专利名称：空肠弯曲杆菌的聚合酶链反应检测方法
技术领域：
本发明涉及一种人兽共患病病原一空肠弯曲杆菌的检测方法，具体涉及一 种空肠弯曲杆菌的聚合酶链反应(PCR)检测方法，属于医学生物技术领域。
背景技术：
空肠弯曲杆菌(C"m/7_y/Wa"w "/)是弯曲菌属的一种，是近十几年来受 到国内外广泛重视的人畜共患病原菌，主要可引起人体急性肠炎和食物中毒,并
伴发反应性关节炎、肝炎、瑞特氏病和格林-巴利综合症等免疫性损伤性疾病。 在兽医学上，可引起家畜流产不孕、乳房炎及幼畜禽腹泻和家禽肝炎。该菌通 过动物带菌者或患病者的粪便进入环境中，并在水环境中可以进入一种称为"活 的非可培养"(Viable butnonculturer-able， VBNC)状态的休眠期，处于VBNC 状态的细菌在特定条件下可以复苏且具有致病性。接触畜禽类，或食入受到污 染的禽制品、水源和牛奶是该菌感染人体的主要途径。世界卫生组织己将该病 列为最常见的食源性传染病之一。
空肠弯曲杆菌培养条件苛刻，在25'C不生长，42t:生长良好容易进入状态
VBNC,使得常规的分离培养和生化鉴定耗时费力、灵敏度不高，所需时间长(一 般需要48-72 h)，而不利于暴发疫情的快速诊断，也不符合临床病原菌检测所要 求的快速、准确的原则。近年来，PCR方法取得了长足发展，它具有灵敏度高、 特异性强、检测快速等优点。然而，国内外所报道的PCR方法对空肠弯曲杆菌 和结肠弯曲杆菌的鉴别存在特异性不高的缺陷。因此，建立一种能检测动物及 其产品中空肠弯曲杆菌的快速、简洁、准确的PCR方法，以实现对致病性空肠 弯曲杆菌简便、快速、准确的检测,对有效控制和预防该类食源性传染病意义重 大。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种空肠弯曲杆菌的聚合酶
链反应检测方法，能快速、简洁、准确的检测动物产品中的空肠弯曲杆菌。
为实现这一目的，本发明采用了一种菌落PCR方法，首先对空肠弯曲杆菌 进行微需氧分离培养，获得可疑空肠弯曲杆菌，再挑取单个可疑菌落溶于专用 于溶解空肠弯曲杆菌的缓冲液(K Buffer)中，煮沸离心后，取上清作为PCR 的模板，然后根据空肠弯曲杆菌VS1基因序列中的保守片段设计一对特异性引 物进行PCR反应，反应产物用琼脂糖凝胶电泳观察，出现516bp条带即为阳性 结果。
本发明的方法具体步骤如下
1、 可疑菌落分离培养无菌取动物组织装入灭菌器皿中，作为待检样品； 将组织捣碎匀浆，先以0.65um的微孔滤膜过滤，直接划线接种在选择培养基平 板上，置于微需氧培养装置中42 "C进行培养。
2、 挑取可疑菌落从样品培养所得的菌落中挑取可疑菌落，其中I型可疑 菌落不溶血，灰白色、棕黄色(可能出现浅红色)，扁平、湿润、有光泽，半 透明看上去像水滴，凸起、光滑，边缘不整有从接种线向外扩散的倾向；II型可 疑菌落也不溶血，圆形、有光泽、半透明，常呈分散凸起的单个菌落(直径为l 2mm)，边缘完整、发亮。
3、 PCR模板的制备挑取I型或II型可疑菌落，溶于专用于溶解空肠弯曲杆 菌的缓冲液中，混匀后煮沸，离心取上清作为PCR的模板。所述专用于溶解空 肠弯曲杆菌的缓冲液成分K buffer 50 mM KC1， 10mM Tris pH 8.0, 2.5 mM MgC12， 0.5%Tween20， 100 ug/ml proteinase K。
4、 PCR引物设计与合成根据网上 (http:〃www.sanger.ac,uk/Projects/CJejuni/)公布的空肠弯曲杆菌VS1基因序列
中的i呆守片段设计一对牛寺异引物VS-F:5， TAC GAT TTG TTT CATTG 3'， VS-R: 5'ATTTCTTTAGCAGGCATA 3，。
5、 可疑菌落的PCR检测利用特异引物按照常规方法进行PCR扩增，扩 增出的DNA片段长度为516bp。
6、 PCR扩增产物的鉴定取PCR产物在琼脂糖凝胶电泳，取胶置于凝胶 成像系统拍摄和分析，在516bp处出现条带，即可确定样品为空肠弯曲杆菌。
