卤醇脱卤酶突变体菌株、卤醇脱卤酶突变体及其制备方法和应用的利记博彩app

专利名称：：卤醇脱卤酶突变体菌株、卤醇脱卤酶突变体及其制备方法和应用的利记博彩app
技术领域：
：本发明涉及微生物领域，尤其涉及一种卤醇脱卤酶基因突变体，生产该卤醇脱卤酶突变体的基因工程菌的构建，生产及其应用。
背景技术：
：环氧化物被公认为是有机合成中最重要、应用最广泛的合成中间体之一。此类化合物通过化学合成易于制备，但化学反应立体选择性差，针对手性碳相连的羟基和卣素进行脱卤环氧化过程中，化学反应一般没有立体选择性，虽然可以在一些化学催化剂的帮助下进行立体选择性反应，但一般反应条件要求苛刻，结果也不理想。借助卤醇脱卤酶生物催化剂的使用，可以进行高立体选择性脱卤环氧化，从而得到单一的环氧化物，为下一步合成奠定坚实的基础，而且其也可以用于拆分不同手性的邻卤醇混合物。同样，环氧化物在开环反应中可以进行立体选择，其中立体选择性开环反应因产生两个邻近的手性中心，所以是不对称合成中极为重要的方法之一。目前环氧化物开环过程中使用的亲核试剂主要有含碳亲核试剂、含硫亲核试剂、含氧亲核试剂、含卣素亲核试剂、和含氮亲核试剂等，化学手性开环需要添加化学手性催化剂，这些手性催化剂在手性选择上的结果并不理想。借助卤醇脱卤酶生物催化剂的使用，可以进行高手性选择环氧化物开环反应，开环过程中可以加入亲核基团如氰基、硝基或者叠氮基等，来制备非常有用的化学中间体，使用这种方法也可以对环氧化物进行手性拆分。使用化学催化剂进行的化学合成费用昂贵，而且重金属会对环境带来污染，要求的反应条件也很苛刻。而使用卤醇脱卤酶生物催化剂进行的生物合成，具有反应条件温和，立体选择性高，价格相对低廉，对环境没有污染等特点，因此，卣醇脱卣酶生物催化在环氧化物合成中的应用被大力推崇。近年来，国内外有许多学者把环氧化物的合成和开环反应的研究重心转移到生物催化领域中，Jensen完成(CanJMicrobiol，1957.3:151-153)了a-卤酸脱卤酶的早期石开究，并把能使卤族离子从卤代有机化合物上释放出来的酶统称为脱卤酶(dehalogenase)，人们发现脱卤酶具有很好的立体选择作用。脱卤酶既可以进行环氧化反应，同时又可以可逆地进行开环反应，反应过程中加入亲核基团，环氧和开环可以同时进行，两步反应后亲核基团将取代卤素，同时又不改变碳原子的手性。生物催化反应所要求的反应条件一般比较温和常温、常压、中性或者接近中性pH。这样对设备性能要求不高，投入资金相对较少，生产过程安全，并方便于工厂管理和员工的操作。目前针对卤醇脱卤酶在邻卤醇的脱卤反应，申请人在国内还没有发现用基因工程的方法来工业化生产卤醇脱卤酶的相关报道。
发明内容因此为了更好地实现卤醇脱卤酶的工业化生产，本发明提出的技术方案的目的之一在于提供一种卤醇脱卤酶突变体基因，并通过筛选得到生产该卤醇脱卤酶突变体的基因工程菌。本发明的另一个目的在于提供一种卤醇脱卤酶突变体。根据本发明的技术方案，构建基因工程菌的宿主细胞选自大肠杆菌BL21，MC1061，和JM105中的一种，其载体系统选自改造后的pGEF或改造后的pBAD，且其包括本发明所提供的卤醇脱卤酶突变体基因。根据本发明的另一目的，提供了一种利用该基因工程菌制备卤醇脱卤酶突变体的方法，包括构建该基因工程菌；筛选得到该基因工程菌；培养该基因工程菌；种子罐发酵该基因工程菌；以及收集和制备卤醇脱卤酶突变体。本发明的另一个目的在于将由基因工程菌生产出的卤醇脱卤酶突变体应用到邻卤醇脱卤环氧化和环氧化物的开环中。根据本发明提供的该基因工程菌的应用，其中，底物的结构式为其中可以是选自由氢，低级烷基，环烷烃，烷氧基，链烯基，炔基，杂环，芳基和取代芳基组成的组中的任意一种取代基，&可以是选自由低级烷基，环烷烃，烷氧基，链烯基，炔基，杂环，芳基，取代芳基和酯基组成的组中的任意一种取代基，X为Cl，Br或I。其中&、R2独立地选自由氢，低级烷基，环烷烃，烷氧基，链烯基，炔基，杂环，杂芳基，芳基，取代芳基和酯基组成的组。本发明基因工程菌的保藏信息—种基因工程菌，名称为大肠杆菌MC1061，属于大肠埃希氏菌，拉丁学名EscherichiacoliMC1061，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期2008-6-16，保藏编号CCTCCNO:M208089。具体实施例方式根据本发明一个实施例的卤醇脱卤酶基因突变体，其来源于放射形土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter)，通过聚合酶链反应扩增(PCR)方式从放射形土壤杆菌细胞基因组中得到基因序列，然后对某些位点进行突变，从而获得该目的基因，其基因序列为SEQIDNO.1根据本发明一个实施例的卤醇脱卤酶突变体的蛋白序列为SEQIDNO.2。根据本发明一个实施例的重组载体，包括根据本发明实施例的卤醇脱卤基因突变体，载体可以是改造后的pGEF或改造后的pBAD，所述改造后的pGEF，具有核苷酸序列SEQIDN0.3，所述改造后的pBAD，具有核苷酸序列SEQIDNO.4，其中pGEF采用乳糖启动子，诱根据本发明提供的该基因工程菌的应用，其中底物的结构式为导剂为IPTG;pBAD采用阿拉伯糖启动子，诱导剂为L-阿拉伯糖。根据本发明一个实施例的生产卤醇脱卤酶突变体的基因工程菌具有包括卤醇脱卣酶(halohydrindehalogenase)基因突变体的重组载体。具体地，本发明的基因工程菌为保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)的保藏编号为CCTCCNO:M208089的基因工程菌。根据本发明的一个实施例的基因工程菌发酵工艺，包括以下步骤A)将根据本发明实施例的菌株进行摇瓶发酵；B)种子罐发酵；以及C)商品罐发酵。