耐高温强碱的克劳氏芽孢杆菌、分泌的蛋白酶及制备的利记博彩app

专利名称：：耐高温强碱的克劳氏芽孢杆菌、分泌的蛋白酶及制备的利记博彩app耐高温强碱的克劳氏芽孢杆菌、分泌的蛋白酶及制备发明领域本发明涉及微生物发酵及其产物酶领域。具体的说，本发明涉及一种耐高温耐盐碱的克劳氏芽孢杆菌(Ac27/mc"/7)、分泌的蛋白酶及其生产制备方法。
背景技术：
：碱性蛋白酶在工业上具有巨大的应用潜力，如洗涤剂、皮革制造、食品加工、制药以及废物处理等工业中，碱性蛋白酶取代传统化学试剂能显著改善产品品质、节约成本，消除制革等工业污染物，减轻对环境的污染，并在工业应用中具有举足轻重的作用。为了得到有工业价值的碱性蛋白酶，最近对来源于极端环境下的耐碱菌抹展开了深入的研究，经研究可分离得到具有良好的热稳定性、抗氧化性和广泛pH耐受性的碱性蛋白酶，从而可以满足工业需要，促进工业的快速发展。几十年来国外在不断选育新菌种，美、日、印等国学者对来源于极端环境下的嗜碱微生物进行了深入的研究，经分离得到了具有良好的热稳定性、抗氧化性和广泛pH耐受性的酶。1999年UUam等从水样中分离得到一林芽孢短杆菌，分泌的胞外酶最适水解pH为10.5,最适水解温度为37°C,50°C、60。C的半衰期分别为60小时、70小时(〃〃<3/CA<3/7^/5s/2eryee，va乂'es力Jwrari^//，Jz//，v^/m/5b"/.1999,35:213-219)。2001年/o力"Mi7/等报道从嗜碱菌林w.JB-99中分离得到一种耐热的石咸性蛋白酶，酶作用的最适温度为70°C(及/o力/^es/力A7^/1户r(9cei"51A/(9c力e/z7/5^r/,2001，37:139-144)。2002年Kanekar等报道了两抹从碱性湖泊中分离得到的产碱性蛋白酶菌抹Ara/z7^〃s和及a/cs/o/^//^,它们在65。C下分泌的蛋白酶的最适pH分别为11和10,在碱性范围内水解蛋白质的能力都十分的稳定(￡3/7ehr尸户，o尸a/;<3///^7/c6a"e".a7W<3/e^//>咖<2/h///e/ale//7/7o7a.j9/ore5^z/rce7bc力/7o/c^/,2002,85:87-93)。2003年Joo等报道了一林从韩国西海仁川港口的淤泥滩中筛选得到的嗜碱克劳氏芽孢杆菌(勘"7/Mc/a^//)I-52,其外分泌的碱性蛋白酶的最适pHll,最适温度60。C,在氧化剂和SDS存在的条件下具有极高的稳定性，用5^SDS和10°0202处理72小时仍可分别保持原来酶活的75%和110°/。以上(/oo，仗X，Ji/厠r，C《，"C.，51AC力a/7Aftr/A/7/1<3/^57^—〃aWe/7rofes5"e/>咖勘c///〃51c/aw〃27/—/ltc^wc〃朋a/dso爬;r。;7er〃e51./owmg/oTWcr06/(/0^7，2003，95:267-272)。该菌株只能在碱性条件下生长，菌株分泌的蛋白酶为碱性蛋白酶，在碱性下具有较大的活性，最适pH分别是pHll和10.5。2006年NedraElHadj-Ali等报道了一抹地衣芽孢杆菌NHl,分泌的胞外碱性蛋白酶的最适温度为65-70。C,在pH7-ll具有很好的稳定性，最适pH为10-11,该酶是一个Ca离子稳定酶，对工业洗涤剂具有突出的稳定性和相容性GVeA5W￡9/70"/，j9/oa/e/b/ca/<9/7<^/zzo/ecw/arc力arac,er/za/7<9"ofsG^/e/^e/7fs/"s6/ea/j^2/2'/7eser/we—profease<3/e『/y/so/afed40(4):515-523)。黄红英等报道一抹从皖北盐碱地土样中分离得到的地衣芽孢杆菌011，分泌的胞外碱性蛋白酶的最适温度为60°C,最适pH为9.O(黄红英，方海红，刘爱民，夏颍，吕正兵，张林普一抹地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究I.微生物学通报2001，28(5):20-24)。彭东等报道的地衣芽孢杆菌B.LJF-ld最适反应温度为55°C，最适pH为10.5，具有较高的热稳定性，对SDS有较强的耐受性(彭东，王忠彦，胡承，胡永松地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究II碱性蛋白酶的提纯和性质研究工业微生物2000,30(4):37-40)。f76r/o;z;e"c力"/bn'/瓜"菌株产生碱性蛋白酶的最适温度为6(TC,最适pH高达12以上，对表面活性剂和氧化剂具有较好的稳定性，对各种洗衣粉具有良好的协同性(梅承芳，江晓路，牟海津，王鹏盐湖高产性性蛋白酶菌的选育育和产酶条件研究，中国海洋大学学报自然科学版2005,35(4):613-617)。随着对极端环境微生物的研究，所获得的蛋白酶的酶学特征越来越优越。由于SDS和氧化剂等是洗涤剂中的主要成分，因而不仅要求所添加的蛋白酶能在高碱条件保持较高的活性，也需要其对SDS和氧化剂等具有极端的稳定性。近两年来，对SDS和氧化剂等具有稳定性的蛋白酶及其生产菌抹进行筛选研究，国外从2003年Joo报道一抹能分泌对SDS和氧化剂具有稳定性的蛋白酶的菌抹后，不断有文献报道新的抗SDS和氧化剂的蛋白酶。国内也初步研究报道能分泌对SDS和氧化剂稳定的蛋白酶的菌抹，但是抗氧化性和抗SDS的性能不高，国产碱性酶的主要酶学性质难以满足洗涤工业发展的需要，不具有大规模的工业开发潜能，大规模工业碱性酶的来源主要依赖于国外进口。因此，我国对极端微生物的开发其及碱性蛋白酶的研究需要不断的深入。而深海、碱湖、沙地、盐碱地等强碱高盐环境中蕴藏着独特性质的微生物，其分泌的碱性蛋白酶将具有优良的热稳定性和pH稳定性，利用微生物的极端耐受性，研究开发极端微生物分泌的蛋白酶，从而找出一种能分泌具有良好酶学特性并适用工业生产的碱性蛋白酶菌抹具有重要的理论意义和应用价值。
发明内容由于新疆广阔的盐碱地蕴藏着丰富的耐高温耐强碱微生物。研究新疆极端微生物不仅有助于扩大极端微生物资源库，也有利于新疆特殊环境微生物的开发和利用，从而为工业生产提供高活性高稳定性的酶来源。本发明从新疆吐鲁番地区的工厂废水中:f又样，筛选出一4朱耐高温耐强石威的细菌，该菌4^能外分泌碱性蛋白酶，该酶具有良好的热稳定性和pH稳定性，对SDS和氧化剂具有极端的稳定性和相容性，并且碱性蛋白酶的生产已经建立初步的发酵条件，为该菌林的碱性蛋白酶的开发应用奠定了理论基础。本发明提供了一种耐高温耐强碱的克劳氏芽孢杆菌抹(c/a^/7)、其外分泌的蛋白酶及其生产方法。所述的碱性蛋白酶与常规碱性蛋白酶比较，在高温强碱条件下可发挥较高的蛋白酶活性。本发明根据新疆的地理环境的特殊性，从新疆典型的盐碱水样中进行微生物菌种的培养、分离与筛选，获得一批耐高温耐盐碱微生物菌抹，并从中分离筛选出高温碱性蛋白酶产生菌抹，编号为XJU-5,从而提供了一抹高温碱性蛋白酶产生菌，其具有生产高温碱性蛋白酶的优良特性，经微生物学分类与鉴定，属于克劳氏芽孢杆菌(勘c///^c/sww7)。本发明还提供了高温碱性蛋白酶，通过利用本发明的菌林经过本发明确定的具体发酵工艺而获得，该菌林提供的酶制剂不仅仅限于高温碱性蛋白酶一种产物。同时，本发明还提供了一种高温碱性蛋白酶基因，通过克隆表达该高温碱性蛋白酶基因，并在宿主细胞大肠杆菌DH5cc中稳定保存。本发明具体提供了一种高温碱性蛋白酶生产菌株，命名为XJU-5，其能够产生高温碱性蛋白酶。参照《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》(《》e/^ej^s他/7ws/0/5y^e鹏"cA<^er/o-/^》〉)第九版和《常用细菌系统鉴定手册》等对XJU-5菌林进行形态学测定，生理生化检测、G+C含量测定，确定XJU-5菌林为克劳氏芽孢杆菌林(勘c/〃mcA3w//)中的成员。16SrRNA同源分析、系统发育分析和细胞脂肪酸组分分析结果都表明XJU-5菌抹为克劳氏芽孢杆菌(勘"7/"sc7<sm//)，以下简称及c/sm//XJU-5。该菌才朱已于申i貪日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，邮编100080，保藏日期是2006年7月31日，保藏号是CGMCCNo.1768。该菌抹培养温度38。C，最适培养温度42.5°C;优先生长于牛肉膏培养基表面(培养基组分[g/ml]为0.5%牛肉膏、1%蛋白胨、l%NaCl、1.8°/。琼脂粉)，38。