专利名称：利用细胞间期核染色中心数鉴定杨树多倍体的方法
技术领域：
本发明涉及一种植物多倍体的鉴别方法，尤其涉及一种通过对杨树 体细胞间期核染色中心计数，进而从杨树二倍体和多倍体植株中鉴别出 三倍体等多倍体植株的方法，属于植物遗传育种领域。
背景技术：
在林木多倍体育种中，三倍体的直接价值要高得多，尤其是在纸桨 等纤维材新品种选育中，多倍体细胞巨大性不仅带来三倍体的生长提 速，同时由于三倍体纤维细胞增长变大,单位材积的纤维细胞数以及细胞 表面积相应减小，导致细胞壁木质素等含量降低，而纤维素含量则相对 提高，可保证整个产业链的综合效益最大化，具有重要的开发利用潜力。
通过染色体加倍处理获得的后代是否存在多倍体，需要进行染色体 组倍性鉴定。在进行多倍体植株检测时，可采用形态解剖及气孔观察、 染色体计数、流式细胞仪检测等方法。其中，由于植物多倍体一般具有 巨大性特点，可以通过叶片大小、叶色深浅以及气孔大小等形态观察对
多倍体进行初步判别(WH路易斯主编,鲍文奎等译.多倍体在植物和动 物中的地位.贵阳:贵州人民出版社，1984;孙仲序，李云荣.刺槐同源多倍体 研究初报.山东林业科技,1984(2):12-23)，形态观察有助于縮小筛选范围，
但这毕竟是一种间接鉴定，只能作为多倍体鉴定的参考指标。染色体记 数法是通过观察植物细胞染色体数目来进行多倍体鉴定的方法，也是最 直接、最准确的鉴定方法(李懋学，张赞平.作物染色体及研究技术.北京:
中国农业出版社，1996;康向阳,朱之悌，张志毅.毛白杨异源三倍体形态 和减数分裂观察.北京林业大学学报，1999， 21 (1): 1-5)，但对染色体 计数的材料要求较高，只有细胞分裂旺盛、中期分裂相较多时适用，且 需要经历预处理等完整的细胞染色体制片过程。目前流式细胞仪己被广 泛应用于倍性鉴定(Galbraith D W. Analysis of nuclear DNA content in plant cell by flow cytometry. 5zW尸/"W, 1989,31:113-120; Tamum M， Tao R: Sugiura A. Production of dodecaploid plants of Japanese persimmon (D/ay/7>Tas AaA:/ L,) by colchicine treatment of protoplasts.尸/a"f Ce〃 i eporfe,1996,15(7): 470-473;刘继红，曾少华，徐春永，等.澳洲指橘与 粗柠檬体细胞杂种倍性FCM分析及其花粉活力检测.果树学报，2003， 2 (4) : 251-255)，采用流式细胞仪检测不要求材料必须细胞分裂旺盛等 条件，且可一次快速分析成千上万个细胞的倍性，在统计学上更为可靠， 但需要设置对照样，且需要昂贵设备予以支持，试验成本相对较高，实 验时间也较长。
细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程称为 细胞周期，分为间期与分裂期两个阶段，其中间期持续时间较长，而分 裂期相对较短，因此在细胞学观察时，见到的多为间期细胞相，而处于 分裂期的细胞相，尤其是中期分裂相相对较少。染色中心是存在于间期 细胞核内的染色较深的异染色质块，其在间期不发生螺旋消失而保持浓
縮持久状态。玉米等不同倍性组织的研究表明，染色体加倍后，随着染 色体数目的增多，基因组内异染色质区的数量也有所增加，同时也势必 带来间期核内染色中心数目的增长，即染色中心数目是与其倍性水平密
