专利名称：水稻生长素诱导蛋白基因克隆的方法
技术领域：
本发明涉及水稻功能基因组学应用方法，特别涉及一种水稻生长素诱导 蛋白基因克隆的方法。
背景技术：
水稻是三大粮食作物之一，超过世界人口总数三分之一的人将其作为食 物的主要来源，它在国民经济中占有举足轻重的地位。随着世界人口的不断 增加以及对粮食需求的加大，每年对水稻的需求量都在不断的上升，在土地 面积日趋縮小的今天，如何使水稻稳产、高产以缓解因人口的增加给水稻生 产带来的压力是世界范围内所面临的难题，也是摆在科研工作者面前的一个 重大科研课题。尽管传统的遗传研究和常规育种已经为水稻的产量提高和品 质改善作出了重要贡献，但是由于稻属种质资源及常规育种方法的局限性， 给水稻进一步的遗传改良带来一定的困难。随着分子生物学、分子标记育种、 基因组学、生物信息学的快速发展和水稻基因组计划的实施，给水稻的生产 和育种带来了新机遇。但是严重缺乏拥有自主知识产权的重要功能基因是严 重制约我国农业生物技术育种高水平发展的一个"瓶颈"。目前水稻基因组序列 的测定和水稻功能基因组研究的成果将对我国农业生产发挥重要影响，加快
农作物品种的更新换代。国际水稻基因组测序计划启动于1998年，由政府和 其它公共资金支持，中国、日本、美国、法国等ll个国家和地区共同发起并 承担了这项庞大的科研任务。这是继人类基因组计划后的又一重大国际合作 的基因组研究项目[Takuji Sasaki da/.， 2000]。水稻基因组相对于玉米、小麦 等禾谷类作物小，约420-460M个碱基，基因数约3-5万个，被国际上广泛选为 模式作物，进行基因组测序和功能基因组研究。随着去年水稻全基因组测序 草图的完成和精确测序的完成[JunYu"a/., 2002; Stephen A.Goff"a/.， 2002; QiFeng， "a/.， 2003; SasakiT&a/.， 2003]，水稻的研究重点由结构基因组
4学开始向功能基因组学转移，功能基因组学的研究现已经成为全球研究的重 点，由于基因组序列研究成果的国际共享性，为人们利用该研究成果进入水 稻基因资源的竟争提供了新的机遇。特别是，这样的局面为中国开展功能基 因组研究，发现重要功能基因，实现基因组研究的跨越式发展提供了千载难 逢的机会。谁先克隆了基因，'谁就享有该基因的知识产权。反之，就丧失主 动权，就会受治于人。为了在这场"基因大战"中取得胜利，世界上一些发达国
家及大的跨国公司纷纷投巨资于这一领域的研究[HieterP""/.， 1997]。在美 洲，美国、加拿大投巨资于玉米、小麦基因的研究；在欧洲，英国JohnI皿es 研究中心从杜邦公司每年得到l-2千万英镑从事小麦基因的研究；在亚洲，日 本、韩国等投巨资从事水稻基因研究；在澳洲，澳大利亚政府投巨资成立了 小麦分子育种合作研究中心，每年投入上千万澳元从事小麦分子育种研究。 人们预计，在未来的10-20年时间内，国际上的"基因大战"将会愈演愈烈。在 功能基因及其编码蛋白质的结构与功能的研究领域，并在此基础上发现一批 具有重要生理活性和开发应用前景的功能基因是未来工作和研究的重点，从 而为我国以基因和基因表达产物为基础的动植物遗传改良奠定基础，更有力 地推动我国农业生物技术产业的快速发展。随着2002年全球水稻基因组测序 计划的完成和水稻全基因组序列的公布，水稻功能基因组学的研究现已成为 世界范围内研究的重点，了解这些基因在生长和发育中的作用越来越受到人 们的关注。
因此，提供一种水稻生长素诱导蛋白基因克隆的方法，已成为该领域科 研人员急需研究开发的新课题之一。
