专利名称：用微生物混合菌株制备红景天液态转化发酵物的方法
技术领域：
本发明属于从红景天藏中药材中提取有效活性成分的技术领域，具体涉及一种用 微生物混合菌株制备红景天液态转化发酵物的方法，该方法使发酵物中所含的有效活, 性成分大大提高。
背景技术：
红景天是指景天科红景天属植物，在世界上有卯余种，多分布在北半球的高寒地 带，大多数都生长在海拔3500-5000米左右的高山流石或灌木丛林下。我国现发现有 73种，主要分布在我国西藏的高山高寒地带，另外东北、西北、华北的一些地区也有 红景天资源分布。
红景天的主要药用部位是根茎，其中所含的主要有效成份红景天甙和酪醇(甙元)， 具有抗疲劳、抗缺氧、抗诱变和抑制肿瘤等功效，且无副作用(宋月英等，红景天属植 物化学成分及药連作用的研究进展中草药.2004， 35(2),235-236;李刚等藏药红景天 的药理学研究进展中国民族医药杂志.2004， 10(3).-38-40;王家明闫继平王盛虔 红景天的药理作用研究进展中医药学报.2003，31(4),57-59)，因此，在药品和保健食 品的开发中得到了广泛的应用。
由于对红景天的大量开发利用，使这种高原藏区野生药材资源已面临枯竭的危机。 而目前采用的红景天活性成分制备工艺大多是用醇类(乙醇等)直接浸泡红景天原料 .进行提取。这种方法只能提取其中存在的有效活性成分，而其中的有效活性成分含量 又很低，如红景天苷的含量约为0.6~0.7%。面对大量的社会需求，如何在当前提取法 的基础上开发新的制备方法，以提高红景天原药材的利用率，已成为当前本领域急需 解决的问题。己报道的新工艺方法有化学合成法，植物细胞组织培养法以及用单一菌 株的微生物转化法。这些方法均是在醇类提取工艺之前，欲通过不同来源获得或增加 有效成分，期望减少野生资源的用量。其中微生物转化法从提高红景天本身的有效成 分来说是最具应用前景的方法，如专利申请"一种微生物转化制备红景天提取物的方 法"(申请号200610146107.2 )公开的技术就是采用单一微生物菌株进行转化发酵的 方法。虽然该方法能提高红景天本身的有效成分，但因其最高只能提高有效活性成分
含量约30%，故提高有限，还不够理想，尤其是作为增加了微生物菌株转化发酵工序 所带来的成本，与所提高的有效活性成分含量的价值相比，只能处于盈亏平衡点附近， 使其生产应用价值不大。
发明内容
本发明的目的是针对已有的采用单一微生物菌株进行转化发酵提高红景天有效成 分方法存在的缺陷，提供一种用微生物混合菌株制备红景天液态转化发酵物的方法， 该方法能大幅提高红景天原药材中有效活性成分，在利用同等量原药材的条件下，能 获得更多的提取产物，使野生藏中药材得到充分利用。
本发明提供的用微生物混合菌株制备红景天液态转化发酵物的方法，该方法的工艺 步骤和条件为
1) 将红景天根茎粉碎至60 120目，优选80 120目，更优选80目；
2) 在每100份的红景天粉中加入800 1000份水，优选800 900份，0.5~2份酵 母膏，优选1 2份，0.5 2份磷酸二氢钾，优选1 2份，和0.2 0.5份硫酸镁，优 选0.2份，搅拌混合均匀，使之成为红景天液态水悬液，并灭菌；
3) 在含红景天粉的液体种子培养基中分别制备曲霉属中的黑曲霉^^^^//^"/^" 和米曲霉(Ape^7/Mj 077加e)的菌丝培养物；
4) 将制备的两种霉菌的菌丝培养物按重量比2 8 : 8 2混合后，将混合菌丝培养 物接种于红景天液态水悬液中，接种量按湿重计为每100份水接种5 20份；
5) 将接种后的制备物在温度28 32'C下保温培养发酵48 60小时，优选温度30 'C，培养时间50小时即可，
