专利名称：：破骨细胞V-ATP酶质子泵亚基ATP6vlcl的RNA干扰靶点及其应用的利记博彩app
技术领域：
：本发明属于分子生物学与生物医药
技术领域：
，涉及破骨细胞V-ATP酶质子泵亚基ATP6vlcl(简称C1)序列上用于RNA干扰的干扰靶点，以及针对这些靶点的以各种方式获得的小干扰RNA分子以及其在制备治疗骨质疏松症的药物中的应用。
背景技术：
：骨质疏松症是发病率高、死亡率高、保健费用消耗大的最常见的骨代谢疾病。据估计，半数以上的妇女和大约三分之一的男性在其生存期内会发生骨质疏松性骨折。骨折给人们的生活带来极大的痛苦，轻者使人们生活质量下降，重者将导致瘫痪(如股骨骨折)并由此引发很多并发症甚至导致死亡。这些疾病的产生与破骨细胞(Osteoclast)的过度活跃有关。破骨细胞与成骨细胞(Osteoblast)是骨中的两类重要细胞，分别负责骨吸收与骨形成，两者之间的平衡保证了成年动物及人类骨量的恒定；然而在破骨细胞的活性大于成骨细胞活性的时候，破骨细胞对骨的吸收大于成骨细胞的骨形成作用，导致骨密度下降最终出现骨质疏松，对于这些疾病的治疗必须抑制破骨细胞的活性。破骨细胞皱褶缘V-ATP酶负责破骨细胞的细胞外酸化过程，使骨去矿化并为蛋白酶降解骨有机成份提供酸性微环境。发明人通过Micrroarray数据分析首次发现C1在破骨细胞中高表达而不是C2，因此，C1是C亚基在破骨细胞中的特异亚型，即C1是破骨细胞V-ATP酶具有的特异亚基。抑制破骨细胞Cl的表达导致破骨细胞细胞外酸化和骨吸收功能下降。在多核破骨细胞中，骨吸收发生在致密的缝合区(sealingzone)内，缝合区包围着浆膜异化的皱褶缘。缝合区由含actin的黏附结构，即podosome所构成，这一结构处于高度动态平衡中，podosome由小的丝状肌动蛋白(F-actin)柱为中心，外周围绕着蛋白如粘着斑蛋白(vinculin)和桩蛋白(paxillin)所构成。从皱褶缘分泌的3质子和酶被封闭在缝合区内的吸收腔隙。但体外培养在玻璃或塑料表面的成熟破骨细胞，其podosome在细胞外周形成一条环形的带状结构。发明人发现抑制破骨细胞C1的表达使破骨细胞不能形成规则的丝状肌动蛋白纤维环，即抑制破骨细胞C1的表达会导致破骨细胞缝合区形成缺陷。因此，Cl可以作为药物靶点特异抑制破骨细胞的活性。本发明设计和体外慢病毒表达Cl-ShRNA用于抑制破骨细胞的骨吸收活性，以达到治疗骨质疏松等骨相关疾病的目的。
发明内容本发明的一个目的在于提供破骨细胞V-ATP酶质子泵亚基ATP6vlcl(简称C1)的RNA干扰靶点，针对该靶点设计人工序列，并将该序列在表达载体中进行表达获得小干扰RNA分子(SiRNA)，并构建重组慢病毒表达载体。因此本发明的目的也在于提供针对Cl的小干扰RNA分子，包含该小干扰RNA分子的表达载体以及由其转化的慢病毒表达载体，此外，由表达载体表达产生的、作为小干扰RNA分子前体的短发夹结构RNA分子(ShRNA)也包含在本发明中。本发明的另一目的在于提供Cl的RNA干扰耙点在制备治疗骨质疏松药物中的应用。根据本发明的一方面，根据破骨细胞V-ATP酶质子泵亚基ATP6vlcl的mRNA序列体外合成抑制Cl基因表达的双链小干扰RNA(SiRNA)片段的DNA序列，并克隆到短发夹结构RNA(ShRNA)的表达质粒上，表达并筛选对破骨细胞吸收抑制作用较强的Cl-SiRNA，确定RNA干扰靶点序列，SEQIDNO.1~3为针对C1的RNA干扰靶点序列，优选的RNA干扰靶点具有如SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。SEQIDNO.4~5为针对干扰靶点序列1的设计的用于表达SiRNA的DNA序列，SEQIDNO.67是针对干扰靶点序列2设计的用于表达SiRNA的DNA序列，SEQIDNO.89是针对干扰靶点序列3设计的用于表达SiRNA的DNA序列，每对序列均为互补序列。