专利名称：一种分离获得植物内生菌的方法
技术领域：
本发明属于微生物学领域，涉及一种从植物中全面分离获得植物内生菌的方法
背景技术：
植物内生菌广泛存在于各种植物中，他们对宿主的生命活动产生了巨大的影响，目前 植物内生菌的研究正成为国际上生物、环境、化学等领域的热点。现有所公布的植物内生 菌分离方法200710065724主要是利用机械力研磨离心的方法从植物组织匀奖中将植物内 生菌分离出来。然而，在离心的过程中，很多内生菌可能仍然存在植物组织中未被分离。 而植物内生菌的研究迫切希望尽可能获得植物宿主体内所有的内生菌，而本发明使用的方 法则能最大限度的获得植物宿主体内全部内生菌。
发明内容
本发明的目的在于提供一种分离获得植物内生菌的方法，以期尽可能获得植物宿主体 内所有的内生菌。
本发明的目的是通过以下方式实现的。
一种分离获得植物内生菌的方法，是经过植物预处理、表面消毒、内生菌的浸出、内生菌的分离纯化四步，所述的内生菌的浸出过程为经表面消毒后的根、茎、叶小段分别
在无菌条件下于纤维素酶浓度为40—60 ix g/mL， 0.15—0.3% SDS的8 —12mL灭菌PBS溶 液中充分研磨，将研磨液转入50mL锥型瓶中25—35"C条件下120—180rpm振荡50— 卯min，得上清液和植物残渣。
内生菌的最佳浸出过程为经表面消毒后的根、茎、叶小段分别在无菌条件下于纤维 素酶浓度为50 U g/mL， 0.25% SDS的10mL灭菌PBS溶液中充分研磨，将研磨液转入50mL 锥型瓶中30。C条件下150rpm振荡60min，得上清液和植物残渣。
所述的植物预处理过程为将采集好的新鲜植物用清水洗净并将其根、茎、叶切成2 厘米左右的小段。
所述的表面消毒过程为在70%乙醇与2%次氯酸钠溶液中浸泡进行表面消毒，浸泡 后用无菌水冲洗5次以去除残余表面消毒液。
所述的内生菌的分离纯化过程为在无菌条件下将内生菌的浸出过程中所得上清液、
10倍和100倍稀释上清液各100 u L分别涂布TSB琼脂平板；将植物残渣直接印记至TSB琼脂平板上，所有平板均于30'C恒温培养2 14天后挑取不同形态的菌落，真菌至査氏培 养基，细菌至TSB固体培养基中，划线培养至纯后于-8(TC保存。 本发明的具体过程为
1、 植物预处理
将采集好的新鲜植物用清水洗净并将其根、茎、叶切成2厘米左右的小段，
2、 表面消毒
通过在70%乙醇与2%次氯酸纳溶液中的浸泡进行表面消毒，浸泡后用无菌水冲洗5 次以去除残余表面消毒液，并取100 tx L最后一次洗液涂布平板于3(TC下恒温培养3天作 为表面消毒的对照，若对照平板无菌落形成则证明表面消毒充分，后续步骤所分离获得的 均为植物内生菌。表面消毒液的浸泡时间为获得充分表面消毒效果的最短时间。 一般说来， 植物的根茎表面消毒的时间要长于叶部。
3、 内生菌的浸出
经表面消毒后的根、茎、叶小段分别在无菌条件下于纤维素酶浓度为40—60yg/mL， 0.15—0.3% SDS的8 — 12mL灭菌PBS溶液中充分研磨，将研磨液转入50mL锥型瓶中120 一180rpm， 25—35。C条件下保持50—90min，取上清液。在利用机械剪切力使植物内生菌 浸出的基础上利用表面活性剂与纤维素酶能分解植物纤维及植物细胞壁，使植物组织中的 内生菌充分释放出来，以获得更好的植物内生菌分离效果。
4、 内生菌的分离纯化
在无菌条件下一方面将经步骤3的上清液作梯度稀释，分别取原液、10倍、100倍稀 释液100ixL涂布TSB琼脂平板；另一方面，将植物残渣直接印记至TSB琼脂平板上，所 有平板均于3(TC恒温培养2~14天后挑取不同形态的菌落，真菌至査氏培养基，细菌至TSB 固体培养基中，划线培养至纯后于-80。C保存。
本发明的有益效果
本发明方法与一般方法相比，不仅仅利用机械研磨和剪切力使植物内生菌浸出，同时 加入表面活性剂和纤维素酶分解植物纤维及植物细胞壁，使植物组织中的内生菌更加充分 释放出来，获得更好的植物内生菌分离效果。
