一种高通量定向t载体克隆方法

专利名称：一种高通量定向t载体克隆方法
技术领域：
本发明涉及的是生物基因克隆表达技术，特别是一种可视高通量定向T载体克隆方法，特别适合用于大规模精确快速的克隆PCR产物，并在同一载体上表达对应ORF。

背景技术：
随着越来越多的物种全基因组序列测定工作的完成，基因功能及基因间的相互作用日益成为分子生物学研究的热点。研究人员利用各种生物信息学工具对全基因组序列进行分析，获取有重要价值的基因序列信息，并由已知序列设计引物扩增DNA并克隆表达，再进行相关结构、功能的研究，这些工作加快了生命科学研究的进程，然而如何大规模精确的克隆这些各种长度的基因片段便成为限制众多研究人员工作开展的瓶颈。
传统的克隆PCR产物方法利用PCR引物5′端引入限制性酶切位点进行克隆，在应对高通量克隆时体现了其自身的不足，其不足有四点第一点不足，引物的合成成本高。由于引物5′端引入酶切位点以及保护碱基，引物的合成成本将会提高1/3。第二点不足，针对每一个ORF(开放阅读框)或者基因片段，需要考虑在两条PCR引物5′端引入的限制性酶切位点有可能也同时存在于ORF或者基因片段中，酶切时这些基因片段就会被切断使基因不完整或者无法克隆，无法实现通量化。第三点不足，PCR扩增的片段需要经过回收-酶切-回收才能进行酶学连接反应，会耗费大量的人力物力。第四点不足，克隆的效率不高，克隆的转化子需要酶切或者PCR鉴定，不利于高通量操作。
为了克服传统克隆方法的不足，目前已有几家公司推出了高通量克隆表达系统，如In-FusionTM PCR Cloning Kits(Clontech Laboratories，Inc.)，

technology(invitrogen，Inc.)，

cloning(invitrogen，Inc.)，这些商业公司开发的克隆方法在一定程度上克服了传统的克隆方法的不足，满足了高通量克隆发展的需求，但是这些商业公司开发的克隆产品也存在不足，他们的不足之处表现在 第一，引物成本方面，In-FusionTM PCR Cloning，

entry clone，要求在设计PCR两对引物时都带上额外的碱基序列，这些碱基数目通常大于或者等于2×15nt。(

entry clone要求额外的61 nt附加碱基序列，

cloning要求2×(9～16)nt，较长的碱基序列意味着较高的合成成本和错误几率，这些不利于发展高通量技术，亟待克服。
第二，克隆的效率方面，In-FusionTM PCR Cloning，

cloning，

cloning，都要求体外的酶学反应，而且这些反应都是可逆的，如果克隆片段较大，克隆效率就会大大降低。
第三，这些克隆方法的下游鉴定占用了大量的时间和人力物力，普通的克隆方法获得的转化子需要进行下游传统而又繁琐的鉴定，这些鉴定包括抽提质粒比较大小鉴定，PCR鉴定，酶切鉴定及测序鉴定(传统的T-A克隆还无法做到定向克隆，这时还需要针对定向进行酶切和PCR再鉴定)。就目前的高通量克隆而言，鉴定这个过程一般要求48小时以上，难以适应日益发展的基因功能组学研究的步伐。
第四，这些克隆方法不适合做基因非融合表达研究。由于基因上游或者下游通过引物引入较多的额外必需碱基，这些克隆方法也不能够做到真正意义上的无缝克隆(seamless cloning)，融合的蛋白质间也会由于基因上游或者下游引入的额外必需碱基而产生额外的氨基酸，而这些氨基酸并不是一个对实验结果追求精益求精的研究人员所需要的。
第五，克隆的时间周期长，从研究人员获取基因至真正找到肯定的含有插入片段的重组子，一般要求在72小时以上，难以满足蓬勃发展的基因功能及蛋白质间的相互作用研究的需求。
第六，实验的成本依然比较高，首先，无论是In-Fusion反应酶混合液，拓扑异构酶，还是λ整合酶、整合宿主因子蛋白质和切除酶，都比较昂贵；其次，通过测序分析依旧占用了很大比例的研究成本。
(参见期刊Genome-Scale Cloning and Expression of Individual OpenReading Frames Using Topoisomerase I-Mediated Ligation.Genome Res.，Apr 1999；9383-392. An efficient plasmid vector for expression cloning of large numbersof PCR fragments in Escherichia coli.Appl Microbiol Biotechnol(2007)77241-244 Cloning technologies for protein expression and purification.Current Opinion in Biotechnology Volume 17，Issue 4，August 2006，Pages359-366Protein technologies)

