专利名称：利用rna干扰文库筛选肿瘤化疗药物敏感基因的方法
技术领域：
本发明涉及的是一种利用RNA干扰文库筛选肿瘤化疗药物敏感基因的方法，属于生物医 药技术领域。
背景技术：
肿瘤治疗的手段主要分为手术切除、化疗、放疗和其他方法。肿瘤化疗，即用化学药物 进行肿瘤的治疗。近年来在肿瘤治疗中发展最快的是化疗，它己成为当今临床治疗肿瘤的最 重要手段之一，属于肿瘤的全身治疗方法。随着化学药物种类的逐渐增多，用药方法的不断 改进，临床经验的不断积累，其疗效日益提高，化疗已从以前的姑息性治疗向根治性治疗阶 段过渡。
化疗的原理是利用通过化学方法合成或从其他物质中提取出来的药物作用在细胞生长繁 殖的不同环节上，抑制或杀灭肿瘤细胞，从而达到治疗的目的。化疗效果决定于肿瘤细胞对 化疗药物的敏感性。这一敏感性是肿瘤细胞对化疗药物的耐药性和敏感性的综合，并决定于 肿瘤细胞的耐药基因和敏感基因。
肿瘤细胞的耐药性限制了肿瘤化疗的使用和疗效，因而人们试图通过确定肿瘤耐药基因， 并据此选择化疗药物、制定化疗方案，从而改善化疗的效果。多年来，利用各种基因过表达 手段，人们找到了一些药物耐受基因，如多药耐药基因蛋白、肺耐药相关蛋白、拓扑异构酶 II、谷光甘肽S转移酶等。遗憾的是，由于肿瘤细胞的耐药性表现为多药耐药，即指肿瘤细 胞接触一种化疗药物后产生针对这种药物，和对其他多种结构和作用机制相同和不同的化疗 药物亦产生耐受的现象。这样一来，即使找到了肿瘤的耐药基因，确定了肿瘤的多药耐药性 也很难找到有效的化疗方案，达到改善化疗的目的，使得多年来肿瘤的治疗没有大的改观。
在这种情况下，我们试图从肿瘤细胞的药物敏感性着手改善肿瘤化疗的效果。不过，筛 选药物敏感性需要通过降低药物敏感基因表达来实现。由于没有可靠的降低表达手段，长期 以来只确定了有限的药物敏感基因，使得对药物敏感基因的研究、开发、利用无法进行，肿 瘤化疗的效果受到了极大的限制。
最近，美国科学家安德鲁 法尔和克雷格 梅洛1998年发现了 RNA干扰机制，2006年他 们俩分享了诺贝尔生理学和医学奖。 一项全新的技术在提出后短短几年就得到诺贝尔奖的肯定，足见RNA干扰在医学领域的开创性意义和极大的应用前景。这一可以使得基因在体降低
表达的机制，也为寻找药物敏感基因提供了条件。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种利用RNA干扰文库筛选肿瘤化 疗药物敏感基因的方法。它从肿瘤细胞的药物敏感性着手，利用RNA干扰文库使得人类基因 组的各种基因分别在个体细胞任意地降低表达，在药物敏感基因降低表达的细胞，药物的敏 感性降低，受化疗药物处理后更容易存活下来，通过克隆可以确定存活细胞内的药物敏感基 因。
本发明的目的是通过如下技术方案来完成的，该方法是利用降低基因表达的RNA干扰 文库，对肿瘤细胞的药物敏感基因表达进行降低。使得它们的药物敏感性减弱，而药物耐受 性升高，从而在高浓度药物处理条件下存活下来，并形成细胞克隆，通过基因克隆找到并筛 选到药物敏感基因。
本发明从存活下来的细胞内提取基因组DNA， PCR扩增从RNA干扰文库中插入的DNA片 段，用TA克隆法克隆PCR扩增的DNA片段，挑选克隆，纯化DNA，最后基因测序确定筛选基 因。
本发明在筛选基因后进一步分析对药物敏感性的影响，它们是
a. 利用RNA干扰降低基因表达作Loss-of function分析；
b. 利用过表达作Gain-of-function分析；
c. 利用生化实验分析筛选基因影响药物敏感性的机制。
本发明在筛选基因后，分析其在肿瘤中对药物敏感性的影响等状况，它们是
a. 检测筛选基因是否在肿瘤中过表达；
b. 检测筛选基因是否在肿瘤中低表达；
c. 检测筛选基因是否在肿瘤中被修饰，如甲基化等。
本发明是通过利用人类基因组的RNA干扰文库，结合药物敏感基因的作用原理发明了一 种药物敏感基因筛选的新技术，并率先进行了肝癌细胞的药物敏感基因筛选，世界上首次确 定了一批真正的药物敏感基因。
本发明从基因组水平筛选肿瘤细胞药物敏感基因，并用于
