专利名称：：一种磷酸转移酶及其编码基因与应用的利记博彩app
技术领域：
：本发明涉及一种磷酸转移酶及其编码基因与应用。
背景技术：
：呈味核苷酸是继谷氨酸钠(MSG)之后，助鲜效果更明显、效率更高的新一代食品助鲜剂，被广泛应用于食品加工领域。呈味核苷酸与谷氨酸钠按一定比例混合使用时产生协同效应，使食品的鲜度提高数倍至数十倍，可使相同鲜度的助鲜产品成本降低40-60%。因此，作为食品的新型助鲜剂，呈味核苷酸的研究与应用引起了国内外的广泛重视。呈味核苷酸的呈味作用取决于其化学结构，只有核苷的5'位磷酸酯化才具有呈味作用[Yoshikawa，M.，T.Kato，andT.Takenishi.Studiesofphosphorylation.III.Selectivephosphorylationofunprotectednucleosides.C/柳5bc.Jpn，1969,42:3505-3508.]，2'、3'位磷酸酯化没有呈味作用。因此，目前有关生产呈味核苷酸工艺的研究，都是围绕着如何使核苷的5'位特异磷酸酯化。5'-肌苷酸和5'-鸟苷酸为代表性的呈味核苷酸，5'-肌苷酸二钠和5'-鸟苷酸二钠的结构如下OH5'位我,^,NH2iz。c。,■、*人.HHHM。OH5'-肌苷酸二钠(5'—IMPNa2)。H■r::[VJ1-、N:h:.n，5'位，^N,^^CM敏翻5'-鸟苷酸二钠(5'-GMPNa2)。从上世纪60年代日本开始实现核苷酸工业化生产以来，经过几十年的研究，已经有多种生产核苷酸及其衍生物的方法。核苷酸的生产技术可分为以下三大类核酸酶解法、直接发酵法及核苷发酵-合成法。一、核酸酶解法核酸酶解法是历史最长、最成熟的生产呈味核苷酸的方法。利用桔青霉的5'-4磷酸二酯酶与从酵母中提取的RNA反应，可得到四种5'-核苷酸的混合物。经离子交换树脂分离纯化，得到四种核苷酸产品。为提高酶反应的速度及操作性能，可以采用固定化酶或膜反应器工艺。虽然核酸的酶解方法反应简单，但生产的核酸产物是混合物，要进一步得到5'-肌苷酸，需要将混合物进行分离纯化，并对5'-AMP进行化学修饰或酶法转化，才能得到5'-IMP。该方法分离纯化操作复杂，占地面积大，整体生产效率较低。二、直接发酵法直接发酵法生产核苷酸主要利用微生物代谢直接从简单的碳源和氮源生产5'肌苷酸或5'黄苷酸。直接发酵法生产肌苷酸的菌株主要有产氨短杆菌(及ayfflzo/2iage/2e5)、谷氨酸棒杆菌(C67w^3/zicwff)、嗜酉昔酸棒杆菌(Cace&ac^/o/7^7^)等。直接发酵法的生产菌株选育比较复杂。生产肌苷酸需要ATP的参与和再生，代谢途径控制难，产生的肌苷酸易于被继续分解。解决或解除终产物的反馈调节要比利用中间产物的代谢调控复杂得多，这一问题也限制了直接发酵法生产肌苷酸的工业应用。三、核苷发酵-合成法核苷发酵-合成法由发酵法生产核苷和磷酸化制备核苷酸两步工艺组成。先利用简单的碳源和氮源发酵生成核苷，再通过微生物酶的磷酸化反应，得到相应的核苷酸，其技术的关键问题在于如何将发酵生产的核苷高效地转化为目的核苷酸。核苷的磷酸化反应，可以通过化学转化和微生物酶转化来实现。化学转化法可以将核苷进行磷酸酯化反应从而生成核苷酸，它是目前工业上常用的生产工艺之一。要利用化学法在核苷的5'位上导入磷酸基，得到5'-核苷酸，必须在磷酸化反应之前，使用适当的保护剂，保护核苷上碳2'和碳3'位的羟基不参与反应，然后在磷酸化反应结束后脱去保护剂。常用的核苷磷酸化试剂主要是磷酸或者焦磷酸衍生物，包括对三齒氧化磷，焦磷酰氯、双-对硝基苯焦磷酸等，而目前工业上广泛采用的是三氯氧化磷。由于化学法所用的试剂较昂贵，许多化学药品具有剧毒(如三氯氧化磷)，安全控制难度大，工艺要求高，环境污染严重，生产成本偏高。因此化学合成法一般用于生产一些有特殊用途的核苷酸的衍生物。微生物中存在的核苷磷酸化酶可以不利用ATP将无机磷酸根特异的转移到核苷分子的特定位置上，具有反应条件温和、反应速度快、位置特异性强、转化率高、环境友好等特点，而且和传统的核酸酶解法及直接发酵法相比，催化过程简单，不需要ATP参与，过程控制容易，在呈味核苷酸的生产方面具有重要的应用价值。