发明内容
本发明方法提供了一种快速经济的高通量克隆技术，利用该方法仅通过蓝白斑筛选实现重组子筛选、克隆定向。该方法构建的载体既可以当作普通的T载体使用，也可以直接作为基因表达载体使用，通过该方法可以针对任意的载体实现任意位点插入目的基因(融合或者非融合方式)，并且所见即所得，直接可以进入下游的操作。
本发明是通过载体和克隆片段间重构完整的乳糖操纵基因序列(LacO)实现定向克隆和无鉴定克隆的；同时该发明引进特定的IIS型限制性内切酶位点实现融合和非融合T载体的构建(如原理图1)，其内容如下 1、选定合适的IIS型限制性内切酶位点和乳糖操纵基因序列(LacO)。
首先选择IIS型限制性内切酶，其标准是选择的IIS型限制性内切酶识别位点在载体上应该尽可能的稀有。IIS型限制性内切酶在目的识别位点之外切开DNA，本发明所用IIS型限制性内切酶的识别和切割位点如下所示
其中识别位点为方框中的a个特定碱基X，切割位点在n个任意碱基N之后，并突出3′端任意碱基N。如Bfu I和Bfi I同属于符合本发明要求的IIS型限制性内切酶，其识别位点和切割位点如下 Bfu I
Bfi I
再选择特定的乳糖操纵基因序列(LacO)，LacO序列有多种形式，但目前认为有以下五种。一般来说长的乳糖操纵基因序列对转化子筛选定向更加有利，本发明选择的LacO为下图中的D形式。用其他形式原理与此相同。


