专利名称：：降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽转基因序列及其转基因工程菌株的利记博彩app
技术领域：
：本发明涉及一种融合多肽转基因序列及转基因工程菌株。技术背景降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽(如SEQIDNO:3所示)具有降钙素基因相关肽和鲑鱼降钙素各自的酶活性；而且偶联反应产生还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的速度是同时加入两种单一(降钙素基因相关肽和鲑鱼降钙素)多肽的反应体系反应速度的两倍以上，同时过渡态时间(transienttime)大大縮短，缩短至原过渡态时间的1/4左右等诸多优点。为了产业化生产目前多采用微生物和动物为反应器，但是以微生物和动物为反应器存在以下问题①细菌无法生产完整的抗体，也不能进行极为重要的转录后加工；0用传统方法表达重组蛋白，需购买昂贵的培养基和设备(动物细胞)，后续的加工纯化也需要大量的投资，同时动物转基因还存在法律和伦理方面的约束；G)用微生物生产重组蛋白时，伴随产生的内毒素难以在加工中去除，同时用动物生产的重组蛋白(或血制品)往往污染有可以传染给人的病原菌、病毒的污染。所以，降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽不适合用微生物和动物为反应器进行产业化生产。
发明内容本发明的目的是为了解决目前降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽不适合用微生物和动物为反应器进行产业化生产的问题，而提供的一种降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽转基因序列及其转基因工程菌株。降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽转基因序列如降药素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽转基因序列如SEQIDNO:1所示。降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽转基因工程菌株为含有融合基因质粒的农杆菌，其中质粒中融合基因如SEQIDNO:l所示。本发明降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽转基因工程菌株为革兰氏阴性菌，无芽孢短杆菌，菌宽为0.61.0nm、菌长为1.53.0pm，以1~6根周生或侧生鞭毛运动，好气性，代谢为呼吸型，最适生长温度为2528"C，最适酸碱度为pH6.0;菌落通常为圆形、隆起、光滑、白色至灰白色，半透明，具有利福平抗性和卡那霉素抗性。本发明降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽转基因在转基因植物中表达的蛋白具有完全的抗原活性或能识别抗体链，而且能发生有效的酶联免疫反应。本发明降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽转基因序列根据番茄偏爱的密码子而设计；为了增强启动子CaMV35S的效果，融合基因前设计了一个AMV序列；为了使降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽C端酰胺化，在降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽基因序列C端设计了一个编码Gly的密码子，作为酶法酰氮化前体。本发明将花椰菜花叶病毒(cauliflowermosaicbirus，CaMV)35S启动子与苜蓿(Madicagosativa)花叶病毒(alfalfamosaicvirus,AMV)RNA4的5'非转录区序列连接，构成组成型启动子CaMV35S/AMV。本发明降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽转基因序列与以￡S启动子的基因序列分别转入番茄中，GUS活性分析显示CaMV35S/AMV控制报道基因的表达远远高于5S启动子，约为2.6倍。本发明降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽转基因工程菌株可用于介导植物。用转基因工程菌株介导植物，以植物为反应器进行大规模、产业化生产具有以下优点①植物具有比较高级的真核蛋白合成途径，与动物细胞极其相似，能够表达完整的抗体，可以成功地进行转录后修饰和加工；⑦外源蛋白在植物中可以积累到较高水平，并且植物中表达的蛋白和抗体在功能上与动物自身产生的蛋白和抗体相同，可见转基因植物具有作为生物反应器生产疫苗、抗体、蛋白、细胞因子和生长因子的能力；G)植物病原菌不会对人或动物构成威胁，不存在像动物表达系统的产品有被病原菌污染的可能，因此以植物作为反应器生产蛋白更安全；④以植物作为反应器易于规模化生产，就生物量生产而言，植物的田间种植比其它任何系统更加低廉有效。