根据本发明一个实施例的制备卤醇脱卤酶突变体的方法，包括以下步骤A)将根据本发明实施例的菌株进行摇瓶发酵；B)种子罐发酵；C)商品罐发酵；以及D)将商品罐发酵所获得的菌体进行处理，获得液态卤醇脱卤酶突变体。根据本发明实施例的制备卤醇脱卤酶突变体的方法可以进一步包括E)将获得的液态卤醇脱卤酶突变体进行干燥，以获得固态卤醇脱卤酶突变体。下面对本发明的各个步骤进行详细描述。—、基因工程菌构建过程1.放射形土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter)AD1基因组DNA的抽提1)5mlLB培养基细菌过夜培养，取1.5ml培养物离心12000rpm/3min;2)将离心得到的沉淀物用567ii1TE缓冲液(10mMTris.HCl，pH8.0;lmMEDTA)溶解，加入30iU10X的SDS和3iU20mg/ml的蛋白酶K，混匀，37摄氏度温育lh;3)加入100ill的5MNaCl，充分混匀，再加入80ii1CTAB麵C1溶液(10%CTAB、0.7MNaCl)，混匀，65摄氏度温育lOmin;4)加入等体积的氯仿/异戊醇(24:l)，混匀离心12000rpm/5min。将上清液转入一个新离心管中；5)加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:l)，混匀离心12000rpm/5min。将上清液转入一个新离心管中；6)加入0.6倍体积异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，离心后沉淀用70%乙醇洗涤；以及7)离心弃上清液，沉淀干燥后用lOOulTE缓冲液溶解。2.引物的设计以NCBI登录号为AF397296的片段为模板，以primmer5引物设计软件为基础进行引物设计正引物:ATCTGACCATGGCAACCGCAATTG(下划线代表Ncol限制性酶切位点)；以及反引物:CCCAACGGATCCACGAACCACGGC(下划线代表BamHI限制性酶切位点)。3.目的基因片段的获得PCR反应获得原始卤醇脱卤酶基因片段，对序列进行测序分析，基因序列为SEQIDNO.5。BLAST比对后确定片段为卤醇脱卤酶基因，然后，限制性酶NcoI和BamHI酶切后和表达载体改造后的pGEF和改造后的pBAD相连，转化BL21、MC1061或JM105，通过抗生素、酶切、测序等方式筛选得到重组后的目的菌株。二、突变体文库建立和筛选针对野生态卤醇脱卤酶在催化由S-3-羟基-4-氯-丁酸乙酯合成R-3-羟基_4-氰基_丁酸乙酯反应中的低转换数，对该酶进行设计与改造。酶的催化效率可用酶的转换数表示。在酶浓度一定，底物浓度远远大于酶浓度[Et]的情况下，酶对特定底物的最大反应速度(Vmax)也是一个常数。此时Vmax=K3[Et]。K3表示酶被底物完全饱和时，每单位时间内每个酶分子所能转化底物的分子数，称为转换数(turnover皿mbeTN)，也称为催化常数kcat。它相当于一旦底物_酶中间物形成后，酶将底物转化为产物的效率，Kcat值愈大表示酶的催化效率愈高。在本发明中，改善酶的催化效率主要依靠大引物PCR技术，对卤离子结合区(Prol75-Tyr187)进行突变，构建相应的突变体文库，并对所构建的文库进行筛选以获得具有优良特性的突变体。1、简并引物设计与合成将175-178位四个相邻的突变位点设计在同一引物上，合成两条互补的简并引物(见表l)。由于引物中引入的突变位点较多，因此所合成的引物较普通的PCR引物长很多，以保证引物可以很好地进行退火。表1用于构建突变体文库的两条互补大引物(应用primerpremier5)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2、PCR扩增反应扩增反应在0.2毫升的PCR管中进行，将模板、上述引物、底物、和MgCl2按照一定比例混合，加双蒸水至各个PCR管的终体积为50微升，最后加入高保真pfuDNA聚合酶，在95t:下预变性2分钟，95t:变性1分钟，55t:退火30秒，72。C延伸2分钟，PCR循环数为33，随后72t:再延伸5分钟。加入甘油增加pfuDNA聚合酶的稳定性，同时提高反应体系的pH值，为扩增反应提供良好的环境。额外加入了镁离子，增强聚合酶的扩增能力。3、电击转化实验为了保证所构建文库具有足够的多样性，因此，需要非常高的转化效率，为此选择电击转化。对此方法，转化时所加DNA的体积要足够小。实验前要对经Dpnl(购自MBI公司)处理过的上述PCR产物进行浓縮。采用传统的乙丙醇/乙醇沉淀法。实验证明，在4t:冰箱过夜沉淀的DNA浓縮效果最好。电击转化后铺板培养过夜，转化菌落数极大(大约107—8个)。4、突变体文库保存突变体文库保存的方法有多种，理论上应在电转化铺板培养后进行单克隆菌种保存，但是该方法不适合较大突变体文库的保存，目前比较常用的方法是突变体文库质粒的保存。因此，需对转化后的菌落进行洗涤，采用中量质粒提取试剂盒进行质粒回收。同时，为了证明所构建文库的质量，进行了酶切实验。在含有野生型HheC基因的质粒中，只含有唯一一个限制性内切酶PpuMI酶切位点，因此，含有野生态HheC基因的质粒经该酶切后形成线形DNA。该酶切位点正好位于编码Pro175的密码子处，因此，该酶切位点会因为Pro175的突变而消失，因而在经该酶切后不会形成线形DNA。5、突变体文库筛选突变体表达后的筛选a.毒性试验法由于HheC作用的大多数底物具有毒性，因而可在含有一定浓度底物的培养基中进行文库筛选。含有高催化活性的突变体的菌株可分解有毒底物而可以生存且繁殖，而含野生态或含具有低催化活性的突变体的菌株将不能生存。该方法不仅快速，而且适用的底物范围广。