4(1) 指导肿瘤化疗的药物选择当针对某一药物的敏感基因表达正常时，推荐选用该药物； 当针对某一药物的敏感基因降低表达或发生突变时，避免选用该药物。
(2) 开发应用此类基因作为肿瘤的生物标志，在诊断之前，用于风险评估和发病普查；在诊 断时，用于肿瘤的分类和定级；在诊断之后，用于评估治疗效果和检测复发。
具体实施例方式
本发明从肿瘤细胞的药物敏感性着手，利用RNA干扰文库使得人类基因组的各种基因分 别在个体细胞任意地降低表达，这样，在药物耐受基因降低表达的细胞，药物的耐受性降低， 受化疗药物处理后更容易被杀死、清除，因而不能找到药物耐受基因；相反，在药物敏感基 因降低表达的细胞，药物的敏感性降低，受化疗药物处理后更容易存活下来，通过克隆可以 确定存活细胞内的药物敏感基因。
本发明的主要构思是由于存在多药耐药性，部分细胞可以在临床使用高浓度的抗癌药 物作用下存活下来。不过，当药物浓度升高到一定程度时，所有的细胞将被杀死。经过RNA 干扰文库处理后，由于一些细胞内的药物敏感基因表达被降低，使得它们的药物敏感性减弱， 药物耐受性升高，从而在高浓度药物处理条件下存活下来，并形成细胞克隆。通过基因克隆 可找到药物敏感基因。
本发明的主要特征是
A、 与过去从肿瘤药物耐受性着手不同，反向从肿瘤药物敏感性着手；
B、 与过去筛选药物耐受基因不同，反向筛选药物敏感基因；
C、 与过去利用过表达文库不同，反向利用降低基因表达的RNA干扰文库。 本发明采用的主要技术方案是
A、 表型筛选
a. 在低浓度时，对照和RNA文库处理细胞都存活下来，但RNA文库处理细胞存活下来更多；
b. 在中等浓度时，对照和RNA文库处理细胞都形成克隆，但RNA文库处理细胞形成克隆更 多；
c. 在一定浓度时，只有RNA文库处理细胞存活下来并形成克隆；
d. 在更高浓度时，RNA文库处理细胞和对照细胞都没有细胞存活下来。
B、 候选基因鉴定
a.从存活下来的细胞内提取基因组DNA;b. PCR扩增从RNA干扰文库中插入的DNA片段；
c. TA克隆法克隆PCR扩增的DNA片段；
d. 挑选克隆，纯化DNA;
e. 基因测序确定筛选基因。
C、 分析筛选基因对药物敏感性的影响
a. 利用RNA干扰降低基因表达作Loss-of function分析；
b. 利用过表达作Gain-of-function分析；
c. 利用生化实验分析筛选基因影响药物敏感性的机制。
D、 分析筛选基因在肿瘤中的状况(对药物敏感性的影响)
a. 检测筛选基因是否在肿瘤中过表达；
b. 检测筛选基因是否在肿瘤中低表达；
c. 检测筛选基因是否在肿瘤中被修饰，如甲基化等。 实施例1
利用本发明技术，我们已经进行了肝癌细胞(H印G2， A謂:HB-8065)的阿霉素和顺 铂的敏感基因的筛选，并分别筛选到了肝癌细胞的31种阿霉素敏感基因和23种顺铂敏感基 因(另外申请产品专利)。以筛选肝癌细胞的阿霉素敏感基因为例介绍
具体实施例方式
一、利用RNA干扰文库DNA转染菲尼克思(Phoenix)反转录病毒包装细胞 第一天准备菲尼克思反转录病毒包装细胞
1、 转染之前18-24小时，按3x10710厘米平板接种菲尼克思细胞到平板上；
2、 让细胞贴壁10-24小时；
3、 当细胞密度达到2/3时， 一个10厘米平板大约有5xl()6细胞。这时的包装细胞最容易转染 并产生最高滴度的病毒37°C;
*培养基DMEM， 10%胎牛血清，1%青-链霉素，1%谷氨酰胺。 第二天转染
1、 准备好转染用的DNA并溶解在HEPES溶液中；
2、 转染之前大约5分钟，在平板中加入25微摩氯喹(氯喹的储藏浓度为50毫摩)；
*氯喹通过中和胞内转运微泡内的pH而抑制溶酶体内的DNA酶；3、 在一个15毫升的试管内，加入(以10厘米平板为例、室温条件)
20微克文库DNA和20微克辅助质粒DNA; 62.5微升2摩尔的氯化钙(手指轻弹混匀)； 加无菌双蒸水至500微升总体积。
4、 快速加入500微升2倍的HEPES缓冲液，然后利用全自动移液枪激烈吹气泡5-15秒；
