专利名称：：牛蛙抗菌肽temporin-Lb及其基因和在制药中的应用的利记博彩app
技术领域：
：本发明涉及一种牛蛙抗菌肽temporin-Lb及其基因和在制药中的应用，属于生物医学
技术领域：
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背景技术：
：抗菌肽作为一种全新概念的、广谱抗菌蛋白类抗生素将具有比传统抗生素更加广阔的市场前景,有希望成为新一代抗菌剂,其研制目前受到广泛重视。目前已从不同的无尾目动物皮肤中分离到300多条不同的抗菌肽，并且其数目还在增加。来自中国科学院昆明动物研究所生物毒素系的研究人员在Oform朋gra/wm/(无指盘臭蛙，一种两栖动物)中发现了107种新型的抗菌肽(antimicrobialpeptides),并进行了抗菌机制研究，这比目前报道的两栖类抗菌肽数目多了三倍，是迄今为止发现的最丰富的抗菌肽资源，这也为抗菌机制研究提供了重要信息。在中国，很多两栖类动物被作为传统中药和民族药物而广泛应用，如中华蟾蜍(Sw/ogwgw/加ra)等。这些两栖类动物的皮肤和内脏具有广泛的药理活性和临床疗效。己报道药理活性有广谱抗微生物作用、抗肿瘤、镇痛、局部麻醉、免疫调节、心血管系统作用等。据国内外文献报道，已从各种生物来源分离得到不同的活性多肽，而且有些已进入临床治疗。例如将esculentin-l基因转入到烟草中，在其体液中检测到有活性的esculentin-l的存在，同时这种植物对细菌以及真菌的抵抗力明显增强；从爪蟾(义e"o/n^'皮肤分泌液获得的抗菌肽Magainin具广谱抗微生物作用,同时具有抗肿瘤活性,在美国已获准作为广谱抗菌药物,其基因工程产品已进入三期临床。我国对两栖类药物的应用有悠久的历史，但对其活性成分和药理性质的研究主要集中于生物碱等有机小分子，对其皮肤活性肽类物质的研究不多。发明人将本发明的牛蛙抗菌肽全序列氨基酸结构经蛋白质数据库进行比对，未发现有任何相同多肽。
发明内容本发明的目的在于提供一种牛蛙抗菌肽temporin-Lb，为一种新的牛蛙抗菌肽，具有药效活性成分。3本发明还进一步提供了牛蛙抗菌肽temporin-Lb在制药中的应用，制备病原微生物感染疾病的治疗药物和肿瘤治疗药物。本发明公开的牛蛙抗菌肽为一种新的抗菌肽命名为temporin-Lb，是由无尾两栖类牛蛙抗菌肽基因编码的一种单链多肽，分子量为1691.11道尔顿，等电点为9.70，多肽全序列一级结构为LeuPheArgHisValValLysliePheGluLysTyrLeu—AMIDATION。本发明还提供了牛蛙抗菌肽temporin-Lb基因的核苷酸序列，其特征在于cDNA由322个核苷酸组成，其自5'端至3'端序列分别为atgttcaccatgaagaaatccctgttactcctttttttccttggggccctcaactttttt60atttgtggggaagggggggatgUgatc;a卿tgaEiag肪gggatgattccggtg3aagg120aatgttcaaatggaaaaacgattgtttcggcatgttgtaaagatttttgaaaaatatttg180ggaaaataacccgaa3tgttgaaactttgaaaatgga3ttggaa3tcatttgatgtgg犯240tattatttggctaaatgctcaacagatgttttataaa幼taaataaatatgttgcaaaaa300所述的牛蛙抗菌肽基因核苷酸序列，其特征在于，编码牛蛙成熟抗菌肽为142-180位核苷酸，其氨基酸序列为LeuPheArgHisValValLysliePheGluLysTyrLeu-AMIDAT腿。牛蛙抗菌肽基因的克隆包括牛蛙皮肤总RNA的提取，mRNA的纯化，mRNA的反转录及cDNA文库构建，设计引物利用PCR方法筛选牛蛙抗菌肽基因。