C下培养10-18小时可获得单菌落。菌落小，呈黄白色、粘稠、扁状、边缘不整齐、不透明。该菌株不具有运动性、兼性好氧且产生棒状孢子(分别是0.7-0.85x2.5-5.O,)的革兰氏阳性芽孢细菌，孢子膨胀且在细胞中央。透射电镜结果表明，菌抹XJU-5不具有孝便毛和荚膜。水解淀4分、吐温80、吐温60、吐温40和吐温20,可使凝胶液化、发生硝酸和亚硝酸还原，接触酶和氧化酶实验均呈现阳性，且产果胶酶和脂酶。而VP反应(pHlO.5)、吲哚产生实验均呈阴性。有比较广泛的酸碱pH耐受范围(pH5-14),最适pH是10。该菌抹可耐盐范围分别是0-20%(w/v)NaCl(pH10)。由以上实—险结果表明，XJU-5是极端耐碱、兼性耐酸和耐盐的细菌，最突出的特点是生长范围广泛，可分别在0-20%的NaCl浓度、pH5.5-13.6、4-86。C的条件下生长，同时该菌林可在pH13和80。C的双重胁迫条件下生长。及"馬/ZXJU-5的G+Cmol。/。为43.35%,通过BLAST同源比对，XJU-5的16SrRNA序列与及c/a蹈7种的16SrRNA序列的相似性最高，XJU-5的脂肪酸成分主要是15:0的不饱和脂肪酸。本发明通过及c"^/iXJU-5发酵获得的碱性蛋白酶具有良好热稳定性，最适温度是75。C,30-80。C培育2小时能分别保留原来酶活的90%以上。该酶的最适pH是10.5,具有广泛的pH稳定性，在pH10-13条件下分别培育100分钟能保持原来酶活的90%以上。本发明的蛋白酶还是一种对SDS、H202、7WM/Lf-100稳定的酶，用1°/。SDS、1°織、l订ritonX-lOO处理48小时后能分别保持原来酶活的262.2°/。、117.5%、102.5%，这一性质在工业上具有4艮重要的开发潜能。本产品已具备规模工业化生产能力，通过对发酵培养基及发酵工艺参数的优化，选用廉价普通的营养成分，采用常规单批发酵方式，发酵酶活达65U/ml。参见附图2。本发明还提供了碱性蛋白酶的基因，其序列与勘c///^m.的热稳定碱性蛋白酶基因的同源性高达99%，明显的基因差别在于本发明的碱性蛋白酶基因序列的891、1039、1070、1233位,分别是A/G、A/G、A/T、C/T。与将该基因转入基因克隆表达的常用基因宿主细胞-大肠杆菌DH5ot中，并在其体内稳定遗传和保存。进一步将该基因构建到表达载体pET30a(+)上，本领域普通技术人员已知该载体含有组氨酸标签，能够快速纯化克隆表达的外源蛋白，从而获得高纯度的高温碱性蛋白酶，为工业化大规模生产纯化该碱性蛋白酶奠定基础。本发明建立菌种筛选、鉴定、保藏、复壮及选育的系统工艺流程技术。一.菌种筛选从新疆吐鲁番的工厂未处理废水中取样，涂布于含有2.0%小麦秸、0.2%NH4N03、0.2%K2HP04、0.02°/。MgSO4.7H20、0.5%酵母膏(g/1)的琼脂培养基(pH10.5),37。C下培养18小时从而得到单菌落，用接种针挑取单菌落画线接于上述固体培养基中纯化菌种。二.菌种鉴定A.生理生化冲企测根据《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》(《&rge,s他/2ua/of分We鹏〃c勘"e,/o-/og7》)第九版及&e^力"aA(1986)a/"yK/ehe""<3人(1995)等人的方法，对菌抹的形状、大小、生理生化反应进行检测，本发明的高温碱性蛋白酶微生物菌种及c/ww'/XJU-5,其生物学特性如表l所示表l<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>B.G+C含量测定采用反相高效液相色谱法进行G+C含量测定，具体方法参照林万明的《细菌分子遗传学分类鉴定法》。本发明的高温碱性蛋白酶微生物菌种及chw//XJU-5的G+Cmoiyo为43.35%。C.16SrRNA序列分析利用细菌16SrRNA的通用引物Pl:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3';P2:5'AAGGAGGTGATCCAGCCGCA3'。PCR扩增得到1500bp左右的产物，用DNA片段回收试剂盒回收产物。由T^T^^/>司完成DNA序列测定，测序反应采用双脱氧核甘酸《连终止法原理，在ABIPRISMTM377DNASequencer全自动序列4义上进行电泳和读序。本发明的高温碱性蛋白酶产生菌Ac/薦2'/XJU-5,其16SrRNA序列如下:1cttccgatacggctaccttgttacgacttcaccccaatcatttgtcccaccttaggcggc61tggctccataaggttgcctcaccgacttcgggtgttacaaactctcgtggtgtgacgggc121ggtgtgtacaagacccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcaa181ttccggcttcatgcaggcgagttgcagcctgcaatccgaactg卿"ggcttUtggga241ttggcttcacctcgcggtttcgctgccctttgUccatccattgUgcacgtgtgtsigcc301caggtcaitaaggggcatgatg"ttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccgg361cagtcaccttagagtgcccaactcaatgctggcaactaagatcaagggttgcgctcgttg421cgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcact481ttgcccccgaaggggaagcccaatctcttgggtggtcaaagg"gtcaagacctggtaag541gttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaxtgcttgtgcgggtccccgtcaa601ttcctttgagUtcagccttgcggccgtactccccaggcggagtgcttaatgtgttaact661tcggcactacgggcatcgaaacccctaacacctagcactcatcgtttacggcgtggacta721ccagggtatcUatcctgtttgctccccacgctttcgcgcctcagcgtcagttacagacc781agagagtcgccttcgccsictggtgttcctccacatctctacgc"Ucaccgctacacgt841ggaattccactctcctcttctgcactcaagctccccagtttccaatggccgctcggggtt901gagccccgagatttcacatcagacttaagaagccgcctgcgcgcgcttt￡icgccca"aa961ttccggacaacgcttgccacctacgtatUccgcggctgctggcsicgtagUagccgtgg1021ctttctggtgaggt￡iccgtcaaggtaccgccctattcgaacggtaccgcttcttccctca1081caacagagctttacgaxccgaaggccttectcactcacgcggcgttgctccgtcagactt1141tcgtccattgcggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcag1201tcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggctaegcatcgttgccttggtaagccgtt1261accttaccaactagctaatgcgccgcgggcccatcccctagtgaUgccga￡igccatctt1321tcaccctctctccaggtggsig譜ggg"tateeggtattagetceggttteceggagtt1381atcccagtctaaggggC3ggttgcccacgtgttactcacccgtccgccgctaaegtcegg1441gagcaagctcccttctgtccgctcgacttgcatgt"taggcacgccgccagcgttcgtc该基因在Ce/^/^申报注册，其收录号为AY959330。进行BLAST比对分析，该序列与勘c///^c/a"w'/的同源性最高，为99%，根据相邻连接方法构建系统进化树参见附图1所示。