5、 转染之前大约5分钟，给包装细胞换已预热至、含终浓度25微摩氯喹的培养液9毫升；
6、 20分钟之后，将HEPES/DNA混合液逐滴、快速加入平板。 注意
*在显微镜下观察，应该看到一些大小均一、分布均匀的细小黑色颗粒； *将平板放入37"C孵箱，前后左右轻轻转动平板使DNA/CaP04颗粒均匀分布； * HEPES购于Sigma (商品目录号:H-7006) *氯化钙购于Mallinkrodt (商品目录号H-4160)
*由于pH非常重要，可分别配制pH 6.95、 pH 7.00、 pH 7. 05的缓冲液进行测试； *使用之前将所有的试剂复苏到室温。 第三天转染后24小时，换液、准备好感染细胞
1、 转染后24小时，给包装细胞换预热至37°C的培养液10毫升(不要让氯喹在培养液中影响 细胞超过24小时)；
2、 将感染靶细胞分盘，细胞密度为2x10710厘米平板，培养液DMEM， 10%胎牛血清，1% 青-链霉素，1%谷氨酰胺。
第四天转染后24小时，用含反转录病毒的上清感染靶细胞
1、 用移液枪从转染后的包装细胞中吸取上清并置于15毫升的试管内，1500转/分钟离心5 分钟以除去细胞碎片；
2、 用0.45微米滤膜过滤；
3、 从耙细胞培养板内吸除2毫升培养液；
4、 在靶细胞培养板内加入5微升polybrene(polybrene的1000倍储藏浓度为5毫克/毫升)， 混匀；
5、 在靶细胞培养板内加入2毫升含反转录病毒的上清，置于32-37。C，轻轻混匀；6、每隔4-6小时进行重复感染。 第五天吸除含反转录病毒的上清
感染后24小时吸除含反转录病毒的上清，加入新鲜的培养基DMEM, 10%胎牛血清，1%青 -链霉素，1%谷氨酰胺。并加入5微升puromycin (puromycin的1000倍储藏浓度为5毫克/ 毫升)筛选24小时。
二、 处理(表型筛选)
第六天感染后48小时(puromycin作用24小时)，靶细胞可用于各种处理，进行表型筛选。
1、 将感染靶细胞分盘，培养液为DMEM， 10%胎牛血清，1%青-链霉素，1%谷氨酰胺。
2、 分盘后12小时，以不同浓度加入不同药物处理。
三、 挑细胞克隆
2周后，存活细胞形成了细胞克隆
1、 吸除细胞上清，加入无菌PBS洗一遍并吸除PBS;
2、 用消毒无菌的枪头挑取单个细胞克隆，置于含100微升1毫摩EDTA/0. 25%胰酶的48孔平 板内；
3、 37。C消化5分钟；
4、 加入200微升培养基(DMEM， 10%胎牛血清，1%青_链霉素，1%谷氨酰胺，200微克/毫升 puromycin)反复吹打；
5、 24小时后，换新鲜培养基(DMEM， 10%胎牛血清，1%青-链霉素，1%谷氨酰胺，200微克/ 毫升puromycin);
6、 将增殖细胞逐渐转到体积大的平板上生长；
7、 待细胞扩增到足够时，冷冻保存细胞克隆；同时收集细胞用于提取基因组DNA。
四、 基因鉴定
1、 利用Roche生产的High Pure PCR Template Preparation试剂盒(商品目录号 11796828001)从收集的细胞中提取基因组DNA;
2、 以基因组DNA为模板，通过PCR扩增插入细胞基因组DNA的RNA干扰文库特异片段 (1)扩增引物
RNAi clone 1: 5， -gag ggc eta ttt ccc atg at_3， (20bp)RNAi clone 2: 5， _gta ata cga etc act ata ggg cct ctt egg卿tea get tc-3， (41bp)
(2) PCR反应体系
H20 13. 0 |xl
10xPCR Buffer 2. 5 pi
25mM MgCl2 2. 0 pi
2. 5mM dNTP 2. 0 pi
10nM primer F2. 0 pi
lO(iM Primer R 2. 0 |xl
Taq 0.5 pi
Template 1. 0 pi
Total 25.0 pi
(3) PCR反应条件