方框中为乳糖操纵基因序列(LacO)的保守碱基。
2.诱变目标载体。选定任意目标载体，对目标载体进行定点诱变，消除目标载体上在步骤1中选定的IIS型限制性内切酶位点和潜在的LacO序列(Bfu I是符合实验要求的IIS型限制性内切酶，以下用Bfu I位点代替符合实验要求的IIS型限制性内切酶识别位点)。
3.引入酶切位点和填充片段。诱变完成后，利用酶切连接或者PCR在紧邻着目标载体所需要的融合区域后引入两个相同的限制性酶切位点Bfu I和任意填充片段(如绿色荧光蛋白基因gfp)，以及13bp的部分LacO序列。即在目的融合区域后插入如下片段Bfu I酶切位点——填充片段——Bfu I酶切位点——13bp的部分LacO序列，获得如原理图1中A-载体结构的载体 4.制备T载体。获得步骤3中的含有填充片段的载体后，用Bfu I酶切载体回收不含有填充片段的载体，即制备得到需要的T载体，结构如原理图1中T载体所示，其3′端均各突出一个“T”。
5.扩增目的片段。针对特定的目的片段设计一对如原理1所示的PCR或者RT-PCR引物F1、R1进行扩增反应。上游引物F1无特殊要求(融合表达时必需考虑读框一致，简单克隆片段无要求)，PCR下游引物R1需要在5′端加上7个碱基的部分LacO序列5′C A C AA T T 3′(如原理图1引物R1末端)，PCR或者RT-PCR反应使用3′末端转移酶活性的Taq酶进行扩增；或者利用3′-5′proof-reading活性DNA聚合酶扩增，然后产物通过rTaq和dATP或者T4DNA聚合酶和dATP处理补加“A”。
6.连接和转化。步骤5中片段无需回收，和步骤4中制备的T载体连接即可快速转化lac+的菌株感受态细胞或者含有lac+单元的菌株感受态细胞(如DH10β)，将转化菌液涂布LB平板，平板含有载体带有抗性基因对应抗生素和15～30μg/ml X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)，37℃左右，避光培养。高于30μg/ml的X-gal浓度更有利于缩短显色时间，X-gal浓度不应该低于15μg/ml，否则步骤7中显色时间会偏长，将导致获得少许的假阳性克隆。
7.挑取目的转化子。培养9-16小时，挑取步骤6中平板上蓝色转化子，抽提质粒，所获得的质粒即是重组分子，按照最初克隆要求，可以直接进行下游的操作，如表达，下游的基因操作等，但为了测试该方法的重组效率可以同时进行菌落PCR鉴定，在实际操作中，这个过程一般不需要，它获得的结果仅仅作为抽检质量控制标准使用。
通过本发明方法获取的克隆通过PCR鉴定99％以上含有插入目的片段，且插入方向正确。本发明方法构建的融合载体可以实现任意位点任意融合，可以按照设计者的要求，进行融合和非融合表达，而且融合表达可以做到完全无缝融合，由于不存在鉴定过程，本方法从获得基因到获得定向的目的重组子耗时一般小于12小时。
Bfu I(或Bfi I)都属于IIS型限制性内切酶，它们在识别位点之外切开DNA，利用其切开的序列为非固定序列，且为非对称结构，可以方便的进行不带任何额外氨基酸的融合表达接头设计，同时它们切开的突出末端为任意碱基，利用这一特性在序列设计的时候可以定义突出末端碱基为“T”，这样就可以方便的设计为T载体，利用Bfu I(或Bfi I)酶切便获得克隆和融合表达T载体。
本发明方法构建的定向T载体工作原理是如原理图1示正向连接的克隆将重构完整的20bp乳糖操纵基因，竞争性吸附宿主菌表达的LacI蛋白，使宿主菌的乳糖启动子控制的全长β-半乳糖糖苷酶基因表达解抑制，当转化平板补加适当浓度对应抗生素和X-gal时，正向连接的克隆转化子表达β-半乳糖糖苷酶，分解X-gal(半乳糖类似物)，使正向连接的克隆转化子呈现蓝色；如果载体自连、片段反向插入、载体酶切回收污染、杂菌污染等由于无法使β-半乳糖糖苷酶基因表达解抑制，将呈现白色。
本发明与现有的技术比较有如下优势 1.本发明方法克隆引物设计简单，对于融合引物设计提供了“start tostop codon”方式，甚至可以更加灵活变通。具体实施过程中仅仅需要在反向引物的5′端加上特定的7个碱基。这些过程完全可以通过程序语言完成。更重要的是利用这种克隆方式设计引物，比商业化克隆要求设计的引物更短，可以节约1/3左右的引物成本，短引物避免了长引物化学合成的错误，以及这种错误导致的基因融合下游读框移码、终止等风险。
2.本发明方法克隆的效率高，通过本方法克隆得到转化子数目大于三千个，且菌落蓝色的经过鉴定全为定向的目的重组子。该方法对片段大小的兼容性强于上述商业化产品，尤其在克隆极其小的片段时，该发明方法具有明显的优势(理论上可以小至一个碱基)。
3.利用本发明方法获得的重组子无需后续鉴定。传统方法和商业的试剂盒实验获得的转化子一般需要进行鉴定，这些鉴定包括，抽提质粒比较大小鉴定，PCR鉴定，酶切鉴定，(并且传统的T-A克隆无法做到定向克隆，这时还需要针对克隆片段定向进行酶切和PCR再鉴定)测序鉴定。就现有高通量克隆而言，鉴定这个过程一般要求48小时以上。本方法从获得基因到获得定向的目的重组子仅仅需要12小时，无需后续鉴定。
4.本发明方法兼容传统的克隆方法，尤其适用于构建克隆文库，PCR或者RT-PCR产物可以直接克隆并在同一个载体实现表达，表达形式可以是融合的，也可以是非融合的，可以构建原核载体，也可以构建真核载体。
5.本发明方法非常适合于融合表达克隆和非融合表达克隆的构建，并且不会因为引物引入额外的碱基和载体引入酶切位点而导致表达的蛋白质会多出几个或者更多的氨基酸，真正的做到生物资源“零”浪费，不仅如此“零”浪费带来的是更加可靠的下游实验结果，因为用本方法构建的载体所表达的感兴趣蛋白质在序列上是更加忠实于设计者初衷的。
6.本发明方法从获得基因到获得定向的目的重组子仅仅需要12小时，无需后续鉴定。本方法构建的表达克隆从获得基因到获得目的蛋白质耗时小于36小时，能够真正的适应蓬勃发展的基因组功能及基因间的相互作用研究的需求。
7.利用本发明方法实验的成本非常低。利用该方法不需要购买昂贵的酶(In-Fusion反应酶混合液，拓扑异构酶，λ整合酶、整合宿主因子蛋白质和切除酶等)，本发明方法实验仅需要常规克隆酶，如Taq酶，连接酶和限制性内切酶Bfu I(或Bfi I)，成本不足商业方法1/100。该方法非常适用于高通量高质量的基因组功能及蛋白质间的相互作用研究。



