专利名称：：一种新型糖苷水解酶抑制剂的制备方法
技术领域：
：本发明属于微生物药物的研究开发领域，具体涉及从微生物球孢链霉菌的发酵液中提取制备一种新型糖苷水解酶抑制剂的制备方法。
背景技术：
：糖尿病是一组由遗传因素及环境因素弓l起的临床综合症，是全世界发病率最高的疾病之一。流行病学的研究表明，空腹血糖水平与餐后血糖水平这两大血糖指标中，餐后血糖水平尤为重要，它是葡萄糖耐受受损(IGT)的病人发展为II型糖尿病的重要因素，是引起糖尿病人大血管并发症和微血管并发症的重要因素，而这些并发症是引起糖尿病人死亡率增大的一个重要原因。所以，严格控制餐后血糖的抗糖尿病药物对糖尿病的防治具有很大的应用价值。ot-淀粉酶抑制剂以人体唾液及胰ct-淀粉酶为作用耙点，通过抑制其活性，可以降低食物中淀粉等碳水化合物水解形成寡糖的速度;a-葡萄糖苷酶抑制剂以人体小肠上皮绒毛膜刷状缘上多种双糖酶为作用靶点,通过抑制其活性,使蔗糖、麦芽糖等双糖降解速度减缓。两种酶抑制剂都属于糖苷水解酶抑制剂，二者协同作用，可以延缓碳水化合物的消化和吸收，使葡萄糖的生成和吸收减缓，达到降低餐后高血糖，减少糖尿病病发症发生的目的。a-葡萄糖苷酶柿制剂还可影响脂肪生成及脂肪酸的代谢，降低甘油三酯水平,有利于预防糖尿病心血管及微管(视网膜)病变的发生与发展。目前临床上应用的糖苷酶抑制剂类药物阿卡波糖(商品名拜糖苹)，是从游动放线菌的发酵代谢产物中提取得到，其提取工艺复杂，而且需用酸性洗脱液，容易对环境造成污染(参考专利02136309.9)。
发明内容本发明的目的是提供一种新型糖苷水解酶抑制剂生产的制备方法，它是从球孢链霉菌的发酵产物中提取得到糖苷水解酶抑制剂，其提取工艺简单，不使用酸碱，有利于环保，且提取得到的糖苷水解酶抑制剂对胰ct-淀粉酶及ct-葡萄糖苷酶同时具有抑制活性。本发明的目的是这样实现的，一种新型糖苷水解酶抑制剂生产制备方法，其特征是它由球孢链霉菌发酵液经过高温杀菌、超滤、纳滤，以及大孔吸附树脂吸附、洗脱，减压浓縮后冷冻千燥得到。所述的新型糖苷水解酶抑制剂的具体生产方法是(1)收集购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为4.187的球孢链霉菌CS^p&w^ragfo^spomsWaksman)发酵液，升温至90°C杀菌；(2)上述发酵液经超滤，除去分子直径大于O.lMm的菌丝体、可溶性蛋白、培养基和色素，得到黄色透明超滤液，测定超滤液中a-淀粉酶抑制剂和ot-葡萄糖苷酶抑制剂的抑制活性；(3)上述超滤液经纳滤，除去分子量小于300Da的色素和无机盐及小分子杂质，得到淡黄色透明浓縮液，测定浓縮液中a-淀粉酶抑制剂和a-葡萄糖苷酶抑制剂的抑制活性；(4)上述浓縮液经过大孔吸附树脂吸附；用蒸馏水洗至流出液无色后，再用有机溶剂进行梯度洗脱，分管收集，减压浓縮除去洗脱液中的乙醇后，分别测定各管浓縮液中a-淀粉酶抑制剂和ot-葡萄糖苷酶抑制剂的抑制活性，收集合并具有抑制活性的各管；(5)活性组分经冷冻干燥即可得到a-葡萄糖苷酶抑制剂样品。所述的超滤采用的是膜孔径为0.1A2Mm的管式无机陶瓷膜。所述的纳滤采用的是有机巻式聚醚砜膜，截留分子量为100-300Da。所述的大孔吸附树脂是非极性大孔吸附树脂。所述的吸附是浓缩液以4.5BV/h的流速经过大孔吸附树脂。所述的有机溶剂梯度洗脱是用0~95%的乙醇以1.5BV/h的流速进行梯度洗脱o本发明的特点是从球孢链霉菌的发酵产物中提取得到糖苷水解酶抑制剂，其提取工艺简单，不使用酸碱，有利于环保，且提取得到的糖苷水解酶抑制剂对猪胰a-淀粉酶及ct-葡萄糖苷酶同时具有抑制活性，且抑制活性远远高于阿卡波糖，是一种新型的糖苷水解酶抑制剂。