而且植物可以大规模种植和收获，产物可贮藏在块茎、种子或果实中便于贮藏和运输。另外，转基因植物自交后得到的同质后代的新遗传性状稳定，作为食物还可以省去下游加工成本的开支。本发明降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽转基因工程菌株以植物为反应器生产降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽的成本为大肠杆菌的1/10~1/50。图l是具体实施方式二中降钙素基因相关肽与鲑鱼降f5素融合多肽转基因工程菌株中融合多肽转基因序列正义链DNA测序结果图；图2是具体实施方式二中降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽转基因工程菌株中融合多肽转基因序列反义链DNA测序结果图；图3是图1中A部放大图；图4是图1中B部放大图；图5是图1中C部放大图；图6是图2中A部放大图；图7是图2中B部放大图；图8是图2中C部放大图。具体实施方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。具体实施方式一本实施方式降钙素基因相关肽与鲑鱼降转素融合多肽转基因序列如下TCCCCCGGGGTTTTTATTTTTAATTTTCTTTCAAATACTTCCATCATGCATCATCATCATCATCATATGGCTTGCGATACTGCTACTTGCGTTACTCATAGACTTGCTGGACTTCTTTCTAGATCTGGAGGAGTTGTTAAGAATAATTTTGTTCCAACTAATGTTGGATCTAAGGCTTTTGGTACCTGCTCTAATCTTTCTACTTGCGGACTTGGAAAGCTTTCTCAAGAAGCTCATAAGCTTCAAACTCCAAGAACTAATACTGGATCTGGAACTCCAGGCTAATAAGAGCTCG。本实施方式降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽转基因序列由南京基天有限责任公司合成。本实施方式降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽转基因序列根据番茄偏爱的密码子而设计；为了增强启动子CaMV35S的效果，融合基因前设计了一个AMV序列(基因序列下划线部分)。因本实施方式要选用番茄作为植物表达系统，所以设计一个6XHis标签，以便从番茄中纯化出降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽。此外为了使6xHis与目的蛋白分离，本实施方式在6xHis与目的蛋白之间设计了一个ATG密码子编码的Met，可利用溴化氢将6xHis与目的蛋白分离。本实施方式在启动子CaMV35S/AMV后添加起始密码子(ATG)，用于起始氨基酸编码。本实施方式在融合多肽C端末尾设计两个终止密码子(TAA)用于终止氨基酸编码；在整基因序列前后各设计一个S附aI和I酶切位点用于后续基因操作。本实施方式基因序列用于替代pBI121载体上的g^基因，并且缩短了融融合多肽与CaMV35S启动子之间的距离，同时加入了双酶切效率高的限制性内切酶(Sm"I和5^cI)来提高酶切和连接效率；而且在限制性内切酶的两侧添上了几个保护性碱基，对限制性内切酶进行保护。因为pBI121上无尺/"I酶切位点，所以本实施方式中加入尺/wI酶切位点可作为初步筛选位点。具体实施方式二本实施方式降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽转基因工程菌株为含有融合基因质粒的农杆菌，其中质粒中融合基因如SEQIDNO:l所示。本实施方式降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽转基因工程菌株为革兰氏阴性菌，无芽孢短杆菌，菌宽为0.61.0pm、菌长为1.53.0pm，以16根周生或侧生鞭毛运动，好气性，代谢为呼吸型，最适生长温度为2528。C，最适酸碱度为pH6.0;菌落通常为圆形、隆起、光滑、白色至灰白色，半透明，具有利福平抗性和卡那霉素抗性。本实施方式将SEQIDNO:l所示基因序列克隆到pUC57载体上，通过SacI和SmaI双酶切回收融合基因，并用T4DNA连接酶将融合基因克隆到pBI121植物表达载体上(经测序可知融合基因成功克隆到pBI121植物表达载体上，SEQIDNO:l所示基因序列替代了pBI121载体上的g"s基因)，用电转化法导入根癌农杆菌EHA105中，既得到降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽转基因工程菌株。在用本实施方式转基因工程菌株介导番茄，便可以实现以植物为反应器的产业化生产。本实施方式中使用的药品、试剂、酶、感受态细胞和质粒等均容易购得，若无特殊要求则浓度为产品标注浓度；SEQIDNO:1所示基因序列由南京基天有限责任公司合成，然后按照操作步骤参见试剂盒使用操作手册。