对于植物内生菌的研究来说所得出的结论科学与否的根本在于是否能分离获得植物 体内所有的内生菌。因此，尽可能全面的分离获得植物内生菌是全面研究植物内生菌的根 本。利用本发明方法分离植物内生菌效果比一般分离方法效果显著得多，因此，本发明是 研究植物内生菌的优良方法。
图1为一般分离法分离内生菌流程图； 图2为本发明方法分离内生菌流程图。
具体实施例方式
以下实施方式和实施例旨在进一步说明本发明，而不是对本发明的限定。 实施例1
采用两种方法分别分离龙葵、齿果草、蚂蝗七、水鸡仔四种植物中的内生菌；采用一 般分离法分离内生菌流程如图1所示；采用本发明方法分离内生菌流程如图2所示。
随后，将分别经过上述两种方法获得的平板经3(TC恒温培养2~14天后挑取不同形态 的菌落，真菌至查氏培养基，细菌至TSB固体培养基中，划线培养至纯，统计结果如下表
所示:
根内生菌数茎内生菌数叶内生菌数龙葵内生菌总数
未采用本发明方法71123
采用本发明方法34362797
根内生菌数茎内生菌数叶内生菌数齿果草内生菌总数
未采用本发明方法85821
采用本发明方法28122767
根内生菌数茎内生菌数叶内生菌数蚂蝗七内生菌总数
未采用本发明方法94316
采用本发明方法35282083
根内生菌数茎内生菌数叶内生菌数水鸡仔内生菌总数
未采用本发明方法106420
采用本发明方法31231569
5由结果可见采用本发明方法分离四种内生菌总数明显比未采用本发明方法分离得到 的内生菌总数要多3 5倍；采用本发明方法能最大限度的分离获得植物体内的内生菌。本 发明方法效果显著是一种分离获得植物体内生菌的优良方法。
权利要求
1、一种分离获得植物内生菌的方法，是经过植物预处理、表面消毒、内生菌的浸出、内生菌的分离纯化四步，其特征在于所述的内生菌的浸出过程为经表面消毒后的根、茎、叶小段分别在无菌条件下于纤维素酶浓度为40—60μg/mL，0.15—0.3％SDS的8—12mL灭菌PBS溶液中充分研磨，将研磨液转入50mL锥型瓶中25—35℃条件下120—180rpm振荡50—90min，得上清液和植物残渣。
2、 根据权利要求1所述的一种分离获得植物内生菌的方法，其特征在于，所述的内 生菌的浸出过程为经表面消毒后的根、茎、叶小段分别在无菌条件下于纤维素酶浓度为 50y g/mL， 0.25% SDS的10mL灭菌PBS溶液中充分研磨，将研磨液转入50mL锥型瓶中 3(TC条件下150rpm振荡60min，得上清液和植物残渣。
3、 根据权利要求1或2 —种分离获得植物内生菌的方法，其特征在于，所述的植物 预处理过程为将采集好的新鲜植物用清水洗净并将其根、茎、叶切成2厘米左右的小段。
4、 根据权利要求3 —种分离获得植物内生菌的方法，其特征在于，所述的表面消毒 过程为在70%乙醇与2%次氯酸钠溶液中浸泡进行表面消毒，浸泡后用无菌水冲洗5次 以去除残余表面消毒液。
5、 根据权利要求4 一种分离获得植物内生菌的方法，其特征在于，所述的内生菌的 分离纯化过程为在无菌条件下将内生菌的浸出过程中所得上清液、IO倍和IOO倍稀释上 清液各100uL分别涂布TSB琼脂平板；将植物残渣直接印记至TSB琼脂平板上，所有平 板均于3(TC恒温培养2 14天后挑取不同形态的菌落，真菌至查氏培养基，细菌至TSB固 体培养基中，划线培养至纯后于-80'C保存。
全文摘要
本发明提供了一种分离获得植物内生菌的方法，是经过植物预处理、表面消毒、内生菌的浸出、内生菌的分离纯化等步骤，本发明方法与一般方法相比，不仅仅利用机械研磨和剪切力使植物内生菌浸出，同时加入表面活性剂和纤维素酶分解植物纤维及植物细胞壁，使植物组织中的内生菌更加充分释放出来，获得更好的植物内生菌分离效果。
文档编号C12N1/00GK101434906SQ20081010751
公开日2009年5月20日 申请日期2008年12月19日 优先权日2008年12月19日
发明者勇 万, 喆 曹, 罗胜联, 潇 肖, 峰 苏, 郭函君, 亮 陈 申请人:湖南大学