扩增引物长度为20个核苷酸，其序列为-ATGTTCACCWTGAAGAAATC-3'，PCR另一扩增引物为CLONTECH公司SMARTcDNALibraryConstructionKit中的5'PCRPrimer引物，其序列为5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCC-3'。所获阳性单克隆进行核苷酸序列测定。测序结果表明牛蛙抗菌肽的基因由322个核苷酸组成，自5'端至3'端序列分别为atgttcaccatgaBgaaatccctgttactcctttttttccttggggccctcaactttttt60atttgtggggaagggggggatgttgatca卿tgaaagaagggatgattccggtgaaagg120aMgttcaaatggaaaaacgattgtttcggcatgttgtaaagatttttgaagLaatatttg180ggaaaataacccgaaatgttgaaactttgaaaatggaattggaaatcatttgatgtggaa2404tattatttggctaaatgctcaacagatgttttataaaaataaataaatatgttgcaaaa^300aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa322编码牛蛙成熟抗菌肽为第142-180位核苷酸，其氨基酸序为LeuPheArgHisValValLysliePheGluLysTyrLeu-AMIDATION牛蛙抗菌肽基因作为基因工程制备牛蛙抗菌肽的应用。牛蛙抗菌肽的制备方法根据编码牛蛙抗菌肽的基因推断牛蛙抗菌肽的氨基酸序列，用自动多肽合成仪APEX396合成其全序列。通过HPLC反相ds柱层析脱盐、纯化。然后用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用快原子轰击质谱法，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。下述的药理实验证实了牛蛙抗菌肽具有显著的抑制细菌和真菌生长的作用，可以作为制备病原微生物感染疾病的治疗药物被应用。l.牛蛙抗菌肽抑制细菌生长的作用抗菌活性检测，测定最小抑菌浓度(MIC)时，采用二倍稀释法进行抗菌检测。以LB液体培养基作为培养介质。将过夜培养的标准菌株用LB培养基稀释菌落成每毫升含105细菌的菌液，将菌液接种于LB液体培养基，细菌最终浓度为105。在96孔细胞培养板上加入90(aLLB培养基中，加入经0.22pm孔径膜过滤的溶解于生理盐水的牛蛙抗菌肽样品lO^L作为第一孔,混匀后取50pL加入第2管，依次倍比稀释，自第9孔吸出5(^L弃去，第10管系对照管，每个样品重复两次。细菌菌株均为吉林大学畜牧兽医学院微生物与免疫实验室保存，结果如表l.表l.牛蛙抗菌肽抑制细菌生长的作用菌株最小抑菌浓度(吗/mL)牛蛙抗菌肽temporin-Lb李斯特杆菌ATCC5400431.25金葡菌ATCC259237.8链球菌2型CVCC6067.8沙门氏菌ATCC2002062.5大肠杆菌ATCC2592231.25肺炎克雷伯菌ATCC700603125由表1可见，合成的牛蛙抗菌肽具有显著的抑制细菌生长的作用。2.牛蛙抗菌肽抑制真菌生长的作用抗真菌活性检测采用杯碟法,培养基采用改良沙保氏(Sabousand)。采用二倍稀释法进行抗菌活性检测。在96孔细胞培养板上加入9(^L沙保氏培养基中，加入经0.22nm孔径膜过滤的溶解于生理盐水的牛蛙抗菌肽样品1(^L作为第一孔，混匀后取5(^L加入第2管，依次倍比稀释，自第9孔吸出50^iL弃去，第10管系对照管，每个样品重复两次。白色念珠菌为吉林大学畜牧兽医学院微生物与免疫实验室保存，结果如表2.表2.