1、本发明制得的糖苷水解酶抑制剂可同时抑制糖代谢过程的关键ila-淀粉酶和a-葡萄糖苷酶的生物活性，抑制活性高，应用价值大，可用于降糖、减肥产品的开发；2、本发明制得的糖苷水解酶抑制剂是由球孢链霉菌经发酵制得，不同于阿卡波糖的生产菌种游动放线菌；3、本发明采用膜分离技术用于发酵液中糖苷水解酶抑制剂的提取，选择性地去除一定分子量范围的杂质，提高了提取物的纯度；4、本发明选用的大孔吸附树脂对糖苷水解酶抑制剂的吸附量大，洗脱方便,低浓度的有机溶剂即可洗脱，可减少对环境的污染；5、本发明选用有机溶剂梯度洗脱可提高糖苷水解酶抑制剂的纯度和活性收率；6、本发明制备糖苷水解酶抑制剂的工艺方法，工艺简单，提取收率高，其a-淀粉酶抑制剂活性收率和a-葡萄糖苷酶抑制剂活性收率均达90。/n以上；7、本发明制备得到的糖苷水解酶抑制剂与阿卡波糖相比，其a-淀粉酶抑制抑制活性较阿卡波糖高20倍。具体实施例方式以下通过具体实施例对本发明做进一步说明，但下述实施例并不限制本发明的实施范围。实施例由球孢链霉菌发酵液经过高温杀菌、超滤、纳滤，以及大孔吸附树脂吸附、洗脱，减压浓縮后冷冻干燥得到。新型糖苷水解酶抑制剂的具体生产方法是(1)收集购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为4.187的球孢链霉菌CS^/&w^vesgfo6纽/w，Walcsman)发酵液，升温至90°C杀菌；(2)Jt^发酵液经超滤，除去分子直径大于(UMm的菌丝体、可溶性蛋白、培养基和色素，得到黄色透明超滤液，测定超滤液中ot-淀粉酶抑制剂和ot-葡萄糖苷酶抑制剂的抑制活性；(3)，超滤液经纳滤，除去分子量小于300Da的色素和无机盐及小分子杂质，得到淡黄色透明浓縮液，测定浓縮液中a-淀粉酶抑制剂和ot-葡萄糖苷酶抑制剂的抑制活性；(4)上述浓^缩液经过大孔吸附树脂吸附；用蒸馏水洗至流出液无色后，再用有机溶剂进行梯度洗脱，分管收集，减压浓缩除去洗脱液中的乙醇后，分别测定各管浓缩液中a-淀粉酵抑制剂和ot-葡萄糖苷酶抑制剂的抑制活性，收集合并具有抑制活性的各管；(5)活性组分经冷冻干燥即可得到ct-葡萄糖苷酶抑制剂样品。实施例l-L收集1L球孢链霉菌CS^ptow^wsgfo6&/w>，Waksman,购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号4.187)发酵液，升温至90。C杀菌；2.经膜孔径为O.lnm的管式无机陶瓷膜超滤(南京九思高科技有限公司生产)，加水量为原料液量的l倍，除去直径大于O.lMm菌丝体、可溶性蛋白、培养基和色素，得到黄色透明超滤液1L，测定超滤液中的ot-葡萄糖苷酶抑制活性和ot-淀粉酶抑制活性。测定方法如下c^葡萄糖苷酶抑制剂活性測定方法(参照陈海敏、严小军，ct-葡萄糖苷酶抑制剂的构效关系[J],中国生物化学与分子生物学报，2003,19(6):780-784):在200nl的磷酸盐缓冲液(pH:6.8)中加入100nl样品(测酶时用缓冲液代替)和100nlp—硝基苯-a~D—葡萄糖(PNPG)溶液，于37"下预热5ain后加入100ja1100u/aLa—葡萄糖苷酶溶液开始反应，30aiii后加'^5ul甘氨酸缓冲液终止反应，于41(J加下测光密度A;适当调整酶浓度，使其读数在0.30.6之间，调整抑制剂浓度，使其抑制率在50%左右。a-葡萄糖苷酶抑制剂抑制率及抑制活性按以下公式计算抑制率=(Ae-A》/ABX100%AE——a-葡萄糖苷酶在A4W的读数A^#品在^00的读数ot-葡萄糖苷酶抑制活性-a-葡萄糖苷酶活性X抑制率X样品稀释倍数ot-淀粉酶抑制剂活性涮定方法(参照吕风霞、陆新，淀粉酶抑制剂的研究进展IJ].食品科学.2002,23(3):152-155.)取100u/nL胰a-淀粉酶溶液0.25bL和一定浓度k制剂溶液0.25L在37^预先孵化I0in，加入1.,邻可溶性淀粉0.5aL，37t:反应5ain后加入1bLDNS试剂，沸水浴加热lOnin,迅速冷却后稀释至适当倍数在520ra波长测定吸光度值。适当调整酶浓度，使其读数在0.30.6之间，调整抑制剂浓度，使其抑制率在50%左右。a-淀粉酶抑制率及抑制活性按以下公式计算抑制率a)=(Ae-A。