1. 940C 3:00
2. 94。C 0:15
3. 60°C 0:45
4. 720C 2:00
5. Go to 2 35X
6. 72。C 4:00
7. 4QC forever
(4) PCR反应结果在0.8%琼脂糖凝胶水平电泳，观察一0.6 kb条带。
3、 利用Invitrogen Life Technologies生产的T0P0 TA克隆试剂盒(商品目录号 K4600-01)将PCR扩增的插入细胞基因组DNA的RNA干扰文库特异片段克隆；
4、 挑选得到的克隆，置于含2毫升青霉素抗性的LB内，37T振荡培养16小时；
用Sigma-Aldrich生产的GeneElutePlasmidMinipr印试剂盒(商品目录号:PLN350)提取 质粒；
5、 将质粒送测序公司测序，测序引物为反向M13;
6、 利用公用的NCBI Blast程序(http:〃blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)确定基 因；对候选基因作生物信息学分析，了解基因的基本情况及其已知的功能。
931种阿霉素敏感基因被鉴定出来，在此仅给出其中三种基因为例-
(1) CDK10: shRNA片段为 ATCAGCTCCACGATGTTCGGATGACGCAGGTTGGCTTGCGTTATCCGGACATCGTGGAGTTGA;
(2) GP5: shRNA片段为 CTCCAGAAACACCACCTTATCCAGCAACGCCAACGCTGCTGGATAAGATGGTGCTCCTGGAG;
(3) INTS12: shRNA片段为 GATGTTGCCAGACCAGTCAAACCCACAGGTTGGCTTGTGGGTTTGATTGGTCTGGTAATATC。
其中CDK10已在最近被证实与乳腺癌细胞对他莫西芬的敏感性相关(Iorns et al. 2008. Identification of CDK10 as an important determinant of resistance to endocrine therapy for breast cancer. Cancer Cell, 13(2): 83-85 )。 五、药物敏感基因对药物敏感性的鉴定
1、 分别构建药物敏感基因的基于反转录病毒载体的RNA干扰和过表达质粒；
2、 利用RNA文库同样的技术和步骤分别建立稳定RNA干扰和过表达细胞；
3、 检测各细胞的药物敏感性-(1)半抑制率(IC50)检测
a. 将肝癌细胞按画个/100微升/孔接种到96孔板上，37°C， 5%C02， 24小时，培养液DMEM， 10%胎牛血清，1%青_链霉素，1%谷氨酰胺；
b. 置换带有0、 5、 10、 15、 20、 30纳摩阿霉素的培养液培养三天，设置三复孔；
c. 置换50微升/孔带有MTT (3毫克/毫升)、不含10%胎牛血清的培养液，37°C， 5%C02培 养4小时；
d. 吸除培养液，按50微升/孔加入二甲基亚砜(DMS0)，摇床摇动10分钟；
e. 利用分光光度计读取波长570纳米的吸光度；
f. 记录结果，以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制细胞生长曲线；
g. 以阿霉素的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到50%抑制率时候的药品浓度， 就是IC50 (抑制率=1-加药组0D值/对照组0D值)。
注意事项
a. 选择适当得细胞接种浓度；
b. 避免血清干扰 一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液；
c. 设空白对照与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后 比色以空白调零；
d. 保持MTT实验吸光度值最后要在0-0. 7之间这一线性关系范围。
(2) 相对细胞生长速度检测