牛蛙抗菌肽抑制真菌生长的作用<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>由表2可知，牛蛙抗菌肽具有抑制真菌生长的作用。本发明的有益效果在于由牛蛙抗菌肽编码基因推导其氨基酸结构，合成一种新的牛蛙抗菌肽，具有显著的抑制细菌和真菌生长的作用，无溶血活性，该牛蛙抗菌肽具有结构简单、人工合成方便、抗菌谱系广的有益特点，可以作为制备治疗病原微生物感染疾病的药物被应用。具体实施例方式下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。实施例l:牛蛙抗菌肽基因克隆I.牛蛙皮肤总RNA提取A.活体牛蛙用双蒸水清洗千净，灭菌针从牛蛙的延髓腔致瘫，取50100mg牛蛙皮肤组织放入千烤过的研钵中，加入lmLTRIZOLReagent(Invitrogen公司产品)迅速在冰水浴中研磨。B.充分混匀后,移入1.5mL离心管中(DEPC管)1530°C放置5min,加入等体积氯仿，旋涡混匀15s,4°C，12000xg离心15min。C.取上清加入500^L异丙醇,153(TC放置5min，旋涡15s混匀，4°C,12000xg离心10min。弃上清,加入lmL75。/。乙醇漂洗沉淀，7500xg离心5min，重复1次。超净工作台中干燥90s，用30nLRNase-freewater溶解,即得到牛蛙皮肤组织总RNA。II.牛蛙皮肤mRNA分离纯化采用操作步骤按照德国QIAGEN公司的01igotex⑧mRNAMiniKiU式剂盒说明书进行。III.牛蛙皮肤cDNA文库的构建采用CLONTECH公司的CreatorSMARTcDNALibraryConstructionKit文库构建试剂盒。A.cDNA第一链合成(mRNA反转录)l.在05ml无菌的离心管加入luL牛蛙皮肤mRNA、lpLSMARTIV寡聚核苷酸、l^LCDSm/3'PCR引物，力fl2去离子水使总体积达到5pL。2.混匀离心管中的试剂并短暂离心，72°C保温2分钟。3.将离心管在冰上孵育2分钟。4.在离心管中加入以下试剂2pL5X第一链缓冲、10^L20mM二硫苏糖醇、l.O^LdNTP(10mM)混合物、1.0Powerscript反转录酶。5.混合离心管中试剂并短暂离心，在42°C保温1小时。6.将离心管置于冰上中止第一链的合成。7.从离心管取2pL所合成的cDNA第一链备用。B.采用长末端聚合酶链式反应(LD-PCR)方法扩增第二链1.95°C预热PCR仪。2.将2pLcDNA第一链(mRNA反转录)、80pL去离子水、10pL10*Advantage2PCR缓冲液、2pL50*dNTP混合物、2pL5'PCR引物、2pLCDS111/3'PCR引物以及2^L50*Advantage2PolymeraseMix离心管进行反应。3.在PCR仪中按以下程序扩增-95°C1分钟；②22个循环95°C15秒钟，68°C复性6分钟。4.循环结束后，将离心管中合成的cDNA双链进行纯化。C.cDNA双链的纯化1.蛋白酶K的消化在一个0.5mL的试管中加入50"L经扩增得到的双链cDNA(2-3yg)产物，然后向其中加入2uL的蛋白酶K(20iig/iiL)。注意用蛋白酶K处理抑制DNA聚合酶的活性是非常必要的。该系统在操作过程中经过优化最佳的PCR产物cDNA的量为2-3ug(50uL体系)。过多的双链cDNA会降低文库的效价。2.颠倒混匀，45。C，20分钟。3.加50UL去离子水。4.加100uL苯酚:氯仿:异戊醇，连续轻柔的颠倒混合1-2分钟。5.14,000rpm，5min，使其两相分离。6.将上层(水相)移入洁净的0.5ml的试管(弃去界面和下层液体)。7.加100ul氯仿:异戊醇，连续轻柔的颠倒混合l-2分钟。8.14,000rpm，5min，使其两相分离。9.将上层(水相)移入洁净的0.5ml的试管(弃去界面和下层液体)10.