专利名称：：由木质纤维素制备含糖水解产物的方法
技术领域：
：本发明涉及可用于发酵过程的溶液或悬浮体，并且所述溶液或悬浮体是通过酶水解含木质纤维素的材料获得的，本发明还涉及它们的制备方法及其在制备有机目标产物的发酵中的用途。
背景技术：
：现在通过生物工程技术代替经典方法获得许多这些物质。在这些方法中，微生物在发酵过程中将供应的碳源转变成所需产物。然而，碳源成本限制了其商业范围。例如L-赖氨酸的制备成本中最大的一项是碳源。为此目的而最频繁使用的糖(例如葡萄糖或者蔗糖)的价格变化大，并且主要影响发酵过程的经济活力，特别是在为低成本大批量产物例如谷氨酸一钠、L-赖氨酸-HCl禾PL-苏氨酸的情况下，主要由竞争决定它们的市场(M.Ikeda,AdvancesinBiochemicalEngineeringABiotechnology,Vol.79(2003)2-35)。因此进行许多尝试以由合适的可更新原料获得发酵用合适的碳源。除了淀粉之外，还由葡萄糖单体形成纤维素并通过适当水解可以分解成这些单体。为此，需要淀粉降解不同的酶，这是由于它们是P-l,4-键连接的单体。纤维素是所有植物的基本细胞成分并因此是世界上最广泛的生物聚合物。含木质纤维素的杆是以农业废物获得的并且构成比为此特别生长的含淀粉植物便宜的水解用原料。然而，植物细胞壁由网络状筛孔纤维素、半纤维素和木质素组成。后者使得纤维素免受微生物攻击，它对植物的稳定性是重要的。纤维素的部分结晶结构还使酶降解性能复杂化。原则上这是可能的但是仅可以差的产率实现。至于工业利用，希望水解速度高且葡萄糖产率高。此外，可以使用水解产物作为发酵的碳源来获得精细化学品或乙醇。在R.Busch等的(Chem.Ing.Tech.78(2006)219-228)中可以发现目前在工业化学品生产中利用可更新原料领域的开发状态的概况。基于此，通过酸与水解酶的作用可以将纤维素和半纤维素转变成发酵产物。要解决的问题为了由含木质纤维素的原料获得发酵水解产物，这些原料，由于其网络状结构，因此在水解之前必需经过物理和化学预处理。含木质纤维素的原料理解为是指阔叶树和针叶树的木材例如玉米、黑麦、小麦、燕麦、大麦、高粱、油菜、稻的杆甘蔗。为了能够为化学物质与酶的作用提供较大的表面积，原料用磨粉机粉碎。所需粒径在0.5-10mm之间，优选0.5-5mm，特别是1-3mm。化学预处理使得半纤维素存在于溶液中并将木质素的交联芳香结构破碎。将部分结晶的纤维素结构溶解使得酶的攻击更容易实现。本发明的目的是提供一种水解形成并适宜作为发酵用碳源以制备有机目标产物的产品。它们包括具有至少1个氮原子的有机物和/或具有至少3个碳原子的有机物。所需化合物的己知实例有醇类、L-氨基酸、维生素、抗生素、核酸、蛋白质、酶和有机酸。L-氨基酸尤其包括L-赖氨酸、L-高丝氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸、L-脯氨酸、L-甲硫氨酸和L-色氨酸。
发明内容本发明提供了一种由含木质纤维素的材料制备含糖水解产物的方法，包括a)在水的存在下用选自由下面物质组成的组的化合物预处理所述含木质纤维素的材料硫酸、碱金属过硫酸盐，特别是过硫酸钾或过硫酸铵、过氧化钾、氢氧化钾，和b)除去水相并将所得产物洗涤之后，在水的存在下用适合水解的酶处理所述产物。该方法使用含木质纤维素的材料，即阔叶树和针叶树的木材，或者选自以下种类的植物的杆玉米、黑麦、小麦、燕麦、大麦、高粱、油菜或稻、甘蔗。为了使所用化合物获得较大的攻击面积，用已知方法将原料粉碎或磨碎。术语"含糖水解产物"包含下面的糖己糖类，例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖及它们的衍生物，例如葡糖酸、葡糖二酸或葡糖醛酸；或戊糖类例如木糖或阿拉伯糖及它们的衍生物。