/^X10f^&~~a-淀粉酶在U的读数a￡~—样品在yu的读数Ot-淀粉酶抑制活性:(X-淀粉酶活性X抑制率X样品稀释倍数3.将1L超滤液经截留分子量为lOODa的有机巻式聚醚砜膜纳滤膜(北京安石环境工程有限公司生产)纳滤，加水量为原超滤液的1倍，除去分子量小于100Da的色素、无机盐和杂质，得到淡黄色透明发酵液(K5L浓縮液，按照第二步的方法涮定纳滤液的a-葡萄糖苷酶抑制活性和a-淀粉酶抑制的抑制活性。4.将上述0.51^浓縮液以4.58￥/11的流速通过经过大孔吸附树脂HPD100(河北沧州化工有限公司生产，树脂按出厂要求做好预处理)层析柱(2.5xl0c显)。用蒸馏水洗至流出液无色后，再用0-95%的乙醇以1.5BV/h进行梯度洗脱，分管收集，101/管，旋转蒸发减压浓縮(52°C)(减压浓縮设备是巩义市英峪高科仪器厂生产)，除去洗脱液中的乙醇后，分别测定各管浓縮液中a-淀粉酶抑制活性和a-葡萄糖苷酶抑制剂活性，收集合并活性组分；5.活性组分经冷冻干燥(冷冻干燥机的型号为LGMO由巩义市英裕予华仪器厂生产)，即可得到糖昔酶抑制剂样品。其分步收率结果如下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例2:1.收集1L球孢链霉菌Camp&w^wsgfo6纽/wrasWaksman,购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号4.187)发酵液，升温至90。C杀菌；2.经膜孔径为0.2卿的管式无机陶瓷膜超滤(南京九思高科技有限公司生产)，加水量为原料液量的0.8倍，除去直径大于0.2拜菌丝体、可溶性蛋白、培养基和色素，得到黄色透明超滤液1.2L,按照实施例1的方法测定超滤液中的a-葡萄糖苷酶抑制活性和oc-淀粉酶抑制活性。3.将1.2L超滤液经截留分子量为200Da的有机巻式聚醚砜膜纳滤膜(北京安石环境工程有限公司生产)纳滤，加水量为原超滤液的0.8倍，除去分子量小于200Da的色素、无机盐和杂质，得到淡黄色透明发酵液0.6L浓縮液，按照实施例1的方法测定纳滤液的Ot-葡萄糖苷酶抑制活性和(X-淀粉酶抑制的抑制活性。4.将上述0.6L浓縮液以4.5BV/h的流速通过经过大孔吸附树脂HPDIOO(河北沧州化工有限公司生产，树脂按出厂要求做好预处理)层析柱(2.0xl5c班)。用蒸馏水洗至流出液无色后，再用0-95%的乙醇以1.5BV/h进行梯度洗脱，分管收集，121/管，旋转蒸发减压浓縮(50T)除去洗脱液中的乙醇后，分别测定各管浓縮液中a-淀粉酶抑制活性和oc-葡萄糖苷酶抑制剂活性，收集合并活性组分；5.活性组分经冷冻干燥即可得到糖苷酶抑制剂样品。其分步收率结果如下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例3:1.收集IL球孢链霉菌(S^/rfomyce;jgA6iis/JomsWaksmat^购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号4.187)发酵液，升温至90。C杀菌；2.经膜孔径为0.2pm的管式无机陶瓷膜超滤(南京九思高科技有限公司生产:)，加水量为原料液量的0.8倍，除去直径大于0.2jim菌丝体、可溶性蛋白、培养基和色素，得到黄色透明超滤液1.2L,按照实施例1的方法测定超滤液中的a-葡萄糖苷酶抑制活性和a-淀粉酶抑制活性。3.将1.2L超滤液经截留分子量为3100Da的有机巻式聚醚砜膜纳滤膜(北京安石环境工程有限公司生产)纳滤，加水量为原超滤液的0.8倍，除去分子量小于300Da的色素、无机盐和杂质，得到淡黄色透明发酵液0.6L浓缩液，按照实施例l的方法测定纳滤液的a-葡萄糖苷酶抑制活性和ot-淀粉酶抑制的抑制活性。4.将上述0.6L浓縮液以4.5BV/h的流速通过经过大孔吸附树脂KPDIOO(河北沧州化工有限公司生产，树脂按出厂要求做好预处理)层析柱(2.0x15cB)。