b.pH指示法通过pH指示剂的显色反应来检测酶催化底物的反应速率。三、具有高催化活性的卤醇脱卤酶突变体的获得在特定条件下，催化效率是参考特定质量的酶在特定时间特定体积内催化特定底物转化为实际产物质量与理论产物质量(100%转化)的百分比值来进行评定的，比值越大，催化效率越高。这里是指在p朋.5-8.0的10-100mMTris_H2S04缓冲液中，底物为(S)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯，反应液中底物初始浓度5-50mM，卤醇脱卤酶(0.01-100mg/100ml)在20-5(TC下催化反应20-60小时后得到的实际产物质量与理论产物质量的比值。通过该方法，最后筛选得到催化效率提高3倍以上的正突变体，突变体的催化效率在表2中示出。表2卤醇脱卤酶突变体催化特性比较<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>四、基因工程菌发酵工艺A)摇瓶发酵摇瓶种子培养基成分酵母抽提物5g/1;蛋白胨10g/1;NaCl:10g/1;氨苄青霉素(简称氨苄)100iig/ml。摇瓶种子培养基制备取5g酵母抽提物，10g蛋白胨，10gNaCl，溶解在800ml蒸馏水中，调节pH到7，用蒸馏水定容到1000ml，12rC保持15min，，在12rC下保持15min，溶液冷却到60°C以下后加入氨苄至终浓度100iig/ml。发酵步骤从斜面接种到摇瓶，30-37t:，转速150-200rpm搅拌，过夜培养1012h。B)种子罐发酵培养基成分蛋白胨5-15g/1、酵母抽提物5-20g/1、葡萄糖8_20g/l(或者甘油5-10g/l)、KH2P0410-15g/l、(NH4)2HP044.0_5.0g/l、(NH4)2S04l_2g/l、MgS04.7H201-1.5g/l、拧檬酸1.5-2.0g/l、CoCl2*6H202_3mg/l、MnCl2*4H2012-15.0mg/l、CuCl2.4H201-2mg/l、生物素4-5mg/l、维生素B14_5mg/1。底料培养基配制蛋白胨、酵母抽提物、KH2P04、(NH4)2HP04、(NH4)2S04、柠檬酸、CoCl2.6H20、MnCl2.4H20、CuCl2.4H20搅拌溶解，用NaOH调节溶液pH至6-7，121°C下保持30min，冷却后待用。葡萄糖(或者甘油)、MgS047H20单独灭菌，12rC下保持20min。生物素和维生素Bl采用无菌膜过滤除菌。然后将无菌的葡萄糖(或者甘油)，MgS047H20，生物素，和维生素B1加入底料培养基中。种子罐发酵控制按照5%_10%的接种量从摇瓶接种到种子罐中，发酵温度控制在27-32。C，pH控制在6-8，D0X(溶解氧，dissolvedoxygen)控制在20%以上。C)商品罐发酵培养基分底料培养基和流加培养基。其中底料培养基成分如下葡萄糖2-20g/l(或者甘油5-10g/l)、蛋白胨5-15g/l、酵母抽提物5-20g/l、KH2P0410_15g/1、(NH4)2HP044.0-5.0g/l、(NH4)2S04l-2g/l、MgS04.7H201-1.5g/l、拧檬酸1.5-2.Og/1、CoCl26H202-3mg/l、MnCl24H2012—15.Omg/l、CuCl24H20l_2mg/l、Na2Mo042H202-3mg/l、Zn(CH3C00)22H2010-20mg/l、拧檬酸铁80-100.Omg/l、生物素4-5mg/l、维生素B14-5mg/1。底料培养基配制蛋白胨、酵母抽提物、KH2P04、(NH4)2HP04、(NH4)2S04、柠檬酸、CoCl2.6H20、MnCl24H20、CuCl24H20、Na2Mo042H20、Zn(CH3COO)221120、拧檬酸铁搅拌溶解，用NaOH调节溶液pH至6-7，12rC下保持30min，冷却后待用。葡萄糖(或者甘油)和MgS047H20单独灭菌，12rC下保持20min。生物素和维生素Bl采用无菌膜过滤除菌。然后将无菌的葡萄糖、MgS(^71120、生物素、和维生素Bl加入底料培养基中。流加培养基成分如下葡萄糖400g/l(或者甘油700g/l)、CoCl26H204.0-6.Omg/l、MnCl24H2020_30mg/l、CuCl24H202_3mg/l、H3B035_8mg/l、Na2Mo042H204-5mg/l、Zn(CH3C00)22H2010-20mg/l、拧檬酸铁40_50mg/l。流加培养基配制:CoCl26H20、MnCl24H20、CuCl24H20、Na2Mo042H20、Zn(CH3COO)221120、柠檬酸铁搅拌溶解，用NaOH调节溶液pH至6-7，121。C下保持30min，冷却后待用。葡萄糖和MgS0^7H20单独灭菌，12rC下保持20min。然后将无菌的葡萄糖(或者甘油)和MgS047H20加入流加培养基中。商品罐发酵控制整个过程控制DO20%以上，通风比为1:l-4(VVM)，葡萄糖(或者甘油)残余含量O.001%。-1%。(w/v)，整个发酵时间25-60小时，发酵结束后菌体干重可以达到20-80g/l左右。商品罐诱导控制在发酵过程中，通过诱导剂的添加表达目的蛋白酶，诱导剂有IPTG或者L-阿拉伯糖，诱导剂用量为0.1°;-5°;(w/v)，诱导时期为发酵前期或者中后期。五、发酵液处理和酶制备发酵完毕后，将发酵液送入连续分离机、板框或者真空转鼓进行菌液分离，浓縮菌体，浓縮菌体单独或者结合采用物理、化学和生物破壁方法进行细胞破碎。物理方法主要采用均质机破碎，菌液浓度控制在50-200g/l，破碎压力控制在30-60Mpa;化学方法开始用稀硫酸将浓菌体(50-200g/l)的pH调到7-8，搅拌均匀，用10X-20X的CaCl2下调pH到6-7，充分搅拌后用稀NaOH调节pH到7_8;生物方法主要采用溶菌酶进行细胞破壁，溶菌酶浓度l-2mg/ml，菌液浓度50-200g/l，摄氏37度处理4_20小时。