具体序列见表1和表2.SiRNA分子为双链RNA分子，一单链含有RNA靶点序和在3'末端的UU双核苷酸尾(如SEQIDNO.IO所示)，另一单链为互补链，双核苷酸尾UU同样位于3'末端。SiRNA进入细胞后直接干扰目标基因的表达。表1ClRNAi耙点序列<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表2合成用于表达siRNA的DNA序列<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>本发明的RNA耙点序列SEQIDNO.3为具有19nt长度，在形成SiRNA分子后，3'端加上UU双核苷酸尾构成分别具有21bp的双链RNA而发挥功能。本领域技术人员可以理解的是，增加或减少几个碱基的SiRNA序列在基因沉默中可以具有同样的功能，例如2123bp的SiRNA序列己被证明在其他基因的沉默中具有同样功能(Nature2001，(411):24,494-98)。同样可以理解的是，也可以设计更长的序列，通过在发挥功能时被剪切为短的RNA序列而发挥作用。体外合成的抑制CI基因表达的基因序列克隆到表达载体后，表达ShRNA，ShRNA含有干扰耙点序列、干扰耙点序列的反义序列、短发夹结构序列(序列如SEQIDNO.11所示)。形成ShRNA序列的短发夹结构序列优选采用九个碱基的loop环序列UUCAAGAGA，也可以用TTCGtetraloop(LeukemiaResearch30(2006)1013—1017)。短发夹结构RNA，通过表达载体表达产生，发挥功能时需要细胞内Dicer酶切成siRNA分子干扰基因的表达，图1示出了通过合成序列克隆到表达载体，产生ShRNA，再加工成具有功能的SiRNA的过程。根据本发明的另一方面，提供CI基因的RNA干扰靶点在制备骨质疏松药物中的应用，慢病毒介导的小干扰RNA分子可抑制破骨细胞的骨吸收活性，用于治疗骨质疏松等骨相关疾病。实现本发明目的的技术手段为第一，在体外合成表达抑制CI基因表达的双链SiRNA的DNA序列，并克隆到ShRNA表达质粒上；1、SiRNA设计采用DharmaconsiDESIGNcenter(http:〃www.dharmacon.com)设计针对CImRNA的特异靶序列，选取特异性的耙序列3条，且靶序列与人的相应靶序列80%—90%相似。2、单链SiRNA合成和纯化由Invitrogen公司合成纯化3、双链SiRNA的制备和表达ShRNA克隆的构建两条互补的单链SiRNA经加热后退火处理形成双链SiRNA，并将双链SiRNA克隆到表达ShRNA的质粒上。第二，用外源共表达Cl-Flag蛋白和Cl-ShRNA筛选有效的Cl-SiRNA。第三，通过破骨细胞功能实验阐明Cl敲低后破骨细胞骨吸收能力缺陷的机制。1.破骨细胞细胞外酸化和骨吸收功能检测体外破骨细胞功能实验采用被广泛使用的细胞外酸化功能和骨片吸收功能的检测方法正常的破骨细胞具有细胞外酸化和骨吸收功能，破骨细胞质子泵将细胞外酸化后吖啶橙染色呈橘红色，被破骨细胞吸收后的骨片经甲苯胺兰染色后可以观察到大量深蓝色的骨吸收陷窝。在原代培养的破骨细胞中分别加入各种表达Cl-shRNA的慢病毒，3—5天后吖啶橙染色观察细胞的细胞外酸化能力，及甲苯胺兰染色观察骨片上的陷窝数目及形态。2.破骨细胞丝状肌动蛋白纤维环形成检测本实验采用广泛应用的丝状肌动蛋白染色方法，成熟的破骨细胞经固定和rhodaminephalloidin染色，在荧光显微镜下能看到发红色荧光的丝状肌动蛋白，培养在玻片上的功能正常的破骨细胞在细胞外周能看到丝状肌动蛋白组成的规则的环状结构。本发明所针对的药物靶点Cl是由申请人首先发现它是破骨细胞骨吸收功能的必须基因。所以本发明所选定siRNA靶序列的是新的针对Cl的药物靶点，且与人的相应耙位置序列80%相似。本发明利用的RNAi技术的出现已有近20年，但是利用RNAi技术得到的实验结果往往发表在影响力很高的期刊上；这也说明了RNAi在基础研究和应用上的重要性。