 菌介导的遗传转化方法，其特征在于所述步骤(1)中浸泡是在5(TC的温水中 浸泡3小时。
4、 根据权利要求1所述的一种以花生成熟种子休眠芽胚轴为外植体的农杆 菌介导的遗传转化方法，其特征在于所述步骤(2)中待转化质粒为植物表达 载体 pCAMBIA1301-PR10 、 pCAMBIA1301-LjCYC 或 pCAMBIA1301 画GmFAD3C。
5、 根据权利要求1所述的一种以花生成熟种子休眠芽胚轴为外植体的农杆 菌介导的遗传转化方法，其特征在于所述步骤(2)中农杆菌为EHA105菌株。
6、 根据权利要求1所述的一种以花生成熟种子休眠芽胚轴为外植体的农杆 菌介导的遗传转化方法，其特征在于所述步骤(4)中芽诱导培养条件为24 28°C， 16小时光照/8小时黑暗，培养时间为5 10天。
全文摘要
本发明公开了一种以花生成熟种子休眠芽胚轴为外植体的农杆菌介导的花生遗传转化方法，该方法以花生成熟种子休眠芽胚轴为外植体，经过预培养脱分化后，采用农杆菌介导的方法进行遗传转化。并通过优化芽诱导培养和生根培养过程，有效提高了转化再生率和生根速度。本发明不依赖于基因枪等贵重仪器，不需要金粉等昂贵的实验载体材料，仅需一个超浮工作台以及相关农杆菌菌株就能在最简单地实验环境下实现花生成熟种子胚的休眠芽胚轴外植体的高效转化，而且周期短，在不同基因型品种间的转化效果稳定。
文档编号C12N15/82GK101445808SQ20081021935
公开日2009年6月3日 申请日期2008年11月24日 优先权日2008年11月24日
发明者刘海燕, 梁炫强, 温世杰 申请人:广东省农业科学院作物研究所