预处理的pH在1-14之间，优选根据所用化合物进行选择。酶水解通常在4-7的范围内，优选4.5-5.5pH的下进行。所用酶通常是纤维素酶，例如Novozyme的SpezymeCp(可商购获得)。就在酸性培养基中的预处理而言，使用浓度为0.5-5%，优选1-2%，优选1-1.5%的稀硫酸。。/。重量是以硫酸含量为基础(g/100g)。酸性杆悬浮体在有自生压力、温度80-150。C，优选90-140。C，优选100-130°C下的高压灭菌器中搅拌卯分钟。对于用KOH的处理，应相应地采用这些条件。所用氧化剂可以是碱金属过硫酸盐，特别是过硫酸钾和过氧化钾，浓度为0.5-5%。接着除去杆并优选重复洗涤以除去溶解的有毒物质。然后将洗涤过的杆用于水解并且最初以悬浮体形式倒入。所用酶在现有技术中为已知(WO2004/081185)。在接下来的酶水解中，纤维素酶复合物将纤维素链分裂成较小片段直到葡萄糖单体。酶(蛋白质)的量应是0.1-5g/ml，优选0.1-3g/ml，并应间隔几小时以相对小的份加入。最佳量取决于预处理所用的化合物。水解在温度30-70°C，优选40-65°，优选50-60°C下进行24h。pH应是3-7，优选4-6，优选4.5-5.5。接着，优选将仍然存在的固体除去。在适当浓縮之后，浓縮优选在减压下进行，成功地使用含葡萄糖的溶液作为发酵的碳源。通过用纤维素酶-酶复合物(Novozymes，丹麦)酶水解细碎玉米杆、黑麦杆和小麦杆(平均粒径1-3mm)己实验证实了本发明方法。水解产物在真空旋转蒸发器中浓縮然后经高压灭菌器灭菌。这种方式制得的小麦和玉米杆水解产物作为精细化学品的发酵制备的碳源的适应性采用在摇动烧瓶实验中用Bm^acteWwmy/avwmDM1730菌株(Georgi等2005)制备L-赖氨酸同时监控代谢活性的实例来证实。此外，出人意料地发现，采用水解产物的一些试验使得产品形成明显高于用标准葡萄糖溶液的对照试验的产品形成。本发明因此同样提供了一种权利要求1-3的方法，在该方法之后进行通过微生物发酵制备具有至少3个碳原子的或具有至少2个碳原子和1个氮原子的有机目标产物，所述微生物用于制备所述有机目标产物，其中使用本发明制得的含糖水解产物用作碳源。它可以任选由其它碳源补充。发酵之后，目标产物优选经分离，其任选与所有量或部分量的生物质一起被分离。发酵培养液通常预先以温和方式浓縮，即组分没有分解。在图1中，再现整个过程的顺序。在本发明的方法中，特别是制备选自如下的目标产物具有3-10个碳原子的单羧酸、二羧酸和三羧酸、蛋白原的和非蛋白原的L-氨基酸、饱和的和不饱和的脂肪酸；具有3-8个碳原子的二醇、具有3个或更多个羟基的多元醇、具有至少4个碳原子的相对长链醇、维生素、维生素原、具有3-10个碳原子的酮。目标产物尤其选自L-氨基酸和维生素，特别是L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苏氨酸、L-脯氨酸、L-异亮氨酸、L-高丝氨酸、L-缬氨酸、泛酸和核黄素、以及丙酸、丙二醇、丁醇和丙酮。微生物选自特别是产生L-氨基酸或维生素的那些，特别是选自产生L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苏氨酸、L-脯氨酸、L-异亮氨酸、L-高丝氨酸、L-缬氨酸、泛酸、核黄素、丙酸、丙二醇、丁醇、丙酮和海藻糖的微生物。产生性微生物应理解为是指产生所需目标产物至与野生型相比增加的程度并且可以排出它们的那些。微生物的发酵可以连续进行(例如PCT/EP2004/008882中所述)，或者以间歇过程(间歇培养)或以加料间歇过程或重复加料间歇过程间歇进行来产生目标产物。