D.细胞脂肪酸组分和含量分析提取细菌脂肪酸，使用美国MIDI公司5Ter/oci:全自动细菌鉴定系统对该菌体脂肪酸成分进行分析，具体方法依照仪器说明进行操作。本发明的高温碱性蛋白酶产生菌及c/犯W/XJU-5,其细胞脂肪酸组分和含量见表2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>通过以上的生理生化检测、G+C含量测定，16SrRNA同源分析、系统发育分析和细胞脂肪酸组分分析，各项实验结果都可以表明XJU-5菌抹为克劳氏芽孢杆菌抹(&c27/i^c/aws//)中的成员，从而可以精确的将本发明的XJU-5菌林分类为克劳氏芽孢杆菌(勘c/7/mc"m2'/)，也建立了分类鉴定微生物的一种可靠、准确的途径。三.菌种保藏利用低温保存法，无菌条件下将80%菌液和20%甘油混合，菌种保存于-80°C的超低温冰箱中。四.菌种活化取保存菌种液，緩慢融化取少量接于固体牛肉膏培养基上，在适合菌抹生长的温度下培养一定时间后，连续活化数次，可进行菌株其它实验的测定。五.菌种复壮在测定酶活性前，确定了一套保持产酶特性稳定菌株筛选的流程。首先按(四)步骤活化菌种，然后在筛选培养基中接种活化好的菌并进行培养，检测菌抹周围的透明圈大小，选取优良菌林接种于斜面培养基上培养，并将此菌株作为生产菌林使用。本发明还具体提供一种高温碱性蛋白酶的生产方法，其包括(一)对克劳氏芽孢杆菌及c/a^/2'XJU-5CGMCCNo.1768进行菌种活化培养步骤；(二)利用如上步骤获得的活化菌种进行发酵步骤；(三)发酵后的纯化提取步骤。具体的，本发明在发酵罐发酵工艺上，采用常规单批发酵方式，发酵酶活达65u/ml,如果能够采用连续发酵，发酵酶活将达到150-200U/ml。在发酵过程中，培养基是发酵工艺的基础。本发明在实验中，利用摇瓶发酵对发酵培养基进行筛选与优化，并对菌种活性进行检测。本着高产率、低成本的原则，在实验室的基础上进行了培养基筛选和优化的工业化中试研究。本发明的及c/犯w'iXJU-5对培养基的营养源并无特殊要求，用于微生物培养的常规碳源、氮源就可以满足其发酵生产高温碱性蛋白酶。及c/aws//XJU-5菌林可以葡萄糖、蔗糖、玉米粉、淀粉等作碳源，生长并产酶，其中以葡萄糖为碳源时菌体生长最快，但是没有加入碳源时酶活最高。利用蛋白胨、酪蛋白、尿素等可作为氮源使用，但蛋白胨为最佳产酶氮源，无机氮源对产酶具有降低的作用。金属离子对发酵有一定的作用，Mg、K离子对产酶具有促进作用，选4奪加入0.01%和0.05%的Mg和K离子。综合最适碳源氮源实验，选择最优化的产酶培养基，可使生产菌抹达最大的产酶量。培养基灭菌后采用灭菌的10%碳酸钠溶液将灭菌后培养基的pH调至发酵所需的值。本发明的发酵过程中，选择摇瓶种子培养将活化好的克劳氏芽孢杆菌Ac/at/s//XJU-5菌林挑取一环接种于装有150mL种子培养基的500mL摇瓶中，置于"。C、M0r/min摇床上培养16h,将摇瓶种子以2%的接种量接入发酵罐上进行了连续5批次的发酵实验，可获得稳定的发酵酶产量，从而确定了发酵温度3643。C,优选发酵温度42.5°C,溶氧控制始终在大于30%饱和氧度，通过补加浓氨水和4mol/LHC1溶液控制pH值。搅拌速度250r/min、发酵罐维持0.lMPa、发酵周期48-72h,平均发酵酶活可达50U/mL以上，最高发酵酶活可达65U/mL。本发明将发酵得到的培养液在12000rpm,4。C下离心30min,弃去沉淀，上清即为粗酶液，采用石克酸铵分级沉淀透析、1.5倍的丙酮沉淀、羧曱基纤维素CM-52层析、化/7A^e义^100层析分离等，可进一步分离制得酶制品，获得300u/ml-350u/ml的液体酶制剂，产品质量符合国家相关行业标准Q/GB1805.3-93。本发明还对碱性蛋白酶的酶学性质进行研究，以确定该发明的蛋白酶是否具有工业应用潜力和价值。本领域普通技术人员已知，高温碱性蛋白酶的反应温度较高，一般反应温度40-60。C。本发明同时提供了利用耐高温耐强碱的克劳氏芽孢杆菌林及c"ww7XJU-5获得的蛋白酶，其不仅具有一般碱性蛋白酶的特征，还是一种具有良好热稳定性的碱性蛋白酶，最适温度是75。C,30-8(TC培育2小时能分别保留原来酶活的90y。以上，85。C培育2小时保留原来酶活的65%，可使高温碱性蛋白酶的应用温度升高20°C。该酶的最适pH是10.5,具有广泛的pH稳定性，在pH10-13条件下分别培育100分钟能保持原来酶活的90%以上。对SDS、H202、7y〃朋I-100具有极强的稳定性，用1°/。SDS、1°歸2、l订ritonX-100处理48小时后能分别保持原来酶活的262.2%、117.5%、102.5%。Cu2+、Fe2+，Mn2+能够提高酶活，Zn"对酶活性没有多大的影响，Mg2+、Co"反而使该酶酶活降低。本产品已具备规模工业化生产能力，通过对发酵培养基及发酵工艺参数的优化，在发酵醪液中富集酶分子，并利用酶分子的物化性质进行产物分离。本发明同时具体提供了一种高温碱性蛋白酶基因克隆表达的技术路线(一)引物设计、PCR扩增高温碱性蛋白酶基因并回收根据出发菌抹克劳氏芽孢杆菌及c/,//XJU-5(CGMCCNo.1768)的16SrRNA序列同源性，序列比对找出相似的碱性蛋白酶基因序列，利用尸r/z/7er5程序设计高温碱性蛋白酶基因的PCR引物。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶检测有一条大约1500bp特异性条带，参见附图7,采用DNA片段回收试剂盒回收该片段，具体操作过程属已公知技术。(二)PCR产物的T克隆测序将上述回收得到的产物通过连接酶作用，与购买于7^h^2的pMD19-T载体相连，转入到大肠杆菌DH5a,利用蓝白斑筛选阳性转化子，提取阳性转化子的质粒，酶切和PCR双重鉴定转入的为克隆得到的高温4^性蛋白酶基因，酶切和PCR结果都符合预期片段大小的为高温碱性蛋白酶基因的阳性转化子，参见附图7。由7^Js^公司完成质粒DNA序列测定，测序反应采用i^/^er双脱氧核甘酸链终止法原理，在ABIPRISM377DNA《e^7e/2cer全自动序列仪上进行电泳和读序。得到的高温碱性蛋白酶基因序列如下'；TGTTGTTTGATTGGCA该序列共有1376bp,开放阅读框从190-1255bp，在NCBI上进行BLAST比对分析，其序列与勘c/7/mm.的热稳定碱性蛋白酶基因的同源性高达99%,明显的基因差别在于本发明的碱性蛋白酶基因序列的891、1039、1070、1233位，分别是A/G、A/G、A/T、C/T。本发明的高温碱性蛋白酶基因序列与勘c///^力a/o^/ra^C-125的胞外碱性丝氨酸蛋白酶基因、飽"'/7ws的丝氨酸蛋白酶基因AprM也有很高的相似性，除同样具有上述四个位点的区别外，本发明的蛋白酶基因在197位为C,而勘"77mAs/M"ra/^C-125的胞外碱性丝氨酸蛋白酶基因、勘c/7/m^的丝氨酸蛋白酶基因AprM都为T,本发明的蛋白酶基因的424位为G，而Ac27/m力a/o^rs/LyC-125的胞外碱性丝氨酸蛋白酶基因为A。本发明的碱性蛋白酶的蛋白的序列如下1MRQSLKVMVSSTVALL腿NPAAASEEKKEYLIVVEPEEV41SAQSVEESYD丽IHEFEEIPVIHAELTKKELKKLKKDPN81VKAIEENAEVTISQTVPWGISFINTQQAHNRGIFGNGARV121AVLDTGIASHPDLRIAGGASFISSEPSYHDNNGHGTHVAG161TIAAL丽SIGVLGVAPSADLYAVKVLDRNGSGSLASVAQG201IEWAI丽NMHIINMSLGSTSGSSTLELAVNRANNAGILLV241GAAGNTGRQGVNYPARYSGVMAAAAVDQNGQRASFSTYGP281EIEISAPGVNINSTYTGNRYESLSGTSMATPHVAGVAALV321KSRYPSYTNNQIRQRINQTATYLGSPSLYGNGLVHAGRAT361Q*在NCBI上进行BLAST比对分析，该蛋白属于蛋白酶S8家族，分子量为38046道尔顿，与fe"7/MA5/^/wrs/LyC-125的胞外碱性丝氨酸蛋白酶、勘c/7/〃i^/7.的丝氨酸蛋白酶Jpr,勘c27/mm的热稳定碱性蛋白酶都有98°/。的相似性，与勘c/7/〃i"j氾W的高碱性丝氨酸蛋白酶有95%的同源性。碱性蛋白酶基因序列和蛋白序列的同源比对结果与本发明的碱性蛋白酶的热稳定性的特征相结合，可以确定本发明的蛋白酶是一种热稳定的碱性丝氨酸蛋白酶，并命名为HAPl(thermostablealkalineprotease)。本发明的石咸'I"生蛋白酶基因及蛋白序列并在^e/2勘d上申报注册，收录号为DQ868543。(三)构建高温碱性蛋白酶基因的载体有关技术人员所熟知，为了高效表达外源基因需要将获得的酶基因连接到高效表达载体。本发明中将高温碱性蛋白酶基因连接到pET-30a-c(+)载体上进一步表达。通过实施本发明具体的技术指标，实现本