以上所用物料份数均为重量份。
以上接种的菌丝培养物的湿重是指将培养出来的菌丝培养物离心除去水分后的重量。
该方法中对红景天液态水悬液灭菌可在常规条件下进行，如在温度121'C灭菌30 分钟。
该方法中所用的菌丝培养物是这样培养的先将粒径为80目的红景天粉和水按 1 : IO重量份混合，再按水的重量份计分别加入0.2%的酵母膏、0.1%的磷酸二氢钾和 0.05%的硫酸镁，配成液体种子培养基，然后在液体种子培养基中分别接入曲霉属 (Aspergillus)中的黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(Aspergillus oryzae)孢子，在温度 3(TC下摇床培养2天，离心后弃去上清液，收集菌丝沉淀。
其中所用的两种霉菌既可采用已有的曲霉属(^ pe/"gi'"w)中的黑曲霉 04wwgWw m'ger)和米曲霉04印erg///^ 0A7加e),也可采用本发明人从野生红景天药材 中分离纯化和筛选后得到的，优选后一种。本发明人从野生红景天药材中分离纯化和 筛选后得到的黑曲霉04^erg/〃"sw扭r)和米曲霉(^y;^gz7/M;y or;;z加)的具体方法是将 天然野生红景天药材捣碎，取lg，加入5ml无菌水，震荡摇匀，再用无菌水分别稀释 10、 100、 1000和10000倍。将以上各稀释液分别取0.1ml，涂布于分离培养基中，经 3(TC培养3天，挑取单菌落，选择在红景天培养基中转化发酵后，用高效液相色谱 (HPLC)检测，红景天苷含量提高的菌株。分离培养基配方是葡萄糖10g、蛋白胨 5g、酵母膏5g、磷酸二氢钾lg、硫酸铵0.5g、琼脂20g和水lOOOml。所分离出的两种 霉菌根据常规方法鉴定为曲霉属(A，W/to)中的黑曲霉(Asperg说^w/ger)和米曲霉
对于红景天植物中的主要有效活性成分红景天苷的含量，中国药典2005年版一部 规定药材中红景天苷的含量应>0.5%，而经实测天然红景天原药材中红景天苷的含量 约为0.6~0.7%。现有的红景天苷提取物的制备工艺是采用醇类(乙醇等)直接浸泡提 取，故只能提取已经存在的红景天苷。由于红景天的主要有效活性成分红景天甙及酪 醇(甙元)的合成属于次级代谢，即酪醇及红景天甙是在酚性结构基础上分别加上乙 醇基和葡萄糖基所形成。本发明人在研究时发现红景天植物中存在着一定的可转化的 前体，因而根据微生物具有丰富的的代谢多样性和很强的代谢能力，并具有在高等植 物体内存在的代谢途径，曾提出了用微生物的酶系来催化红景天原料中无活性的前体， 使之与葡萄糖基及乙醇基等成分合成酪醇及红景天甙，以提高红景天甙及酪醇(甙元) 含量的技术方案(专利申请号200610146107.2)。该技术方案的原理如下图所示
加上乙醇基 加上葡萄糖基
无活性的前体
微生物酶
酪醇(苷元)
微生物酶
红景天苷
但由于该方法采用的是单一菌株，虽然能提高有效活性成分的含量，但其提高量 较为有限。本发明人在进一步研究中，大胆打破"使用混合酶发酵比单一酶效果更差" 的惯性思维，进行了创造性的探索，提供了上述用曲霉属中的黑曲霉(^pe/"g!7^m'g^ 和米曲霉(^y; ergf//^ 0^加e)两种微生物混合菌株制备红景天液态转化发酵物的方法。 该方法能大幅提高红景天原药材中有效活性成分，使红景天苷的含量最高可比原药材 提高100%以上，因而在利用同等量原药材的条件下，能获得更多的提取产物，使野生
藏中药材得到充分利用。
由于经本发明方法发酵处理后所得的转化发酵物中红景天苷的含量最高可比原药 材提高100%以上，因而在获得同等量产物时，可减少原药材消耗。且还可通过以下经 济效益的分析计算中看出，单菌株转化法增效处于盈亏平衡点附近；而本方法增效是 单菌株转化法的8倍，具有很强的应用前景