随着人们对RNAi原理的了解和其应用范围的扩大，这一技术己经突破了基础研究的范围，向着应用迈进。疾病治疗领域的初期研究已经显示，由病毒介导的ShRNA表达抑制致病基因的表达这一技术由于其自身的优势必将成为药物设计的新的增长点。而慢病毒表达ShRNA本身较腺病毒和逆转录病毒有很多优势，慢病毒可感染分裂或非分裂细胞及终末分化细胞，而逆转录病毒只能感染分裂细胞，腺病毒可感染分裂或非分裂细胞。因此，相对于传统的新药研制来说，慢病毒介导的RNAi技术有很多优点针对性强，针对治病基因；特异性好；无需知道蛋白的三维结构；无需筛选大量的候选化合物；它是利用哺乳动物自身的防御系统治疗疾病，至今没有发现副作用；作用时间长，它通过整合到细胞基因组中表达发挥作用，且机体有RNAi放大的本发明开创性的用慢病毒介导RNAi技术抑制疾病基因的表达，可以说具有很强的前瞻性，表达特异ClshRNA的慢病毒感染骨髓细胞的技术可有望运用于研制慢病毒型生物制剂以治疗骨质疏松。同时，表达特异C1ShRNA的慢病毒感染肿瘤细胞也可有望抑制肿瘤生长和转移。本发明将为制药业提供全新的思路。图1为pSUPER-SiRNA质粒的构建；示出了针对靶序列3的SiRNA分子和ShRNA分子形成后的结构图2为PLB-SiRNA载体的构建，将pSUPER-siRNA质粒上的Hl-SiRNA序列克隆到pLB质粒并取代U6启动子；图3为含有SiRNA的表达载体PLB-SiRNA载体结构图4为逆转录病毒的包装；图5为Westernblotting筛选有效的ClsiRNA序列及检测Lenti-Cl敲低的效率；图6为检测Cl敲低后对破骨细胞的分化和成熟的影响；图7为检测Cl敲低后对破骨细胞细胞外酸化和骨吸收的影响；图8为检测Cl敲低后对丝状肌动蛋白环形成的影响。具体实施例方式以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。实施例中所使用各种培养基和试剂如无特别说明均为市售购买。实施例一原代破骨细胞培养参照Yang，S.andLi，Y.P.(2007)J.BoneMiner.Res.,22,45-54原代培养骨髓单个核细胞并诱导其分化为成熟破骨细胞。6-8周龄C57BL6小鼠，拉颈处死，常规消毒后，取其后肢股骨和胫骨放入冰预冷的含抗生素的RIMP-1640培液中。用剪刀和镊子将骨表面的血管结缔组织分离干净，冰预冷的含抗生素的8RIMP-1640培液冲洗。剪刀剪去股骨和胫骨两端，用无菌注射器(lml)将骨髓细胞吹入冰预冷的含10Q^FBS的a-MEM培液中。注射器针头反复吸冲成单细胞悬液。4°C离心(1100rpmx6min)，用含M-CSF(10ng/ml)和RANKL(10ng/ml)(R&Dsysyems)的a-MEM+10%FBS培液重悬细胞。细胞以l-2xl0V孔接种于24孔板，以lxl0V孔接种于6孔板。细胞培养基为a-MEM+10%FBS+10ng/mlRANKL+10ng/mlM-CSF。细胞在37。C、5。/。C02条件下培养4一6天获的成熟的破骨细胞。实施例二抗体准备合成多肽CI12EKTCQQTWEKLHAATTK28禾nAtp6vla(A),CQLLEDMQNAFRSLED""偶联到KLH，免疫雄性新西兰大白兔获得抗Cl和A的多克隆抗体，抗GAPDH的单克隆抗体购自cellsignaling公司，抗Flag抗体和抗GFP抗体购自sigma。实施例三筛选有效的SiRNA序列采用DharmaconsiDESIGNcenter(http:〃www.dharmacon.com)设计小干扰siRNA，选三条特异的针对Atp6vlclmRNA的耙序列clsl:5'-UUCGUGACUUCCAGUAUAA-3，，c1s2:5，國UUGCGUGGAUUCAUAUAAA-3，，，cls3:5'-GAGUUGACUUGGUUACUUA-3,,阴性对照为特异针对LacZ基因mRNA的靶序列si-LacZ:5'-CTCGGCGTTTCATCTGTGG-3，。