发明内容，可以达到以下有益效果。A、定向筛选到Ac/s^2'2'XJU-5高温碱性蛋白酶高产菌林经鉴定为克劳氏芽孢杆菌(5ac/7/"sc/a"w7，及c/犯s//),该细菌为极端耐石成、兼性耐酸和耐盐的细菌，最突出的特点是生长范围广泛，可分别在0-20%的NaCl浓度、pH5-13.6、温度4-86。C范围内生长，并可在pH13和80。C的双重胁迫条件下生长，菌株还具有外分泌淀^f分酶、脂酶和果胶酶的能力。B、通过本发明优选实施方案，确立及c^m//J7&5生产菌林稳定的发酵工艺，以常规单批发酵方式，发酵酶活达65u/ml，以连续发酵，发酵酶活将达到200-300U/ml,产品质量符合国家相关行业标准Q/GB1805.3-93。C、克隆得到了本发明的碱性蛋白酶的基因，并在常用基因宿主细胞-大肠杆菌DH5a中稳定遗传和保存。进一步将该基因构建到基因表达载体pET30上，本领域普通技术人员已知该载体含有组氨酸标签，能够快速纯化克隆表达的外源蛋白，从而获得高纯度的高温碱性蛋白酶，为工业化大规模开发生产该碱性蛋白酶奠定基础。附图简要说明图1所示为系统进化树的图表。图2所示为生长曲线和产酶曲线的图表。在发酵产酶的过程中，本发明的菌抹勘"7细XJU-5CGMCCNo.1768经过24小时的细胞生长阶l殳后开始产酶，然后酶产量呈指数增长，在50-70小时的发酵时间内也就是培养基中的营养开始缺少时蛋白酶的产量达到最大值。图3所示为高温碱性蛋白酶最适温度曲线图表。图4所示为高温碱性蛋白酶的温度稳定性曲线图表。图5所示为高温碱性蛋白酶最适pH曲线图表。图6所示为高温碱性蛋白酶的pH稳定性曲线图表。图7所示为1.5y。琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段图，其中1、3为MakerDL2000,2为高温碱性蛋白酶基因的PCR扩增条带，4为PCR验证转化质粒的PCR扩增条带，5为质粒的酶切条带，6为MakerDL15000。具体实施方式下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。另夕卜，在下述的说明中，如无特别说明，则％皆指质量百分比。实施例1:高温碱性蛋白酶产生菌Ac/a^/;y//XJU-5的培养及篩选1、样品采集从新疆吐鲁番的盐碱水中采集样品。2、菌株的分离酉己制平板培养基(g/1):2.0%小麦秸、0.2%NH4N03、0.2%K2HP04、0.02%MgSO4.7H20、0.5%酵母膏，1.8%琼脂粉，pH10.5。将上述培养基以1.05kg/cm2,m。C，高压蒸汽灭菌20分钟。将釆集的水样品8000rpm离心10min,弃上清，用灭菌的生理盐水溶解沉淀，悬浮液按101,103，104,105,107制成5个稀释梯度，取每个稀释度样品液0.2mL分别均匀涂布于上述培养基(pH10.5)平板上，38。C下培养18小时从而得到单菌落，用接种针挑取单菌落画线接于上述固体培养基中纯化菌种。3、产碱性蛋白酶菌株的筛选制成筛选培养基，用牙签挑取各个单菌落点于筛选平板上，38。C培养24-48小时，周围形成透明圈的为蛋白酶生产菌抹,观察并挑选透明圈大的菌落，其中一菌抹命名为XJU-5，纯化后保藏。筛选培养基蛋白胨10g、酵母浸粉5g、氯化钠5g、琼脂18g、酪素5g、磷酸氩二钾lg、碌iJ吏4美晶体0.2g和水1000ml。注pH10.0-11.0，以灭菌10%碳酸钠溶液调节灭菌后培养基的pH。实施例2:高温碱性蛋白酶产生菌Ac/aw;27XJU-5的发酵培养培养基是发酵工艺技术的基础，在实验室研究的基础上进行了工业化中试研究的培养基筛选和优化，在基础发酵培养液的&出上进行优化。2.基础发酵培养液蛋白胨10g、酵母浸粉5g、氯化钠5g、磷酸氢二钾lg、碌u酸4美晶体0.2g和水1000ml。注pH10.0-11.0,以灭菌1W碳酸钠溶液调节灭菌后培养基的pH。(一)发酵产酶培养基的优化1.碳源对产酶的影响选择无碳源、葡萄糖、酵母膏、玉米粉、蔗糖、淀粉分别取代基础培养液中的酵母浸粉制成不同碳源培养液，在相同的条件下接入产酶菌种进行发酵产酶，38。C振荡培养48小时，搅拌速度为150rpm，以上清酶活大小为指标。发酵结束后收集上清进行酶活检测比较。其中无碳源时酶活最高，其次是玉米粉，酵母膏，其他对产酶没有多大的影响。2.有机氮源对产酶的影响按如上同样的方法对麸皮、玉米粉、牛肉膏、大豆粉、蛋白胨、酪蛋白、酵母膏、尿素等有机氮源进行检测，其中酵母膏为氮源是酶活最高，其次是蛋白胨、尿素、牛肉膏。3.无机氮源对产酶的影响按如上同样的方法对硫酸胺、氯化胺、硝酸钠等无机氮源进行检测，结果得出无机氮源大大降低产酶。4.金属离子对产酶的影响同样的方法，分别在培养液中加入一定量的Na、Mg、Mn、Cu、K等离子，发酵后测定酶活，结果发现加入一定量Na、K、Mg离子，能^f足进菌体生产和产酶率的提高。(二)最佳发酵培养基和条件的选择根据基础发酵培养基和发酵培养基优化试验，本着高产酶率、低成本的原则，选出了产酶相对比较高的培养基。在38°C、500ml的摇瓶中含有150ml培养液，取5ml培养活化菌悬液于发酵瓶中，搅拌速度为150rpm，发酵周期48_72h。检测发酵液酶产量，当酶产量达50u/ml以上时，证明菌生产能力符合生产要求。3.发酵培养基蛋白胨5g、酵母浸粉lg、氯化钠2g、琼脂18g、磷酸氢二钾0.lg、硫酸镁晶体0.5g和水1000ml。注pH10.0-11.0，以灭菌10。/U友酸钠溶液调节灭菌后培养基的pH。实施例3:高温碱性蛋白酶活性的测量方法才艮据中华人民共和国轻工业部于1993-07-29发布，并于1994-03-01实施的《中华人民共和国行业标准》QB/T1803、1804—93，QB/T1805、1806—93,工业酶制剂通用试验方法，在测试过程中温度定为40°C、pH为10.5。1.1定义lg固体酶粉(或lmL液体酶)，在一定温度和pH值条件下，lmin水解酪素产生lPg酪氨酸为一个酶活力单位，以u/g(u/mL)表示。1.2福林法3.2.1原理蛋白酶在一定的温度与pH条件下.水解酪素底物，产生含有酚基的氮基酸(如酪氨酸、色氨酸等)，在碱性条件下，将福林试剂(Folin)还原，生成铝蓝与钨蓝，用分光光度法测定，计算其酶活力。3.2.2试剂和;容液3.2.2.1福林试剂的制备于2000ml磨口回流装置中加人鴒酸钠(Na2W04'2H20)100g,铝酸钠(Na2Mo04.2H20)25g、水700mL、85。/。磷酸50mL、浓盐酸100mL，小火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加人辟^酸锂(Li2SQ4)50g、水50ml和凄t滴浓溴水(99%),再微沸15min,以除去多余的溴(冷后仍有绿色需再加溴水，再煮沸除去过量的溴)，冷却，加水定容至10OOmL,混匀，过滤。制得的试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。使用溶液一份福林试剂与二份水混合，摇勻。3.2.2.2石友酸钠;容液c(Na2CO3)=0.4mol/L称取无水碳酸钠(Na2C03)42.4g，用水溶解并定容至lQQOmL.3.2.2.3三氯乙酸c(CCl3COOH)-0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g,用水溶解并定容至1000mL。3.2.2.4氢氧化钠溶液c(NaOH)=0.5mol/L按GB601配制。3.2.2.5盐酸溶液c(HCl卜lmol/L及0.lmol/L按GB601配制。3.2.2.6缓沖溶液a.磷酸緩冲液(pH-7.5)，适用于中性蛋白酶称取磷酸氢二钠(Na2HP04.12H20)6.02g和磷酸二氢钠(NaH2P04.2H20)0.5g，加水溶解并定容至1000mL。b.