已知培养方法的总论可以在Chmid的教科书(Bioprozesstechnik1.EinfiihrungindieBioverfahrenstechnik[Bioprocesstechnology1.Introductionintobioprocesstechnology](GustavFischerVerlag,Stuttgart,1991))或者在Storhas的教科书(BioreaktorenundperiphereEinrichtungen[Bioreactorsandperipheraldevices](ViewegVerlag,Braunschweig/Wiesbaden,1994》中获得。所用培养基或发酵培养基必需以适当方式满足特定菌株的需要。不同微生物的培养基的描述在AmericanSocietyforBacteriology的手册"ManualofMethodsforGeneralBacteriology"(WashingtonD.C,、USA、1981)中。术语"培养基(culturemedium)"和"发酵培养基(fermentationmedium)"或"培养基(medium)"可以互换。所用碳源以及水解获得的糖，可以是其它糖和碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、得自甜菜或甘蔗生产的含蔗糖的溶液、淀粉、淀粉水解产物和纤维素、油和脂肪(例如大豆油、向日葵油、花生油和椰子脂)、脂肪酸(例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)、醇类(例如甘油、甲醇和乙醇)、和有机酸(例如乙酸)。这些物质可以单独使用或者以混合物使用。所用氮源可以是有机氮化合物(例如胨、酵母提取物、肉膏、麦芽提取物、玉米浆、豆粉和脲)、或无机化合物(例如氨、硫酸铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)，优选氨或硫酸铵。这些氮源可以单独使用或者以混合物使用。所用磷源可以是磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾、或者相应的钠盐。培养基还必须含有盐，例如以金属(例如钠、钾、镁、钙和铁)的硫酸盐的形式，例如硫酸镁或硫酸铁，它们是生长所需的。最后，除了上述物质之外，可以使用必需的生长因子例如氨基酸(例如高丝氨酸)，和维生素(例如硫胺素、生物素或泛酸)。而且，可以将特定氨基酸的合适前体加到培养基中。所用原料以单一混合物添加到培养物中或者在培养期间以合适方式加料。就培养物的pH控制而言，以合适方式使用碱性化合物例如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水，优选氨或氨水；或酸性化合物例如磷酸或硫酸。通常将pH调整至值6.0-9.0，优选6.5-8。为了控制泡沫的出现，可以使用消泡剂，例如脂肪酸聚乙二醇酯。为了保持质粒的稳定性，可以将合适的选择性物质，例如抗生素，加入到该培养基中。为了保持需氧条件，将氧或含氧气体混合物例如空气加到该培养基中。同样可以使用富含过氧化氢的液体。如果适当的话，在升压，例如0.03-0.2Mpa的压力下进行发酵。培养温度通常是20°C-45°C，优选25°C-40°C。在间歇过程中，连续培养直到形成最大的所需氨基酸。该目的通常是在10小时-160小时实现的。在连续过程中，可以进行较长的培养时间。其中，合适发酵培养基的实例可以在专利US5,770,409、US5，840，551和US5,990,350、US5,275,940或US4,275,157中找到。发酵培养基的其它实例可以在Ozaki禾口Shiio(AgriculturalandBiologicalChemistry47(7)，1569-1576,1983)和Shiio等(AgriculturalandBiologicalChemistry48(6)，1551-1558，1984)中找到。