化学合成的短发夹结构的靶序列经退火复性后连接到pSUPER载体(OligoEngine)上BglII/Hind111位点之间。短发夹结构RNA(ShRNA)敲低Cl表达的效率检测是通过在人胚肾细胞系293T(HEK293T,ATCCNo.CRL-11268TM)中共表达质粒pFlag-CMV-4-Cl(Flag-Cl)和质粒pSUPER-siRNA完成的。艮口用lipofectaminereagent(Invitrogen公司)将克隆有SiRNA的ShRNA表达质粒与Flag-Cl质粒共转染HEK293T胞，转染后48小时，收集细胞(裂解液50mMTris-HCl，pH6.8,100mMdithiothreitol，2%SDS,0.001%bromphenolblue,10%glycerol),进行蛋白印迹实验(westernblotting)。结果显示与siLacZ处理的细胞相比，三个ClSiRNA之一(cls3)能够敲低Flag-Cl的表达98.8%，而其它两个ClSiRNAs(clsl和cls2)分别敲低Cl的表达仅27。/。和34%(图4A,B)。因此选择SiRNA-cls3克隆到lentivirus载体pLB。实施例四包装逆转录病毒第一天(9-10am):293T细胞接种，每10cm培养皿接种2-2.5xl06293T细胞；第二天(9-10am):转染，准备钙一磷酸沉淀(lml/10cmplate)Transfervector(PLB，Addgene)-20)igPackagingplasmid(dR8.2,Addgene)-15|igEnvelopeplasmid(vsvg，Addgene)-6pg力口2.5MCaCl250ul，力QddH20到500^1，混匀；加500^12xHBS，吹打混匀；室温孵育20分钟，将沉淀逐滴加到培养的细胞中，混匀；转染后6—8小时，换新鲜培液，6ml/plate;第四天(9-10am):收集病毒收集培养上清3000rpm/5min/RT离心上清0.45pm过滤，分装，直接感染细胞或冻存于一80。C实施例五逆转录病毒滴度测定第1天(9-Uam):在24孔板每个孔接种3xl04293T细胞，lml培液培养；第2天(4-6pm):计数一个孔的细胞(应该6—8xl04)，4一6倍系列稀释的病毒感染细胞，加4pg/nlpolybrene。第3天(9-12am):力[]lml培液；第5天观察细胞荧光蛋白表达，并用FACS分析表达荧光蛋白的细胞比例，并计算滴度。实施例六逆转录病毒感染破骨细胞骨髓单个核细胞在M-CSF(10ng/ml)和RANKL(10ng/ml)的存在下诱导48小时，然后在polybrene(4吗/ml)的存在下用包装好的逆转录病毒感染8小时。换新鲜培液(X-MEM+10%FBS+10ng/mlRANKL+10ng/mlM-CSF10继续培养4—6天。收集破骨细胞蛋白(裂解液50mMTris-HCl,pH6.8,100mMdithiothreitol,2%SDS，0.001%bromphenolblue,10%glycerol),进行蛋白印迹实验(westernblotting)用于检测CI敲低的效率。被病毒感染的细胞发绿色荧光，病毒感染后2天在荧光显微镜下观察发荧光的细胞，结果显示病毒感染后几乎所有细胞均发绿色荧光(图6A)。Western-blotting蛋白印迹试验结果显示，与lenti-LacZ感染的破骨细胞的CI表达水平相比，Lenti-Cl(靶序列为Cls3)感染破骨细胞后CI的表达显著降低90%(图5C,D)。说明表达特异针对C1的ShRNA的慢病毒感染破骨细胞后能显著抑制C1的蛋白表达水平。实施例七TRAP染色固定破骨细胞后用Sigma的TRAP活性染色试剂盒染色，前体破骨细胞盒成熟的破骨细胞(多于三个核)呈现深红色，并在光镜下计数。每组十个视野被计数，数据用均数i标准差表示(n=10)。TRAP染色的结果显示与lenti-LacZ处理后的细胞相似，Lenti-Cl处理后的细胞也能分化成熟为多核破骨细胞，且二者显示相似的多核破骨细胞数目和形成百分比(图6B，C，D)。