按获得红景天苷同等含量计算，直接用乙醇浸泡的原工艺需消耗原药材1吨，单 菌株转化法需原药材770kg (按可提高30%来计算的)，本发明方法只需原药材500kg (按可提高100%来计算的)。又因单菌株转化法与本发明方法增加的生产成本相同，约 4000元/吨原药材。按购买每吨原药材需2万元计， 单菌株转化法
降低原料成本20000元/吨X230k^ 4600元， 增加的生产成本4000元/吨X770kgz 3080元
增加盈利4600元一3080元=1520元/770kg，相当于1974元/吨原药材。 本发明方法
降低原料成本20000元/吨乂5001^= 10000元。 增加的生产成本4000元/吨X500kg-2000元
增加盈利10000元一2000元=8000元/500kg，相当于16000元/吨原药材。 同时使野生资源的利用率提高1倍，从而可实现野生藏中药材的保护性开发，并 减少药渣等污染物的排量。
具体实施例方式
下面给出实施例以对本发明作出进一步说明，但所给出的实施例不能理解为对本 发明保护范围的限制，因而本专业的技术人员根据上述本发明的内容和设计思想所作 出的非本质的改进和调整也应属于本发明的保护范围。
另外，值得说明的是以下实施例所用物料份数均为重量份。 实施例1
本实施例为黑曲霉04^erg///^ w/ger)和米曲霉(^5;^^7/1 oo;zfle)菌丝的制取。 1)将天然野生红景天药材捣碎，取lg，加入5ml无菌水，震荡摇匀，再用无菌水 分别稀释IO、 100、 1000和10000倍。将以上各稀释液分别取0.1ml，涂布于由葡萄糖 10g、蛋白胨5g、酵母膏5g、磷酸二氢钾lg、硫酸铵0.5g、琼脂20g和水1000ml组成 的分离培养基中，经30'C培养3天，挑取单菌落，选择在红景天培养基中转化发酵后，
用高效液相色谱(HPLC)检测，红景天苷含量提高的菌株。
2)先将粒径为80目的红景天粉和水按i: io重量份混合，再按水的重量份计分
别加入0.2%的酵母膏、0.1%的磷酸二氢钾和0.05%的硫酸镁，配成液体种子培养基， 然后在液体种子培养基中分别接入第一步方法所获取的曲霉属(J^erg///^)中的黑曲 霉(^/^( ///^ "/ger)和米曲霉(A;^gz7/^ 0A7加e)孢子，然后在温度30'C下摇床培养2 天，离心后弃去上清液，分别收集菌丝沉淀，用离心机甩干备用。 实施例2
将100g红景天根茎原料粉碎至60目，然后加入0.5g酵母膏、0.5g磷酸二氢钾、 0.2g硫酸镁和800mL水，搅拌混合均匀，使之成为红景天液态水悬液，并用蒸汽在121°C 下灭菌30分钟；冷却后接种按实施例1方法制备的80g (湿重)的混合霉菌菌丝体， 其中黑曲霉^4印￡^///^ /^^和米曲霉(^pe/^〃MJOo;加e)的重量配比为8 : 2，然后在 30'C保温培养发酵50小时即可。
将获得的液态转化发酵物用高效液相色谱(HPLC)检测，红景天苷含量为1.3586%, 与同样条件检测的原始药材的红景天苷含量为0.7306%相比，经转化后发酵物中的红 景天苷含量可提高85.96%。
实施例3
将100g红景天根茎原料粉碎至80目，然后加入lg酵母膏、lg磷酸二氢钾、0.3g 硫酸镁和900mL升的水，搅拌混合均匀，使之成为红景天液态水悬液,并用蒸汽在121 °C 下灭菌30分钟；冷却后接种按实施例1方法制备的90g (湿重)的混合霉菌菌丝体， 其中黑曲霉^印e^7/t^"/g^)和米曲霉(^y，/^7/wwy加e)的重量配比为6 : 4，然后在 3(TC保温培养发酵50小时即可。