乳酸緩沖液(pH=3.0)适用于酸性蛋白酶曱液称取乳酸(80%-90%)10.6g，加水溶解并定容至10OOmL;乙液称取乳酸钠(70Dl6g,加水溶解并定容至1000mL。使用溶液取曱液8mL,加乙液lmL,混匀，稀释一倍，即成O.05mol/L乳酸緩沖溶液。c.硼酸緩沖溶液(p1^10.5)适用于碱性蛋白酶曱液称取硼酸钠(硼砂)19.08g，加水溶解并定容至1000mL;乙液称取氢氧化钠4.0g，力口水溶解并定容至1000mL。使用溶液耳又曱液500mL、乙液400mL混勻，用水稀释至1000mL，上述各种緩冲溶液，均须用pH计校正。3.2.2.710g/L酪素溶液(即l。/。酪素溶液)称取酪素1.000g,精确至O.OOlg，用少量O.5mol/L氬氧化钠溶液(若酸性蛋白酶则用浓乳酸2-3滴)湿润后，加人适量的各种适宜pH的缓沖溶液约80mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转人100mL容量瓶中，用适宜的pH缓沖溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。3.2.2.8100pg/mLL-酪氨酸标准溶液a.称取预先于105。C干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g，精确至O.0002g，用1mo1/L盐酸6OmL溶解后定容至1OOmL，即为lmg/mL酪氨酸标准溶液。b.吸取lmg/mL酪氨酸标准溶液10.OOmL，用0.lmol/L盐酸定容至100mL,即得到10(mg/mL酪氨酸标准溶液。3.2.3仪器和i殳备3.2.3.1恒温水浴40。C士0.2°C。3.2.3.2分光光度计应符合GB9721的规定。3.2.4分析步骤3.2.4.1标准曲线的绘制aL-酪氨酸标准溶液按如下表配制。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>b.分别取上述溶液各1.00mL(须做平行试验)，各加Q.4mol/L碳酸钠溶液5.OOmL，福林试剂使用溶液l.OOmL，置于40。C士0.2。C水浴中显色20min，取出，用分光光度计于波长680腿，10mm比色皿，以不含酪氨酸的管为空白，分别测定其吸光度。以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线(此线应通过零点)。根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为l时的酪氨酸的量(4g),即为吸光常数K值，其K值应在95-100范围内。3.2.4.2测定(l)待测酶液的制备a.称取酶粉l-2g，精确至O.0002g(或吸取液体酶l.OOmL),用少量该酶的緩沖液溶解，并用玻璃棒捣研，然后将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣中再添加少量上述緩沖液如此溶解、捣研3-4次，最后全部移入容量瓶中，用緩沖液定容至刻度，摇匀。用四层纱布过滤，滤液根据酶活力再一次用緩沖液稀释至适当浓度，供测试用(稀释至被测试液吸光值在O.25-0.40范围内)。b.酶粉测定时，稀释倍数参考如下表(液体酶亦可参照如下表稀释)<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>(2)测定a.先将酪素溶液放人4(TC士0.2'C恒温水浴中预热5mi仏b.按下列程序操作试管A(空白)1加酶液1.00mL,放人40。C士0.2。C恒温水浴中预热2min2加三氯乙酸2.OOml(摇匀)，40。C士0.2。C恒温水浴中预热5min;3加酪素l.OOmL摇匀4耳又出l争止10min，过滤5取1.00mL滤液6加石友酸钠纟容液5.OmL7加福林试剂使用液l.OOmL，40。C士0.2。C恒温水浴中显色20min8于680nm波长，用10mm比色皿测其吸于光度试管B(酶试样，需作三个平行样)1加酶液1.00mL,放人4(TC士0.2。C恒温水浴中预热2min2加酪素l.OOml(摇匀)，40。C士0.2'C恒温水浴中预热10min3加三氯乙酸2.OOmL摇匀4耳又出l争止10min,过滤5取1.00mL滤液6力口石友酸钠溶液5.OmL7加福林试剂^f吏用液1.OOmL,40。C士0.2。C恒温水浴中显色20min8于680nm波长，用10mm比色皿测其吸于光度3.2.5计算X=AxKx4/10xn=2/5xAxKxn..............................(A3)式中X——样品的酶活力，u/g(u/mL)tA——样品平行试验的平均吸光度；K——吸光常数；4——反应试剂的总体积，Ml;10--"反应时间10min,以lmin计；n——稀释倍数。所得结果表示至整数。3.2.6结果的允许差平行试验相对误差不得超过3%。实施例4:温度对高温碱性蛋白酶酶活力的影响l.试剂配制1.1.pH10.5的硼砂-氢氧化钠缓沖液曱液称耳又硼酸钠(硼石少)19.08g，加水溶解并定容至1000mL;乙液称耳又氢氧化钠4.Og,加水溶解并定容至1000mL。使用溶液耳又曱液500mL、乙液400mL混匀，pH计才交正，用水稀释至1000mL。1.20.5mol/L氢氧化钠溶液称耳又20.OgNaOH用蒸馏水溶解并定容至1000mL,终浓度0.5mol/L。1.31%的酪蛋白溶液称取酪蛋白l.OOOg,精确至O.OOlg，用少量O.5mol/L氢氧化钠溶液湿润后，加人pH10.5的硼砂-氲氧化钠缓沖液80mL,在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转人100mL容量瓶中，定容至100mL。2.高温碱性蛋白酶最适温度的测定及结果2.1酶活测定除分别置于1(TC,20°C,30°C，40°C，50°C,60°C，70°C，75°C,80°C,90°C,95。C的温度下反应20min，其它条件都相同，酶活测定方法具体参照实施例3。2.2结果测定比较各温度的酶活，75。C的条件下酶活最高，酶的最适温度为75。C。各平行试验相对误差低于3%。结果参见附图3。3.高温碱性蛋白酶的热稳定性的测定及结果3.1酶活测定除分别置于30。C,40°C，50°C,60°C，70°C,75°C，80°C,85。C的温度下保温60min、12Qmin后，测定剩余酶活，酶活测定方法具体参照实施例3。1.3.2结果在30-80。C之间保温60min、120min后，各剩余酶活保持在80%以上，保温120min后剩余酶活也只有略有下降。70。C保温60min、120min后，剩余酶活均为100°/。，在此温度下酶的性质最稳定，大于8(TC时酶活力显著下降，结果参见附图4,各平行试验相对误差低于3%。实施例5:pH对高温碱性蛋白酶酶活力的影响1.试剂配制1.1醋酸-醋酸钾緩沖液(pH5.5)称取1.55ml冰乙酸用蒸馏水溶解并定容至1000mL，终浓度O.lmol，配成A液；称耳又19.6gKAc用蒸馏水溶解并定容至1000mL,终浓度0.2mol/L,配成B液。A液2.4mL十B液22.6mL用蒸馏水溶解，pH计4交正至5.5并定容至100mL。1.2磷酸二氬钾-磷酸氩二钾緩沖液(pH6.0,pH7.0，pH8.0)称取27.2gKH2PO4用蒸馏水溶解并定容至10Q0mL配成A液；称取45.6gK2HP04用蒸馏水溶解并定容至1000mL配成B液。pH6.Q磷酸二氢钾-磷酸氢二钾緩冲液A液45mL+B液23mLpH7.0石粦酸二氬钾-石粦酸氮二钾緩沖液A液18mL+B液30mLpH8.0磷酸二氬钾-磷酸氩二钾緩沖液A液3mL+B液48mL均用蒸馏水溶解，pH计校正至各pH值并定容至100mL。1.3硼砂-氩氧化钠緩冲液(pH9.0，10.0,10.5，11.0)称取19.07gNa2B407.10H20(硼砂)用蒸馏水溶解并定容至lOOOmL,终浓度0.05mol/L配成A液；称取8gNaOH用蒸馏水溶解并定容至lOOOmL,终浓度0.2mol/L配成B液。pH9.Q硼砂-氬氧化钠緩沖液A液24mL+B液2mLpH10.0硼砂-氩氧化钠緩沖液A液25mL十B液22mLpHll.0硼石少-氢氧化钠纟爰沖液A液5mL十B液25mL均用蒸馏水溶解，pH计校正至各pH值并定容至100mL。1.4.磷酸氢二钠一NaOH緩沖液(pH12.0,pH13.0,pH14.0)称取67.9gNa2HP04,用蒸馏水溶解并定容至lOQQmL,终浓度0.05mol几配成A液；称耳又4.0gNaOH用蒸馏水溶解并定容至lOOOmL,终浓度0.1mol/L配成B液；称耳又40.OgNaOH用蒸馏水溶解并定容至lOOOmL,终浓度1.0mol/L酉己AC&。