发明内容
本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一种水稻生长素诱导蛋白基 因克隆的方法。
为实现上述目的本发明所采用的技术方案是 一种水稻生长素诱导蛋白 基因克隆的方法，其特征在于实施步骤如下 (1)水稻转化受体的制备 水稻品种日本晴成熟后的种子脱壳，先用70%酒精浸泡1分钟，然后用0.1%升汞溶液灭菌20分钟，再用无菌水冲洗3次，吸干后接种到NBo培养基 上进行愈伤诱导，培养温度25士rC， l周后，挑取愈伤进行继代培养，继代2 周后，取出愈伤进行转化。
(2) 水稻遗传转化
挑取农杆菌单菌落到含有50mg/L Kanamgcin和20mg/ L Rifampicin的 YEP液体培养基中，28'C振荡培养14小时，使菌液浓度达到OD值0.5，再 取lmL菌液加到含有同样抗生素浓度的AB和0.5%蔗糖的100mL溶液中继 续培养17小时左右，使OD值达到0.8。将上述菌液置于50mL离心管中， 4000rpm离心20分钟，去除上清，加入同原菌液等量的AAM培养基，重新 悬浮；重复上述做法，再离心，去掉上清，再用AAM悬浮，使OD值约0.4; 将愈伤组织在农杆菌液中浸泡30分钟；然后将愈伤组织移至干燥的灭菌滤纸 上，吸去多余的菌液，最后将愈伤组织置于其培养培养基NA上，共培养一 般2-3天。待愈伤组织周围出现农杆菌菌落后，用500mg/L的Cefotaximine 和200mg/Lampicillin溶液充分漂洗，以后再置于选择培养基NBDH。
(3) 抗性愈伤的筛选和植株再生 愈伤组织在选择培养基上培养大约10-15天后，大部分愈伤变褐死亡，一
些新鲜的抗性愈伤就陆续死亡的愈伤表面出现，挑取抗性愈伤于选择培养基 上继代20天左右，选择黄色质地坚硬的愈伤抗性愈伤再转移到预分化培养基 NBP上，25天后待愈伤变白后就可以转移到分化培养基NBR上，3天就开始 有绿点产生，IO天左右苗就陆续出来，30天左右就可以移苗于1/2MS培养基 上生根，当幼苗长至8cm以上时，练苗7天时间就可以移入温室中的土里种 植。
(4) T-DNA(转移DNA)插入后代的突变体筛选 通过农杆菌介导转化日本晴，获得T-DNA插入群体。通过对To代各个时
期的表型的观察和接种实验来进行突变体筛选。共发现突变体208个，突变 率为11.3%，表型涉及株高、叶片、穗型、生育期、颖花、颖壳着色、抗病 等，其中出现株高矮化突变体，后代分离接近3: 1，株高37cm，茎杆细， 多分蘖，株高层次分明。
(5 ) Tail-PCR (热不对称交错PCR)
6根据pCAMBIA1301T-DNA右边界设计的三个嵌套式的特异性引物SPl， SP2和SP3分别距T-DNA右边界重复序列297 bp， 234 bp和48 bp。通过切 胶回收第三次扩增所得到的比第二次小的片断，连接到pGM-T Easy载体(一 种高效克隆PCR产物的专用载体)上，然后采用电击法转入到大肠杆菌 DH5a,然后通过测序获得基因序列。 (6)网上序列比对分析
① 突变体T-DNA插入水稻基因组的位置处在水稻4号染色体上，与已知 水稻BAC克隆(BAC clone: OSJNBa0084K01)序列同源性达到97%;
② 生长素诱导蛋白基因序列，该基因没有内含子，大小为462个碱基序
列；
③ 功能预测，通过网上比对认为该基因与拟南芥生长素诱导蛋白基因同 源性达到71%;通过网上搜索水稻cDNA克隆，找到了T-DNA插入位点上游 基因-生长素诱导基因的cDNA克隆，证明该基因是存在的；