将获得的液态转化发酵物用高效液相色谱(HPLC)检测，红景天苷含量为1.4125%, 与同样条件检测的原始药材的红景天苷含量为0.7306%相比，经转化后发酵物中的红 景天苷含量可提高93.33%。
实施例4
将100g红景天根茎原料粉碎至80目，然后加入2g酵母膏、2g磷酸二氢钾、0.5g 硫酸镁和1000mL升的水，搅拌混合均匀，使之成为红景天液态水悬液，并用蒸汽在 121'C下灭菌30分钟；冷却后接种按实施例1方法制备的100g (湿重)的混合霉菌菌 丝体，其中黑曲霉^j^^7/附"/g勿和米曲霉(^ /^/^///^^^加)的重量配比为4 : 6, 然后在30'C保温培养发酵50小时即可。
将获得的液态转化发酵物用高效液相色谱(HPLC)检测，红景天苷含量为1.3639%， 与同样条件检测的原始药材的红景天苷含量为0.7306%相比，经转化后发酵物中的红 景天苷含量可提高86.68%。
实施例5
将100g红景天根茎原料粉碎至80目，然后加入l,2g酵母膏、1.2g磷酸二氢钾、 0.3g硫酸镁和800mL升的水，搅拌混合均匀，使之成为红景天液态水悬液，并用蒸汽 在121'C下灭菌30分钟；冷却后接种按实施例1方法制备的40g (湿重)的混合霉菌 菌丝体，其中黑曲霉f^pergz7/wsm'g勿和米曲霉04^ergi//^ 07加e)的重量配比为2 : 8， 然后在28'C保温培养发酵55小时即可。
将获得的液态转化发酵物用高效液相色谱(HPLC)检测，红景天苷含量为1.3255%， 与同样条件检测的原始药材的红景天苷含量为0.7306%相比，经转化后发酵物中的红 景天苷含量可提高81.43%。
实施例6
将100g红景天根茎原料粉碎至80目，然后加入1.5g酵母膏、1.5g磷酸二氢钾、 0.3g硫酸镁和800mL升的水，搅拌混合均匀，使之成为红景天液态水悬液，并用蒸汽 在121'C下灭菌30分钟；冷却后接种按实施例1方法制备的60g (湿重)的混合霉菌 菌丝体，其中黑曲霉(^^^7/1^"&^和米曲霉(^^ergz7tooo^ae)的重量配比为5 : 5， 然后在32'C保温培养发酵60小时即可。
将获得的液态转化发酵物用高效液相色谱(HPLC)检测，红景天苷含量为1.3910%， 与同样条件检测的原始药材的红景天苷含量为0.7306%相比，经转化后发酵物中的红 景天苷含量可提高90.39%。
实施例7
将100g红景天根茎原料粉碎至100目，然后加入2g酵母膏、2g磷酸二氢钾、0.4g 硫酸镁和800mL升的水，搅拌混合均匀，使之成为红景天液态水悬液，并用蒸汽在121°C 下灭菌30分钟；冷却后接种按实施例1方法制备的120g (湿重)的混合霉菌菌丝体， 其中黑曲霉^^e^7/^^g勿和米曲霉(A芦rgz7/woo^fle)的重量配比为3 : 7，然后在 3(TC保温培养发酵60小时即可。
将获得的液态转化发酵物用高效液相色谱(HPLC)检测，红景天苷含量为1.5738%， 与同样条件检测的原始药材的红景天苷含量为0.7306%相比，经转化后发酵物中的红 景天苷含量可提高115.41%。
实施例8
将100g红景天根茎原料粉碎至120目，然后加入1.5g酵母膏、1.75g磷酸二氢钾、 0.25g硫酸镁和800mL升的水，搅拌混合均匀，使之成为红景天液态水悬液，并用蒸 汽在121'C下灭菌30分钟；冷却后接种按实施例1方法制备的160g (湿重)的混合霉 菌菌丝体，其中黑曲霉(S4^wgz7/^ w/g勿和米曲霉(^perg///^ 00^e)的重量配比为7 : 3，然后在3(TC保温培养发酵48小时即可。