用蒸馏水洗至流出液无色后，再用0-95鬼的乙醇以1.5BV/h进行梯度洗脱，分管收集，121/管，旋转蒸发减压浓縮(50C)除去洗脱液中的乙醇后，分别测定各管浓縮液中ot-淀粉酶抑制活性和a-葡萄糖苷酶抑制剂活性，收集合并活性组分；5.活性组分经冷冻千燥即可得到糖苷酶抑制剂样品。其分步收率结果如下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>本发明制备得到的糖苷水解酶抑制剂与阿卡波糖相比，其a-淀粉酶抑制抑制话性较阿卡波糖高20倍，其具体測定方法如下各取50mg外购的阿卡波糖(商品名拜糖苹，北京拜耳医药有限公司生产)和本专利方法制得的糖苷酶抑制剂样品，分别溶于250mL水中；采用实施例1中a魂粉酶抑制剂和ct-葡萄糖苷酶抑制剂抑制活性的测定方法，测定其抑制率并计算其抑制活性；拜糖苹的a-淀粉酶抑制活性为450u/mg，本专利制得的糖苷酶抑制剂样品a-淀粉酶抑制活性为9000u/mg，抑制活性提高了20倍。以上实施例中未作详细叙述部分，属于本行业或相关行业的公知技术及设备，或采用的是行业惯例。权利要求1、一种新型糖苷水解酶抑制剂的制备方法，其特征是它由球孢链霉菌发酵液经过高温杀菌、超滤、纳滤，以及大孔吸附树脂吸附、洗脱，减压浓缩后冷冻于燥得到。2、根据权利要求1所述的一种新型糖苷水解酶抑制剂的制备方法，其特征是所述的新型糖苷水解酶抑制剂的具体生产方法是(1)收集购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为4.187的球孢链霉菌CSftrcptovce$gfo/>&/wnWaksman)发酵液，升温至90°C杀菌；(2)上述发酵液经超滤，除去分子直径大于O.Uon的菌丝体、可溶性蛋白、培养基和色素，得到黄色透明超滤液，测定超滤液中a-淀粉酶抑制剂和ot-葡萄糖苷酶抑制剂的抑制活性；(3)上述超滤液经纳滤，除去分子量小于300Da的色素和无机盐及小分子杂质，得到淡黄色透明浓縮液，涮定浓縮液中a-淀粉酶抑制剂和a-葡萄糖苷酶抑制剂的抑制活性；(4)上述浓缩液经过大孔吸附树脂吸附；用蒸馏水洗至流出液无色后，再用有机溶剂进行梯度洗脱，分管收集，减压浓縮除去洗脱液中的乙醇后，分别测定各管浓縮液中ot-淀粉酶抑制剂和ot-葡萄糖苷酶抑制剂的抑制活性，收集合并具有抑制活性的各管；(5)活性组分经冷冻千燥即可得到ot-葡萄糖苷酶抑制剂样品。3、根据权利要求1所述的一种新型糖苷水解酶抑制剂的制备方法，其特征是所述的超滤采用的是膜孔径为0.1力.2,的管式无机陶瓷膜。4、根据权利要求1所述的一种新型糖苷水解酶抑制剂的制备方法，其特征是所述的纳滤采用的是有机巻式聚醚砜膜，截留分子量为100-300Da。5、根据权利要求1所述的一种新型糖苷水解酶抑制剂的制备方法，其特征是所述的大孔吸附树脂是非极性大孔吸附树脂。6、根据权利要求1所述的一种新型糖苷水解酶抑制剂的制备方法，其特征是所述的吸附是浓缩液以4.5BV/h的流速经过大孔吸附树脂。7、根据权利要求2所述的一种新型糖苷水解酶抑制剂的制备方法，其特征是所述的有机溶剂梯度洗脱是用0-95%的乙醇以1.5BV/h的流速进行梯度洗脱。全文摘要本发明属于微生物药物的研究开发领域，具体涉及从微生物球孢链霉菌的发酵液中提取制备一种新型糖苷水解酶抑制剂的制备方法，其特征是它由球孢链霉菌发酵液经过高温杀菌、超滤、纳滤，以及大孔吸附树脂吸附、洗脱，减压浓缩后冷冻干燥得到。它提取工艺简单，提取过程不使用酸碱，有利于环保，且提取得到的糖苷水解酶抑制剂对胰α-淀粉酶及α-葡萄糖苷酶同时具有抑制活性，可用于降糖、减肥产品的开发。文档编号C12R1/465GK101358208SQ200810150720公开日2009年2月4日申请日期2008年8月22日优先权日2008年8月22日发明者张晓琦,杨明琰,稼田,瑜马申请人:陕西省微生物研究所