专利名称：一株毒杀植物寄生线虫的黑曲霉真菌及其制备方法和应用的利记博彩app
技术领域：
本发明属于微生物农药技术领域，具体涉及一种毒杀植物寄生线虫的真菌及其制备方法 和应用。
背景技术：
植物寄生线虫在世界上许多国家和地区发生和为害，种类多种多样。在全球范围内，植 物寄生线虫的发生与危害随着农林业的发展和耕作栽培制度的变化日益严重，据Esser统计， 到1990年为止全世界已报道发现植物寄生线虫207属4832种(刘维志，段玉玺.2000.植物 病原线虫学.北京中国农业出版社，pl-2)。据估计，植物寄生线虫造成世界主要农作物的 年损失率为12.3%，超过1000亿美元，而实际的损失远远超过估计，理由是许多线虫造成 的危害因没有田间可见症状或专化性特征而未引起注意(王寿华.果树线虫学.北京中国农业 科技出版社，1994. P. 1-5)，此外，世界范围内对线虫为害的新发现还在不断增加，而且一些 更新的农业栽培体制使线虫问题更加突出，再者，线虫与其它生物相互作用而对植物产生的 直接或间接影响还在急剧增加。从这种意义上说，线虫造成的危害较其它生物更加隐蔽！根 结线虫是农业上为害最大的一类线虫，病害发生后， 一般减产10%左右，严重的高达75%以 上，甚至绝收(A. G. Whitehead, 1998. Plant Nematode Control. ISBN0851991882 CAB International)。目前，植物寄生线虫的防治仍以化学防治为主，但近年来，化学杀线剂的 应用浪费大，污染环境，选择性差，灭生性强，破坏土壤生物区系等弊端日益为人们所重视 (张克勤，何世川，周薇等.1991.真菌和细菌在线虫生防中的作用及其研究进展.杀虫微生 物.3:55-66)， 21世纪称为环保世纪， 一些有效的化学杀线剂的应用逐步受到限制，因此对植 物寄生线虫的生物防治研究自然成为热点问题。本发明正是基于上述理论，以植物寄生线虫 为靶标，从真菌代谢产物中寻找具有高效杀线虫活性物质，拟为研究开发新型生物杀线虫剂
寻找新的资源。
发明内容
本发明的目的是选择对根结线虫具高活性的真菌菌株，将菌株按常规液体发酵培养后， 从代谢产物中提取具杀线虫活性物质的有效成分，开发杀线虫生物农药，其中，所述的根结 线虫优选是南方根结线虫。
本发明筛选到的一株具有杀线虫活性的真菌菌株是J5p"gz7/船m'gwY-61，保藏单位中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏登记入册的编号CGMCC No. 2631。 AY-61是从大量土壤真菌菌株中筛选出的一株对南方根结线虫具有良好杀线虫活性的真
菌菌株。保藏日期是2008年8月7日。保藏地址是中国北京朝阳区大屯路。 本发明通过研究发现，土壤真菌有很多株真菌都具有较高的杀线虫活性，从这些真菌中
筛选出一株性状相对最好的真菌菌株A w扭r Y-61进行了进一步的研究。
本发明还涉及用于防治植物寄生线虫的真菌代谢物，其是由本发明的真菌菌株A
Y-61经过常规的液体发酵培养后提取制备的。
本发明的真菌菌株A "/ger Y-61是通过试管种培养后，再经扩大发酵培养来制备，其具 体方法如下
1. 试管种培养
培养基配方为马铃薯琼脂(PDA)培养基，即马铃薯200g;葡萄糖20g;琼脂17g;蒸馏 水lOOOmL。
2. 液体发酵培养
其中液体发酵培养基配方为以重量百分比计，含有麦芽糖1.6%-2.4%、葡萄糖0.6 %-1.4%、蛋白胨O. 06%-0. 14%、酵母膏0. 06%-0. 12% 、 KH2P04 7H20 0. 06%_0. 14%、 MgSO4 0. 03-0. 07%， Cacl2 2H2O0. 15%、 Fecl3 0.098%、 ZnS04 7H200. 0002% ，余下为蒸馏 水，pH为6-7，优选pH为6. 5。