本发明在利用T-DNA标签法进行水稻功能基因组研究时，获得一个株 高矮小的水稻突变体，通过利用TAIL-PCR技术对突变体的侧临序列进行研 究，同时经过网上NCBI和TIGR数据库的比对发现该突变体T-DNA插入水 稻基因组的位置处在水稻4号染色体上，并且已找到该位点所在的水稻BAC 克隆(OSJNBa0084K01)。经过对该克隆的分析发现，T-DNA插在该克隆两 个基因的中间位置。通过网上序列比对预测与BAC克隆编码氨基酸序列同 源性很高的已知功能的基因。T-DNA插入位于大小为2699bp上游基因2.5kb 处，位于大小为462bp下游基因1.3kb处；通过网上比对分析，上游基因与 玉米4， 5， 7-三羟黄垸酮加双氧酶基因同源性达到85%。下游基因与已知拟 南芥生长素诱导蛋白基因同源性达到71%。通过对下游生长素诱导蛋白基因 网上搜索，找到了该基因的cDNA克隆(002-148-C10),证明该基因是存在 的，通过cDNA与预测生长素诱导蛋白基因的比对，发现该基因没有内含子， 大小为462bp。
本发明的有益效果是本发明在研究突变体T-DNA插入侧临序列时，通 过TAIL-PCR获得侧临序列，经过网上NCBI和TIGR数据库的比对发现T-DNA 插入水稻基因组的位置处在水稻4号染色体上，并且已找到该位点所在的水稻BAC克隆(OSJNBa0084K01)。经过对该克隆的分析发现，T-DNA插在该克隆 两个基因的中间位置。通过生物信息学和比较基因组学研究，发现该侧临序 列所在的一个基因与拟南芥上生长素诱导蛋白基因同源性高达71%。该方法 实施步骤简单易行，实施条件宽松，效果非常显著。
具体实施例方式
以下结合较佳实施例，对依据本发明提供的具体实施步骤详述如下
(1) 水稻转化受体的制备 水稻品种日本晴成熟后的种子脱壳，先用70%酒精浸泡1分钟，然后用
0.1%升汞溶液灭菌20分钟，再用无菌水冲洗3次，吸干后接种到NBD培养基 上进行愈伤诱导，培养温度25士rC, l周后，挑取愈伤进行继代培养，继代2 周后，取出愈伤进行转化。
(2) 水稻遗传转化
挑取农杆菌单菌落到含有50mg/L卡那霉素和20mg/L利福平的YEP液体 培养基中，28"C振荡培养14小时，使菌液浓度达到OD值0.5，再取lmL菌 液加到含有同样抗生素浓度的AB和0.5%蔗糖的lOOmL溶液中继续培养17 小时左右，使OD值达到0.8。将上述菌液置于50mL离心管中，4000rpm离 心20分钟，去除上清，加入同原菌液等量的AAM培养基，重新悬浮；重复 上述做法，再离心，去掉上清，再用AAM悬浮，使OD值约0.4;将愈伤组 织在农杆菌液中浸泡30分钟；然后将愈伤组织移至干燥的灭菌滤纸上，吸去 多余的菌液，最后将愈伤组织置于其培养培养基NA上，共培养一般2-3天。 待愈伤组织周围出现农杆菌菌落后，用500mg/L的头孢霉素和200mg/L氨节 青霉素溶液充分漂洗，以后再置于选择培养基NBDH。
(3) 抗性愈伤的筛选和植株再生
愈伤组织在选择培养基上培养大约10-15天后，大部分愈伤变褐死亡，一 些新鲜的抗性愈伤就陆续死亡的愈伤表面出现，挑取抗性愈伤于选择培养基 上继代20天左右，选择黄色质地坚硬的愈伤抗性愈伤再转移到预分化培养基 NBP上，25天后待愈伤变白后就可以转移到分化培养基NBR上，3天就开始 有绿点产生，IO天左右苗就陆续出来，30天左右就可以移苗于1/2MS培养基 上生根，当幼苗长至8cm以上时，练苗7天时间就可以移入温室中的土里种植。 .