主要问题是ATP再生过程细胞膜通透性的控制，系统稳定控制难度较大；反应副产物多，不利于产品的分离纯化；只能进行批式反应；反应需要的时间长；转化率还有待于提高。Brawermann[Brawerman，G.,andE.Chargaff.Onthesynthesisofnucleotidesbynucleosidephosphor-transferase.^2.0c/i瓜Jcta,1954，15:549-559.]和Chargaff通过植物酶转化有机磷源合成核苷酸。Marutzky等利用胡萝卜磷酸转移酶以苯基磷酸盐为磷源合成多种5'-核苷酸。而在细菌催化核苷磷酸化反应研究方面，Mitsugi等[R.Marutzky,H.Peterssen-Borstel，J.Flossdorf，M.-RKula，Biotechnol.Bioeng.16(1974)1449.]利用硝基苯基磷酸盐作为磷酸供体合成了各种核苷酸，并发现细菌内磷酸转移酶根据所合成核苷酸的立体异构性可分为碳5'位转移酶和碳3'(或2')位转移酶两类。1999年日本的Asano等[Asano,Y.，Y.Mihara,andH.Yamada.1999.AnovelselectivenucleosidephosphorylationenzymefromyJfor卵/7eJZ3历or卵/j丄J.Biosci.Bioeng.87:732-738.]研究发现ifo2^s/e77a/zot《朋j7的酸性磷酸酶具有选择性磷酸转移酶活性，可利用无机焦磷酸(PPi)和核苷催化生成5'核苷酸，催化过程如下PiinosineE+PPiE-PO3-~>E+5'-IMP(PPi-itiosinephosphotransferasereaction)7、E+5'-IMP-E"PO3-E+Pi(phosphatasereaction)为生物酶法生产核苷酸提供了新思路。从上述反应可以看出如果能够充分利用酸性磷酸酶特异磷酸化生成5'-核苷酸的特点，可以开发出高效生产呈味核苷酸的生物酶工程技术。随后Asano等对A/^er7'c5a"eria的几个禾中/!rowWe/2"-a"war"J'、^sc力en'c力^Wa"ae和A7eZw'e7"A/a/^ico"酸性磷酸酶基因进行了克隆和催化反应研究，结果发现肠杆菌属，广泛含有选择性磷酸转移酶的活性，但关键问题是细胞内反应到一定程度后生成的肌苷酸又被降解，而且磷酸根在核苷分子上的转移位置取决于微生物的种类。为解决生成的肌苷酸的胞内降解问题，他们以^c力ew'c力^为出发菌株，利用错位PCR技术，对酸性磷酸酶基因进行突变，筛选出了高活性磷酸转移酶的突变体[YasuhiroMIHARA，1;yKohkiISHIKAWA，2Ei-ichiroSUZUKI，2andYasuhisaASAN03.2004ImprovingthePyrophosphate-inosinePhosphotransferaseActivityofEscherichiablattaeAcidPhosphatasebySequentialSite—directedMutagenesis.Biosci.Biotechnol.Biochem.，68(5)，1046-1050]。到目前为止，相关的技术研究和应用，主要限于利用整细胞的催化。利用整细胞催化的最大问题是核苷及核苷酸跨细胞膜传递阻力大，反应时间长，而且细胞内其他反应的存在造成代谢副产物多、目标反应过程控制难。由于酸性磷酸酶催化的反应仅仅是一步磷酸基团的转移反应，因此如果能够制备使用方便、低成本、高活性的酸性磷酸酶制剂，利用酶催化生产核苷酸的酶工程技术有望成为可能，它可以彻底解决上述整细胞催化过程中存在的主要问题，对于呈味核苷酸的生产技术进步具有推动作用。
