专利名称：一种生物材料玻璃化冷冻载体及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物医学领域，涉及一种生物材料玻璃化冷冻载体及其制备方法。
背景技术：
目前，低温冷冻技术在辅助生殖领域应用广泛。玻璃化冷冻技术是利用体积微
小的冷冻承载工具，在极快速降温(>2 00(TC/min)过程中，使高浓度的冷冻保护 液由液态转变为黏度很高的类似玻璃样的固态，避免细胞内冰晶的形成，达到冷冻 保护的作用，从而显著提高细胞/组织冷冻后的存活力和发育能力。玻璃化冷冻技 术具有简单、高效、省时、安全、费用少等优点。近年来，玻璃化冷冻技术在人卵 与胚胎的冷冻保存中的应用逐渐增多，利用该技术对人未成熟卵母细胞、成熟卵母 细胞、胚胎及囊胚进行冷冻均己有成功报道。
冷冻载体是冷冻保存时承载细胞/组织的物体，玻璃化冷冻成功的关键因素之 一就是选择适当的冷冻载体。目前使用的玻璃化冷冻载体主要包括开放式拉细麦 管、封闭式拉细麦管、电子显微镜铜网、Cryoloop、 Cryot叩和Cryoleaf等。玻璃 化冷冻载体的功能在于承载标本的同时尽量减少负载的冷冻液，达到以下两个目 的冷冻过程中使标本直接接触液氮，快速降温达到玻璃化状态；解冻过程中使冻 存标本充分接触解冻液，及时脱离高浓度冷冻保护剂环境。
目前已有的玻璃化冷冻载体在制作、使用中存在着各种问题，影响了冻存效率 和玻璃化冷冻技术的开展。开放式拉细麦管或封闭式拉细麦管存在如下问题制作 过程中加热装置(酒精灯或热板)的温度不易控制，温度稍低不能将麦管拉长，温 度稍高麦管易断；存储过程中易受到外力破坏而断损，致冻存标本丢失。电子显微 镜铜网、Cryolo叩、Cryotop在冷冻过程及储存过程容易丢失标本。所以上述冷冻 载体在临床应用推广中可行性差，不被广泛接受。Cryoleaf是目前临床上应用最广 泛的冷冻载体，但费用昂贵(每支约200元人民币)，在科学研究中难以广泛采用。
发明内容
本发明的目的是提供一种生物材料玻璃化冷冻载体及其制备方法。
本发明提供的生物材料玻璃化冷冻载体，其特征在于它包括注射针头1和麦
片2;
所述注射针头1由针头1-1和针头座1-2组成；
所述麦片2为开放型拉细麦管，其一端2-l套设于所述针头1-l的内腔中；另
一游离端2-2的麦管壁部分缺失，余留麦管壁的横截面为圆周的1/5-1/3。
所述针头1-1的内腔与所述开放型拉细麦管的口径最好匹配。
所述冷冻载体还可包括防护套3，所述针头1-1和所述麦片2套设于防护套3内。
为了组装方便，所述麦片2套设于所述针头中的一端2-l的端缘为尖端；所述
针头1-1的端缘为平端。
所述麦片2游离端2-2余留麦管壁的横截面具体可为圆周的1/3。 所述麦片2的厚度最好控制在80-100um之间，外径、内径及长度可根据所选
用的注射针头而定。
所述麦片2的外径具体可为0. 8-1. 2誦，优选lmrn;所述麦片2的内径具体可 为O. 6-1.04mm，优选0. 8mm;所述麦片2的长度具体可为2. 5-3. 5cm，优选3cm。 所述注射针头可为任何市售注射针头，所述麦片可由任何市售麦管制作而成。 所述针头1-1的材质具体可为金属，所述针头座1-2的材质具体可为塑料，所 述麦片2的材质具体可为聚乙烯，所述防护套3具体可为注射器针头套。 本发明还提供了制备所述生物材料玻璃化冷冻载体的方法。 本发明提供的制备方法，包括如下步骤是将开放型拉细麦管的一端2-l套设 入注射针头l的针头l-l的内腔中；另一端2-2沿纵向切去部分麦管壁，余留麦管 壁的横截面为圆周的1/5-1/3;得到生物材料玻璃化冷冻载体。