在一个优选实施方案中，发酵制得的产物是L-氨基酸，特别是L-赖氨酸。为了进行发酵，这里可以使用例如Pfefferle等，AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,Vol.79(2003)60-112禾口US3,708,395中所述的类似条件和步骤。本发明所用的微生物优选选自棒状杆菌属、杆菌属、埃希氏菌属、曲霉属、乳杆菌属，特别是选自产谷氨酸棒状杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌或黑曲霉的菌株。已知有许多预处理纤维素以强化水解产物的化学方法。然而，不是所有水解产物适合作为发酵用碳源。一种特别合适的方法是本发明的用硫酸或氢氧化钾和一些选择的氧化剂，例如过氧化钾或过硫酸钾的预处理。同样已显示这不是用氢氧化钠的碱预处理的情形(按照Varga等进行)Varga等，AppliedBiochemistryandBiotechnology,vol.98-100(2002)75-86、和用过乙酸、过氧化氢或次氯酸钠的氧化预处理的情形(按照WO2004/081185进行)、和组合使用氢氧化钠和硫酸的情形(2-步，按照Varga等)。可能形成毒性副产物，它防碍微生物的生长，这样也不形成产物。具体实施例方式已显示仅选择的预处理方法，例如使用硫酸或特别是氧化剂，获得可用作发酵过程的碳源的水解产物。实施例1.本发明预处理1.1硫酸使用浓硫酸发烟硫酸，96%)通过稀释制备1.2%溶液。将10g的磨碎的杆加入到钽高压灭菌器中并与500ml的上述稀酸混合。随着自生压力出现，将高压灭菌器加热至120°C。在该温度下，将杆悬浮体搅拌90min然后冷却。重复该操作，使得可以获得11的预处理过的杆悬浮体用于水解。1.2氧化剂将20g的杆悬浮于约800ml的软化水中。将氧化剂溶解在约200ml的软化水中并通过滴液漏斗慢慢加入到杆悬浮体中。精确用量的细节可以示于表1。滴加速度是约1滴/分钟以防温度上升过度。加入一结束，就接通恒温器并将该悬浮体加热至80°C。搅拌下(150rpm)，在该温度下将悬浮体保持24h。接着，用过氧化物测定棒或碘化钾-淀粉纸测定氧化剂的存在，并任选用催化量的硫酸亚铁(II)破坏。表l:<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>2.非本发明处理2.1碱(按照Varga等)使用NaOH丸制备11的1%溶液。将10g的磨碎的杆填充到一11Hastelloy高压灭菌器中并与500ml的上述稀氢氧化钠溶液混合。随着自生压力的出现，将高压灭菌器加热至120°C。该温度下，将杆悬浮体搅拌60min然后冷却。重复该操作，使得可以获得ll的预处理过的杆悬浮体用于水解。2.22-步(按照Varga等)室温下将20g的杆悬浮在1%氢氧化钠溶液，同时搅拌(150rpm)24h。接着，采用真空泵通过过滤器抽吸将杆过滤并用软化水重复洗涤。将杆悬浮在高压灭菌器内的P/。硫酸中并在120。C搅拌，出现自生压力lh。3.氧化剂(按照WO2004/081185)与本发明的预处理相同，只是使用不同的氧化剂(表2)表2:<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>4.酶水解将1和2中所述预处理过的杆悬浮体填充到61发酵罐中并用10mM柠檬酸盐缓冲液和10M氢氧化钠溶液或浓硫酸调整至pH5.0。将悬浮体在100rpm搅拌并加热至60°C，然后加入2ml(0.133g/ml的蛋白质)的SpezymeCp酶制剂(Novozymes，丹麦)。