发明内容本发明的目的是提供一种磷酸转移酶及其编码基因。本发明提供的磷酸转移酶，名称为phoC，来源于产气肠杆菌￡sero《^"IAM1183，是如下(a)或(b)或(c)的蛋白质(a)由序列l自氨基末端第11-248位氨基酸序列组成的蛋白质；(b)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(c)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有磷酸转移酶活性的由序列1衍生的蛋白质。序列表中的序列1由248个氨基酸残基组成，是磷酸转移酶。自序列1的氨基末端第1-10位氨基酸残基是信号肽区域。所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指在序列1的上述信号肽区域进行取代和/或缺失和/或添加。为了使(a)中的phoC便于纯化，可在由序列表中序列l所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表l所示的标签。表l标签的序列7<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>上述(c)中的phoC可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(c)中的phoC的编码基因可通过将序列表中序列2自5'端第1至747位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。上述磷酸转移酶的编码基因也属于本发明的保护范围。所述磷酸转移酶的编码基因为如下l)或2)或3)或4)的DNA分子1)其编码序列是序列表中序列2自5'末端第31-747位脱氧核糖核苷酸所示的DNA分子；2)其核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；3)在严格条件下与l)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；4)与序列表中序列2限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。上述严格条件可为在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交,然后用2XSSC,0.1%SDS和1XSSC，0.1%SDS各洗膜一次。序列表中的序列1由747个脱氧核糖核苷酸组成，自5'端的第1至3位脱氧核糖核苷酸为P力oC的起始密码子ATG，自5'端的第745至747位脱氧核糖核苷酸为p力oC的终止密码子TAG。含有;力oC基因的表达盒或重组表达载体也属于本发明的保护范围。可用现有的表达载体构建含有p力oC基因的重组表达载体。使用p力oC构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因菌株进行鉴定及筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入可在菌株中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因等。所述重组表达载体具体可为pMKL-c2x-p力oC。上述pMKL-c2x-;力oC是将pMKL-c2x的；fe/zI、历'"dIII位点间的小片段替换为所述基因得到的。含有p力oC基因的转基因细胞系和重组菌都属于本发明的保护范围。所述重组菌具体可为￡aero《e/esIAM1183(pcphoC)、ATBlI(pcphoC)或￡BL21(DE3)(pcphoC)。上述￡aaroge"esIAM1183(pcphoC)是将所述pMKL-c2x-//oC质粒导入A3eroge"esIAM1183得到的。上述￡co7iTB1I(pcphoC)是将所述pMKL-c2x-/力oC质粒导入￡TB1I得到的。上述coh'BL21(DE3)(pcphoC)是将所述pMKL-c2x-p力oC质粒导入￡coZiBL21(DE3)得到的。本发明还提供了表达所述phoC蛋白的方法，是培养所述重组菌，得到所述phoC蛋白。上述方法中，可对所述重组菌进行诱导，诱导条件可为0.3-lmMIPTG、5-25。C、5-10小时。所述phoC蛋白及其编码基因、表达盒、重组表达载体、重组菌和转基因细胞系均可应用于生产5'呈味核苷酸。