说明CI敲低后并不影响骨髓单个核细胞分化成熟为多个核的破骨细胞。实施例八吖啶橙染色骨髓单个核细胞被接种在24孔板，在M-CSF(10ng/ml)和RANKL(10ng/ml)的存在下诱导48小时，然后在polybrene(4吗/ml)的存在下用包装好的逆转录病毒感染8小时，换新鲜培液a-MEM+10%FBS+10ng/mlRANKL+10ng/mlM-CSF继续培养4天。破骨细胞在含5pg/m1吖啶橙的a-MEM中37°C孵育15分钟，用a-MEM洗10minutes,在荧光显微镜下观察细胞(激发光490nm和吸收光525nm)。吖啶橙染色结果显示与lenti-LacZ感染的破骨细胞相比，Lenti-Cl感染的多核破骨细胞细胞橘红色染色明显减少，细胞外酸化明显受抑制(图7)。说明CI敲低后破骨细胞的细胞外酸化功能明显下降。li实施例九破骨细胞骨吸收功能分析破骨细胞骨吸收活性的分析通过分析吸收陷窝的形成来完成。骨髓单个核细胞被接种在放置于96孔板孔里的象牙骨片上，在M-CSF(10ng/ml)和RANKL(10ng/ml)的存在下诱导48小时，然后在polybrene(4吗/ml)的存在下用包装好的逆转录病毒感染8小时，换新鲜培液a-MEM+10MFBS+10ng/mlRANKL+10ng/mlM-CSF继续培养6天。6天后骨片在1MNH4OH的溶液里超声出去细胞。无细胞的骨片经1%toluidineblue(1%sodiumborate)染色1分钟。吸收陷窝呈深蓝色，并在光镜下观察，计数随机视野下吸收面积占总视野面积的百分比，每组计数三个视野，数据用均数±标准差表示(11=3)。骨吸收实验结果显示与lenti-LacZ感染的破骨细胞形成骨吸收陷窝(陷窝为深蓝色)面积占随机观察视野面积的百分数相比，Lenti-Cl感染的多核破骨细胞在象牙骨片上形成的吸收陷窝面积占随机观察视野面积的百分数明显减少(*P<0.05,n=3)，且Lenti-Cl感染的多核破骨细胞在象牙骨片上形成的吸收陷窝更浅(图7)。说明C1敲低后破骨细胞骨吸收功能明显下降。实施例十细胞丝状肌动蛋白环染色骨髓单个核细胞被接种在24孔板，在M-CSF(10ng/ml)和RANKL(10ng/ml)的存在下诱导48小时，然后在polybrene(4吗/ml)的存在下用包装好的逆转录病毒感染8小时，换新鲜培液a-MEM+10%FBS+10ng/mlRANKL+10ng/mlM-CSF继续培养4天。细胞在3.7%多聚甲醛中固定10分钟；0.2%TritonX-100透膜处理10分钟；用1%山羊血清和3%BSA室温下封闭1小时；用2U/mlrhodaminephalloidin(MolecularProbes)室温下孵育30分钟；1pg/mlDAPI(Sigma)染核呈蓝色；细胞在荧光显微镜下观察。细胞丝状肌动蛋白环染色结果显示与表达特异LacZSiRNA的成熟破骨细胞形成丝状肌动蛋白环相似，表达特异CISiRNA的成熟破骨细胞也能形成规则的丝状肌动蛋白环。表明CI敲低不影响成熟破骨细胞骨丝状肌动蛋白环的形成。12SEQUENCELISTING<U0〉浙江赛尔生物医学研究有限公司<120〉破骨细胞V-ATP酶质子泵亚基ATP6vlcl的RNA干扰靶点及其应用〈130〉ZJ188-08P103436<160>11<170〉Patentlnversion3.1<210〉1〈211〉19<212〉腿〈213〉Artificial<400〉1uucgugacuuccaguauaa19〈210〉2<211〉19〈212〉RNA<213>Artificial<400>2uugcguggauucauauaaa19<210>3<211〉19<212〉RNA<213>Artificial<220〉<221>misc一RNA<222>(1)..