切相关(Ceccarelli M， Cionin P G. Chromocenter association in plant cell nuclei: determinants, functional significance, and evolutionary implications. Ge"ome， 1998, 41: 96-103.; Dhaliwal H S， King P J. Ploidy analysis of haploid derived tissue cultures of Zea m， by chromocentre counting . Tl^y^ca, 1979, 24: 103-112)。目前在植物染色中心研究中，尚未见将染 色中心数目量化并用于多倍体鉴定的报道，更未见通过细胞间期核染色 中心计数进行杨树多倍体植株鉴别的研究报导。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有杨树多倍体的鉴定方法中 所存在的不足，将染色中心数目量化并用于杨树多倍体的鉴定，提供一 种利用体细胞间期核染色中心显微计数观察鉴别杨树多倍体植株的方 法。当难以通过形态等指标观察、检测杨树多倍体，而待鉴别材料中又 存在所含细胞中期分裂相较少、染色体计数困难等情况，从而难以对杨 树多倍体后代进行鉴定时，采用本发明方法可以准确的从上述待鉴别材 料中鉴别出杨树多倍体，此外，本发明方法可以对杨树多倍体植株的进 行快速鉴定，从而满足生产实践的需要。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的 一种利用细胞间期核染色中心数鉴定杨树多倍体的方法，包括以 下步骤
采集待鉴别的杨树植株的幼嫩生长部位，依次进行固定，解离， 水洗，染色，常规压片；观察统计间期细胞核内的染色中心数目；如果 所鉴定植株的间期细胞核的染色中心数目大于40，则所鉴定植株为杨树
三倍体等多倍体植株。
上述方法中，所述杨树植株的幼嫩生长部位包括杨树植株的幼叶、
芽、根尖等部位；
其中，所述的固定选用卡诺固定液(乙酸乙醇=1 : 3)在4" 下固定2h以上；所述的卡诺固定液由乙酸和乙醇按照1 : 3的体积比组 成；
所述的解离为在常温下用解离液(浓HC1 :乙醇=1 : 1)解离25 30min;所述的解离液由浓盐酸和乙醇按照1 : 1的体积比组成；
所述的染色为用改良卡宝品红进行染色；所述的改良卡宝品红染 色液配制方法为A液取3克碱性品红定溶100ml的70%酒精中(可 长期保存)；B液取A液10ml，加入5%苯酚(石炭酸)水溶液90ml(限 2周内使用)；C液(染色液母液)取B液55ml，加入37。/。甲醛6ml、 冰醋酸6ml;改良卡宝品红染色液取C液10ml，加入45%醋酸卯ml 以及山梨醇l克，放置两周后使用；
其中，在观察统计间期细胞核内的染色中心数目时可在普通的光 学显微镜下进行观察统计。
本发明方法的有益效果l)尤其适合于分生组织细胞分裂不旺盛、 所含细胞中期分裂相较少、染色体计数困难的杨树实验材料的多倍体鉴
定；2)明确了多倍体间期细胞核染色中心的数目基准，即只要所观察 材料中存在染色中心数目超过40个的间期细胞核，则该植株可初步判 定为多倍体(图1、图2)，判别简单而明确；3)可省却预处理等制片 技术环节，适宜杨树多倍体植株的快速鉴定等；4)与杨树染色体计数 以及流式细胞仪检测相比，对细胞分裂相、染色体制片技术和显微观察 仪器要求不高，易于掌握和实施。
图l哲引3号杨x北京杨Fl代二倍体与三倍体植株幼叶细胞间期核 形态及其染色中心数目变异(标尺40iim); a: 二倍体植株幼叶细胞间 期核形态及其染色中心数目动态变化；b:三倍体植株幼叶细胞间期核 形态及其染色中心数目动态变化。
图2哲引3号杨x北京杨Fl代二倍体与三倍体植株幼叶细胞间期核 染色中心数分布情况；其中二倍体的细胞间期核染色中心数最高为40 个，而三倍体细胞间期核的染色中心数最高均超过40个。
具体实施例方式
实施例1
一、试验材料
试验材料包括7株哲引3号杨x北京杨Fl代三倍体植株(2n = 3x = 57)和26株哲引3号杨x北京杨Fl代二倍体植株(2n = 2x = 38)，上述 试验材料植株的倍性已预先通过染色体制片得到鉴定。
二、试验方法