所述方法中，所述开放型拉细麦管是将麦管在沸水浴中拉长得到的。 所述方法中还可包括将保护套3套设于所述针头1-1和麦片2外的步骤。 为了组装方便，所述麦片2套设于所述针头中的一端2-1的端缘为尖端；所述 针头1-1的端缘为平端。
所述麦片2游离端2-2余留麦管壁的横截面具体可为圆周的1/3。 所述麦片2的厚度最好控制在80-100um之间，外径、内径及长度可根据所选 用的注射针头而定。
所述麦片2的外径具体可为0. 8-1. 2mm，优选lmm;所述麦片2的内径具体可 为0. 6-1. 04mm，优选0. 8匪；所述麦片2的长度具体可为2. 5-3. 5cm，优选3cra。 所述注射针头可为任何巿售注射针头，所述麦片可由任何市售麦管制作而成。
所述针头l-l的材质具体可为金属，所述针头座1-2的材质具体可为塑料，所 述麦片2的材质具体可为聚乙烯，所述防护套3具体可为注射器针头套。
得到的生物材料玻璃化冷冻载体可以消毒后售出，也可直接售出，使用前进行 消毒即可。常规消毒方法均可采用，如环氧乙烷熏蒸法。
本发明提供的生物材料玻璃化冷冻载体，具有如下优点
1) 材料主要是一次性注射针头和麦管，来源丰富、成本低(注射器针头每支
l.O元，麦管每支0.4元)。
2) 冷冻载体上有多处用于标记的部位，使用很方便。
3) 冷冻载体占用储存容器空间小，取放轻便，易于储存、运输。
4) 具有防护套，可以防止外界的机械碰触而导致的冻存标本丢失，冻存标本 放心、可靠。
应用本发明的方法制备生物材料玻璃化冷冻载体，具有如下优点
1) 在制作过程中麦管加热装置采用沸水浴，温度恒定维持在IO(TC左右，使麦 管受热均匀、柔韧性好，易于牵拉，拉长、拉细程度可因不同需要而随意调整并且 不会变质。
2) 利记博彩app简单易行、重复性好。
3) 制备时间短煮沸水10分钟，拉管10秒，修管及装管l分钟。 本发明可以解决目前存在的自制冷冻载体难度大，而商品化载体价格昂贵的问
题，适用于各医院生殖中心实验室及各研究单位使用，对于推动玻璃化冷冻技术的 发展以及卵、胚胎、卵巢组织等的冷冻保存研究有着重要的意义。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
图1为生物材料玻璃化冷冻载体的结构示意图。
图2为麦片的结构示意图。
图3为图2的俯视图。
图4A、图4B、图4C为应用生物材料玻璃化冷冻载体的操作示意图。
具体实施例方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。 实施例l、生物材料玻璃化冷冻载体的制备 一、材料的准备
市售注射针头(18号)；市售注射器针头套(18号)；
麦管(0. 25ml):法国I.M.V公司。
二、生物材料玻璃化冷冻载体的制备
1) 用钳子将注射针头的针头前二分之一处剪断成平口，得到平口注射针头；
2) 用电炉将双蒸水煮沸；
3) 用血管钳将麦管两端夹住；
4) 手持血管钳，将麦管浸入沸水浴中，向两端平拉至原管长的4倍，得到开 放型拉细麦管(外径1.0mm，内径O. 8mm);