所述5'呈味核苷酸具体可为5'肌苷酸或5'鸟苷酸。本发明公开了一种磷酸转移酶及其编码基因，还提供了携带磷酸转移酶编码基因的表达载体和用该表达载体转化宿主得到的基因工程菌。本发明将克隆的产气肠杆菌(AaeiY^e72esIAM1183)磷酸转移酶基因，与表达载体pMKL-C2X相连接，构建了MBP与PhoC相融合的表达载体pMKL-C2X-转化到不同的宿主，利用表达的融合蛋白催化呈味核苷酸的生成。所述磷酸转移酶的酶促反应温度范围3040°C，最适温度为35。C;酶促反应的pH范围为pH4.8-7.6，最适pH为6.8。本发明提供的磷酸转移酶和工程菌可用于生产5'呈味核苷酸，生产率和转化速率高，水解活性低，且最适pH值近中性。本发明技术具有很高的实际应用价值和广阔的工业应用前景。以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。图1为从产气肠杆菌PCR克隆的磷酸转移酶编码基因的电泳图图2为PMD-18T-;^oC克隆载体构建过程图图3为pMKL-c2x-p力oC表达载体构建过程图图4为pMKL-c2x-p力oC的酶切鉴定图图5为￡coh'TBII(pcphoC)的磷酸转移酶表达SDS分析图6为原始菌株与转化菌株的酶活图7为原始菌株与转化菌株的催化速度图8为原始菌株与转化菌株的水解活性图9为pH值对原始菌株与转化菌株的酶活性的影响具体实施例方式下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例l、磷酸转移酶及其编码基因的获得和克隆根据已发表的磷酸转移酶基因保守区域设计一对引物pi和P2，引入"a/zei和历'/7dlII酶切位点。以产气肠杆菌"3ar^朋e^sIAM1183)(购自日本东京大学应用微生物研究所(IAM)菌种库)的基因组DNA为模板进行PCR扩增。PI:phoC-fw5'-CGCGGATCCATGAAAAAGCGTGTACTCGCCC-3，，P2:phoC-rw5，-CCCAAGCTTCTATTTCTGCTGTTTCGCAAACT-3，。PI和P2的划线部分为根据需要设计的5aMII和历V2dlII酶切位点。PCR条件95。C预变性5min;30个循环94。C变性、1rain,50-6(TC退火、30see,72。C延伸、1min;72。C、10rain。对pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳图见图l。图l中，1:6(tc退火温度的PCR产物；2:55。C退火温度的PCR产物；3:DNAladder2000:2000、1000、700、500、250、100bp。结果表明，采用6(TC退火温度得到了分子量约为700bp的条带，与预期结果相符。将该PCR产物4。C保存，送上海InvitrogenCorporation测序，测序结果表明，扩增到的核苷酸序列见序列表的序列2，编码氨基酸序列是序列表的序列1的蛋白质phoC。扩增到的p力oC基因由747个脱氧核糖核苷酸组成。用琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANGEN)回收该片段。将该回收片段与pMD-18T(大连TaKaRa;货号D103A)连接，构建克隆载体，构建过程见图2。将含有序列表中序列2的自5'末端第1-747位脱氧核糖核苷酸的p力W基因的pMD-18T载体命名为pMD-18T-z7力oC。实施例2、表达载体pMKL-c2x-p力oC的构建表达载体pMKL-c2x-p力oC的构建过程如图3所示，具体步骤如下1)用Aa/zfll、A'72dlII双酶切质粒pMD-18T-/力oC;2)回收酶切后的750bp左右的p力oC片段；3)将750bp左右的/力oC片段插入到用5a/zHI、历VdIII双切的pMKL-c2x(NewEnglandBiolabscode:NEBtt8000S)多克隆位点上。得到重组载体。