pH12.Q磷酸氩二钠一NaOH緩冲液A液50mL+B液28mLpH13.0磷酸氬二钠一NaOH缓冲液A液10mL+B液50mLpH14.0磷酸氲二钠一NaOH緩冲液A液2mL+C液50mL均用蒸馏水溶解，PH计校正至各pH值并定容至lOOmL。1.5.0.5mol/L氬氧化钠溶液称取20.0gNaOH用蒸馏水溶解并定容至lOOOmL,终浓度O.5mol/L。1.6.ly。酪蛋白溶液称耳又酪蛋白1.OOOg,4青确至G.OOlg，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液湿润后，加人上述各种配好的緩冲液80mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转人100mL容量瓶中，定容至100mL。2.高温碱性蛋白酶最适pH的测定及结果2.1酶活测定以相应pH值的酪蛋白缓冲溶液为底物与酶反应，4(TC下反应20min，其它条件都相同，然后测定酶活，酶活测定方法具体参照实施例3。2.2结果测定比较各pH值的酶活大小，在pH10.5酶活最高，该酶的最适pH为10.5，结果参见附图5,各平行试验相对误差低于3%。2.3高温碱性蛋白酶的pH稳定性的测定及结果2.3.1酶活测定将酶液用不同pH緩冲液(8.0-13.0)稀释，40。C水浴保温100min后，测定剩余酶活，酶活测定方法具体参照实施例3。2.3.2结果由此可见，该酶在pH13.O条件下稳定性最高，为80%,其它pH条件下，剩余酶活也保持在60%以上。结果参见附图6,各平行试验相对误差低于3%。pH在5.5-6.0之间的酶活力比开始提高了，在pH10.0-12.0的酶活力基本比较稳定，pH13.0的酶活稳定性开始升高。实施例6:表面活性剂和氧化剂对高温碱性蛋白酶酶活力的影响1.表面活性剂/氧化剂的选4奪为了检测本发明的高温碱性蛋白酶对洗涤剂的融合性和稳定性，根据国家轻工业行业洗涤剂QB1806-1993标准的要求，选用表面活性剂Triton-X-lOO、CTAB、Tween20、SDS和氧化剂H202、过硼酸钠对本发明的高温碱性蛋白酶进行检测。2.表面活性剂/氧化剂-酶液的配制2.1pH10.5的硼砂-氢氧化钠緩冲液曱液称取硼酸钠(硼砂、)19.08g，加水溶解并定容至1000mL;乙液称耳又氢氧化钠4.0g,加水溶解并定容至1000mL。使用溶液取曱液500mL、乙液400mL混匀，pH计校正，用水稀释至1000mL。2.21%TritonX-IOO-酶液吸耳又TritonX-lOOlmL,溶解于酶液并定容至100mL。2.31%CTAB-酶液称取CTABlg,溶解于酶液并定容至100mL。2.41%Tween20-酶液吸耳又Tween2QlmL,纟容解于酶液并定容至100mL。2.51%SDS-酶液SDS称耳又CTABlg，溶解于酶液并定容至1Q0mL。2.61%HA-酶液吸取HAlmL,溶解于酶液并定容至1Q0mL。2.71%过硼酸钠-酶液称取过硼酸钠lg，溶解于酶液并定容至100mL。2.80.5mol/L氬氧4b钠溶液称取20.OgNaOH用蒸馏水溶解并定容至1000mL,终浓度0.5mol/L。2.91%的酪蛋白溶液称取酪蛋白l.OOOg，精确至0.001g,用少量O.5mol/L氢氧化钠溶液湿润后，加人pH10.5的硼砂-氪氧化钠緩沖液80mL,在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转人100mL容量瓶中，定容至100mL。3.3表面活性剂/氧化剂处理酶液将配好的表面活性剂/氧化剂-酶液置于38。C下温育48小时。3.4酶活的测定取出表面活性剂/氧化剂48小时处理的酶液，具体参照实施例3测定酶活。3.4结果用1%SDS处理酶液48h后，酶活是原来的2.62倍，用l%TritonX-100、1%H202处理酶液48h后，酶活力基本与原来酶活相同，用1%CTAB处理酶液后也保持原来酶活的80°/。，而Tween20、过硼酸钠大大影响该酶活力甚至使枚完全失活。可见该高温碱性蛋白酶与SDS、H202、TritonX-100具有《艮好的相容性。结果见表4，各平行试验相对误差低于3%。表3.表面活性剂/氧化剂对酶活的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>4二价金属离子对高温碱性蛋白酶酶活力的影响4.1二价金属离子-酶液的配制4.1.10.025°/^62+-酶液称取FeCh固体0.025g,用酶液溶解并定容于100mL。4.1.20.025%0)2+-酶液:称耳又FeCl2固体0.025g，用酶液溶解并定容于100mL。4.1.30.025%012+-酶液:称耳又CuCl2固体0.025g，用酶液溶解并定容于100mL。4.1.40,025%Mn2+-酶液:称耳又MnCl2固体0.025g,用酶液溶解并定容于100mL。4.1.50.025。/。Zn2+-酶液称取ZnCh固体0.025g,用酶液溶解并定容于100mL。4.1.60.025°厕§2+-酶液称取MgCl2固体0.025g，用酶液溶解并定容于100mL。4.1.7pH10.5的硼砂-氢氧化钠緩沖液曱液称耳又硼酸钠(硼砂、)19.08g,加水溶解并定容至1000mL;乙液称耳又氢氧化钠4.Og,加水溶解并定容至1000mL。使用溶液取曱液500mL、乙液400mL混匀，pH计校正，用水稀释至1000mL。4.1.80.5mol/L氬氧化钠溶液称取20.OgNaOH用蒸馏水溶解并定容至10Q0mL,终浓度0.5mol/L。4.1.91%的酪蛋白溶液称取酪蛋白l.OOOg,精确至O.OOlg,用少量O.5mol/L氢氧化钠溶液湿润后，加人pH10.5的硼砂-氢氧化钠緩冲液80mL,在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转人100mL容量瓶中，定容至100mL。4.2酶活的测定将加入各种离子的酶液进行酶活测定，没加任何离子的酶液为对照，具体参照实施例3测定酶活。4.3结果与不加任何离子的酶活力相比较，在酶反应溶液中加入C、Fe2+，Mn"能够提高酶活，对酶具有激活的作用，Zn"对酶活性没有多大的影响，Mg2+、Co2+反而使酶活降低。结果参见表4，各平行试验相对误差低于3%。表4.二价金属离子对酶活的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>实施例7碱性蛋白酶基因的PCR扩增和回收根据出发菌林克劳氏芽孢杆菌及c/愿y/XJU-5(CGMCC.No.1768)的16SrDNA序列同源性，根据序列比对找出同源性高的菌株以及相似的碱性蛋白酶基因序列，利用Primer5程序设计高温碱性蛋白酶基因的PCR引物。引物序列为PP1:5'ATAATGACGGTTATTGACCAT3';PP2:5'GCCAATCAAACAACAGA3'。每25ml的PCR反应体系中加入PCRbuffer(plusMg2+)2.,dNTP2.,PP1、PP2引物(浓度为100pM)各0.5W,TaqDNA聚合酶0.，菌抹及c/馬//XJU-5(CGMCC.No.1768)的基因组DNA2.5^1，加灭菌的双重水至25^1。PCR过程为94°C5min—个循环；94°Clmin，54°C45s,72°Clmin30s,30个循环；72°C7min,—个《盾环。经1%的琼脂糖凝胶检测有一条大约1500bp的特性性条带，参见附图7，采用DNA片段回收试剂盒回收该片段，具体操作过程参见其产品说明书。实施例8Ac/ai/s//XJU-5(CGMCC.No.1768)分泌物的鉴定和分析1菌种活化取保存菌种液，緩慢融化取少量接于固体牛肉膏培养基上，在适合菌抹生长的温度下培养一定时间后，连续活化数次，可进行菌林其它实验的测定。2鉴定产酶培养基的配制配制各种酶的筛选培养基(配制方法如下表)。淀粉酶鉴定培养基蛋白胨10g、酵母浸粉5g、氯化钠5g、琼脂18g、淀粉5g、磷酸氢二钾lg、辟u酸4美晶体0.2g和水1000ml.注pH10.0-11.0，以灭菌10y。碳S臾钠溶液调节灭菌后培养基的pH。果胶酶鉴定培养基蛋白胨10g、酵母浸粉5g、氯化钠5g、琼脂18g、果胶粉10g、磷酸氢二钾lg、硫酸镁晶体O.2g和水1000ml。注pH10.0-11.0,以灭菌10°/。