(4) T-DNA(转移DNA)插入后代的突变体筛选 通过农杆菌介导转化日本晴，获得T-DNA插入群体。通过对T。代各个时 期的表型的观察和接种实验来进行突变体筛选。共发现突变体208个，突变 率为11.3%，表型涉及株高、叶片、穗型、生育期、颖花、颖壳着色、抗病 等，其中出现株高矮化突变体，后代分离接近3: 1，株高37cm，茎杆细， 多分蘖，株高层次分明。
(5 ) Tail-PCR (热不对称交错PCR) 根据pCAMBIA1301T-DNA右边界设计的三个嵌套式的特异性引物SP1， SP2和SP3分别距T-DNA右边界重复序列297 bp， 234 bp和48bp。通过切 胶回收第三次扩增所得到的比第二次小的片断，连接到pGM-T Easy载体(一 种高效克隆PCR产物的专用载体)上，然后采用电击法转入到大肠杆菌 DH5a，然后通过测序获得基因序列。
(6)网上序列比对分析由上面分析可知P1424突变体T一DNA插入水 稻基因组的位置处在水稻4号染色体上，与已知水稻BAC克隆(BAC clone: OSJNBa0084K01 )序列同源性达到97%;通过分析发现该克隆含有两个基因， T-DNA插在距上游基因1.3kb与下游基因2.7kb之间的位置上；通过分析插入 位点上游基因氨基酸序列比对发现，与未知功能基因的氨基酸序列同源性达 到75%，通过网上比对认为该基因与拟南芥生长素诱导蛋白基因同源性达到 71%，因此预测该基因的功能为生长素诱导蛋白基因；同时对下游距离插入位 点较远的基因通过网上氨基酸序列比对，下游基因与水稻未知功能基因同源 性达到96%，与玉米4,5,7-三羟黄垸酮力tf双氧酶基因同源性达到85%;为了 更进一步证明所预测的基因到底是否存在，通过网上搜索水稻cDNA克隆， 找到了 T-DNA插入位点上游基因-生长素诱导基因的cDNA克隆，证明该基 因是存在的，该cDNA序列与基因序列完全一致，说明该基因没有内含子， 大小为462个碱基序列。
上述参照实施例对水稻生长素诱导蛋白基因克隆的方法进行的详细描 述，是说明性的而不是限定性的，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和 修改，应属本发明的保护范围之内。
权利要求
1、一种水稻生长素诱导蛋白基因克隆的方法，其特征在于实施步骤如下(1)水稻转化受体的制备水稻品种日本晴成熟后的种子脱壳，先用70％酒精浸泡1分钟，然后用0.1％升汞溶液灭菌20分钟，再用无菌水冲洗3次，吸干后接种到NBD培养基上进行愈伤诱导，培养温度25±1℃，1周后，挑取愈伤进行继代培养，继代2周后，取出愈伤进行转化；(2)水稻遗传转化挑取农杆菌单菌落到含有50mg/L卡那霉素和20mg/L利福平的YEP液体培养基中，28℃振荡培养14小时，使菌液浓度达到OD值0.5，再取1mL菌液加到含有同样抗生素浓度的AB和0.5％蔗糖的100mL溶液中继续培养17小时，使OD值达到0.8；将上述菌液置于50mL离心管中，4000rpm离心20分钟，去除上清，加入同原菌液等量的AAM培养基，即含有乙酰丁香酮的农杆菌培养基，重新悬浮；重复上述做法，再离心，去掉上清，再用AAM悬浮，使OD值为0.4；将愈伤组织在农杆菌液中浸泡30分钟；然后将愈伤组织移至干燥的灭菌滤纸上，吸去多余的菌液，最后将愈伤组织置于其培养基NA上，共培养一般2-3天；待愈伤组织周围出现农杆菌菌落后，用500mg/L的头孢霉素和200mg/L氨苄青霉素溶液充分漂洗，以后再置于选择