将试管种接种到500mL三角瓶(每瓶装125mL)液体培养基中，25。C 28。C下，摇床转速 以220r min—t 240r min-1、发酵168h。
本发明还涉及一种杀线虫制剂，其包含本发明所述的真菌菌株A Y-61本身或其代
谢物作为有效活性成分。
本发明的真菌菌株A Y-61或其代谢物具有杀线虫活性物质，可用于植物寄生线虫
的生物防治，特别是根结线虫(ife"jWogK/7e spp.)。
具体实施例方式
为了更详细地进一步阐明而不是为了限制本发明，给出了下列实施例。 首先对A Y-61菌株进行发酵培养，然后对发酵培养后的代谢产物进行杀线虫活性
试验，确定其对线虫的作用。
实施例1:菌株A "扭/" Y-61的培养
将A w/ger Y-61的菌丝体接种到试管琼脂培养基上，培养基配方为PDA培养基，即马铃 薯200g;葡萄糖20g;琼脂17g;蒸馏水1000mL。 25'C培养7d,获得试管种。
再将试管种接种到500mL三角瓶(每瓶装125mL)液体培养基中，培养基配方为(重量百分比)麦芽糖(2.4%)、葡萄糖(0.8%)、蛋白胨(0.06%)、酵母膏(0.06%) 、 KH2P04 .7H20
(0.14%)、 MgS04 (0.04%) ， Cacl2*2H20 0.15%、 Fecl3 0.098%、 ZnS04 7H20 0. 00 02%, 余下为蒸馏水，pH 6.5。 25。C 28。C下，摇床转速以220r rain_1 240r min—'、发酵168h。 将发酵液配成不同的倍数进行杀线虫药效试验。
实施例2:菌株A w扭r Y-61的培养
基本同实施例一，不同之处是液体培养基配方，其配方为
液体培养基配方为麦芽糖(1.6%)、葡萄糖(0.6%)、蛋白胨(0.08%)、酵母膏(0. 12 %) 、 KH2P04*7H20 (0.10%)、 MgS04 (0.04%) ， Cacl2 2H20 0.15%、 Fecl3 0.098%、 ZnS04 7H20 0. 0002%， pH 7。
实施例3:菌株A m'gw Y-61的培养
基本同实施例一，不同之处是液体培养基配方，其配方为
液体培养基配方为麦芽糖(2.2%)、葡萄糖(0.8%)、蛋白胨(0.12%)、酵母膏(0. 14 %) 、 KH2P04 7H20 (0.10%)、 MgS04 (0.07%) ， Cacl2 2H20 0.15%、 Fecl3 0.098%、 ZnS04 7H20 0.0002%， pH 6。
实施例4:菌株A "z'gw Y-61的培养
基本同实施例一，不同之处是液体培养基配方，其配方为
液体培养基配方为麦芽糖(2.0%)、葡萄糖(0.6%)、蛋白胨(0.12%)、酵母膏(0.06 %) 、 KH2P04 *7H20 (0. 12%)、 MgS04(0. 03%) ， Cacl2 *2H20 0. 15%、 Fecl30. 098%、 ZnS04 '7H20 0.0002%， pH 6.5。
实施例5:菌株A m'gw Y-61的杀线虫活性
将发酵液依次稀释5倍、10倍、浓縮5倍和10倍获得不同浓度的发酵液，分别处理南 方根结线虫2龄幼虫。
1. 制备试验用制剂
按前述液体发酵培养方法制备的真菌菌株A "z'ger Y-61，用不同倍数的发酵液进行杀线 虫活性试验。
2. 制备试验用线虫
(1)制备南方根结线虫卵囊及2龄幼虫
在温室中盆栽感病的番茄品种L402上繁殖南方根结线虫。将番说种子播种在育苗床中， 待番茄苗长到3叶期，稍显粗壮时移为盆栽。接种南方根结线虫2龄幼虫，大约55d后，根
5部会产生大量卵囊。将根取出并洗去泥土，用镊子挑取卵囊置于培养皿中，用0.5%的次氯酸 钠处理3min，再用无菌水冲洗三次，置于25'C培养箱中进行孵化。3d左右就会孵化出很多2 龄幼虫，吸到灭菌的三角瓶中，置于4'C的冰箱中备用。
3.试验方法