细胞处理液板框过滤或者离心后取上清，上清进行微滤和超滤浓縮，向浓縮液中添加1%_10%甘油，0.02%。-2%。苯甲酸钠，制备液态酶。按照产品酶活，将浓縮液中添加适量的淀粉、面粉、糊精等，在进风温度120-180。C、出风温度70-80。C、风速l士O.5mVmin、压力:12-15X10kPa条件下进行喷雾干燥，制备固态酶。卤醇脱卤酶突变体的应用1.卤醇脱卤酶的作用机理卤醇脱卤酶和SDR家族在活性位点上存在相似性，其中132位丝氨酸(Serl32)和145位酪氨酸(Tyrl45)在蛋白氨基酸组成中非常保守，这些氨基酸在催化过程中所起的作用和SDR家族类似。Tyr作用于底物中的邻卤羟基，获取质子，同时Ser通过氢氧键和底物的羟基中的氧结合，固定底物和稳定反应液。卤醇脱卤酶HheC在pH7-8、30-5(TC条件下，145位的苏氨酸，132位的丝氨酸，和149位的Arg与底物反应，生成单一手性环氧化物。开环过程类似，是环氧化物合成的逆反应。通过氨基酸位点突变来证明酶的作用机理(底物2-溴-1-苯乙醇)，结果在表3中示出。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>从表3中我们可以看出，对于丝氨酸(Serl32)和145位酪氨酸(Tyrl45)进行突变后，其对底物的反应速度明显下降，证明这两个位点对于卤醇脱卤酶的催化作用起到了至关重要的作用。反应式l如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>反应式1关于卤醇脱卤酶作用底物的广泛性，可以通过以下实验结果得到证实(见表4)。表4催化速度(以每毫克蛋白每分钟从1、3-二氯-2-丙醇中释放20.71111101卤素计为100%)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>从表4中可知，卤醇脱卤酶对多种卤醇都具有脱卤催化作用。环氧化物合成的作用底物邻卤醇其中，&可以是选自由氢，低级烷基，环烷烃，烷氧基，链烯基，炔基，杂环，芳基和取代芳基组成的组中的任意一种取代基，&可以是选自由低级烷基，环烷烃，烷氧基，链烯基，炔基，杂环，芳基，取代芳基和酯基组成的组中的任意一种取代基，X为Cl，Br或I。2.环氧化物开环的作用底物环氧化物o其中，R2独立地选自由氢，低级烷基，环烷烃，烷氧基，链烯基，炔基，杂环，杂芳基，芳基，取代芳基和酯基组成的组。开环过程中，可以通过NaCN、NaN02、NaN3引入_CN、_冊2、或者_N3亲核基团，从而合成各种非常有用的中间体化合物。在一种优选的具体实施方式中，&为H，R2为乙酸乙酯基。在另一种优选的具体实施方式中，&为H，R2为乙酸甲酯基。在另一种优选的具体实施方式中，&为H，R2为氯甲基。在另一种优选的具体实施方式中，&为对硝基_苯基，R2为H。在本申请的上下文中，烷基可以是含有1至IO个碳原子的直链或支链饱和基团，具有包括1至10个碳原子在内的烷基基团的实例是甲基，乙基，丙基，异丙基，叔丁基，正丁基，戊基，己基，庚基，辛基，壬基，癸基，2-乙基己基，2_甲基丁基，2_甲基戊基，l-甲基己基，3_甲基庚基，以及它们的其他异构形式。优选地，烷基基团具有1至6个碳原子，实例是甲基，乙基，丙基，异丙基，叔丁基，正丁基，戊基，己基等。如下所述，这些烷基基团可以被取代，例如被芳基或烷氧基基团取代。术语烷氧基表示如上文定义的烷基基团，其通过一个氧原子连接于分子的其余部分。术语链烯基表示直链或支链基团，这些基团包含2至6个碳原子，并且存在至少一个C=C双键。链烯基基团的实例尤其包括烯丙基基团。术语炔基表示直链或支链基团，其包含2至8个碳原子，并且存在至少一个Cec三键。炔基基团的实例尤其包括乙炔基，丙炔基，丁炔基，戊炔基和己炔基基团。如下所述，这样的基团可以被取代，尤其是被烷氧基、NHCOR'或如下定义的芳基取代。术语芳基包括任何包含6至18个碳原子，优选6至14个碳原子的芳族基团。最优选的芳基基团是单环或双环的，并且包含6至10个碳原子，如苯基、或a-萘基、或者|3-萘基。另一种最优选的芳基基团是三环的，并且包括蒽基、或芴基基团。当&或者12是芳基基团时，它优选是苯基、l-萘基、或2-萘基基团。术语杂芳基包括任何包含4至18个碳原子，优选4至14个碳原子，并且被选自N、0、S的一个或几个杂原子所中断的芳族基团。最优选的杂芳基基团是噻吩基或苯并噻吩基，苯并呋喃基，吡啶基，嘧啶基，哒嗪基，异喹啉基，喹啉，噻唑基，呋喃基，吡喃基，吡咯基，2H-吡咯基，咪唑基，苯并咪唑基，吡唑基，异噻唑基，异噁唑基，以及喷哚基基团。术语芳烷基(或芳(C「Ce)烷基)基团总体上表示通过如上文定义的烷基基团连接于分子的芳基基团，如苄基或苯乙基。术语(C「Ce)烷芳基基团总体上表示通过如上文定义的芳基基团连接于分子的烷基基团。术语"环烷基"表示环状的饱和烃基体系，其优选为具有3至6个碳原子的单环或多环。这类基团的典型实例是环丙基、环丁基、环戊基或环己基基团。术语"杂环"包括任何烃基化的芳族或非芳族的环，并具有一个或多个环杂原子。尤其是，一个杂环存在4至18个碳原子和一个或多个环杂原子，如N、0、或S。它们包括杂芳基基团，如噻吩基，苯并噻吩基，苯并呋喃基，吡啶基，嘧啶基，哒嗪基，异喹啉基，喹啉基，噻唑基，呋喃基，妣喃基，妣咯基，2H-妣咯基，咪唑基，苯并咪唑基，妣唑基，异噻唑基，异唑基，以及吲哚基基团。它们还包括非芳族杂环，如吗啉，哌啶，哌嗪，四氢呋喃基，以及吡咯烷基团。卤素应理解为是指氟、氯、溴或碘。杂原子应理解为是指0、N或S。