a. 将肝癌细胞按1000个/100微升/孔接种到96孔板上，37°C， 5%C02， 24小时，培养液DMEM， 10%胎牛血清，1%青_链霉素，1%谷氨酰胺；
b. 置换带有0、 5、 10、 15、 20、 30纳摩阿霉素的培养液培养7天，设置三复孔；
c. 利用细胞计数器每天计数细胞的总数；
d. 计算处理组对未处理组的细胞数的百分比。比较实验组和对照组的差别。
(3) 细胞克隆形成检测
a. 将1.2X低熔点琼脂糖与2X细胞培养基以1:1的体积比混合制备0. 6%的底层琼脂，6孔 板中每个孔1.2ml温室凝固；
b. 取对数期细胞，胰酶消化后吹散成单个细胞悬液，计数，并调细胞浓度为10000个/ml;
c. 将0.6%低熔点琼脂糖与2X细胞培养基以1:1的体积比混合，制备0.3%的上层琼脂， 按100/lml上层琼脂和lOOjil单细胞悬液/孔(1000个/孔)，混匀，室温凝固；
d. 置于37。C, 5%C02的细胞培养箱中培养2 — 3周；
e. 计数含50个细胞以上的克隆，计算细胞克隆形成率。
六、实验材料和仪器
1、 各种实验室常规仪器；
2、 细胞培养箱(Forma Scientific, Inc.,美国)；
3、 超净工作台(Forma Scientific, Inc.,美国);
4、 分光光度计(BIO-TEK INSTRUMENTS, Inc.,美国)；
5、 Zl-颗粒计数器(BECKMAN COULTER,美国)；
6、 倒置显微镜(尼康，日本)；
7、 PCR仪(Bio-Rad,美国)。
权利要求
1、一种利用RNA干扰文库筛选肿瘤化疗药物敏感基因的方法，该方法是利用降低基因表达的RNA干扰文库，对肿瘤细胞的药物敏感基因表达进行降低。使得它们的药物敏感性减弱，而药物耐受性升高，从而在高浓度药物处理条件下存活下来，并形成细胞克隆，通过基因克隆找到并筛选药物敏感基因。
2、 所述的从存活下来的细胞内提取基因组DNA， PCR扩增从RNA干扰文库中插入的DNA 片段，用TA克隆法克隆PCR扩增的DNA片段，挑选克隆，纯化DNA，最后基因测序确定筛选 基因。
3、 根据权利要求2所述的利用RNA干扰文库筛选肿瘤化疗药物敏感基因的方法，其特征 在于在筛选基因后进一步分析对药物敏感性的影响，它们是a. 利用RNA干扰降低基因表达作Loss-of function分析；b. 利用过表达作Gain-of-function分析；c. 利用生化实验分析筛选基因影响药物敏感性的机制。
4、 根据权利要求2所述的利用RNA干扰文库筛选肿瘤化疗药物敏感基因的方法，其特征 在于在筛选基因后，分析它们在肿瘤中对药物敏感性的影响等状况，它们是a. 检测筛选基因是否在肿瘤中过表达；b. 检测筛选基因是否在肿瘤中低表达；c. 检测筛选基因是否在肿瘤中被修饰，如甲基化等。
全文摘要
一种利用RNA干扰文库筛选肿瘤化疗药物敏感基因的方法，该方法是利用降低基因表达的RNA干扰文库，对肿瘤细胞的药物敏感基因表达进行降低。使得它们的药物敏感性减弱，而药物耐受性升高，从而在高浓度药物处理条件下存活下来，并形成细胞克隆，通过基因克隆找到并筛选药物敏感基因；本发明从存活下来的细胞内提取基因组DNA，PCR扩增从RNA干扰文库中插入的DNA片段，用TA克隆法克隆PCR扩增的DNA片段，挑选克隆，纯化DNA，最后基因测序确定筛选基因；本发明率先进行了肝癌细胞的药物敏感基因筛选，世界上首次确定了一批真正的药物敏感基因，并用于(1)指导肿瘤化疗的药物选择当针对某一药物的敏感基因表达正常时，推荐选用该药物；当针对某一药物的敏感基因降低表达或发生突变时，避免选用该药物，(2)开发应用此类基因作为肿瘤的生物标志，在诊断之前，用于风险评估和发病普查；在诊断时，用于肿瘤的分类和定级；在诊断之后，用于评估治疗效果和检测复发。
文档编号C12Q1/68GK101429544SQ20081016340
公开日2009年5月13日 申请日期2008年12月18日 优先权日2008年12月18日
发明者黄行许 申请人:黄行许