将含有序列表中序列2的自5'末端第1-747位脱氧核糖核苷酸的p力oC基因的pMKL-c2x载体命名为pMKL-c2x-p力oC(pcphoC)。将pMKL-c2x-;力oC质粒导入￡DH5a中，得到重组菌株。提取质粒进行酶切鉴定，电泳图见图4。图4中，1:DNAladder2000:2000、1000、700、500、250、100bp;2:勘/dl1、历/2dlII双酶切；3:勘/dU单酶切；4:历/7dlII单酶切；5:DNAladder15000:15000、10000、7500、5000、2500、1500、1000、250bp。将鉴定结果为阳性的pMKL-c2x-/力oC质粒分别导入￡serog朋esIAM1183、co/iTBII(NewEnglandBiolabscode:NEB#8000S)、￡co7iBL21(DE3)宿主菌中，获得3种工程菌Eal(pcphoC)、TBII(pcphoC)、BL21(DE3)(pcphoC)。同时将pMKL-c2x质粒分别导入￡aeiY^e/2esIAM1183、￡TBII和￡coh'BL21(DE3)宿主菌中，得到与3种工程菌对应的3种对照菌Eal(pc)、TBII(pc)、BL21(DE3)(pc)。实施例3、TBII(pcphoC)的磷酸转移酶表达分析选择TB1I(pcphoC)工程菌进行磷酸转移酶表达分析，具体步骤如下1)将实施例2制备的TB1I(pcphoC)工程菌按l:100的体积比接种到100mLLB培养基中；2)30。C培养3h,当OD600到1.8时，加30ulIPTG，15。C过夜；3)收集菌体，加入pH4.8的醋酸缓冲液重悬菌体，使菌体浓度为2mg干重'mr;4)在(TC冰水浴中，超声99次，每次超声时间为3sec，间隔时间为3sec;超声频率为20-25kHz;超声强度为100-400W/cm、5)将得到的菌体细胞破碎液，1300Xg离心10min，取上清液，进行SDS-PAGE电泳，分析pMKL-c2x-;力o咖表达情况。电泳结果见图5。图5中，l为Marker;2、3为TB1I(pcphoC)菌体破碎上清液。由图可见，在71KDa处，有一表达的特征带，与25KD的PhoC和46KD的MBP(麦芽糖结合蛋白)之和相同，说明PhoC蛋白与MBP形成了融合蛋白，并且在IPTG的诱导下得到了有效表达。实施例4、磷酸转移酶的性质测定1、制备菌液和细胞破碎液1)制备菌液。将实施例2制备的Eal(pcphoC)、TBII(pcphoC)、BL21(DE3)(pcphoC)工程菌和Eal(pc)、TBII(pc)、BL21(DE3)(pc)对照菌分别按l:100的体积比接种到100mLLB培养基中。30。C培养3h，当0D600到1.8时，加30ulIPTG，15r过夜。收集菌体，加入pH4.8的醋酸缓冲液重悬菌体，使菌体浓度为2mg干重ml—1,得到3种工程菌和3种对照菌的菌液。2)制备细胞破碎液将3ml步骤l)制备的菌液(菌体浓度为2mg干重'mr)在0'C冰水浴中，超声99次，每次超声时间为3sec，间隔时间为3sec;超声频率为20-25kHz;超声强度为100-400W/cm2;得到3ml细胞破碎液。分别用步骤l)得到3种工程菌和3种对照菌的菌液制备细胞破碎液，得到3种工程菌和3种对照菌的细胞破碎液。2、酶活测定将在35。C，pH7.0的条件下，每分钟合成lwnol5'-肌苷酸所需的酶量定义为l个酶活力单位。分别用Eal(pcphoC)、TBII(pcphoC)、BL21(DE3)(pcphoC)工程菌和Eal(pc)、TB1I(pc)、BL21(DE3)(pc)对照菌的菌液和细胞破碎液进行试验。反应液的组成如下:3ml的菌液或细胞破碎液，10mg'mr'肌苷，100mgm1—112焦磷酸钠，0.2mgml—1MgS047H20。将上述反应液装入5ml离心管，在30。C，170rpm摇床中反应0.5小时，吸取2ml反应液，加入0.4ml2MHC1终止反应，液相色谱分析5'-IMP(肌苷酸)的生成情况。计算Eal(pcphoC)、TBII(pcphoC)、BL21(DE3)(pcphoC)工程菌和Eal(pc)、TB1I(pc)、BL21(DE3)(pc)对照菌的整细胞和细胞破碎液的酶活。