下面将结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。实施例I.本发明基因工程菌的构建依靠大引物PCR技术，对卤醇脱卤酶的卤离子结合区(Prol75-Tyr187)进行突变，将突变体和载体pBAD进行构建，转化到宿主MC1061中构建突变体文库，对突变体文库进行筛选，发现P175H和Y177W突变效果比较理想，突变体氨基酸序列为SEQIDNO.2，进一步得到能生产该突变体的基因工程菌，该基因工程菌保藏编号为CCTCCNO:M208089。II.基因工程菌的发酵将本发明的菌株按照以下条件进行发酵。A)摇瓶发酵取5g酵母抽提物，10g蛋白胨，10gNaCl，溶解在800ml蒸馏水中，调节pH到7，用蒸馏水定容到1000ml，12rC下保持15min，溶液冷却到60°C以下后加入氨苄至终浓度lOOiig/ml。从斜面接种到摇瓶，温度37t:，转速150rpm搅拌，过夜培养12h。B)种子罐发酵培养基成分葡萄糖8g/l(或者甘油10g/l)、蛋白胨10g/l、酵母抽提物15g/1、KH2P0410g/l、(NH4)2HP044.0g/l、(NH4)2S04lg/l、MgS04.7H20lg/l、拧檬酸1.5g/l、CoCl26H202mg/l、MnCl24H2012mg/l、CuCl2.4H20lmg/l、生物素4mg/l、维生素Bl4mg/1。底料培养基配制蛋白胨、酵母抽提物、KH2P04、(NH4)2HP04、(NH4)2S04、柠檬酸、CoCl2.6H20、MnCl2.4H20、CuCl2.41120搅拌溶解，用NaOH调节溶液pH至7，121。C下保持30min，冷却后待用。葡萄糖(或者甘油)、MgS0^7H20单独灭菌，12rC下保持20min。生物素和维生素Bl采用无菌膜过滤除菌。然后将无菌的葡萄糖，MgS0^7H20，生物素和维生素Bl加入底料培养基中。种子罐发酵控制按照5%的接种量从摇瓶接种到种子罐中，发酵温度控制在30°C，pH控制在7，DO控制在20%以上。C)商品罐发酵其中底料培养基成分如下葡萄糖20g/l(或者甘油10g/l)、蛋白胨10g/l、酵母抽提物15g/l、KH2P0410g/l、(NH4)2HP044.0g/l、(NH4)2S04lg/l、MgS04.7H20lg/l、柠檬酸1.5g/l、CoCl26H202mg/l、MnCl24H2012mg/l、CuCl24H20lmg/l、Na2Mo042H202mg/l、Zn(CH3C00)22H2010mg/l、拧檬酸铁80mg/l、生物素4mg/l、维生素Bl4mg/l。底料培养基配制蛋白胨、酵母抽提物、KH2P04、(NH4)2HP04、(NH4)2S04、柠檬酸、13CoCl2.6H20、MnCl24H20、CuCl24H20、Na2Mo042H20、Zn(CH3C00)221120、拧檬酸铁搅拌溶解，用Na0H调节溶液pH至7，12rC下保持30min，冷却后待用。葡萄糖(或者甘油)和MgS0^7H^单独灭菌，12rC下保持20min。生物素和维生素B1采用无菌膜过滤除菌。然后将无菌的葡萄糖(或者甘油)，MgS047H20，生物素和维生素Bl加入底料培养基中。流加培养基成分如下葡萄糖400g/l(或者甘油700g/l);CoCl26H204.Omg/1;MnCl24H2020mg/l;CuCl24H202mg/l;H3B035mg/l;Na2Mo042H204mg/l;Zn(CH3COO)22H2010mg/l;拧檬酸铁40mg/1。流加培养基配制:CoCl26H20、MnCl24H20、CuCl24H20、Na2Mo042H20、Zn(CH3COO)221120、柠檬酸铁搅拌溶解，用NaOH调节溶液pH至6-7，121。C下保持30min，冷却后待用。葡萄糖(或者甘油)和MgS047H20单独灭菌，12rC下保持20min。然后将无菌的葡萄糖和MgS047H20加入流加培养基中。商品罐发酵控制整个过程控制DO20%以上，空气流量1:1.5vvm，控制葡萄糖(或者甘油)残余含量1%。以下，发酵结束后菌体干重可以达到20g/l。商品罐诱导控制在发酵过程中，通过诱导剂的添加表达目的蛋白酶，诱导剂为IPTG(pGEF表达载体)或者L-阿拉伯糖(pBAD表达载体)，诱导剂用量为2%。(w/v)，诱导时期为发酵前期。III.卤醇脱卤酶突变体的制备及鉴定将CCTCCM208089按上述条件发酵完毕后，将发酵液进入连续分离机进行菌液分离，浓縮菌体，浓縮菌体采用均质机破碎，菌液浓度控制在100g/l，破碎压力控制在50MPa。细胞处理液板框过滤后取上清，上清进行微滤和超滤浓縮，浓縮液添加1%甘油，1%。苯甲酸钠，制备液态酶。按照产品酶活，将淀粉和面粉(淀粉面粉=i:i)混合物按照一定比例加入浓縮酶液中，在进风温度15(TC、出风温度7(TC、风速1±0.5mVmin、压力12-15X10kPa条件下进行喷雾干燥，制备固态酶。IV.邻卤醇的脱卤实例1:(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的催化合成将反应缓冲液(50mMTrisH2S04，pH:8)力B热恒温到30°C;将底物加入反应缓冲液中，控制底物在水溶液中的含量为10g/l，搅拌均匀。先将30%NaCN的溶液稀释10-20倍，然后用稀硫酸调节NaCN溶液pH到8.0，按照底物和NaCN的摩尔数比1:2比例添加稀释的NaCN，搅拌均匀；加入卤醇脱卤酶突变体(卤醇脱卤酶突变体(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯二1:100(w/w))进行催化反应，反应过程中通过补加NaCN调节反应液pH值。3(TC下反应24小时，催化效率达到97%，目的产物的光学纯度(ee)值达到99%。