5) 将开放型拉细麦管抬离液面，维持原先的拉力数秒，至冷却；
6) 用剪刀将开放型拉细麦管剪成3厘米的管段；
7) 将开放型拉细麦管(3厘米) 一端剪成0.5厘米斜口末端；
8) 将管段的斜口末端插入平口注射针头，进深1.3厘米；
9) 用手术刀片从开放型拉细麦管(3厘米)中点开始，沿纵向切去长1.5cm、 截面2/3圆周的管壁，剩余管壁修整为长1. 3cm、宽O. lcm的薄片；
得到生物材料玻璃化冷冻载体。
如图1所示，生物材料玻璃化冷冻载体由注射针头l、麦片2和防护套3组成；其 中，注射针头1由端缘为平端的针头1-l和针头座l-2组成；麦片2的一端2-l的端缘 为尖端、套设于针头l-l的内腔中，另一端2-2麦管壁部分缺失，呈薄片状；针头l-l 和麦片2套设于防护套3内。由图2和图3可见，麦片2的一端2-l为斜口末端，另一端 2-2麦管壁部分缺失，呈薄片状。
针头1-l的作用为把持、固定麦片；针头l-l的孔可作为减压孔，不仅可以在将 载体浸入液氮时做为液氮自行注入管内的进口，在从液氮中取出时，还可以释放管 内因液氮迅速气化而产生的高压。针头座1-2用于操作时把持和文字标记。麦片2的 2-1端与注射针头1的针头1-l连接，起固定作用。麦片2的2-2端承载要冻存的标 本，浸入液氮中使标本与液氮直接接触而急速降温达到玻璃化状态。防护套3保护 麦片2及冻存标本免遭外界机械性碰撞，避免存放时标本丢失，还可用于文字标记。 所以组装后的注射针头1和麦片2的长度等于或略小于防护套3的长度。
实施例2、生物材料玻璃化冷冻载体的应用
将实施例l制备的冷冻载体用环氧乙垸熏蒸法消毒。用消毒后的冷冻载体玻璃 化冷冻53枚小鼠成熟卵母细胞，冷冻1天后，解冻卵母细胞，检测其存活情况。复
苏卵母细胞存活标准为卵母细胞折光性好，透明，没有明显的胞浆皱縮，透明带与 细胞膜完整。
平衡液(EM) : 10。/。乙二醇+10。/。二甲基亚砜+10y。胎牛血清+DPBS;
玻璃化冷冻液(VM) : 20y。乙二醇+20。/。二甲基亚砜+10yo胎牛血清+DPBS;
解冻液(Tl溶液)0. 1M蔗糖+1(^胎牛血清+DPBS;
解冻液(T2溶液)0. 5M蔗糖+10y。胎牛血清+DPBS;
解冻液(T3溶液)0.25M蔗糖+10。/。胎牛血清+DPBS;
解冻液(T4溶液)10。/。胎牛血清+DPBS;
M16培养基Sigma公司。
一、 玻璃化冷冻
室温下将小鼠成熟卵母细胞在平衡液(EM)中停留5分钟后移入玻璃化冷冻液 (VM)中40秒，移到用冷冻载体的麦片上(见图4A)，立即投入液氮(见图4B)， 在液氮中盖好注射器针头帽(见图4C)。
二、 快速解冻
将冷冻l天的小鼠成熟卵母细胞进行解冻，并检测解冻后细胞的存活情况，具 体操作如下
从液氮中迅速取出冷冻载体，在室温下把负载小鼠成熟卵母细胞的冷冻载体的 麦片(见图4A)迅速放入T1溶液，在体式显微镜下找到卵母细胞，依次移入T2溶液、 T3溶液和T4溶液中，各停留3min，最后移入M16培养基于培养箱中(37°C， 5%C02)孵 育l小时后观察卵母细胞存活情况。
结果表明，冻存53枚卵母细胞，解冻复苏后获得53枚卵母细胞，存活47枚，无 丢失，存活率88.7%。
权利要求