通过规则测定(regularmeasuments)葡萄糖浓度来对水解监控24h。之后，冷却使水解结束。5.发酵5.1标准通过Keilhauer等的配方(J.Bacteriol.，Vol.175(1993)5595)制备含纯葡萄糖的Cgxn标准培养基，其中葡萄糖含量降低(参见表3)并在高压灭菌器中灭菌。将含氮盐单独溶解在软化水中并在高压灭菌器中灭菌。生物素和原儿茶酸母液不经热灭菌但是新鲜补充并通过无菌过滤器(孔径0.2pm)添加到培养基中。5.2水解产物使用该水解产物制备按照Keilhauer等对CgXII培养基的配方的培养基。所用碳源是其中溶解有营养盐的浓縮水解产物。为了对比，制备含纯葡萄糖的标准培养基。所有培养基中的葡萄糖浓度经过调整使得在灭菌之前全都具有相同的浓度。然而，灭菌之后，它们可能不同。表3:CgXII培养基(按照Keilhauer等，1993，改进过)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>预培养将一无菌可密封的试管填充2ml的标准培养基，从平板接种Brevibacteriumflavum菌株DM1730的细菌培养物(Georgi等VF(2005)Metab.Eng.A(4):291-301)并在加热室内于31。C培养。24h之后，使用该预培养物接种摇动烧瓶。为此，在600nm的波长下测定该预培养物的OD(光密度)，然后用无菌水稀释至所需OD。5.4主发酵为了测定代谢活性，用RAMOS系统(得自HiTecZang，Herzogenrath)进行发酵。它模拟传统摇动烧瓶中的生物法。它记录氧转移速度(OTR)、二氧化碳转移速度(CTR)和呼吸系数(RQ)的分压测定获得的数据，并在连接的计算机设备中将它们绘图。Ramos烧瓶的液体体积必须不超过10ml，并且估量1%的体积用于接种。这样产生100pl的接种物，将其加入到9.9ml的培养基中。将烧瓶填充，称重并固定在摇动器中。检测漏气和氧校准之后，开始测定。参考计算机记录的数据，监控代谢活性的图谱。总是以双份测定进行测量。发酵结束之后，测定OD、葡萄糖含量和氨基酸含量。记录了标准培养基和三种水解产物的OTR曲线(AK硫酸、AK氢氧化钠溶液、过氧化钾)。该标准培养基含有纯葡萄糖并用于比较曲线图谱。约12h之后，标准培养基中的葡萄糖已消耗并且细菌死掉。硫酸培养基中的细菌的生长明显滞后于标准培养基的。显示有抑制剂存在，它造成较长的滞后阶段(适应阶段)。细菌在进入生长阶段之前首先必需使它们的代谢适应这些条件。然而，它们的生长速度仅仅和标准培养基中的一样高。这些抑制剂可能是糖醛和5-羟基甲基糖醛，它们是在糖的酸处理过程中形成的。己知它们为发酵抑制剂。15h之后，曲线中可以看到一个肩峰(shouler)。它表示两度生长。这里，细菌将其代谢转到其它碳源；结果，代谢活性最初保持恒定。氧化预处理的培养基使得早期生长等同于标准培养基中的并且生长速度也相同。10h之后，在曲线图谱中同样可以看到一个肩峰。第二次出现在14h之后。这意味着谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)对存在于水解产物中的除了葡萄糖之外的其它碳源代谢。对得自半纤维素的其它糖而言，它们也可以是糖衍生物。一种假设是葡糖酸，它是在通过水解最初形成的葡糖酸-o-内酯来氧化葡萄糖时形成的。葡糖酸是谷氨酸棒杆菌代谢的中间体并且因此可以从培养基中排放到代谢路径中。从半纤维素中释放的乙酸酯可以经谷氨酸棒杆菌共代谢。这意味着它与葡萄糖同时被利用，代谢没有交换。因此乙酸酯不引起任何两度生长。得自水解缓冲液的柠檬酸盐同样可以被谷氨酸棒杆菌利用。在用NaOH预处理的水解产物中，由于代谢活性完全被抑制，因此一种物质显示对细菌有毒。5.5L-赖氨酸的制备表4列出了使用本发明制得的水解产物测定的发酵结果。