实例2-l:(S)-氯甲基-环氧乙烷的催化合成将反应缓冲液(50mMTris*H2S04，pH:8)加热恒温到30°C;将1，3-二氯-2-丙醇加入反应缓冲液中，控制底物在水溶液中的含量为10g/l，搅拌均匀。加入卤醇脱卤酶突变体(卤醇脱卤酶突变体1，3-二氯-2-丙醇=1:500(w/w))进行催化反应。3(TC下反应24小时，催化效率达到90%，目的产物光学纯度达到95%。实例2-2:(lS，2R)-2-甲基_1_苯基_环氧乙烷的催化合成将反应缓冲液(50mMTris*H2S04，pH:8)加热恒温到30°C;将(1S，2R)_2-氯(或者溴)-1-苯基-1-丙醇加入反应缓冲液中，控制底物在水溶液中的含量为80g/l，搅拌均匀。加入卤醇脱卤酶突变体(卤醇脱卤酶突变体(lS，2R)—2-氯(或者溴)-l-苯基-l-丙醇=1:500(w/w))，进行催化反应。3(TC下反应24小时催化效率达到92X，目的产物光学纯度达到96%。V.环氧化物开环实例3-l:(S)-氯甲基环氧乙烷的手性拆分将反应缓冲液(50mMTrisH2S04，pH:8)加热恒温到30°C;将混旋的氯甲基环氧乙烷加入反应缓冲液中，控制底物在水溶液中的含量为10g/l，然后加入40%NaN3到终浓度为10g/l，搅拌均匀。加入卤醇脱卤酶突变体(卤醇脱卤酶突变体对应于氯甲基环氧乙烷=1:500(w/w))进行催化反应。3(TC下反应24小时催化效率达到45X，目的产物光学纯度达到95%。实施例3-2:(1S，2R)-1_甲基-l-苯基环氧乙烷的手性拆分将反应缓冲液(50mMTris*H2S04，pH:8)加热恒温到30°C;将混旋1_甲基+苯基环氧乙烷加入反应缓冲液中，控制底物在水溶液中的含量为80g/l，然后加入40%NaN3到终浓度为10g/l搅拌均匀。加入卤醇脱卤酶突变体(卤醇脱卤酶突变体(1S，2R)—1-甲基-1-苯基环氧乙烷=1:500(w/w))进行催化反应。3(TC下反应24小时催化效率达到45%，目的产物光学纯度达到96%。综上所述，虽然本发明已以一个优选实施例披露如上，然其并非用以限定本发明。本发明所属
技术领域：
中的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可以作各种更动与修改。因此，本发明的保护范围当视所附的申请权利要求书所限定的为准。序列表〈110〉安琪酵母股份有限公司〈120〉卤醇脱卤酶突变体的菌株、卤醇脱卤酶突变体及其制备方法和应用〈130〉P20220ANGEL〈160>5〈170>PatentInversion3.2〈210>1〈211>765〈212>DNA〈213〉卤醇脱卤酶基因突变体〈400>1atgtcaaccgcaattgtaaccattttggggg^tggggtctgcacttcgt60ctctcggaagagtggcttgcgcttcaaaca120cttgaagcctttgccgaaacctatccacaatgtcgg肌ca3g^CC3gCg180gaactcatcgctccgcttatggt固gttgatgtacttgtg3gC33Cg3C240atettcgcaccagagttccaacccategattcgcggtgcg300gtcgaggcgcaccatttgcactggtcaacgccgttgcaag360^gcgc皿^gcggacatettetctttattacctctgcaacgcccttcgggccttgg啷420gaactttctacctacacgtc3gCCCg3gC3ggtgratgcaccttggcaaatgccctttcg■朋gg朋ctcggtg朋tec朋cattccggtgttcgcaataggacacaattggcttcacagtgaagatagtccctacttctaccccacagaaccgtgg朋朋cgaatccagaacacgttgcccatgtcaaaaaagtcactgcgctccagcggttaggtacac3g朋3g朋ttgggag朋ctcgtcgcgtttctcgcgtctggtegttgtgactatctgaccggccaggtgttctggttggccggcggattcccaatgatcgagcgttggcctggtatgcccgagtag〈210>2〈211>254〈212>PRT〈213〉卤醇脱卤酶突变体〈400>2MetSerThrAlalieValThrAsnValLysHisPheGlyGlyMetGly151015SerAlaLeuArgLeuSerGluAlaGlyHisThrValAlaCysHisAsp202530GluSerPheLysGinLysAspGluLeuGluAlaPheAlaGluThrTyr354045ProGinLeuLysProMetSerGluGinGluProAlaGluLeulieGlu505560AlaValThrSerAlaTyrGlyGinValAspValLeuValSerAsnAsp65707580liePheAlaProGluPheGinProlieAspLysTyrAlaValGluAsp859095TyrArgGlyAlaValGluAlaLeuGinlieArgProPheAlaLeuVal100105110AsnAlaValAlaSerGinMetLysLysArgLysSerGlyHislielie115120125PhelieThrSerAlaThrProPheGlyProTrpLysGluLeuSerThr130135140TyrThrSerAlaArgAlaGlyAlaCysThrLeuAlaAsnAlaLeuSer145150155160LysGluLeuGlyGluTyrAsnlieProValPheAlalieGlyHisAsn165170175TrpLeuHisSerGluAspSerProTyrPheTyrProThrGluProTrp180185190LysThrAsnProGluHisValAlaHisValLysLysValThrAlaLeu195200205GinArgLeuGlyThrGinLysGluLeuGlyGluLeuValAlaPheLeu210215220AlaSerGlySerCysAspTyrLeuThrGlyGinValPheTrpLeuAla13/17页76516225230235240GlyGlyPheProMetlieGluArgTrpProGlyMetProGlu245250〈210〉3〈211〉3089〈212〉DNA〈213〉改造后的pGEF〈400〉3attg^gcatttatcagggttettgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttaga60皿teggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgtatgcggtg120C3C3g3tgCgteaggag3^ateccgcatcaggcg^att180atettttgtt皿^ttcgcgttaaatetttgttaaatcagctcatttttt240ccg^atcggcaaaatccctcg卿tegggttgagtgttg300ttccagtttgg^c^gagtccactettea3g^cgtgg3ctccaacgtc■agggcg^360aaaccgtctatc鄉gcgatggcccactacgtgaaccatcagttttttgc420ggtcg郷tgccgtaaagctcte^tcgga3cccte33gggagcccccgatttagagctt480gacgggg^agCCggCg33Cgtggcg卿a鄉^ggg^ggagcgggcg540ctegggcgctggc卿tgtegcggtcacgctgcgcgtaacC3CC3C3CCCgccgcgctte600atgcgccgctac鄉gcgcgtccagtcgccattcaggctgcgcaactgttggg皿gggcg660atcggtgcgggcctcttcgctettacgccaggatctcgatcccgcgaaattaatecgact720cacteteggg3g3CC3C^Cggtttccctctagaaataattttgtttaac780tggctagcatg3Ctggtgg3C3gC皿3tgggtcggatccggctgctaaca840皿gcccga皿gg皿gctgagttggctgctgccaccgctgagc皿teactegcataacccc■ttggggcctcte皿cgggtcttgaggggttttttgctgaaatetccggat960gggttcg腿tcgateagctctgcctcgcgcgtttcggtgaaacctctga1020cacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgteagcggatgccggg3gC3g3C朋1080gcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagccatgacccagtca1140cgtegcgategcggagtgtetectggctteactetgcggcattgtectga1200g3gtgC3CC3tatetgcggtgtga皿teccgcacagatgcgteaggag皿aateccgcat1260caggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcg13203gcggtetcagctcactc皿aggcggteatacggttetccgggateacgc13803tgtg3gC皿朋ggCC3gC3皿3ggCC3gg皿ccgtea皿aggccgcgtt1440gctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatgacgctc皿g1500tc卿ggtggcg皿3cccgacaggactete皿gatecc3ggcgtttccccctggaagctc1560cctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgctteccggatecctgtccgcctttctccc1620ttcggg朋gcgtggcgctttctcategctcacgctgteggtetctcagttcggtgteggt1680cgttcgctcc朋gctgggctgtgtgracgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgcctt1740atccggtaactatcgtcttgagtccaacccggteagacacgacttetcgccactggcagc1800agccactggt朋caggattegcag3gcgaggtetgteggcggtgct織gagttcttgaa1860gtggtggcctaactecggct3cacteg朋ggacagtetttggtetctgcgctctgctg朋1920gccagttaccgagttggtegctcttgatccggcaaacaaaccaccgctgg1980tegcggtggtttttttgtttgc朋gcagc3gattecgcgc3ga朋朋朋ggatctc朋ga2040agatcctttgatcttttctecggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgtteagg2100gattttggtcatgagattetc朋3朋ggatcttcacctegatcctttt朋atte朋朋tg2160朋gtttte朋tcaatcteaagtetetatgagteaacttggtctgacagttaccaatgctt2220朋tcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctetttcgttcatccategttgcctgact2280ccccgtcgtgtagateactecgatecgggagggctteccatctggccccagtgctgcaat2340gateccgcgagacccacgctcaccggctccagatttetcagcaateaaccagccagccgg2400朋gggCCgElgcgcagaagtggtcctgcaactttetccgcctccatccagtctetteattg2460ttgccggg朋gctegagteagtegttcgccagtteategtttgcgcaacgttgttgccat2520tgctgcaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtetggcttcattcagctccggttc2580ccaacgatcaaggcgagttecatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttegctcctt2640cggtcctccgatcgttgtcagaagteagttggccgcagtgttetcactcatggttetggc2700agcactgcataattctcttectgtcatgccatccgteagatgcttttctgtgactggtga2760gtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtetgcggcgaccgagttgctcttgcccggc2820gtc朋tecgggateateccgcgccarategcag皿ctttea^gtgctcatcattgga朋2880acgttcttcggggcg朋皿ctctcaaggatctteccgctgttgagatccagttcgatgta2940acccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttectttcaccagcgtttctgggtg3000gg皿ggra皿atgccgc皿3皿3ggg皿te3gggcg3cacgg朋atgttg3060ctcttccttt-ttcaatatt3089〈210〉4〈211〉4094〈212〉DNA〈213〉改造后的pBAD〈400〉4ttgtccatettgcatcagacattgccgtcactgcgtcttttectggctct60tctcgcteacca皿ccggteaccccgcttette朋3gcattctgteac朋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—种利用权利要求3所述的基因工程菌制备卤醇脱卤酶突变体的方法，其特征在于包括以下步骤(a)构建所述基因工程菌，所述基因工程菌包括宿主细胞，载体系统以及卤醇脱卤酶突变体基因；(b)筛选得到所述基因工程菌；(c)培养所述基因工程菌；(d)种子罐发酵所述基因工程菌；以及(e)收集和制备卤醇脱卤酶突变体。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述宿主细胞选自大肠杆菌BL21，MC1061，和JM105中的一种。8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述基因工程菌的载体系统选自改造后的pGEF或改造后的pBAD，所述改造后的pGEF，其具有核苷酸序列SEQIDNO.3;所述改造后的pBAD，其具有核苷酸序列SEQIDNO.4。9.根据权利要求68中任一项所述的方法，还包括在一定商业罐发酵条件下，进行工业化制备所述卤醇脱卤酶突变体的步骤。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述商业罐发酵条件是DO20%以上，空气流量1:l-4vvm，葡萄糖或者甘油的残余含量为0.001。；-lQ;。11.根据权利要求35任一项所述的基因工程菌在邻卤醇脱卤环氧化反应中的应用，所述底物的结构式为其中A是选自由氢，低级烷基，环烷烃，烷氧基，链烯基，炔基，杂环，芳基和取代芳基组成的组中的任意一种取代基，R2是选自由低级烷基，环烷烃，烷氧基，链烯基，炔基，杂环，芳基，取代芳基和酯基组成的组中的任意一种取代基，X为Cl，Br或I。12.根据权利要求35任一项所述的基因工程菌在环氧化合物开环反应中的应用，所述环氧化合物的结构式为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中Ri、R2独立地选自由氢，低级烷基，环烷烃，烷氧基，链烯基，炔基，杂环，杂芳基，芳基，取代芳基和酯基组成的组。全文摘要本发明提供了一种生产卤醇脱卤酶的基因工程菌，并且通过培养该基因工程菌和发酵工艺，使得卤醇脱卤酶的生产工业化。本发明还提供了该基因工程菌的应用，由该基因工程菌生产出的卤醇脱卤酶可以应用到邻卤醇脱卤环氧化和环氧化物的开环反应中。文档编号C12N1/21GK101760468SQ20081018657公开日2010年6月30日申请日期2008年12月25日优先权日2008年12月25日发明者余华顺,余明华,俞学锋,姚鹃,李知洪,杨海珍,熊茂盛,石雨申请人:安琪酵母股份有限公司