图1为本发明一种高通量定向T载体克隆方法原理图， 图2为本发明构建的定向表达克隆T载体peTG图谱， 图3为本发明构建的定向表达克隆T载体peTG关键部分序列， 其中图示1中A-载体为任意载体经过发明内容中1、2、3步骤改造得到的含有填充片段的载体，该载体含有盒式结构(Bfu I酶切位点——填充片段——Bfu I酶切位点——13bp的部分LacO)，图中(N)n为任意填充片段。载体经过Bfu I酶切，切下填充片段回收载体片段后即获得图示中的T载体，该T载体的3’端各有一个突出的碱基T同时一端的内侧含有13bp LacO碱基序列。F1和R1是为PCR设计的一对上、下游引物，待克隆的片段经过扩增后下游带上5’cacaatt 3’7个碱基的序列，同时片段的3’末端各转移上一个脱氧核糖核苷酸“A”，该扩增片段同T-载体连接后形成重组分子，转化含有lac+单元的菌株感受态细胞(如DH10β)，重组子(Recombinant)克隆将重构完整的LacO序列，竞争性吸附宿主菌表达的LacI蛋白，使宿主菌的乳糖启动子控制的全长β-半乳糖糖苷酶基因表达解抑制，水解底物平板上的X-gal，含有正确方向插入片段的转化子将显蓝色，如果载体自连、片段反向插入、载体酶切回收污染、杂菌污染等由于无法使β-半乳糖糖苷酶基因表达解抑制，菌落将呈现白色。
图2中Ori为衍生自PBr322的复制子，bla为编码β-内酰胺酶的基因，f1 origin为F1 phage复制子，gfp为绿色荧光蛋白基因，6×His Tag为组氨酸串联纯化标签，T7 promoter为T7 phage启动子，LacO为乳糖操纵基因，NdeI、Xho I、Bfu I分别为Nde I、Xho I、Bfu I限制性酶切位点。
图3是定向表达克隆T载体peTG关键部分序列，包含自3425-4492碱基序列，起点自图2中Nde I位点，终点为图2中Xho I位点，Nde I位点和Xho I位点之间含有盒式结构Bfu I酶切位点——gfp——Bfu I酶切位点——13bp的部分LacO。