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>其它材料*20§的玉米杆、2ml的酶其它61g的小麦杆、40ml的酶200810095935.7转溢齿被12/1555表5含有使用不是按照本发明制得的水解产物获得的结果。发现，即使发酵培养液含有葡萄糖，也不能代谢制备L-赖氨酸。该事实证实必需保持特定条件才能制备可利用的水解产物。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>其它材料*=20经的玉米杆、2ml的酶;其它61g的小麦杆、40ml的酶图1中给出了本发明方法各步骤的流程图。权利要求1.由含木质纤维素的材料制备含糖水解产物的方法，包括a)在水的存在下用选自由下面物质组成的组的化合物预处理所述含木质纤维素的材料硫酸、碱金属过硫酸盐，特别是过硫酸钾或过硫酸铵、过氧化钾和氢氧化钾，和b)除去水相并将所得产物洗涤之后，在水的存在下用适合水解的酶处理所述产物，其中所述水解产物适合作为发酵用碳源。2.权利要求1的方法，其中所用含木质纤维素的材料是阔叶树和针叶树的木材。3.权利要求1的方法，其中所用含木质纤维素的材料是选自以下种类的植物的杆玉米、黑麦、小麦、燕麦、大麦、高粱、油菜或稻、或甘声。/"、、o4.权利要求1-3的方法，其中硫酸或碱金属过硫酸盐在1-3的pH下使用。5.权利要求1-3的方法，其中过氧化钾或氢氧化钾在9-12的pH下使用。6.权利要求1-5的方法，在所述方法之后进行如下过程通过微生物发酵制备具有至少3个碳原子的或具有至少2个碳原子和1个氮原子的有机目标产物，所述微生物用于制备所述有机目标产物，其中使用本发明制得的含糖水解产物作为碳源。7.权利要求6的方法，其中，发酵结束时，所述目标产物被分离，其任选与发酵期间形成的所有或部分生物质一起被分离。8.权利要求6或7的方法，其中制备选自以下物质的目标产物有机的任选带有羟基的具有3-10个碳原子的单羧酸、二羧酸和三羧酸、蛋白原的和非蛋白原的L-氨基酸、饱和的和不饱和的脂肪酸；具有3-8个碳原子的二醇、具有3个或更多个羟基的多元醇、具有至少4个碳原子的相对长链醇、维生素、维生素原、具有3-10个碳原子的酮。9.权利要求6或7的方法，其中制得的目标产物选自L-氨基酸和维生素，特别是L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苏氨酸、L-脯氨酸、L-异亮氨酸、L-高丝氨酸、L-缬氨酸、泛酸和核黄素、以及丙酸、丙二醇、丁醇和丙酮。10.权利要求6或7的方法，其中所述微生物选自超量产生L-氨基酸或维生素的微生物，特别是选自超量产生L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苏氨酸、L-脯氨酸、L-异亮氨酸、L-高丝氨酸、L-缬氨酸、丙酸、丙二醇、丁醇、丙酮和海藻糖的微生物。11.权利要求6或7和IO的方法，其中所述微生物选自棒状杆菌属、杆菌属、埃希氏菌属、曲霉属、乳杆菌属和梭菌属，特别是选自产谷氨酸棒状杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌或黑曲霉的菌株。全文摘要本发明涉及由木质纤维素制备含糖水解产物的方法。具体地说，本发明涉及可用于发酵过程的溶液或悬浮体，并且所述溶液或悬浮体是通过酶水解含木质纤维素的材料获得的，本发明还涉及它们的制备方法及其在制备有机目标产物的发酵中的用途。文档编号C12R1/185GK101353672SQ20081009593公开日2009年1月28日申请日期2008年4月25日优先权日2007年4月26日发明者A·卡劳,M·V·菲尔霍,M·马伊申请人:赢创德固赛有限责任公司