采集待鉴别的杨树植株幼叶用卡诺固定液(乙酸:乙醇=1:3 (V/V))于4。C下固定2h以上，然后在常温下用解离液(浓HC1:乙醇 =1:1 (V/V))解离25 30min，蒸馏水洗，改良卡宝品红染色，常规压 片，普通光学显微镜下观察统计间期细胞核内的染色中心数目；每植株 随机统计50个间期细胞核内的染色中心数目，总计统计1650个细胞。
其中，改良卡宝品红染色液配制
配置A液取3克碱性品红定溶100ml的70%酒精中(可长期保
存)；
配置B液取A液10ml，加入5%苯酚(石炭酸)水溶液90ml(限2 周内使用)；
配置C液(染色液母液)取B液55ml，加入37。/。甲醛6ml、冰 醋酸6ml;改良卡宝品红染色液取C液10ml，加入45%醋酸90ml以 及山梨醇1克，放置两周后使用。 三、试验结果
试验结果见图1和图2。从图2可以看出，试验材料二倍体的细胞 间期核染色中心数最高为40个，而三倍体细胞间期核的染色中心数最 高均超过40个。试验结果说明，如果间期细胞核的染色中心数目达到 40以上时，则所鉴定植株属于三倍体等多倍体植株。
权利要求
1、一种利用细胞间期核染色中心数鉴定杨树多倍体的方法，包括以下步骤采集待鉴别的杨树植株的幼嫩生长部位，依次进行固定，解离，水洗，染色，常规压片；观察统计间期细胞核内的染色中心数目；如果所鉴定杨树植株的间期细胞核的染色中心数目大于40，则所鉴定杨树植株为多倍体植株。
2、 按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述多倍体是三倍体。
3、 按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述杨树植株的幼 嫩生长部位包括杨树植株的幼叶、芽或根尖。
4、 按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的固定用卡诺固定液在4。C温度下固定2小时以上。
5、 按照权利要求4所述的方法，其特征在于所述的卡诺固定液由乙酸和乙醇按照l : 3的体积比组成。
6、 按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的解离是用解 离液解离25 30分钟。
7、 按照权利要求6所述的方法，其特征在于所述的解离液由浓盐酸和乙醇按照1 : 1的体积比组成。
8、 按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的染色为用改良卡宝品红进行染色。
9、 按照权利要求8所述的方法，其特征在于所述的改良卡宝品红的配制方法为(1)制备A液取3克碱性品红定溶于100ml的70% 酒精中；(2)制备B液取A液10ml，加入5%苯酚水溶液90ml; (3) 制备C液取B液55ml，加入37。/。甲醛6ml、冰醋酸6ml; (4):取C 液10ml，加入45。/。醋酸90ml以及山梨醇l克，放置两周，即得。
10、按照权利要求1所述的方法，其特征在于在普通光学显微 镜下观察统计间期细胞核内的染色中心数目。
全文摘要
本发明公开了一种利用细胞间期核染色中心数鉴定杨树多倍体植株的方法，属于植物遗传育种领域。该方法包括以下步骤采集待鉴别的杨树植株的幼嫩生长部位，依次进行固定，解离，水洗，染色，常规压片；观察统计间期细胞核内的染色中心数目；如果所鉴定杨树植株的间期细胞核的染色中心数目大于40，则该植株为三倍体等多倍体植株。本发明方法适合于具有分生组织细胞分裂不旺盛、所含细胞中期分裂相较少、染色体计数困难等特性的杨树实验材料的多倍体鉴定，还适于对杨树多倍体植株进行快速鉴定。本发明方法省却了预处理等制片技术环节，节约了制片与鉴定时间，对于实验材料细胞分裂相、制片技术以及显微观察仪器等要求不高，易于掌握和实施。
文档编号C12Q1/02GK101343655SQ20081011909
公开日2009年1月14日 申请日期2008年8月29日 优先权日2008年8月29日
发明者康向阳, 磊 张, 李代丽, 君 王 申请人:北京林业大学