培养基NBDH；(3)抗性愈伤的筛选和植株再生愈伤组织在选择培养基上培养大约10-15天后，大部分愈伤变褐死亡，一些新鲜的抗性愈伤就陆续死亡的愈伤表面出现，挑取抗性愈伤于选择培养基上继代20天左右，选择黄色质地坚硬的愈伤抗性愈伤再转移到预分化培养基NBP上，25天后待愈伤变白后就可以转移到分化培养基上，3天就开始有绿点产生，10天左右苗就陆续出来，30天左右就可以移苗于1/2MS培养基上生根，当幼苗长至8cm以上时，练苗7天时间就可以移入温室中的土里种植；(4)T-DNA，即转移DNA插入后代的突变体筛选通过农杆菌介导转化日本晴，获得T-DNA插入群体；通过对T0代各个时期的表型的观察和接种实验来进行突变体筛选；共发现突变体208个，突变率为11.3％，表型涉及株高、叶片、穗型、生育期、颖花、颖壳着色、抗病等，其中出现株高矮化突变体，后代分离接近3∶1，株高37cm，茎杆细，多分蘖，株高层次分明；(5)Tail-PCR，即热不对称交错PCR根据质粒pCAMBIA1301 T-DNA右边界设计的三个嵌套式的特异性引物SP1，SP2和SP3分别距T-DNA右边界重复序列297bp，234bp和48bp；通过切胶回收第三次扩增所得到的比第二次小的片断，连接到pGM-T Easy载体上，即一种高效克隆PCR产物的专用载体，然后通过电击法转入大肠杆菌DH5α，然后通过测序获得基因序列；(6)进行网上序列比对分析由上面分析可知P1424突变体T-DNA插入水稻基因组的位置处在水稻4号染色体上，与已知水稻BAC克隆(BAC cloneOSJNBa0084K01)序列同源性达到97％；通过分析发现该克隆含有两个基因，T-DNA插在距上游基因1.3kb与下游基因2.7kb之间的位置上；通过分析插入位点上游基因氨基酸序列比对发现，与未知功能基因的氨基酸序列同源性达到75％，与拟南芥生长素诱导蛋白基因同源性达到71％，因此预测该基因的功能为生长素诱导蛋白基因；同时对下游距离插入位点较远的基因通过网上氨基酸序列比对，下游基因与水稻未知功能基因同源性达到96％，与玉米4，5，7-三羟黄烷酮加双氧酶基因同源性达到85％；为了更进一步证明所预测的基因到底是否存在，通过网上搜索水稻cDNA克隆，找到了T-DNA插入位点上游基因-生长素诱导基因的cDNA克隆，证明该基因是存在的，该cDNA序列与基因序列完全一致，说明该基因没有内含子，大小为462个碱基序列。
全文摘要
本发明涉及一种水稻生长素诱导蛋白基因克隆的方法，其特征在于实施步骤包括(1)水稻转化受体的制备；(2)水稻遗传转化；(3)抗性愈伤的筛选和植株再生；(4)T-DNA插入后代的突变体筛选；(5)Tail-PCR；(6)网上序列比对分析。本发明在利用T-DNA标签法进行水稻功能基因组研究时，获得一个株高矮小的水稻突变体，通过利用TAIL-PCR技术对突变体的侧临序列进行研究，同时经过网上NCBI和TIGR数据库的比对发现该突变体T-DNA插入水稻基因组的位置处在水稻4号染色体上，并且已找到该位点所在的水稻BAC克隆(OSJNBa0084K01)。经过对该克隆的分析发现，T-DNA插在该克隆两个基因的中间位置。通过网上序列比对预测与BAC克隆编码氨基酸序列同源性很高的已知功能的基因。
文档编号C12N15/10GK101492671SQ200810052139
公开日2009年7月29日 申请日期2008年1月22日 优先权日2008年1月22日
发明者孙守钧, 李子芳, 峰 罗, 裴忠有 申请人:天津农学院