加入3MNaAc醋酸钠10yL、Glycogen糖原(20ug/uL)1.3uL、95%乙醇(室温)260uL，14，OOOrpm，室温离心20分钟。注意在离心之前不要对样品进行-2(TC预冷或者冰浴，对离心管的冷却将导致样品和杂质一起沉淀。11.用枪小心的移去上清，枪头不要碰到析出物，用100uL80X的乙醇清洗析出物。12.蒸发乙醇，在空气中干燥析出物，加去离子水悬浮析出物。D.大肠杆菌DH5cx感受态细胞的制备1.挑取大肠杆菌DH5a单菌落划线接种在新鲜LB琼脂平板上，37'C过夜。挑取单菌落接种到25mL的LB液体培养基中。2.以220-225rpm37'C振摇过夜。取10mL过夜培养物接种到1LLB中。在37'C剧烈振摇培养直到OD6。Q达到0.5-0.7，冰浴lh。3.把菌液转移到灭菌的预冷的离心瓶中。以4000rpm(2800xg)4'C,15min。去上清液，瓶子放在冰上。轻轻地用1L冰预冷的10%甘油重悬沉淀。4.4000rpm(2800xg)4'C，15min，轻轻地用0.5L冰预冷的10%甘油重悬沉淀。5.4000rpm(2800xg)4°C,15min，轻轻地用250mL冰预冷的10%甘油重悬沉淀。6.4000rpm(2800xg)4°C，15min。用甘油重悬使最终体积达3.5mL。细菌密度大约为3xlO"细胞/mL。等体积分装为100pL/份，迅速放于干冰中，在-8(TC贮存感受态细胞。7.用超螺旋载体如PUC19进行转化验证感受态。应产生至少80.5-lxl0^cfu/ug的细胞。E.连接以及连接产物的转化1.在微量离心管中加入0.3pLTaKaRapMD18-T载体、2.2^L牛蛙cDNA双链溶液、加入2.5|aL的SolutionI，全量为5pL。2.16'C连接过夜.3.全量(5pL)加入至100pLDH5a感受态细胞中，冰浴30分钟。4.42t:热击90秒钟后，冰浴2分钟。5.加入LB培养基800pL,37°C缓慢振荡培养(60-80转/min)45-60分钟。6.取200pL涂布于含有Amp+的LB培养基上37°C培养16小时，形成单菌落。7.每个LB平皿用5mLLB液体培养基洗涤菌落，加30%甘油冻存。本实验构建的cDNA文库大约含lx106个单独克隆。IV.牛蛙抗菌肽基因克隆筛选扩增引物长度为20个核苷酸，其序列为5'-ATGTTCACCWTGAAGAAATC-3'，PCR另一扩增引物为CLONTECH公司SMARTcDNALibraryConstructionKit中的5'PCRPrimer引物，其序列为5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCC-3'。PCR反应条件如下94。C30秒，5(TC30秒，72°C2分钟，共35个循环，72°C10分钟。V.牛蛙抗菌肽基因序列测定和结果提取质粒并用M13+与M13-测序，仪器为ABIPRISM3730全自动核苷酸序列测定仪，基因测序结果自5'端至3'端序列为atgttcaccatgaagaaatccctgttactcctttttttccttggggccctcaactttttt60atttgtggggaagggggggatgttg^tca卿tg犯卿agggatgattccggtg犯鄉120aatgttcaaatggaaaaacgattgtttcggcatgttgtaaagatttttgaaaaatatttg180ggaaaataacccgaaa/tgttgaaactttgaaaatggaattggaaatcatttgatgtggaa240tattatttggctaaatgctcaacagatgttttataaaaataaataaatatgttgcaaaaa300322牛蛙抗菌肽基因核苷酸的序列表为序列长度分别为322个碱基，序列类型核酸，链数单链，序列种类CDNA，来源牛蛙皮肤9编码牛蛙成熟肽抗菌肽分别为第142-180位核苷酸，其氨基酸序列为LeuPheArgHisValValLysHePheGluLysTyrLeu—AMIDAT腹合成的牛蛙抗菌肽具有显著的抑制细菌和真菌生长的作用，可以作为制备病原微生物感染疾病的治疗药物被应用。