3.1 A "扭r Y-61代谢物对线虫的作用在经灭菌的40孔组织培养板中加入不同浓度的 试验用发酵液各100 y L，以加100u L无菌水作为对照，然后分别向处理和对照中各加入100 PL线虫悬浮液(约含线虫20. 11. 士2.06条)，放入25'C培养箱中，24h后记录线虫死亡率， 计算校正死亡率即为杀线虫药效。每处理重复4次。
死亡线虫数 触死亡率(%)=I^^X100
校正死亡率(%)=处理线，:率:，线玄虫死亡率x则
l一对照线虫死匸率 3. 2 A "&er Y-61代谢物对南方根结线虫卵囊孵化的作用
在每个无菌的直径为6cm的塑料培养皿中放入3个表面消毒的发育较一致的卵囊，分别 加入3mL不同浓度的试验用发酵液，以加入3mL无菌水作为对照。试验在25'C下进行，将各 处理塑料培养皿用封口膜封严，以减少污染以及液体蒸发。7d后镜检各处理卵囊孵化情况。 计算卵囊孵化线虫数和卵囊孵化的相对抑制率。每处理重复4次。
相对抑制率《),照孵，S，线虫数x觸
对照孵化线虫数
试验3. 1和3.2的操作均在无菌环境下进行，尽量避免环境和人为因素对试验结果的影
响<
4.试验结果
(1 ) A Y-61代谢物对南方根结线虫2龄幼虫的杀线虫效果
表1 AY-61发酵液不同稀释倍数对南方根结线虫2龄幼虫的影响
稀释倍数 2龄幼虫的平均死亡率(％)~~校正死亡率(％)
10x46.99dD 44.46
5x 75.47cC 74.30
80.73cBC 79.81
5x 89.64bAB 89.19
10x 97.78aA 97.67
4.55eE -
82.28cBC 81.44
77.44cC 76.36
注CK1:无菌水处理；CK2: 10 u g/nil 1.8%阿维菌素乳油处理；CK3: 10ug/ral 10%克线丹颗粒剂处理 结果表明，各稀释浓度的发酵液和无菌水对照之间差异显著，其浓縮5x和浓缩IOX液均
释释液缩缩1 2 3
稀稀原浓浓g g g与阿维菌素和克线丹差异显著，而其原液和稀释5x与阿维菌素和克线丹相当，差异不显著。 (2) A Y-61代谢物对南方根结线虫卵囊孵化的作用
表2 A Y-61发酵液不同稀释倍数对南方根结线虫卵囊孵化的影响
稀释倍数卵囊平均孵化线虫数(条)相对抑制率(％)
释10x61.33bB49-87
稀释5x53.33cB56.40
原液20扁C83.66
浓縮5x楊eD96.73
浓縮10x1.33eD98.9〗
CK1122.33aA"-
CK22.33eD98.10
CK32.67eD97.82
注CK1:无菌水处理；CK2: 10u g/ml 1. 8%阿维菌素乳油处理；CK3: 10u g/ml 10%克线丹颗粒剂处理
结果表明，各稀释浓度的发酵液和无菌水对照处理的卵囊之间，对线虫孵化影响差异显
著，特别是10倍液几乎不能孵化，其浓縮5x和浓缩10x液与阿维菌素和克线丹差异不显著。 通过以上两种对线虫活力和卵囊孵化的抑制作用试验结果表明，AY-61是一株极具有应
用价值的真菌，特别是对南方根结线虫的杀线虫作用和对其卵囊孵化的抑制作用，显示出其良 好的应用开发前景。
实施例6:菌株A m'ge/" Y-61的温室盆栽试验杀线虫活性
采用液体发酵获得的发酵液经不同浓度处理后，在温室盆栽防治番茄根结线虫
(ifeJca't/ogy"e //7C。卵"3)， 效果如下 供试材料和方法
番茄品种为L402
线虫南方根结线虫脸7o油gJ77e J.77C。狎'Z^
每株番茄定植后第5d接种根结线虫5000粒卵，接种后第3d用发酵液进行灌根处理，每 株灌药液40tnl。正常田间管理，分别在45d和80d调査根结数。灌注清水为对照CK1、阿维菌 素为CK2、克线丹为CK3。
结果如下表
处理45d根结 数45d (%)防治效果80d根结数80d (%)防治效果
稀释Ox96aA5. 88213bcBC39. 14