结果如图6所示，图6中，A为整细胞的酶活；B为破碎细胞的酶活。结果表明，三种工程菌的酸性磷酸转移酶酶活都比相应对照菌的酶活高，特别是TB1I(pcphoC)工程菌。3、酸性磷酸转移酶的催化速度分别用Eal(pcphoC)、TBII(pcphoC)、BL21(DE3)(pcphoC)工程菌和Eal(pc)、TB1I(pc)、BL21(DE3)(pc)对照菌的细胞破碎液进行试验。反应液的组成如下3ral细胞破碎液，10mg*ml—i肌苷，100mgmr焦磷酸钠，0.2mgml—1MgS047H20。将上述反应液装入5ml离心管，在30。C，170rpm摇床中反应。在30°C，170rpm条件下，每隔一定时间取样lral，加入0.2ml2MHCl终止，液相色谱分析5'-IMP(肌苷酸)的生成情况。计算Eal(pcphoC)、TBII(pcphoC)、BL21(DE3)(pcphoC)工程菌和Eal(pc)、TB1I(pc)、BL21(DE3)(pc)对照菌的细胞破碎液的酸性磷酸转移酶的催化速度。结果如图7所示。结果表明前0.5h的催化反应速度较快，呈线性，酶催化速度有差异，工程菌的反应初速度，较相应的对照菌要快；当反应进行5h时，不同转化菌的转化率也不同，三种工程菌无论是催化速率，还是转化率都比对照菌有明显提高，TBII(pcphoC)、BL21(DE3)(pcphoC)工程菌尤为显著。4、磷酸转移酶的水解活性测定酸性磷酸转移酶的水解活性是影响产物生成率的主要因素。因此在不影响酶的转移磷酸活性前提下，水解活性降低，可以提高底物的转化率。分别用Eal(pcphoC)、TBII(pcphoC)、BL21(DE3)(pcphoC)工程菌和Eal(pc)、TB1I(pc)、BL21(DE3)(pc)对照菌的细胞破碎液进行试验。反应液组成如下5ml细胞破碎液，10mg'mr肌苷酸，0.2mg'ml—1MgS04*7H20。将上述反应液装入5ml离心管，在30。C，170rpm摇床中反应。每隔一定时间取样0.4ml，加入O.lml2MHC1终止，检测反应液中的肌苷酸和肌苷浓度，结果见图8。图8中，A为5'-IMP的浓度随反应时间的变化；B为肌苷的浓度随反应时间的变化。结果表明对照菌的水解肌苷酸活性是比较稳定的，在只有肌苷酸的反应体系中，水解速率近似常数；不同的菌株水解活性不同，Eal(pc)的水解活性最大，TBII(pcphoC)的水解活性最小，其他菌介于两者之间；所有工程菌株的水解活性要小于相应对照菌株。表明本发明的酸性磷酸转移酶，在酶活性提高的同时，其水解活性也得到了大幅降低。实施例5、pH值对TBlI(pcphoC)磷酸转移酶活性的影响pH是酶促反应的重要特征，选择活性表达活性最高的TBII(pcphoC)检测pH对催化反应的影响。收集过夜培养的菌体TB1I(pcphoC)，12000rpm离心lOmin收集菌体，分成几份，分别加入等体积不同pH(pH4.0-8.4)的缓冲液重悬菌体。每份重悬的菌体又分成两份，分别制备菌液和细胞破碎液。菌液的制备方法同步骤实施例4的步骤1，菌体浓度为2mg干重'm1—1。将3ml菌体浓度为2mg干重'm1—'的菌液按照实施例4的步骤1中2)的方法进行超声破碎，得到3ml细胞破碎液。反应液的组成如下3ml细胞破碎液或菌液，10mg.mr'肌苷，100mgml—'焦磷酸钠，0.2mgml—1MgS047H20。将上述反应液装入5ml离心管，在30。C，170rpm摇床中反应30min后，加入0.4ml2MHC1终止反应，液相色谱分析5'-IMP(肌苷酸)的生成情况。计算TB1I(pcphoC)工程菌的整细胞和细胞破碎液的酶活。结果如图9所示，图9中，A为整细胞酶活随pH的变化；B为破碎细胞酶活随pH的变化。结果表明pH值对于整细胞和破碎细胞酶活的影响情况是相似的，在pH5.6以下，酶活性比较低；在pH5.6以上直到pH8.4的范围内酶活都在一个较高的水平，且变化浮动不大。整细胞最佳pH值为6.4，细胞破碎液最佳pH值为7.2。