实施例2:制备牛蛙抗菌肽I、样品的制备方法根据编码牛蛙抗菌肽的基因推断牛蛙抗菌肽的氨基酸序列，用自动多肽合成仪APEX396合成其全序列。通过HPLC反相C化柱层析脱盐、纯化。II、分子量测定采用电喷雾电离(elec加sprayionization,ESI)，发射电压为4.5Kv。III、纯化的牛蛙抗菌肽用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度(流速l.Oml/min;流动相乙腈+水+TFA0.01。/。，梯度洗脱；色谱柱ds，检测波长220nm)，分子量测定采用快原子轰击质谱法，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。牛蛙抗菌肽是无尾两栖类动物牛蛙抗菌肽基因编码的一种单链多肽，分子量为1691.11道尔顿，等电点为9.70，多肽全序列一级结构为亮氨酸一苯丙氨酸一精氨酸一组氨酸一缬氨酸一缬氨酸一赖氨酸一异亮氨酸一苯丙氨酸一谷氨酸一赖氨酸一酪氨酸—亮氨酸一酰胺化(LeuPheArgHisValValLysliePheGluLysTyrLeu—AMIDATION)。权利要求1、一种牛蛙抗菌肽temporin-Lb，其特征在于为牛蛙抗菌肽基因编码的一种单链多肽，分子量分别为1691.11道尔顿，等电点为9.70，多肽全序列一级结构为LeuPheArgHisValValLysIlePheGluLysTyrLeu-AMIDATION。2.—种牛蛙抗菌肽temporin-Lb基因的核苷酸序歹(j，其特征在于cDNA由322个核苷酸组成，其自5'端至3'端序列分别为atgttcaccatgaagaaatccctgttactcctttttttccttggggccctcaactttttt60amgtggggaagggggggatgttgatca卿tgaa卿agggatgaUccggtgaa郷120aatgttcaaatggaaBaacgattgtttcggcatgttgt犯agatttttgaaaaatatttg180ggaa犯taacccgaaatgttga犯ctttgaaaatggaattggaa^tcatttgatgtggaa240tattatttggctaaatgctcaacagatgttttataaaaataaeLtaaatatgttgcaaaaa3003.权利要求2所述的牛蛙抗菌肽基因核苷酸序列，其特征在于，编码牛蛙抗菌肽为142-180位核苷酸，其氨基酸序列为LeuPheArgHisValValLysliePheGluLysTyrLeu—AMIDATION。4.权利要求1所述的牛蛙抗菌肽temporin-Lb，在制备治疗病原微生物感染疾病的药物和肿瘤药物的应用。全文摘要本发明涉及一种牛蛙抗菌肽temporin-Lb及其基因和在制药中的应用，属于生物医学领域。本发明的牛蛙抗菌肽基因是从构建的牛蛙皮肤cDNA文库中筛选得到的，分子量为1691.11道尔顿，等电点为9.70，多肽全序列一级结构为LeuPheArgHisValValLysIlePheGluLysTyrLeu-AMIDATION。编码牛蛙抗菌肽的基因由322位核苷酸，其中编码成熟肽的为第142-180位核苷酸。人工合成的牛蛙抗菌肽具有明显的抑制细菌和真菌生长的作用，可以作为制备病原微生物感染疾病的治疗药物被应用。文档编号C12N15/12GK101503459SQ200810051639公开日2009年8月12日申请日期2008年12月22日优先权日2008年12月22日发明者新冯,孙长江,赵瑞利,雷连成,韩俊友,韩文瑜申请人:吉林大学