稀释5x52bAB49.20163cdCD53.43
原液43bAB57.84llObB68.57
浓縮5x18bcB82.3566dDE81. 14
浓縮10xlcB99.0210e伍97. 14
CK1皿aA—301aA—
CK23cB97. 0617e伍95. 14
CK3lcB99.02l伍99. 71
7注CK1:无菌水处理；CK2: 10 U g/flll 1. 8%阿维菌素乳油处理；CK3: 10ug/ml 10%克线丹颗粒剂处理 结果表明，该发酵液在没有任何助剂填加的条件下，浓縮至5X至浓缩IOX液防治根结线 虫的效果可以达到80%_90%，该浓度已经达到产业化开发利用的浓度要求。
权利要求
1、保藏号为CGMCC No.2631的菌株。
2、 真菌代谢物，其特征在于，是由权利要求l所述的菌株经过液体发酵提取制备而成。
3、 根据权利要求2的真菌代谢物，其特征在于，所用的液体发酵培养基配方为以重量百分 比计，含有麦芽糖1.6%-2.4%、葡萄糖0.6%-1.4%、蛋白胨0.06%-0. 14%、酵母膏 0.06%-0. 12% 、 KH2P04 7H20 0. 06%-0. 14%、 MgS(X 0. 03-0. 07%, Cacl2 2H200. 15%、 Fecl3 0. 098%、 ZnS04 7H20 0. 0002%，余下为蒸馏水，pH为6-7。
4、 根据权利要求3的真菌代谢物其特征在于，液体发酵培养基配方的pH为6.5。
5、 制备杀线虫制剂的方法，根据权利要求1所述的菌株经过常规的液体发酵后制备而成，其 特征在于该真菌的液体发酵培养基配方为以重量百分比计，含有麦芽糖1.6%-2.4%、 葡萄糖0.6%-1.4%、蛋白胨0.06%-0. 14%、酵母膏O. 06%-0. 12% 、 KH2P04 7H20 0. 06 %-0. 14%、 MgS040. 03-0. 07%， Cacl2 2H200. 15%、 Fecl30.098%、 ZnS04 7H20 0. 0002 %，余下为蒸馏水，pH为6-7。
6、 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，pH为6.5。
7、 一种杀线虫制剂，其特征在于，包含权利要求1所述的真菌或权利要求2所述的真菌代谢 物。
8、 权利要求1所述的真菌或权利要求2所述的真菌代谢物或权利要求5所述的杀线虫制剂的 应用。
9、 根据权利要求8的应用，其特征在于应用防治植物寄生线虫。
10、 根据权利要求9的应用，其特征在于，所述的植物寄生线虫为根结线虫(ifeJwV^y/7e spp.)。
全文摘要
本发明涉及一株具毒杀植物寄生线虫作用的真菌的培养方法及其代谢物制备方法和应用，属于微生物农药技术领域。本发明涉及的真菌菌株Aspergillus niger Y-61，已于2008年8月7日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.2631。Y-61的分类地位是有丝分裂孢子菌类，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属，黑曲霉。通过液体发酵培养制备，其代谢物对植物寄生线虫，特别是对根结线虫具有毒力高，杀线虫效果明显的突出特点，室内测定本菌株发酵液对南方根结线虫(Meloidogyne incognita)2龄幼虫和卵囊孵化的影响。不同稀释浓度发酵液的处理和无菌水处理有显著差异，发酵液的5倍液以上浓度与10μg/ml克线丹的防效相当。具良好的应用开发前景。
文档编号C12N1/14GK101445785SQ20081018826
公开日2009年6月3日 申请日期2008年12月23日 优先权日2008年12月23日
发明者霆 刘, 刘伟成, 刘建华, 刘德文, 卢彩鸽, 裘季燕 申请人:北京市农林科学院