具体实施例方式 下面以实施例对本发明进行详细说明 实施例一 利用本发明方法构建定向克隆人肝蛋白基因BIRC4和CDK9的表达载体，基因直接与6×His无缝融合表达。实施例具体操作如下 1、选择pet-23a载体，诱变消除载体上的Bfu I位点和潜在的LacO序列。
2、诱变后得到的载体用Nhe I和Xhol I双酶切，回收得到约2.6kb的片段。设计一对引物GFPBF、GFPBR*扩增填充片段gfp，同时上下游引物分别引入两个Bfu I位点，下游引入13bp部分LacO序列，利用该对引物扩增填充片段gfp，回收得到约1kb片段，与回收的载体重组获得peTG载体(载体图谱如图2，载体关键克隆位点序列如图3)。
3、Bfu I酶切peTG载体，回收约2.6kb的T载体片段。
4、设计两对RT-PCR引物BIRC4F、BIRC4R和CDK9F、CDK9R*，以HEK293T细胞总RNA为模板M-MLVRTAse反转录扩增人肝蛋白基因BIRC4和CDK9。
5、步骤4中扩增获得的片段直接连接步骤3中制备的T载体，30分钟后快速转化DH10β感受态细胞，转化菌液涂布LB平板，平板含有50μg/ml Amp和30μg/ml x-gal，避光培养，9-16小时内挑取蓝色菌落，进行菌落PCR检测阳性正向克隆，同时挑取蓝色转化子直接裂解转化BL21 Codon Plus，菌液培养到OD600＝0.4时，补加IPTG(0.1mM)诱导4小时，SDS-PAGE检测蛋白质表达水平。
通过本发明方法获取的克隆经过PCR鉴定99.8％以上为目的转化子。蓝色转化子直接裂解转化BL21 Codon Plus，经过SDS-PAGE检测，上述两基因均有高水平表达。
扩增填充片段gfp的引物GFPBF、GFPBR序列如下 GFPBF引物序列 aagaaggagatatacatatgcaccatcatcatcatcattcttcggatacgccgttcgctgtgtcgca ---载体克隆序列-------6×His--------T---Bfu I-----GFPprimer---- GFPBR引物序列 ggtggtggtgctcgagaattgtgagcgctctagaggatactcacttgtacagctcgtccatgc -载体克隆序列---13bp LacO----T---Bfu I----GFP primer---------- RT-PCR引物序列如下 BIRC4Fatggcagacaatttttcgctc BIRC4Rcacaattttatatcatggtatatgaagcactgg 7bp LacO CDK9Fatgggaaccccaaagcca CDK9Rcacaattttattggttgaggtggtgggg 7bp LacO 该实施例使用的LacO为发明内容中的D形式 实施例二 利用本发明方法构建ORF定向融合的哺乳动物双杂交T载体，克隆并融合转录因子ICAM1和E2F-6。
1、选择哺乳动物双杂交载体之一pACT，诱变消除载体上的Bfu I位点和和潜在的LacO序列。
2、诱变完成后在VP16下游插入同上实施例的gfp填充片段(引物如下注释中GFPAF、GFPAR*)，同样gfp上下游分别引入两个Bfu I位点，下游引入13bp部分LacO序列。具体为利用iPCR以pACT为模板，引物iPCRF、iPCRR*反向扩增得到的载体片段与填充片段重组，获得改造后的哺乳动物双杂交载体pACTG。
3、Bfu I酶切pACTG后，回收约5.5kb的T载体。
4、设计两对RT-PCR引物ICAM1F、ICAM1和E2F-6F、E2F-6R，以HEK293T细胞总RNA为模板M-MLVRTAse反转录扩增人肝蛋白基因ICAM1和E2F-6。
5、步骤4中扩增获得的片段直接连接步骤3中制备的T载体，30分钟后快速转化DH10β感受态细胞，转化菌液涂布LB平板，平板含有50μg/ml Amp和30μg/ml x-gal，避光培养，9-16小时内挑取蓝色菌落保存，菌落PCR鉴定。
通过本发明方法获取的克隆通过PCR鉴定99％以上含有目的片段，且插入方向正确。