(19)<223>CIRNAi耙点序列<400〉3gaguugacuugguuacuua19〈210〉4<21D64<212〉隨〈213〉Artificial〈400>4gatccccttcgtgacttccagtataattcaagagattatactggaagtcacgaatttttg60gaaa64<210>5〈211〉64<212>腿<213〉Artificial<400>5agcttttccaaaaattcgtgacttccagtataatctcttgaattatactggaagtcacga60aggg64〈210〉6〈211〉64<212〉DNA〈213〉Artificial〈400>6gatccccttgcgtggattcatataaattcaagagatttatatgaatccacgcaatttttg60g站a64〈210〉7<211>64<212>DNA<213>Artificial<400>7agcttttccaaaaattgcgtggattcatataaatctcttgaatttatatgaatccacgca60柳g<210〉8<211>64<212>DNA〈213〉Artificial64〈400〉8gatccccgagttgacttggttacttattcaagagataagtaaccaagtcaa('tcttl:ttg60gaaa64〈210〉9〈211>64〈212>DNA<213〉Artificial〈400〉9agcttttccaaaaagagttgacttggttacttatctcttgaataagtaaccaagtcaact60cggg<210〉<211〉<212>〈213〉<220〉〈221〉〈222〉<223〉1021RNAArtificialmisc—RNA(21)SiRNA单链〈400〉10gaguugacuugguuacuuau<210〉<211〉<212><213〉<220><221〉<222〉<223〉1149RNAArtificialmisc—隨(1)…(49)ShRNA6421〈400〉11gaguugacuugguuacuuauucaagagauaaguaaccaagucaacucuu49权利要求1、一种破骨细胞V-ATP酶质子泵亚基ATP6v1c1的RNA干扰靶点，其特征在于其具有如SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。2、一种小干扰RNA分子，其为双链分子，其中一单链含有权利要求l所示RNA靶点序列和在3，末端的UU双核苷酸尾，另一单链为互补链。3、一种表达载体，其含有权利要求2的小干扰RNA分子。4、权利要求3所述的表达载体，其特征在于其具有图3所示结构。5、一种重组慢病毒载体，含有权利要求2的小干扰RNA分子。6、权利要求5所述的重组慢病毒载体，其特征在于所述慢病毒载体用权利要求4所述的表达载体转化。7、权利要求l所述的破骨细胞V-ATP酶质子泵亚基ATP6vlcl的RNA干扰靶点在制备治疗骨质疏松药物中的应用。8、权利要求7所述的应用，其特征在于以权利要求5所述的慢病毒载体作为破骨细胞吸收抑制剂。9、一种短发夹结构RNA分子，其至少含有权利要求1所述的RNA干扰靶点序列、短发夹结构序列以及RNA干扰靶点序列的反义序列。10、权利要求9所述的短发夹结构RNA分子，其特征在于进一步在3'末端具有UU双核苷酸尾。全文摘要本发明属于分子生物学与生物医药
技术领域：
，涉及C1序列上用于RNA干扰的靶点，以及针对这些靶点的以各种方式获得的SiRNA用于制备治疗骨质疏松症的新药物。本发明通过慢病毒感染破骨细胞并表达ShRNA及体外基因敲低后破骨细胞功能检测的方法筛选了C1基因上的RNA干扰的靶点。针对该靶点的ShRNA能够明显抑制C1蛋白质的表达，并能稳定抑制破骨细胞的细胞外酸化和骨吸收的能力，但不影响成熟破骨细胞丝状肌动蛋白环的形成。依据这个靶序列可以制备生物药品以治疗骨质疏松。文档编号C12N15/11GK101638652SQ200810145868公开日2010年2月3日申请日期2008年8月7日优先权日2008年8月1日发明者丰盛梅,李亦平申请人:浙江赛尔生物医学研究有限公司