将获得的液态转化发酵物用高效液相色谱(HPLC)检测，红景天苷含量为1.8194%， 与同样条件检测的原始药材的红景天苷含量为0.7306%相比，经转化后发酵物中的红 景天苷含量可提高149.03%。
权利要求
1、一种用微生物混合菌株制备红景天液态转化发酵物的方法，该方法的工艺步骤和条件为1)将红景天根茎粉碎至60～120目；2)在每100份的红景天粉中加入800～1000份水，0.5～2份酵母膏、0.5～2份磷酸二氢钾和0.2～0.5份硫酸镁，搅拌混合均匀，使之成为红景天液态水悬液，并灭菌；3)在含红景天粉的液体种子培养基中分别制备曲霉属中的的黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(Aspergillus oryzae)的菌丝培养物；4)将制备的两种霉菌的菌丝培养物按重量比2～8∶8～2混合后，将混合菌丝培养物接种于红景天液态水悬液中，接种量按湿重计为每100份水接种5～20份；5)将接种后的制备物在温度28～32℃下保温培养发酵48～60小时即可，以上所用物料份数均为重量份。
2、 根据权利要求1所述的用微生物混合菌株制备红景天液态转化发酵物的方法， 该方法是将红景天根茎粉碎至80 120目。
3、 根据权利要求1或2所述的用微生物混合菌株制备红景天液态转化发酵物的方法，该方法是在每100份的红景天粉中加入800 900份水，1 2份酵母膏、1 2份 磷酸二氢钾和0.2 0.3份硫酸镁，搅拌混合均匀，使之成为红景天液态水悬液。
4、 根据权利要求1或2所述的用微生物混合菌株制备红景天液态转化发酵物的方法，该方法所用的菌丝培养物是先将粒径为80目的红景天粉和水按l : 10 重量份混合， 再按水的重量份计分别加入0.2%的酵母膏、0.1%的磷酸二氢钾和0.05%的硫酸镁，配成液体种子培养基，然后在液体种子培养基中分别接入曲霉属(Aspergillus)中的黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(Aspergillus oryzae)的孢子，在30℃温度下摇床培养2天，离心后弃去上清液，收集菌丝沉淀。
5、 根据权利要求3所述的用微生物混合菌株制备红景天液态转化发酵物的方法， 该方法所用的菌丝培养物是先将粒径为80目的红景天粉和水按1 : IO重量份混合，再 按水的重量份计分别加入0.2%的酵母膏、0.1%的磷酸二氢钾和0.05%的硫酸镁，配成液体种子培养基，然后在液体种子培养基中分别接入曲霉属(Aspergillus)中的黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(Aspergillus oryzae)的孢子，在温度30'C下摇床培养2天， 离心后弃去上清液，收集菌丝沉淀。
全文摘要
本发明提供了一种在红景天原药材的液态水悬液中，用微生物混合菌株进行转化发酵以提高红景天原药材中活性成分的方法。该方法是将用红景天根茎粉制成的红景天液态水悬液，经灭菌后接种微生物混合菌株进行液态发酵培养。通过本发明方法的转化发酵可使红景天活性成分比原药材中的活性成分大大提高，使其含量最高可比原药材提高100％以上，因而能有效利用野生资源，同时还能减少药渣等污染物的排量，实现藏中药的保护性开发，具有很好的应用前景。
文档编号C12P1/02GK101386870SQ200810046369
公开日2009年3月18日 申请日期2008年10月24日 优先权日2008年10月24日
发明者邓小晨 申请人:四川大学