番茄是茄科(Solanaceae)番茄属(Lycopersicon)的一年生或多年生的双子叶植物。番茄本身具有很高的营养价值和药用价值。番茄中含有丰富的维生素、矿物质、碳水化合物、有机酸及少量的蛋白质；具有促进消化、利尿、抑制多种细菌的作用。番茄中维生素D可保护血管，治高血压。番茄中有谷胱甘肽，有推迟细胞衰老，增加人体抗癌能力。番茄中胡萝卜素可保护皮肤弹性，促进骨骼钙化的能力。所以选择番茄作为融合多肽的表达系统可以增加其药用价值和经济价值，是合适的表达系统。pBI121载体常用于双子叶植物的转化研究，是用于番茄转化的理想载体。pBI121载体T-DNA片段上含有Kanr抗性基因，可在转化后作为筛选标记。本实施方式中外源目的基因(降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽转基因序列)连接在信号肽的编码序列后面，所表达的目的基因产物即可被信号肽引导而分泌到细胞膜外的周质中，周质内的氧化环境有利于外源蛋白二硫键的形成，有利于产物蛋白的正确折叠，从而使得外源蛋白有可能以有生物活性的可溶性的形式表达。另外，由于周质中仅含约4%的蛋白，因此周质表达也为随后目的表达产物的纯化提供了便利。本实施方式中外源目的基因(降转素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽转基因序列)与一段被称为"亲和手柄"(affinityhandle)的编码序列相连接，这段"亲和手柄"可以与亲和层析柱上的配基特异性地结合，这样所表达的融合多肽蛋白可以用亲和层析的方法快速而简便地纯化出来，所得到的融合蛋白经化学方法或酶法切割开来之后，混合产物再上同一亲和柱，充作"亲和手柄"的一段多肽或蛋白以及尚未被切开的融合蛋白被吸附于柱上，而重组目的产物则处于流动相中。因此可得到较高纯度的降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽。本实施方式在提取质粒后加入RNaseA消化RNA30min可以消除RNA干扰。本实施方式在提取质粒时加入试剂盒溶液I1、.加入试剂盒溶液m及酚、氯仿和异戊醇(体积比酚:氯仿:异戊醇-25:24:l)混合液时应避免剧烈震荡，以避免提取质粒出现有多条带的情况。由金斯特公司对本实施方式重组子正义链进行测序，通过Chromas软件按照基因设计找到起始序列和终止序列，并编码出相应的氨基酸，测序结果如图1所示。由上海生工对本实施方式重组子反义链进行测序，通过Chromas软件，按照反向互补原则，找到融合基因起始序列和终止序列，并编码出相应的氨基酸，测序结果如图2所示。利用DNAMAN将正向测序结果与反向测序结果进行比较分析，正向序列和反向序列匹配率达100%，所以可以肯定，测序结果真实可信。用本实施方式转基因工程菌株介导番茄，然后将F3子代转基因番茄亲和层析纯化得到的融合多肽(即降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽)迸行动物实验实验1:将骨质疏松模型大鼠随机分成两组(治疗组和模型组)，以正常大鼠为空白对照组；治疗组按体重0.5pg/kg剂量注射本实施方式亲和层析纯化得到的融合多肽，模型组注射同等剂量的生理盐水。实验进行84天，对大鼠血清酸性磷酸酶(TRAP)、碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素(BGP)进行检测，并对大鼠进行了骨密度测定。检测结果如表1和表2所示。表1大鼠血清TRAP、ALP、BGP测定结果(X±S)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>根据表1和表2的实验数据说明本实施方式亲和层析纯化得到的融合多肽对骨质疏松具有优异的治疗效果，证明本实施方式亲和层析纯化得到的融合多肽肽具有鲑鱼降钙素活性。实验2:SD大鼠20只造成心肌缺血模型，然后随机分成两组(治疗组和模型组)，治疗组按体重2.5mg/kg剂量注射本实施方式亲和层析纯化得到的融合多肽，模型组注射同等剂量的生理盐水。实验进行4次，对大鼠心肌进行危险区域(AAR)、坏死区(IS)及坏死区与危险区域的比值检测，检测结果如表3所示。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>根据表3的实验数据说明本实施方式亲和层析纯化得到的融合多肽对心肌缺血造成的心肌梗塞具有优异的治疗效果，证明本实施方式亲和层析纯化得到的融合多肽具有降钙素基因相关肽活性。动物实验说明本实施方式亲和层析纯化得到的融合多肽与降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽具有相同的功能。经凝胶电泳实验结果证明本实施方式亲和层析纯化得到的融合多肽与降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽分子量大小相同。证明本实施方式转基因工程菌株成功介导番茄，转基因在番茄中成功、稳定的表达。序列表<110〉黑龙江大学<120>降钶素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽转基因序列及其转基因工程菌株<160>3<210>1<211>295<212〉画<213〉人工序列〈220〉〈221〉CDS〈222〉(46)...