碳酸钠溶液调节灭菌后培养基的pH。脂酶培养基蛋白胨10g、酵母浸粉5g、氯化钠5g、琼脂18g、淀粉5g、磷酸氲二钾lg、硫酸4美晶体0.2g和水1000ml。注pH10.0-11.0，以灭菌10%碳酸钠溶液调节灭菌后培养基的pH。3产酶活性的检测及结果用牙签挑取本发明的及"廳/2'XJU-5CGMCC.No.1768的活化单菌落点于筛选平板上，38。C培养24-48小时。培养好后，在淀粉酶培养基上的菌落周围滴入数滴碘液，有透明圈出现，因而本发明的菌林具有外分泌淀粉酶的能力。在果胶酶培养基上的菌落周围滴入数滴1WCTAB溶液，有透明圏出现，因而本发明的菌林具有外分泌果胶酶的能力。在脂酶培养基上的菌落周围有暈圈出现，因而本发明的菌抹具有外分泌果胶酶的能力。实施例9:高温碱性蛋白酶发酵酶液的纯化蛋白质纯化通常使用两类分离技术，即分级分离和层析技术，粗分级分离技术有(冊4)2S04分段盐析法和等电点沉淀法，低压层析技术则包括离子交换层析及分子筛柱层析(凝胶过滤)等等。本发明的高温碱性蛋白酶的纯化方法如下。1.粗酶液的制备取48h发酵液于4。C经12000g离心30min，除去菌体及残留培养基，收集上清液2.硫酸铵分级沉淀及透析在粗酶液中加入研细的固体(丽4)2S04至9(T/。饱和度，搅拌30min,在水箱(4T)过夜，然后于12000g离心30min。沉淀溶于一定体积0.P/。CaAr,用DEAE-纤维素处理两次，以吸附色素，抽滤去除纤维素。然后酶液进行分极沉淀，收集35°/。-75%(冊4)2304饱和度的沉淀，收集沉淀.将沉淀溶于pH10.O的硼砂-氢氧化钠缓冲液中，经蒸馏水透析36h除去铵离子，再经同样緩沖液透析，得到无色透明酶液。3.羧曱基纤维素CM-52层析柱床经O.4mol/L,pH8-13硼酸-NaOH緩冲液平tf，将得到的酶液上柱，以同种緩沖液展开，收集酶活力峰，再上重新制备层析柱，仍用同种緩沖液洗脱，收集酶活力峰。4.SephadexG-100层析S印hadexG-IOO柱用0.1°/。醋酸4丐平衡，经羧曱基纤维素CM-52层析得到的酶液用冷丙酮沉淀，4。C下12000r离心30min,离心后弃上清，沉淀溶于O.1%少量醋酸钩，进柱，待酶液全部进入柱床后，用0.1%醋酸钙洗脱，洗脱后分步收集器速度为2ml/min收集蛋白峰，酶液于-4。C保存。5.纯化结果最后通过羧曱基纤维素CM-52和S印hadexG-100柱层析得的无色酶液.测定该酶液的酶活.此酶纯化后纯度^^高9.87倍，活力回收率达53.2%，蛋白回收率达14.1%。SEQUENCELISTING〈110>新疆大学<120>耐高温耐强碱的克劳氏芽孢杆菌、分泌的蛋白酶及其制备<130〉耐高温耐强碱的克劳氏芽孢杆菌、分泌的蛋白酶及其制备<160>3<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>1500<212>DNA<213>Bacillusclausii<400>1cttccgatacggctaccttgttacgacttcaccccaatc￡itttgtcccaccmggcggc60tggctccata_aggttgcctcaccgacttegggtgttacaaactctcgtggtgtgacgggc120ggtgtgUcaagacccggg汪axgtattcaccgcggcatgctgatccgegaUactagc汪a180ttccggcttcgttgeagectgc^tccgaactg卿atggcttUtggga240ttggcttcacctcgcggtttcgctgccctttgtaxcatccattgtagcacgtgtgtagcc300caggtcataaggggc"g"g"ttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtc織gg360cagtcaccttactc汪atgctggcaacta汪gatcaagggttgcgctcgttg420cgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaCC￡LtgC￡LCCacctgtcact480Ugcccccgaaggggaagcccaatctcttgggtggtc雄ggatgtcaagacctggtaag540gttcttcgcgUgcttcga汪ttaaaccacatgctccactgcttgtgcgggtccccgtcaa600ttcctttgagtttcagccUgcggccgUctccccaggcggagtgct"3tgtgtUact660tcggceictacgggcatcgaaacccctaacacctagcactcatcgUtacggcgtggacU720ccagggUtctaatcctgtttgctccccacgctttcgcgcctcagcgtcagtUcagacc780cttcgccactggtgttcctccacstctctacgc"ttcaccgctacacgt840ggaaUccactctcctcttctgcactcaagctccccagtttccaatggccgeteggggtt900gagccccgagatttcacatcagacttaagaagccgcctgcgegegctttacgcccaata^960ttccggacaacgcttgccacetaegtattaccgcggctgctggC￡lCgUgUagccgtgg1020ctttctggtgaggtaccgtcaaggUccgccct"tcgaacggtaccgcttcttccctca1080caacagagctttacgacccgaaggccttectcaxtc￡icgcggcgttgctccgtcagactt1140tcgtccattgcggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcag1200tCCC3gtgtggccgatcaccctctcaggtcggctaegcatcgttgccttggUagccgtt1260accttaccaactagcU"gcgccgcgggcccatcccctagtg"agccgaagecatett1320tcaccctctctccaggtggaatccggUUagetceggttteceggagtt1380atcccagtct^ggggcaggttgcccacgtgttactcacccgtccgccgcUacgtccgg1440gagcaagctcccttctgtccgctcgacttgcatgtattaggcacgccgccagcgttcgtc1500<210〉2<211〉1376<212〉DNA<213>Bacillusclausii<400>2ataatgacggttattgaccaUggaagtggacaaaccaccaaaaatggcaaatacagact60cctttgcaatctgct卿ttgaataata^gagatttctgamtatctgetagatcga^a120gtatgtt"ttctgaaatttctaaaataa3^gga_ggctg汪3tggtttatgagacaaagt180ctaaaagttatggtttcgtcaacagtggcattgettttcstggca^cccagcagcagca240agcgaggagaaaaaggaatatttgattgtcgtCgMCCtgaagaagtttctgctcagagt300gtcga3gaaagmtgatgtggaegtcatecatgaatttgaagagattccagtcatteat360gcagaactaactaaaaaaga"tga^aaatt^aga^g"ccgaacgtaaaagcc"c420gaagaga"gcagaagtaaccatcagtcaaaeggttccttgggg^tttcattc"taat480acgcagcaagcgcacaaccgcggtaUUtggt獄ggtgctcgagtcgctgtccttgat540acaggaattgcttcacacccagactUcga"tgcagggggagegagetttatttcaagc600gagccttcctatcatgacaataaeggacacggeiactcacgtggctggtacsiatcgctgcg660Uaaacaatt固tcggtgtgcttggtgtagcaccatcggctgacttgtacgctgtgetaa720gUcttgatcgg汪"ggaagtggttcgcttgcttctgUgctc汪aggaatcgaatgggca780atta^caacaacatgcacattattaatatgagccttggaagcacgagtggttctagcacg840ctgtcaaccgagca^caatgctggt"tctctugtagg900aaUcgggtaga固ggagttaactatcctgctagataxtctggtgtUtggcggctgca960gcagttgatcaaaatggtcaacgcgc^gcttctctacgt"ggeccagaaattgsaatt1020tctgcacctggtgtcaacataaacagcacgtacsicaggca35ategttaegaategetttct1080ggaacatctatggcaacaccacacgttgctggagttgctgcacttgtgaagagcagatat1140cctagctatacgaacaaccaaattcgccagcgtattaatc'aaacagcaacgtatctaggt1200tctcctagcctttatggcaatggattagtacacgctggacgtgcaacacaataaatgcac1260aatgaaaggctgagacaaaactagccaa"gtaataaaaaagttcgg"catcaaaataa1320a"gattcgagcttUUctgtttgcttcatgggctcatctgttgtttgattggca1376<210>3<211>360<212>PRT<213>Bacillusclausii<400〉3MetArgGinSerLeuLysValMetValSerSerThrValAlaLeuLeu151015PheMetAlaAsnProAlaAlaAlaSerGluGluLysLysGluTyrLeu202530lieValValGluProGluGluValSerAlaGinSer.ValGluGluSer354045TyrAspValAspVallieHisGluPheGluGlulieProVallieHis505560AlaGluLeuThrLysLysGluLeuLysLysLeuLysLysAspProAsn65707580ValLysAlalieGluGluAsnAlaGluValThrlieSerGinThrVal859095ProTrpGlylieSerPhelieAsnThrGinGinAlaHisAsnArgGly100105110liePheGlyAsnGlyAlaArgValAlaValLeuAspThrGlylieAla115120125SerHisProAspLeuArglieAlaGlyGlyAlaSerPhelieSerSer130135140GluProSerTyrHisAspAsnAsnGlyHisGlyThrHisValAlaGly14515015516036ThrlieAlaAlaLeuAsnAsnSerlieGlyValLeuGlyValAlaPro170175LeuAspArgAsnGlySerGlyLeu165SerAlaAspLeuTyrAlaValLysSerLeuAla195MetHislielieAsnMet210LeuGluIxuAlaValAsn225230GlyAlaAlaGlyAsnThrLeuTyrAlaValLysVal180185SerValAlaGinGlylieGluTrpAlaGly200LeuGlySer215ArgAlaAsnAsnGly190lieAsnAsnAsn205GlySerSerThrAsn245TyrSerGlyValMetAlaAlaAlaSerThrSer220AsnAlaGlylieLeuIxuVal235240GlyArgGinGlyValAsnTyrProAlaArg250255ValAspGinAsnGlyGinArgValMetAlaAlaAlaAla260265AlaSerPheSerThrTyrGlyProGlulieGlulie275280ValAsnlieAsnSerThrTyrThrGly290295GlyThrSerMetAlaThrProHisVal305310LysSerArgTyrProSerAsnGly270SerAlaProGly285GluSerLeuSerArgTyrProSerTyrThrAsn325AsnGinThrAlaThrTyrLeuGlySer340345LeuValHisAlaGlyArgAlaThr355360AsnArgTyr300AlaGlyValAlaAlaLeuVal315320AsnGinlieArgGinArglie330335ProSerLeuTyrGlyAsnGly350权利要求1.一种具有耐高温耐强碱的克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)CGMCCNo.1768。2、一种如权利要求1所述的耐高温耐强石成的克劳氏芽孢杆菌(6ac说wc/aimY)CGMCCNo.1768的生产方法，其特征在于，其包括，A:对克劳氏芽孢杆菌(Sac/〃wc/mm7)CGMCCNo.1768进行菌种活化培养步骤；B:利用步骤A获得的活化菌种进行发酵步骤；C:发酵后的纯化纟是^^步骤。3、如权利要求2所述耐高温耐强碱的克劳氏芽孢杆菌(S"c/〃mc/aww7)CGMCCNo.1768的生产方法，其特征在于，在菌种活化培养中，该菌抹生长温度范围是4-86。C，培养温度38°C,能够分别在0%隱20%的NaCl浓度、pH5.5-13.6的条件下生长。4、如权利要求2所述耐高温耐强碱的克劳氏芽孢杆菌(Sa"7/wc/aww7)CGMCCNo.l768的生产方法，其特征在于，在发酵培养步骤中，发酵温度3643。C,饱和氧度大于30%，补加浓氨水和4mol/LHCl溶液控制pH值，搅拌速度250r/min、发酵罐维持O.lMPa、发酵周期48-72h。5、如权利要求3所述的耐高温耐强碱的克劳氏芽孢杆菌(S"cz7/wsc/aww7)CGMCCNo.1768的生产方法，其特征在于发酵中，菌林最适培发酵温度42.5°C,并可在pH13和80。C的双重胁迫条件下生长。6、一种高温碱性蛋白酶，其特征在于，其利用权利要求1所述的克劳氏芽孢杆菌(Sac/〃wc/aim'z')CGMCCNo.1768,由权利要求2所述的生产方法制备而成。7、如权利要求6所述的高温碱性蛋白酶，其特征在于，该高温碱性蛋白酶为一种热稳定的碱性丝氨酸蛋白酶，其最适温度是75。C，最适pH是10.5。8、如权利要求7所述的高温碱性蛋白酶，其特征在于，该石咸性丝氨酸蛋白酶85。C培育2小时保留原来酶活的65%,在pH13.0条件下稳定性为80%,其它pH条件下，剩余酶活也保持在60%以上，可使高温碱性蛋白酶的应用温度升高20。C,并对SDS、H202、TritonX-lOO具有极强的稳定性，用1%SDS、1%H202、l%TritonX-100处理48小时后能分别保持原来酶活的262.2%、117.5%、102.5%，Cu2+、Fe2+,Mn2+能提高酶活，Mg2+、0)2+能降低酶活。9、一种如权利要求6所述高温碱性蛋白酶的序列，其特征在于，该序列共有1376bp，开放阅读框从190-1255bp,序列891、1039、1070、1233位分别是A/G、A/G、A/T、C/T，197位为C,424位为G。10、如权利要求9所述的高温碱性蛋白酶的氨基酸序列，其特征在于，该高温石威性蛋白酶的分子量为38046道尔顿，是一种热稳定的碱性蛋白酶全文摘要本发明公开了一种耐高温耐强碱的克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)CGMCC.No1768和生产方法，以及利用此菌株生产高温碱性蛋白酶及其它酶制剂。本发明的克劳氏芽孢杆菌株(Bacillusclausii)具有很好耐受性，能在极端的环境下生长，能够分别在0％-20％的NaCl浓度、pH5-14、4-85℃的条件下生长，生存范围广泛。利用该菌株的极端的耐受性，研究开发其代谢产物具有重要的意义，开发出具有良好的热稳定性、耐高温耐强碱的酶可满足工业生产的需要，提高和稳定酶制剂质量，减少环境污染，促进工业的快速稳定发展。文档编号C12R1/07GK101270347SQ20081007287公开日2008年9月24日申请日期2008年5月8日优先权日2008年5月8日发明者霞易,宁王,艾尔肯·热合曼,邓爱华申请人:新疆大学