本发明方法直接从可疑菌落检测空肠弯曲杆菌，省去了增菌培养环节，设 计的引物也增加了 PCR检测方法的灵敏度和特异性，解决了常规方法检测空肠
弯曲杆菌时间长的难点，为畜、禽及其产品中空肠弯曲杆菌检测提供了快速、
简洁、准确可靠的检测方法，适合基层单位推广应用。
具体实施例方式
以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步详细描述。以下实施 例不构成对本发明的限定。 实施例1
1、 可疑菌落分离培养无菌条件下取鸡肝脏，装入加适量灭菌生理盐水的 青霉素瓶中，先以0.65 um的微孔滤膜过滤，直接划线接种在改良Camp—BAP 选择培养基平板上，置于微需氧培养装置中42 'C进行培养。
2、 挑取可疑菌落从样品培养所得的菌落中挑取可疑菌落，其中I型可 疑菌落不溶血，灰白色、棕黄色、扁平、湿润、有光泽，呈半透明水滴状，凸 起、光滑，边缘不整有从接种线向外扩散的倾向；II型可疑菌落也不溶血，圆形、 有光泽、半透明，常呈分散凸起的单个菌落(直径为1 2mm)，边缘完整、发 亮。上述菌落均可以作为空肠弯曲杆菌的可疑菌落进行进一步鉴定。
3、 PCR模板的制作挑取一个可疑的I型菌落，溶于80ul专用于溶解空 肠弯曲杆菌的缓冲液中(K buffer 50 mM KC1， 10mM Tris pH 8.0, 2.5 mM MgC12， 0.5 % Tween 20， 100 ug/ml proteinase K)，混匀后煮沸10分钟，然后离心5分 钟，取5pl上清液作为PCR的模板。
4、 PCR引物设计与合成
根据网上(http:〃www.sanger.ac.uk/Projects/CJejuni/)公布的空肠弯曲杆菌 VS1基因序列中的保守片段，用Premier5.0软件设计一对特异引物。序列如下 VS-F: 5' TACGATTTGTTTCATTG 3' VS-R: 5' ATT TCT TTA GCA GGC ATA 3，。
5、 可疑I型菌落的PCR检测扩增反应总体积为25^1，其中灭菌重蒸水
8.5^1， PCRMasterMix 12.5nl (包括DNATaqE、 dNTP、 buffer、 Mg+2)， 20pmo1/ L引物(VS-F: 5' TACGATTTGTTTCATTG3'， VS-R:5， ATTTCTTTAGCAGGC ATA 3')各lpl，模板DNA5p1.，置DNA扩增仪上进行PCR反应。循环参 数为94°C预变性5 min， 94 °C 30 S， 55 °C 60S， 72 °C 60S,共35个循环，最 后72'C延伸10min。
扩增出的DNA片段长度为516bp。
6、 PCR扩增产物的鉴定按常规方法配置1%的琼脂糖凝胶。按0.5mg/L 加溴化乙绽(EB)制胶。取5^1 PCR产物和1^1 l(Moading buffer混合加样。用 DL2000 Marker对照。90V电压电泳40min。取胶置于凝胶成像系统拍摄和分析， 结果显示，在516bp处出现清晰条带，虽有模糊的杂带背景，但可以基本确定 样品中含有空肠弯曲杆菌。 实施例2
1、 可疑菌落分离培养无菌条件下取猪盲肠装入加适量灭菌生理盐水的青 霉素瓶中，先以0.65um的微孔滤膜过滤，直接划线接种在改良Camp—BAP选 择培养基平板上，置于微需氧培养装置中42T进行培养。
2、 挑取可疑菌落从样品培养所得的菌落中挑取可疑菌落，其中I型可 疑菌落不溶血,灰白色、棕黄色(可能出现浅红色)、扁平、湿润、有光泽,半透 明看上去像水滴，凸起、光滑，边缘不整有从接种线向外扩散的倾向；II型可疑 菌落也不溶血，圆形、有光泽、半透明，常呈分散凸起的单个菌落(直径为1 2mm)，边缘完整、发亮。
3、 PCR模板的制作挑取一个可疑II型菌落，溶于80ul专用于溶解空肠 弯曲杆菌的缓冲液中(K buffer 50 mMKCl， 10mM Tris pH 8.0， 2.5mMMgC12， 0.5 % Tween 20， 100 ug/ml proteinase K)，混匀后煮沸10分钟，然后离心5分 钟，取5 ul上清液作为PCR的模板。