这与文献报道的酸性磷酸转移酶最佳pH多在5.6以下有所不同，因此酶的催化特性有所改变，这可能是酶的活性部位附近的空间环境有所改变，也可能产气肠杆菌的酸性磷酸转移酶不同于其他已知的酸性磷酸转移酶。序列表〈110〉清华大学<120>—种磷酸转移酶及其编码基因与应用〈130〉CGGNARY81228<160>2<210>1<211>248<212>PRT<213〉产气肠杆菌(￡犯roge77es)<400>1Met1SerLysLysArgValLeuAlaLeuCysLeuAlaSerLeuPheAlaPheAspLeuLeuAla65LeuPro50MetTyr35ProAla20Tyr5LeuValProAlaLeuLysAsnProProGluTyrGluLysAlaAlaGluPheSerAlaLeuHisLys115Ala100LeuAsp85PheGly70AlaVal55ArgAla40GlyGly25Gin10AsnAlaSerlieLeuLeuArgAsnLeuSerGlySerProLeuThrAsnMet120lie105lieAla90SerGluAspAlalieAspAlaPhe60AlaThr75GlyGlyGluLysAspAlaThrSer45LeuThr30LeuSerVal15LysProAlaLeuAsnAspGinAlaArgValAlaAspGly125Ala110AspGlyLys80AsnAla95ProAlaLeuAlaThrArgGlyAlaLysGluLysTyrMetArglieArgProPheAlaPhe130135140TyrGlyValSerThrCysAsnThrThrGluGinAspLysLeuSerLys145150155160AsnGlySerTyrProSerGlyHisThrSerlieGlyTrpAlaThrAla165170175LeuValLeuAlaGlulieAsnProGinArgGinAsnGlulieLeuLys180185190ArgGlyTyrGluLeuGlyGluSerArgVallieCysGlyTyrHisTrp195200205GinSerAspValAspAlaAlaArglieValGlySerAlaValValAla210215220ThrLeuHisThrAsnProAlaPheGinGinGinLeuGinLysAlaLys225230235240AspGluPheAlaLysGinArgAsn245<210〉2<211>747<212>DNA〈213〉产气肠杆菌(￡ser0ge/2es)〈400>2gtgtactcgccctttgccttgccagcctcttttcagttagcgcctttgcg60ctggttcccgccggcaatgatgccaccaccaagcccga_tctctactatctgaaaaatgcc120caggccattgacagcctggcgctgttgccaccgccgccgg犯gtgggcagcattgcgttt180ttaaacgatcaggcgatgtatgagaaaggccgtctgctgcgcgccaccgcccgcggcaag240ttggcggcag2iggatgccaeicctgagcgcgggtggcgtggccaacgccttctccgcagca300ttcggctccccgatcagcgaaaaagacgccccggcgctgcacaaactgctC3CC83C3tg3603ttg犯g3Cgcgggcgatctggcga_cccg3ggCgCg338gagaagta/tatgcgtattcgt420ccgtttgccttctacggcgtgtccacctgcaataccaccgaacaggataagctgtcgaaa480aacggctcctacccttccggacacacctctatcggctgggcgaccgccctggtgctagcc540gaaatcaacccgcagcgccagaatgagattctcaagcgcggctatgagctcggtgaaagt600cgggtgatctgcggttaccactggcagagcgatgttgacgccgcgcggattgtcggctcg660gcggtggttgcaaccctgcataccaatccggccttccagcagcagctgcaaaaagccaaa720gacgagtttgcgaaacagcgaaattag74权利要求1、一种蛋白，是如下(a)或(b)或(c)的蛋白质(a)由序列1自氨基末端第11-248位氨基酸序列组成的蛋白质；(b)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(c)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有磷酸转移酶活性的由序列1衍生的蛋白质。2、权利要求l所述蛋白的编码基因。3、根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述蛋白编码基因为如下l)或2)或3)或4)的DNA分子1)其编码序列是序列表中序列2自5'末端第31-747位脱氧核糖核苷酸所示的DNA分子；2)其编码序列是序列表中序列2所示的DNA分子；3)在严格条件下与l)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；4)与l)或2)限定的DNA序列具有90n/。以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。4、含有权利要求2或3所述基因的表达盒或重组表达载体。5、根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体为pMKL-c2x-所述pMKL-c2x-p力oC是将权利要求2或3所述基因插入pMKL-c2x的多克隆位点得到的重组载体。6、含有权利要求2或3所述基因的细胞系或重组菌。7、根据权利要求6所述的重组菌，其特征在于所述重组菌为￡aerobe/"IAM1183(pcphoC)、￡TBII(pcphoC)或￡c。7iBL21(DE3)(pcphoC);所述￡3erog朋esIAM1183(pcphoC)是将权利要求5所述的pMKL-c2x-p力oC质粒导入￡aarage/esIAMI183得到的；所述￡coh'TBII(pcphoC)是将权利要求5所述的pMKL-c2x-p力oC质粒导入￡TB1I得到的；所述￡co7iBL21(DE3)(pcphoC)是将权利要求5所述的pMKL-c2x-p力oC质粒导入￡co7iBL21(DE3)得到的。8、一种表达权利要求l所述的蛋白的方法，是培养权利要求6或7所述的重组菌，得到权利要求l所述的蛋白。9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述方法中，所述重组菌用0.3-lmMIPTG在5-25。C诱导5-10小时。10、权利要求1所述蛋白或权利要求6或7所述的重组菌在生产5'呈味核苷酸中的应用。11、根据权利要求10所述的应用，其特征在于所述5'呈味核苷酸是5'肌苷酸或5'鸟苷酸。全文摘要本发明公开了一种磷酸转移酶及其编码基因以及携带编码基因的表达载体和用该表达载体转化宿主得到的基因工程菌。本发明公开的蛋白为a)由序列1自氨基末端第11-248位氨基酸序列组成的蛋白质；b)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；c)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有磷酸转移酶活性的由序列1衍生的蛋白质。将上述蛋白基因与pMKL-C2X相连，可构建融合表达载体，转化不同宿主。本发明提供的磷酸转移酶和工程菌可用于生产5′呈味核苷酸，生产率和转化速率高，水解活性低，且最适pH值近中性。本发明技术具有很高的实际应用价值和广阔的工业应用前景。文档编号C12R1/01GK101560507SQ20081010408公开日2009年10月21日申请日期2008年4月15日优先权日2008年4月15日发明者翀张,来奇恒,程杨,赵洪新,邢新会申请人:清华大学