(288)〈220〉<223>降熟'素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽转基因序列。<400>1tcccccggggtttttatttttaattttctttcaaatacttcatcatHisHis5cttgetLeuAla20gttccaValProtctactSerThractcceiThrProcatcatHisHisggacttGlyLeuactaatThrAsntgcggaCysGly558lg￡l3CtArgThr70atggetMetAlactttctLeuSer25gttggaValGly40cttggaLeuGlytgcgatCysAsp10agatctArgSertctaagSerLys朋gcttLysLeuaatactggatctAsnThrGlySer75actgetactThrAlaThrgg&GlygetAlatctSer60ggaGlyggaGlytttPhe45GinactThrccatcatgcatcat54MetHisHis1gttactcatagaValThrHisArggttVal30ggtGlyGluCC3ProtgcCys15gttVal3CCThrgetAlaggcGly犯gLystgcCyssatAsntctSeraattttAsnPhe35aatcttAsnLeu50cttcaaLeuGin102150198246estaagHisLys65taataagagctcg295〈210>2<211>79<212>PRT〈213>人工序列〈220><formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>权利要求1、降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽转基因序列，其特征在于降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽转基因序列如下TCCCCCGGGGTTTTTATTTTTAATTTTCTTTCAAATACTTCCATCATGCATCATCATCATCATCATATGGCTTGCGATACTGCTACTTGCGTTACTCATAGACTTGCTGGACTTCTTTCTAGATCTGGAGGAGTTGTTAAGAATAATTTTGTTCCAACTAATGTTGGATCTAAGGCTTTTGGTACCTGCTCTAATCTTTCTACTTGCGGACTTGGAAAGCTTTCTCAAGAAGCTCATAAGCTTCAAACTCCAAGAACTAATACTGGATCTGGAACTCCAGGCTAATAAGAGCTCG。2、降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽转基因工程菌株，其特征在于降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽转基因工程菌株为含有融合基因质粒的农杆菌，其中质粒中融合基因如SEQIDNO:l所示。3、根据权利要求2所述的降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽转基因工程菌株，其特征在于降f5素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽转基因工程菌株为革兰氏阴性菌，无芽孢短杆菌，菌宽为0.6l都m、菌长为1.53郭m，以16根周生或侧生鞭毛运动，好气性，代谢为呼吸型，最适生长温度为25~28"C，最适酸碱度为pH6.0;菌落通常为圆形、隆起、光滑、白色至灰白色，半透明，具有利福平抗性和卡那霉素抗性。全文摘要降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽转基因序列及其转基因工程菌株，它涉及一种融合多肽转基因序列及转基因工程菌株。它解决了目前降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽不适合用微生物和动物为反应器进行产业化生产的问题。降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽转基因序列如SEQIDNO1所示。降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽转基因工程菌株为含有融合基因质粒的农杆菌，其中质粒中融合基因如SEQIDNO1所示。本发明降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽转基因工程菌株可用于介导植物，且成本为大肠杆菌的1/10～1/50。文档编号C12N1/21GK101319223SQ200810064960公开日2008年12月10日申请日期2008年7月21日优先权日2008年7月21日发明者琼余申请人:黑龙江大学