4 、 PCR引物设计与合成
根据网上(http:〃www.sanger.ac.uk/Projects/CJejuni/)公布的空肠弯曲杆菌 VS1基因序列中的保守片段，用Premier 5. 0软件设计一对特异引物。引物序列如下
VS-F: 5' TAC GAT TTG TTT CAT TG 3' VS-R: 5' ATT TCT TTA GCA GGC ATA 3，。
5、 可疑II型菌落的PCR检测扩增反应总体积为25pl，其中灭菌重蒸水 8.5(il， PCRMasterMix 12.5^1 (包括DNATaqE、 dNTP、 buffer、 Mg+2)， 20pmol/ L引物(VS-F: 5' TAC GAT TTG TTT CAT TG 3 ，， VS-R: 5' ATT TCT TTA GCA GGC ATA 3，) 各lpl，模板DNA5(x1.，置DNA扩增仪上进行PCR反应。循环参 数为94°C预变性5 min， 94 °C 30 S， 58 °C 60S， 72 °C 60S,共35个循环，最 后72。C延伸10min。
扩增出的DNA片段长度为516bp。
6、 PCR扩增产物的鉴定按常规方法配置1%的琼脂糖凝胶。按0.5mg/L 加溴化乙锭(EB)制胶。取5pl PCR产物和1 pi 1 (Moading buffer混合加样。用 DL2000 Marker对照。90V电压电泳40min。取胶置于凝胶成像系统拍摄和分析， 结果显示，在516bp处出现清洗条带，因而确定样品中含有空肠弯曲杆菌。该 步骤中退伙温度改为58"C，背景无杂带，表现出很强的特异性。
权利要求
1、一种空肠弯曲杆菌的聚合酶链反应检测方法，其特征在于包括如下步骤1)无菌取动物组织作为待检样品装入灭菌器皿中，将动物组织捣碎匀浆后以0.65um的微孔滤膜过滤，直接划线接种在选择培养基平板上，置于微需氧培养装置中42℃进行培养；2)从样品培养所得的菌落中挑取可疑菌落，其中I型可疑菌落不溶血，灰白色、棕黄色或浅红色，扁平、湿润、有光泽，半透明，凸起、光滑，边缘不整有从接种线向外扩散的倾向；II型可疑菌落不溶血，圆形、有光泽、半透明，常呈分散凸起的直径为1～2mm的单个菌落，边缘完整、发亮；3)将挑取的I型或II型可疑菌落溶于专用于溶解空肠弯曲杆菌的缓冲液中，混匀后煮沸，离心取上清作为聚合酶链式反应PCR的模板；所述专用于溶解空肠弯曲杆菌的缓冲液成分K buffer 50mM KCl，10mM Tris pH 8.0，2.5mMMgCl2，0.5％Tween 20，100ug/ml proteinase K；4)根据空肠弯曲杆菌VS1基因序列中的保守片段设计一对特异引物VS-F5’TAC GAT TTG TTT CAT TG 3’，VS-R5’ATT TCT TTA GCA GGC ATA 3’；5)利用特异引物进行PCR扩增，扩增出的DNA片段长度为516bp；6)取PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳，取胶置于凝胶成像系统拍摄和分析，在516bp处出现条带，即确定样品为空肠弯曲杆菌。
全文摘要
本发明涉及一种空肠弯曲杆菌的聚合酶链反应检测方法，先对空肠弯曲杆进行微需氧分离培养，挑取可疑菌落溶于专用于溶解空肠弯曲杆菌的缓冲液中，煮沸离心后，取上清作为PCR的模板，然后根据空肠弯曲杆菌VS1基因序列中的保守片段设计一对特异性引物进行PCR反应，反应产物用琼脂糖凝胶电泳观察，出现516bp条带即为阳性结果。本发明方法直接从可疑菌落检测空肠弯曲杆菌，省去了增菌培养环节，设计的特异性引物也增加了PCR检测方法的灵敏度和特异性，解决了常规方法检测空肠弯曲杆菌时间长的难点，为畜、禽及其产品中空肠弯曲杆菌检测提供了可靠的快速检测方法。
文档编号C12Q1/68GK101353699SQ20081004278
公开日2009年1月28日 申请日期2008年9月11日 优先权日2008年9月11日
发明者侯建军, 华修国, 吴忠亮, 毅 姜, 朱建国 申请人:上海交通大学