1、一种生物材料玻璃化冷冻载体，其特征在于它包括注射针头(1)和麦片(2)；所述注射针头(1)由针头(1-1)和针头座(1-2)组成；所述麦片(2)为开放型拉细麦管，其一端(2-1)套设于所述针头(1-1)的内腔中；另一游离端(2-2)的麦管壁部分缺失，余留麦管壁的横截面为圆周的1/5-1/3。
2、 如权利要求1所述的冷冻载体，其特征在于所述冷冻载体还包括防护套(3)， 所述针头(1-1)和所述麦片(2)套设于防护套(3)内。
3、 如权利要求1或2所述的冷冻载体，其特征在于所述麦片(2)套设于所述针头中的一端(2-1)的端缘为尖端；所述针头(1-1)的端缘为平端。
4、 如权利要求1至3中任一所述的冷冻载体，其特征在于所述麦片(2)游离 端(2-2)余留麦管壁的横截面为圆周的1/3。
5、 如权利要求1至4中任一所述的冷冻载体，其特征在于所述麦片(2)的外 径为0.8-1.2ram、内径为0.6-1.04mm,所述麦片(2)的长度为2.5-3.5cm;所述麦片(2)的外径优选为l鹏、内径优选为0.8mm，所述麦片(2)的长度优 选为3cra。
6、 如权利要求1至5中任一所述的冷冻载体，其特征在于所述针头(1-1)的材质为金属，所述针头座(1-2)的材质为塑料，所述麦片(2)的材质为聚乙烯，所 述防护套(3)为注射器针头套。
7、 制备权利要求1所述生物材料玻璃化冷冻载体的方法，是将开放型拉细麦管的一端(2-1)套设入注射针头(1)的针头(1-1)的内腔中；另一端(2-2)沿纵向 切去部分麦管壁，余留麦管壁的横截面为圆周的1/5-1/3;得到生物材料玻璃化冷冻载体。
8、 如权利要求7所述的方法，其特征在于所述方法中还包括将保护套(3)套设于所述针头(1-1)和麦片(2)外的步骤；所述开放型拉细麦管是将麦管在沸水浴中拉长得到的。
9、 如权利要求7或8所述的方法，其特征在于所述麦片(2)套设于所述针头中的一端(2-1)的端缘为尖端；所述针头(1-1)的端缘为平端。
10、 如权利要求7至9中任一所述的方法，其特征在于所述麦片(2)的外径为0.8-1.2mm、内径为0. 6-1. 04mm，所述麦片(2)的长度为2.5-3.5cm;所述麦片(2)的外径优选为lram、内径优选为0.8mm，所述麦片(2)的长度优 选为3cm;所述针头(1-1)的材质为金属，所述针头座(1-2)的材质为塑料，所述麦片(2) 的材质为聚乙烯，所述防护套(3)为注射器针头套。
全文摘要
本发明公开了一种生物材料玻璃化冷冻载体及其制备方法。本发明提供的生物材料玻璃化冷冻载体包括注射针头(1)和麦片(2)；所述注射针头(1)由针头(1-1)和针头座(1-2)组成；所述麦片(2)为开放型拉细麦管，其一端(2-1)套设于所述针头(1-1)的内腔中；另一游离端(2-2)的麦管壁部分缺失，余留麦管壁的横截面为圆周的1/5-1/3。本发明还提供了所述生物材料玻璃化冷冻载体的制备方法。本发明具有操作简便，耗时短，成本低等优点，适用于各医院生殖中心实验室及各研究单位使用，对于推动医学领域玻璃化冷冻技术的发展以及卵、胚胎、卵巢组织等的冷冻保存研究有着重要的意义。
文档编号C12M1/24GK101386814SQ20081011999
公开日2009年3月18日 申请日期2008年10月21日 优先权日2008年10月21日
发明者杰 严, 杰 乔, 平 刘, 颖 廉, 闫丽盈 申请人:北京大学第三医院