iPCR引物序列如下 iPCRF5’tgaataactaaggccgcttccctt 3’ iPCRR5’acccggacccggggaat 3’ 扩增GFP填充片段引物序列如下 GFPAFtccccgggtccgggtttcttcggatacgccgttcgctgtgtcgca --载体克隆序列-T---Bfu I------GFP primer----- GFPARggccttagttattcaaattgtgagcgctctagaggatactcacttgtacagctcgtccatgc --载体克隆序列--13bp LacO--T---Bfu I-----GFPprimer----------- RT-PCR引物序列如下 ICAM1F5’atggctcccagcagcccc 3’ ICAM1R5’cacaatt cccccaccacttcccctctc 3’ 7bp LacO E2F-6F5’atgagtcagcagcggccg 3’ E2F-6R5’cacaattaagatattcccaaaaaactcagtgat 3’ 7bp LacO 该实施例使用的LacO为发明内容中的D形式。
权利要求
1、一种高通量定向T载体克隆方法，其特征在于具体步骤如下
A、选定合适的IIS型限制性内切酶位点和乳糖操纵基因序列(LacO)，
首先选择IIS型限制性内切酶，IIS型限制性内切酶在目的识别位点之外切开DNA，本发明所用IIS型限制性内切酶的识别和切割位点如下所示
其中识别位点为方框中的a个特定碱基X，切割位点在n个任意碱基N之后，并突出3′端任意碱基N；
再选择特定的乳糖操纵基因序列(LacO)，LacO序列有下列五种
方框中为乳糖操纵基因序列(LacO)的保守碱基；
B.诱变目标载体，选定任意目标载体，对目标载体进行定点诱变，消除目标载体上在步骤1中选定的IIS型限制性内切酶位点和潜在的LacO序列；
C.引入酶切位点和填充片段，诱变完成后，利用酶切连接或者PCR在紧邻着目标载体所需要的融合区域后引入两个相同的限制性酶切位点Bfu I和任意填充片段，以及13bp的部分LacO序列，即在目的融合区域后插入如下片段Bfu I酶切位点——填充片段——Bfu I酶切位点——13bp的部分LacO序列，获得含有任意填充片段的载体；
D.制备T载体，获得步骤3中的含有填充片段的载体后，用Bfu I酶切载体回收不含有填充片段的载体，即制备得到需要的T载体，其3′端均各突出一个“T”；
E.扩增目的片段，针对特定的目的片段设计一对PCR引物F1、R1进行PCR或者RT-PCR扩增反应，PCR上游引物F1无特殊要求，PCR下游引物R1需要在5′端加上7个碱基的部分LacO序列5′CACAATT3′，PCR反应使用3′末端转移酶活性的Taq酶进行扩增；或者利用3′-5′proof-reading活性DNA聚合酶扩增，然后产物通过rTaq和dATP或者T4DNA聚合酶和dATP处理补加“A”；
F.连接和转化。步骤5中片段无需回收，和步骤4中制备的T载体连接即可快转lac+的菌株感受态细胞或者含有lac+单元的菌株感受态细胞(如DH10β)，将转化菌液涂布LB平板，平板含有对应抗生素和15～30μg/ml X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)，37℃左右，避光培养；
G.挑取目的转化子，培养9-16小时，挑取步骤6中平板上蓝色转化子，抽提质粒。
全文摘要
本发明提出了一种高通量定向T载体克隆方法，它是选定合适的IIS型限制性内切酶位点和乳糖操纵基因序列(LacO)，通过载体诱变酶切连接转化和克隆片段间重构完整的乳糖操纵基因序列(LacO)，实现定向克隆和无鉴定克隆的；实现融合和非融合T载体的构建。本发明引物设计简单、克隆的效率高、耗用时间短、成本非常低、获得的重组子无需后续鉴定并兼容传统的克隆方法。
文档编号C12N15/66GK101307321SQ20081004798
公开日2008年11月19日 申请日期2008年6月12日 优先权日2008年6月12日
发明者马立新, 星 钟 申请人:湖北大学